（食品科学专业论文）苹果渣中苹果多酚的提取、纯化及功效研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 苹果渣中苹果多酚的提取、纯化及功效学位 硕士 文题目 研究级别 学生学科 导师 姓名 郭娟食品科学艾志录、祝美云 专业姓名 学位论文 否 如需保密，解密时间年月日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 特此声明。 研究生签名：椭 导师签名：玟刍夺 日期：2 0 0 6 年6 月1 0 日日期：2 0 0 6 年6 月l o 日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存，汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书 僦蝼各弩嘲聊微5 浆彘糯册徽5 媳知 日期：2 0 0 6 年6 月1 0 日日期：2 0 0 6 年6 月1 0 日日期：2 0 0 6 年6 月1 0 日 致谢 致谢 本研究是在我的导师艾志录副教授和祝美云副教授的悉心指导下完成的，从研 究方向的确定、研究内容的实施到论文的撰写，无不倾注了导师的心血和智慧。特 别是我的第一导师艾志录副教授，三年来恩师在学术上的谆谆教诲和生活上无微不 至的关怀和帮助，令我终生难忘。恩师渊博的知识、严谨的治学态度、敏锐开阔的 思维方式、正直而又高尚的人格深深地感染着我，并对我今后的学习和工作产生深 远的影响。在此论文完成之际，谨向给予我殷切教诲的导师表示我最诚挚的感谢和 最崇高的敬意! 在论文选题、试验和写作过程中，食品科学技术学院的全体老师都给了我各方 面的支持和帮助，难忘高向阳老师，赵改名老师，李梦琴老师、黄晓书老师耐心、 认真的教导；难忘潘治利老师、王娜老师、张剑老师、柳艳霞老师、赵秋艳老师， 张平安老师兄长、姐妹般的辅导。没有诸位老师的鼎力支持和帮助，我的论文不会 如此顺利的完成，同时也十分感谢师姐张晓宇、师弟王育红、崔建涛、李建新、郑 锐锋及同届的同学们，正是由于他们的密切配合，才使得我能在一个和谐愉快的氛 围中顺利完成研究工作。谨借此机会向所有关心和帮助过我的领导、老师和同学们 表示诚挚的谢意! ! 另外，特别感谢我的家人和亲戚朋友们，正是有了他们这么多年来在生活、学 习等各方面给予我的关心和支持，才有了我今天的进步，也正是有了他们的理解和 帮助，我才能全身心地投入到学习中，顺利完成学业。 最后，再次向给予我帮助的老师、同学以及家人致以最诚挚的谢意! 摘要 摘要 为了充分利用苹果渣，开发商纯度的苹果多酚，本研究以农业废弃物一苹果渣为材料，以没 食子酸为标准品研究了福林法测定苹果渣中多酚物质含量的适宜条件；采用微波辅助提取法， 通过四元二次通用旋转设计确定了苹果渣中多酚的最佳提取工艺；并对经过微波辅助提取所得 的苹果多酚制品与常用抗氧化剂作对比，测定了其对猪油和花生油的抗氧化性能；针对苹果多 酚粗提物，探索了大孔吸附树脂对苹果多酚纯化的最佳条件；研究了s e p h a d e ) 【l h - 2 0 进一步纯 化苹果多酚的工艺；采用高效液相色谱法测定了苹果渣多酚的部分活性成分。研究结果如下： 1 、测定苹果渣提取物中苹果多酚的最优条件是反应温度2 5 ，反应时间1 2 0 m i n ，福林试剂l o n a 2 c 0 3 体积之比l ：l ，测定方法的平均回收率为1 0 6 5 ，r s d 为0 4 9 ，有较好的准确度和 精密度。具有重复性好、所用试剂简单、操作过程方便，灵敏度高等优点，特别适宜大批样品 总酚含量的测定。 2 、苹果渣中苹果多酚的微波提取最优工艺：萃取时间6 0s ，功率7 5 0w ，乙醇浓度6 0 ， 料液比1 ：5 0 ，此时最大吸光度y - 。= 0 4 6 0 ，苹果多酚理论提取得率可达1 1 9 3m g g ( d 、) ，明显 高于热回流及超声波提取得率。 3 、苹果渣中的苹果多酚粗提物对花生油，猪油具有明显的抗氧化作用。 4 、不同树脂对苹果多酚的吸附效果不同，在所选的4 种大孔吸附树脂中n k a 9 为苹果渣中苹 果多酚初步纯化的最佳树脂材料。当供试液苹果多酚浓度为2 5m g m l ，用浓度为6 0 的乙醇 作洗脱剂，洗脱流速为1 0m i , m i n 时，所得苹果多酚的纯度由原来的0 9 7 提高到1 9 7 4 ， 提高了2 0 倍，收率可达6 6 3 4 。 5 、苹果多酚一次纯化浓缩液经过s e p h a d e xl h - 2 0 后，采用分步洗脱方式，先用蒸馏水以 l m l m i n 的流速进行洗脱，后用浓度为8 0 的乙醇以0 5m l m i n 的流速进行洗脱，收集合并 多酚含量较高的部分，苹果多酚的纯度可达到8 4 7 2 。 6 、高效液相色谱法测定了纯化后所得的苹果多酚制品的组分，确定了苹果渣皮中根皮素的测定 方法。 关键词：苹果渣；苹果多酚；福林法；微波辅助提取；抗氧化；纯化；h p l c v l-ir oo-ri 文献综述 苹果渣中苹果多酚的提取、纯化及功效研究 1 文献综述 1 1 苹果渣资源及开发现状 我国盛产苹果，近二十年来，随着苹果种植技术的推广普及以及优良苹果品种的选育和引 进，种植面积不断扩大，苹果总产量逐年提高，据联合国粮农组织( f a o ) 统计，2 0 0 4 年我国 苹果产量和栽培面积分别为2 0 5 0 3 万t 与2 1 0 1 万h i n 2 ，占全世界的苹果产量和栽培面积的3 5 左右和3 9 左右，均位居世界首位【l 】。主要加工产品是浓缩苹果汁，年产量占世界总产量的 4 4 ，生产量超过了7 0 万吨，已经成为世界上最大的苹果浓缩汁生产国，9 5 以上供应出口， 2 0 0 4 年浓缩汁出口达4 8 7 1 万吨，出口量已经占到世界浓缩汁贸易量的近5 0 2 1 。特别是近几 年来，随着“健康、营养，回归大自然”的消费观念深入人心，世界范围内对苹果汁的需求量 逐年增长，据有关专家预计未来几年，苹果浓缩汁还会以每年1 5 的速度持续增长。但是，随 着苹果果汁加工业的进一步发展，随之而来必然排泄越来越多的果渣。苹果渣富含多种营养物 质，但因含水量高，极易腐败发臭。每到生产旺季果汁厂周围的果渣堆积如山，臭味熏天，对 环境造成了严重的污染。这些果渣除少量被加工成饲料或作为肥料、燃料使用外，绝大部分不 得已以每车1 0 元的价格让周围的农民当垃圾深埋。不仅严重污染了环境，还造成了资源的巨大 浪费。如何充分利用果皮渣进行深加工已成为国内外共同关注的问题。为此，新西兰国家专门 为此设立了一项研究项目，探讨苹果渣的综合利用途径，特别对苹果渣中所含的大量抗氧化剂 给予了特别关注，有望开发出新型抗氧化剂。日本也利用苹果渣开发出具有保健功能的苹果纤 维素。近段时间以来，我国相关研究人员对苹果渣中回收果胶给予了特别的关注提出了不少 从苹果渣中提取果胶的工艺 3 1 ，并已经将其投入到生产中，实现了工业化但苹果渣作为一种 极具开发价值的产品，目前人们对它的开发利用还远远不够。比如从苹果皮中提取生物活性物 质开发成功能食品，或者在将来可作为一种配料，增加产品的附加值；利用苹果皮粉生产强化 食品等等，因此。对苹果渣的开发利用还有待进一步的完善。 1 2 植物多酚类产品国内外研究及开发现状 植物多酚是一类广泛存在于植物体内的多酚类物质，是植物的次生代谢产物( s e c o n d a r y m e t a b l i c p r o d u c t s ) ，大部分存在于植物的果皮中。具有清除体内自由基、抗脂质氧化、延缓衰 老预防心血管疾病、防癌、抗辐射等生物活性功能。最初人类对酚类物质的有意识的利用是将 其用来制革。随着科技发展，特别是2 0 世纪5 0 年代以后，随着植物多酚与蛋白质、多糖、生 物或微生物酶、金属离子的反应活性及抗氧化、捕捉自由基、衍生化反应等一系列化学行为被 初步揭示，使人们看到了这类天然产物的应用前景。因此植物多酚的研究以及开发得到全世界 l 文献综述 科技工作者的广泛关注，美国以葡萄籽为原料，开发出用于红葡萄酒生产的原花色素产品；法 国从松树皮中提取的多酚物质，已在美国和1 5 1 本市场推广；在日本市场上可以看到有乌龙茶、 苹果，葡萄籽等多种类型的多酚产品：在欧洲，葡萄籽多酚早在3 0 多年前就作为药物使用，具 有降血脂、抗氧化等多种功效，对动脉硬化、癌、糖尿病及其合并症、运动应激引起的肌肉疲 劳和脂质过氧化反应均有预防效果，还可以改善肠内环境，减轻肠道排泄物臭味。尼柯维斯基 公司成功开发并推出了以。苹果酚”命名的苹果多酚产品。并广泛应用于胶姆糖、糖果、甜点， 饮料等原料，且市场迅速发展扩大。法国的佩尔凯姆公司、日本的常磐植物化学公司，新西兰 x z p 公司和以研制开发植物提取物著称的英德纳公司，都相继开发推广了植物多酚产品。除了 茶多酚之外。人们也试着开发其它来源的多酚化合物，苹果多酚就是其中的一种，经许多研究 发现它的许多生理功能活性比茶多酚要高1 0 0 倍以上，于是有望开发出新型的食品添加剂“ 1 3 苹果多酚及其性质 1 3 1 苹果多酚简介 苹果多酚( a p p l ep o l y p h c n o l s ，a p p ) 是苹果中所含多元酚类物质的通称，是具有苯环并结合 多个羟基化学结构的总称。其主要成分可分为三大类：一类是单体，包括以绿原酸为主的酚酸 类( 包括没食子酸、香豆酸等) 约2 5 ，以及几茶素、表儿茶素、槲皮素、二氢查耳酮等酚 类单体约1 5 。第二类是糖苷类多酚，包括根皮苷、芸香苷、越橘色苷( i d e a i n ) 等，约占1 0 。 第三类是以矢车橘素为单体缩聚而成的二聚体( 原花色素b 1 、b 2 ) 、三聚体以及4 1 5 个单体 聚合而成的缩合单宁，缩合单宁由矢车橘色素的c 4 - - + c 8 碳位结合而成，平均相对分子质量 2 0 0 0 ，约占总量的5 0 。植物中的多酚化合物一般是作为二次代谢产物广泛存在于植物的组 织中，不同品种其构成的多酚种类有所不同，苹果多酚的来源不同，其多酚种类也有所不同。 如成熟苹果的主要多酚类成分有绿原酸，几茶素类以及原花色素等，未成熟苹果中还含有较多 的二羟查耳酮类、槲皮素类等。在一些酿酒苹果品种中多酚含量可高达7 e , k gf w ( 鲜重计) “， 普通的鲜食品种中其含量范围在0 5 - 2g k g r w 州。在欧洲一些酿酒苹果品种的果渣中其含量为 7 2 4g k e , d w ( 干重计) ，其中槲皮配糖体就占了一半以上( 4 4 6g a g c t w ) 。其在苹果中的主要成分 因品种、成熟度，贮藏方式的不同而不同【8 ，“经研究发现果肉中的多酚成分主要为表儿茶素、 原花青素、木糖根皮苷，葡萄糖根皮苷和绿原酸，果皮中则含有较多的槲皮苷配糖体。而且还 发现果皮中的多酚含量远远高于果肉中的，苹果多酚作为保健、功能性食品添加剂，经许多研 究发现它的许多生理功能活性比茶多酚要商1 0 0 倍以上，具有巨大的潜在应用价值。 2 越橘色苷( 矢车菊色素一3 一半乳糖苷) 根皮苷 芸香苷( 芦丁) 3 1 - 4 黄酮醇类 o h r = g l l l l o h i 原花青素b 2 ( e 1 3 t e p i ) r 一, - - , - u r o f f i 原花青素b i ( e p i c 8 t ) 1 i 羟基肉桂酸类 三聚体最花青蠢c 1 ( e l p l - - e p t - - e p i ) 四聚体以上n 一4 1 6 缩台单宁 4 jifi) 文献综述 1 3 2 苹果多酚的特性“” i 3 2 1 颜色 含有2 0 苹果多酚的水溶液呈黄褐色，1 0 0 粉末状呈淡黄褐色。该制品的色调在使用范 围内都较稳定。 1 3 2 2 呈昧性 液状或粉末状的产品具有苹果的风味。有一点的苦味，然而其使用量一般为茶多酚的1 3 1 5 ，于是该苦味的风味几乎没影响。 1 3 2 3 溶解性 苹果多酚的1 0 0 粉末制剂室温下在水里的溶解度可达3 0 以上。其溶解性比一般茶萃取 物粉末制剂要高1 0 倍以上。易溶于乙醇，甲醇、丙酮等有机溶剂中。 1 3 2 4 保存性 苹果多酚中所含二聚和三聚的低聚花色素普含量较高，故有强抗氧化能力；1 0 0 粉末制品 在室温保存一年试验表明，苹果多酚的各项功能几乎不变；稳定性好。 1 3 2 5 耐热性和耐酸性 以多酚残留率为指标进行耐热与耐酸试验，结果显示，耐热试验在r t 下保存一年，耐酸 试验在p h2 1 0 范围内，在1 0 0 c 和1 2 0 c 下加熟3 0m i n ，0 i 和1 0 的苹果多酚( 磷酸缓 冲液中) 的残留率几乎不变，可见苹果多酚对热非常稳定。此外，苹果多酚在酸性至中性范围 内也非常稳定。 i 3 2 6 安全性 经过残留农药、重金属，砷、变异原性、急性毒性试验确认其安全卫生。 1 4 苹果多酚的生理功能“卜捌 概括至今有关苹果多酚的生理功能，其作用大致可体现在如下三个方面： 1 4 1 在医学方面的作用 1 4 i 1 抗衰老 多酚能提高人体内酶类自由基清除剂s o d 、c a t 和g s h - p x 等的活力，延缓衰老的进程。 实验证实：服用多酚的动物，平均寿命可以延长3 6 1 至4 9 9 。多酚抗衰老效果较v e 高1 8 倍 左右，因此苹果多酚可以用来开发抗衰老的医疗保健品。 5 文献综述 1 4 1 2 抗突变及抗癌作用 苹果多酚对食品或环境来源的苯并花等致癌物的致癌性起抑制作用。经研究证实了苹果多 酚物具有抗癌效果。同时，苹果多酚化合物还可以通过诱导细胞的。自杀”作用，抑制癌细胞 增殖和肿瘤增大。并发现原花青素是苹果多酚化合物中抗癌的有效成分。 1 4 1 3 苹果多酚的菌斑抑制和防龋齿作用 苹果多酚具有很强的抑制龋齿菌转葡萄糖基酶( g t a s e ) 的作用，从而防止牙垢的形成。因此， 苹果多酚对预防龋齿非常有效。现已证实苹果多酚对g t a s e 的抑制能力比绿茶中的表儿茶素没 食子酸酯( e g c g ) 高1 0 0 倍，其主要抗龋齿成分是苹果缩合丹宁( a c t ) 因此可以将其作为添加剂 用于牙膏中，既有防龋齿作用又有洁齿作用。 1 4 1 4 抑制高血压，高血脂及心脑血管疾病 苹果多酚可抑制a c e ( 血管紧张肽转化酶) 的活性，且其a c e 抑制活性比茶多酚的主要成分 儿茶素和表儿茶素要高，可以防止血管收缩、血压升高，具有显著降压、降脂作用，可以作为 有效的高血压、高血脂及心脑血管疾病的抑制药剂。被人誉为是。天然降压药”，对于高血压 病人或高脂血症患者尤为适宜。 1 4 1 5 抗氧化、清除自由基能力 自由基是由氧化反应而产生的对身体有害的物质自由基会破坏健康的细胞，侵害人体内 的蛋白质、酶等物质，造成人体组织器官受到破坏，加速机体的衰老进程并诱发癌症以及心、 脑血管等各种疾病到目前为止，医学界已发现许多疾病都与自由基有关，特别是退化性疾病。 通过对亚油酸的抗氧化研究表明，苹果多酚的抗氧化性能超过茶多酚。 1 4 1 6 治脱发作用 多酚对毛发作用方面的报道多见于日本，主要是基于它对毛囊细胞有增殖和再生功能，有 学者发现，1 低聚原花青素类对刮过毛或毛发终止生长期的小鼠的毛发有再生功能。日本协和 发酵公司从苹果的提取物中制成促进头发生长的药剂一药用毛活林p b 对治疗脱发有特殊增殖 效果，在这种物质中加入泛乙醚及b 一甘草酸等物也有良好生发效果。 1 4 1 7 抑制口臭 产生口臭气的主要成分为舍硫氨基酸产生的甲硫醇。在消臭试验中，以含硫的蛋氨酸为基 质，加入含口腔细菌的人体唾液，3 7 c 下作用，结果会产生甲硫醇。而在基质中分别加入苹果 多酚3 0 0p # m l 时，可使甲硫醇产生量减少5 0 以上，当加入量达到1 2 0 0 “g m l 时，能完全抑 6 文献综述 制甲硫醇的产生。对人体的实验申，以咀嚼胶质的形式进行。虽然咀嚼胶质可去除口臭，但咀 嚼不加苹果多酚的胶质时，咀嚼后口腔中的甲硫醇的含量马上开始增加，6 0 r a i n 后又回到原来 的浓度，而咀嚼含苹果多酚0 2 5 的胶质，3 0 m i n 后甲硫醇才开始增加，苹果多酚的含量达0 5 ， 咀嚼后6 0m i n 甲硫醇开始增加，所以苹果多酚具有良好的抑制口臭的作用，可探讨在口香糖类 产品中使用。 1 4 2 在食品方面的作用 1 4 2 1 抑制鱼的腥臭味，保持鱼的鲜度 鱼的腥臭味成分主要是三甲基胺。在抑臭试验中，把三甲基胺和苹果多酚混合，用气相色 谱仪测定其挥发性三甲基胺的量，结果随着苹果多酚浓度的增大，其挥发性三甲基胺的量不断 减少，当苹果多酚的含量为2 0 0t l g m l 时，挥发性三甲基胺的量减少5 0 水产加工中，用水洗 鱼时，加入2 5 0t t g m l 苹果多酚，减少约7 0 挥发性三甲基胺。 1 4 2 2 防止维生素、色素劣化的效果 在1 0 0 苹果汁( 澄清) 中添加v c1 0 0 0m g k g ，再分别添加苹果多酚0 0 5 和0 1 ，在3 0 c 下保存，结果显著地抑制了v c 的劣化。在含p 胡萝h 素或辣椒红色素的清凉饮料里加入o 0 1 的苹果多酚，进行强制褪色试验，结果表明具有强防褪色效果，特别是对b 胡萝h 素的防褪色。 1 4 2 3 猪肉糜保鲜 将猪肉放在绞碎器中混合，分为3 个样，依次加入浓度为1 0 水溶性多酚、油溶性多酚各0 4 以及浓度为7 0 合成生育酚0 1 之后在7 0 c 下加热杀菌4 r a i n 后，于1 下保存，最后测定其外 观以及过氧化值。结果显示，采用多酚的样品比生育酚的效果要好，而对于肉的亲和性，油溶 性多酚要比亲水性的多酚效果要好 1 4 3 在化妆品方面的作用 植物多酚在护肤品中起到多重作用，如抗衰老、抗紫外线，抗辐射，增白、保湿等，对多 种因素造成的皮肤老化都有独特的功效。 1 4 3 1 抗皱作用 研究表明，当将原花青素类多酚注入幼兔皮肤内时，可束缚皮内弹性纤维；将其相同量注 入猪的皮内，同样抑制胰蛋白酶水解弹性蛋白，使皮内周围的弹性蛋白大量重建。同时证明， 在炎症过程中，原花青素可潜在抑制弹性蛋白酶对弹性蛋白的降解作用。 1 4 3 2 防晒、美白作用 7 文献综述 芬兰大学学者曾从细胞学角度，通过紫外能源照射皮肤细胞的体外实验发现，当人皮肤组 织暴露在紫外能源仅3 0m i n , 阳光杀死细胞大约5 0 随着低聚原花青素的加入大约有8 0 皮肤 细胞免受损坏，且与v c 相比具有较好的紫外线吸收作用。1 9 8 8 年美国专利6 8 1 7 2 9 9 开发了含 有6 0 聚原花青素提取物的防晒霜。日本公开特许公报9 4 3 3 6 4 1 报道，原花青素类多酚能使黑 色素的邻苯二醒结构还原成酚型结构，使色素褪色。又因原花青素和维生素之间的协同效应， 研制开发出v c 或v e 一原花青素复合型美白剂，制成奶液用于美白和保护水分。 1 4 3 3 收敛和保湿作用 多酚的收敛作用，使得含多酚的化妆品有很好的附着能力，并且可使粗大的毛孔收缩：多酚 的保湿作用是基于多酚的分子中含有亲水性的酚轻基结构，此结构不仅在空气中易吸潮，而且 能够与多糖、蛋白质、氨基酸，多肽等大分子形成复合物也起到保湿作用。 1 4 4 在其它方面的作用 将苹果多酚连接到聚合物的分子上，从而使聚合物具有多酚的性质。可制成抗菌材料，如可 应用在尿不湿产品的抗菌方面。由于工业的发展，大量酚进入水体环境，和金属离子反应沉积 在河流底的淤泥中，造成对水生物的危害。如将植物酚接枝到聚合物链上，不但可以减少植物 加工过程中排放的含酚废物对环境的破坏，又可作为处理含重金属离子废水的产品，可开发利 用。另外，利用多酚对酶活性的抑制作用，可以控制植物中多酚的含量，对害虫产生阻食性， 减少植物的病虫害。另外，还可作为添加剂用于面包、糖果、糕点、油脂、清凉饮料、水产及 肉制品的加工中。 1 5 苹果多酚的国内外研究现状 苹果多酚是褐变反应的底物之一，并且与新鲜苹果及其制品的感官品质密切相关。因此最早 对其研究开始于对褐变的机理及其控制上，早期人们对苹果中多酚类物质的组成，苹果多酚与 褐变的关系，多酚物质与苹果汁的稳定性及颜色变化之间的关系等进行了大量的研究。“”。而 随着对苹果多酚的生物活性及应用研究的深入和苹果业的快速发展人们开始将注意力投入到 了苹果多酚的功能特性及组分研究上来了。为此，9 0 年代，涌现了大量的有关苹果多酚的功能 特性及组分研究的相关报道。但这些研究结果大都是一些初步的研究结果。同目前茶多酚和葡 萄籽提取物己在食品、化妆品、保健品和药物中的广泛应用相比，苹果多酚的应用显得极其有 限，目前它仅限于部分食品的保质及功能性添加剂等的应用，同时所涉及的也仅限于定性分 析或对褐变的研究，难以满足对苹果多酚开发利用的实际要求。直到9 0 年代中期，才有有关苹 果多酚提取，分离纯化工作的相关报道，国内外具体研究现状如下： s 文献综述 1 5 1 苹果多酚提取方面 在对苹果多酚的提取原理上大多均采用有机溶剂浸提法，不同是所采取的工艺不同， 目前常见的方法有： 1 5 1 1 有机溶剂常温提取 1 9 9 9 年新西兰的f o o 和l up 4 】从苹果皮渣中提取，分离多酚物质就利用了此法，此法的缺 点是没考虑温度对提取率的影响，提取效率较低。只是一些初步结果。 1 5 1 2 热提取法 日本的n i k k a w h i s k y o i s t i l 公司报道了一种从苹果幼果中提取多酚产品的方法，利用果树疏 花疏果时废弃的幼果制取多酚提取物。国内戚向阳【3 5 1 等人利用该法以鲜苹果为原料对苹果多酚 的主要成分原花青素的提取工艺进行了探讨，优化了工艺条件，苹果原花青素的提取率可高达 9 5 6 6 。西北工业大学的任静p ”也利用该法以干果渣为原料，6 0 g j 酮为提取溶剂，用正交试 验的方法确定出原花青素的最佳提取工艺。但此法的缺点是耗时长、溶剂用量大、生产成本高， 不适合工业化大生产。 1 5 1 3 高压液相萃取法 针对有机溶剂常温提取和热回流提取法生产时间长，效率低等缺点，& ma l o n s o s a l c c s 等人p ”提出了第三种方法：高压液相萃取法，该法选择合适的溶剂在逐渐升高的温度( 4 0 2 0 0 1 2 ) ，压力( 5 0 0 3 0 0 0p s i ) 下将包装在一个卫生，无污染的钢质萃取容器里的样品作用5 1 5 m i n ，然后收集随高压气体溶出的有效成分，从而达到对样品的净化，该法具有较高的提取率， 耗时较短，可以实现自动化，同时可以减少光等对酚类物质的氧化影响，但缺点是不适合苹果 皮渣中多酚物质的提取。 1 5 1 4 超声波提取法 r o s am a l o n s o - s a l c e s 3 b 】首次提出了超声波溶剂提取法，利用甲醇、乙酸的混合溶剂通过 超声波提取苹果中的多酚，和反相高效液相色普及光电二级管阵列监测器找出了适合h p l c 进 行检测的多酚提取方法。结果表明，该法具有溶剂用量少，回收率高等优点，但耗时较长。国 内西北农林科技大学的葛蕾o ”对苹果渣中的多酚物质也采用了超声波提取法进行了提取，并确 定了超声波提取的最佳工艺条件：乙醇浓度7 0 ，超声功率2 2 5 w ，提取时间2 0 m i n ，在此条 件下，苹果多酚的提取率8 9 4m g g ，提取得率也大大高于回流提取法，提取时间明显低于热回 流提取，极大地提高了工作效率。 9 文献综述 1 5 1 5 超i 临界萃取( s f e ) 结合传统工艺法 随着超临界萃取技术的发展及应用，近年来有人提出采用超i | 缶界二氧化碳萃取技术，同时 结合传统工艺来生产高纯度的苹果多酚，此工艺将超临界c 0 2 萃取技术与传统提取、浓缩、萃 取技术相结合，得到了制备高纯度苹果多酚的新工艺，既可生产出高质量的苹果多酚，又可解 决传统工艺的一些弊端。优点如下：有机溶剂用量减少、安全性好，污染少，得率高；残留溶剂可 被彻底除去：综合成本低等。该工艺既提高了多酚的纯度、得率，使其含t i 9 0 ，溶剂残留为 零，又符合工业化生产对原料、溶剂、制作路线、生产过程的安全性、产品的颜色，产率，纯 度诸方面的要求，但是工艺中必须确保整个系统处于超临界状态下才能有萃取分离的效果；对 设备要求高，一次性投资大使诸多厂家望而却步，实现工业化难度较高。 近年来。随着微波技术的快速发展，微波提取以其高效、节能、省时、具有强的植物细 胞壁破除能力等优点已被广泛应用于中草药有效成分及茶多酚的提取中“0 4 ”，郭振库【4 2 1 等进 行了微波提取中药金银花中绿原酸类化合物的研究，他们还用同样方法研究了黄芩中黄芩苷 的微波提取，结果表明微波提取不仅所需时间短，而且提取率比超声波法高近2 0 ，而且微 波法的提取率和重复性好于超声波；李学坚 4 3 1 等分别用溶剂回流提取法、微波浸提技术和水 蒸汽蒸馏法提取丁香油进行比较，得出了类似的结论：微波浸提技术能耗低、省时、溶剂耗 量少；比溶剂回流提取法选择性高，比水蒸汽蒸馏法提取率高。说明微波浸提技术与传统提 取方法相比有一定的先进性。微波浸提技术优越性是比较明显的中国农业大学李风英 4 4 1 等人 也进行了微波辅助提取葡萄皮渣中原花青素的研究，范志刚咐1 等研究了m a e 对雪莲中黄酮浸 出量的影响和麻黄中麻黄碱浸出量影响m ，周谨p 1 等利用微波技术提取银杏黄酮，微波辐照 5 m i n , 基本可以达到常规加热l h 的效果，对黄酮物质无破坏作用。周志【柏1 等对绿茶进行微波处 理，用水作溶剂，在料液比1 ：2 0 ，时间3r a i n , 微波浸提两次，在5 0 水浴浸提，1 次1 0m i n ，茶 多酚浸出率达9 0 以上。另外，微波技术在植物色素、多糖等物质的提取上都有广泛应用 4 9 一 但到目前为止，尚未见到微波技术在苹果多酚提取中应用的相关报道。 1 5 2 苹果多酚分离纯化方面 在苹果多酚分离纯化方面，常见的有传统的液一液萃取法，此法在一定程度上可实现苹果 多酚的初步分离纯化，但操作繁琐，产品纯度很低。近年来市场上更注重提高纯度，因此苹果 多酚的分离纯化主要采用柱层析技术，p i c i n e l l i a 等采用e x t r a - s e p c l 8 柱通过调节样品的不同p h 值将苹果多酚分为中性成分和酸性成分，该法与传统的液一液萃取法相比有较高的提取率，原 花青素、绿原酸和黄烷醇类的得率均成倍的提高，特别是根皮素木糖苷，其得率提高了3 倍多。 o l e s z e k w 等人也选择c l l 柱结合h p l c 分析系统成功地从苹果皮中分离出五种槲皮苷配糖体和 t 0 文献综述 两种二氢查耳酮配糖体。l u y i n g r o n g s l l 等人以苹果渣为原料，选择s e p h a d e x l h 一2 0 柱进行吸 附、纯化苹果多酚，效果良好，但只是一些初步的结果。中国农业大学的姜慧采用s e p h a d e x l h 2 0 ，以乙醇水溶液和6 0 的丙酮水溶液为洗脱液研究了苹果多酚分离提纯过程中柱长径比 和流速对解吸率、表儿茶素和绿原酸的得率三个指标的影响中国农科院的刘杰超”1 结合苹果 浓缩汁加工工艺也采用了树脂吸附法对其中的多酚物质进行分离、纯化( 硕士论文) 。此外，西 北大学的任静闻、山东农业大学的孙建霞”、西北农林科技大学的葛蕾9 9 1 也都对苹果多酚类物 质的提取分离及活性研究做了积极的探讨，分别在果渣中原花青素的分离纯化及活性研究、苹 果汁中多酚物质的提取、分离及其主要功能活性、苹果渣多酚浸提物及其抗氧化性等方面做了 大量的研究。但所得的产品纯度均较低，还需进一步研究，使其分离纯化工艺更加完善。增强 实用性。 1 5 3 苹果多酚的功效研究方面 在苹果多酚的功效研究方面，国外学者首先进行了大量的研究，如m a t s u d a d a 等1 ”证实苹果 多酚在体内能有效抑制牙斑的形成，从而起到抗龋齿作用。i g a n d a 等证实从未成熟苹果中提 取分离的缩合单宁可有效抑制组胺酸的游离和透明质酸酶的活性，从而起到抗过敏作用。s i l v n a b 等人报道了在防治心脑血管疾病等方面的功效。l 1 1 等研究发现，苹果皮渣中的多酚物质，包 括绿原酸、根皮苷、儿茶素及其低聚体和栎皮酮糖苷等在b 一胡萝h 素亚油酸系统中具有良好 的抗化活性，对d p p h 和超氧阴离子自由基的清除能力分别是维生素c 或e 的2 3 倍和1 0 3 0 倍。此外，苹果多酚的降低胆固醇及抗突变及抗癌作用、抑制血压上升作用等方面的功效也 有大量的报道。 近几年来，国内学者也开始对苹果多酚的生理活性进行了研究，起初研究的工作主要集中 于对原花青素的研究上。如陆茵等【5 5 】研究了原花青素对h 心n g 致d n a 损伤及拓扑异构酶 的影响。结果表明，p c 对经自由基及致癌剂m n n g 引起的细胞d n a 损伤有一定的保护作用， 但对拓扑异构酶的活性无抑制作用。赵万洲 s s l 等研究了原花青素的抗癌作用等。后来也就是 近几年，对苹果多酚的功效研究才逐渐多了起来，但大多是一些综述性的文章，如徐州市彭城 大学食工系梁峙吲苹果多酚的功效研究与应用，华南理工大学食品与生物工程学院彭志英、唐 传核【1 2 】的苹果多酚的开发及应用等。真正研究性的文章很有限，如华中农业大学戚向阳鲫进行 了苹果多酚提取物清除羟基自由基( - o h ) 的研究等，结果表明，以原花色索为主要成分的苹 果提取物清除o h 的效果远高于茶多酚山东农业大学的孙建霞【蚓采用微量量热法研究苹果多 酚对细菌的抑制作用，并探讨了苹果多酚抗氧化、清除自由基的机理；西北农林科技大学的葛 蕾p 卅也进行了苹果渣提取物对o h 自由基的清除作用及对脂质过氧化的抑制作用的研究；宁波 引言 大学食品科学研究所的吴汉民和李和生【1 4 l 也对苹果多酚的特性及功用进行了研究。但相比之下， 目前的研究大多局限在酚类物质的抗氧化性方面，而对酚类物质的其它功效，如用植物多酚制 备功能高分子材料，大分子的植物多酚经适当的氧化降解后，利用其产物的抑菌性能做成制药 行业重要的原材料，多酚与金属离子络合形成沉淀开发排除重金属的制剂等方面还缺少相应的 研究。 2 引言 2 1 课题提出的依据及研究意义 中国是世界上盛产苹果的国家之一，总产量一直居世界首位。我们河南省作为苹果主产 区之一，种植面积、年产量和苹果浓缩汁出口量均居全国前列，仅以2 0 0 4 年为例，按加3 - 1 吨 浓缩汁会出湿渣2 吨的量进行计算，仅生产苹果浓缩汁产生的苹果渣就约有3 0 万吨，随着近几 年来我省各级政府对苹果加工业支持力度的进一步加大必然会带动我省苹果果汁加工业的迅猛 发展，产生的苹果渣势必会越来越多。因此，本课题立足我省的优势资源更具有广泛的经济价 值和社会价值。 随着当今人民生活水平的不断提高，胃肠道疾病、铅中毒、高血压、高血脂、心脑血管等 慢性病及亚健康状态已严重影响到我国乃至全世界人们的身体健康，成为损伤人体健康的隐形 杀手。当前我国仅高血压患者已超过1 个亿，而且每年新增病例3 0 0 多万，如何积极开发有利 于提高人体免疫力，对高血压、心脏病、癌症等疾病及辐射、化疗损伤有预防和辅助治疗作用， 对人体有保健和延缓衰老作用的功能型产品已成为世界各国科研工作者的重要任务之一。苹果 多酚作为一类具有生物活性的天然化合物，具有强抗氧化性，抗龋齿，抗癌细胞增生、预防心血管、 哮喘、糖尿病等慢性疾病，调节脂类代谢，改善肺功能，抑菌、抑病毒，消除口臭，防脱发、生发、 美容等生理功能，性质稳定。抗氧化性能高于茶多酚，对a c e ( 血管紧张素转移酶) 抑制活性 比茶多酚高，可以作为有效的高血压、高血脂及心脑血管疾病的抑制药剂。对人们在强身健体、 防病治病、延年益寿等各方面具有巨大的潜在价值。 据估计，目前世界植物多酚类物质的总产量，大约5 0 万吨，我国仅约3 4 万吨，尚不足 市场需求份额的l 1 0 。多酚以其多方面的杰出功能，被各国开发利用，日本政府已批准食用 和药用。我国作为抗氧化剂和食品添加剂用。日、美、英、法以及韩国、香港，台湾、东南亚 需求量很大，现在国内及国际市场上销路极好。当前全球的多酚需求约在每年4 万吨( 各种规 格) ，而生产能力不足l 万吨，市场远未饱和，据专家预计，需求量还会以每年4 0 的速度增 长。因此，多酚产品具有广阔的市场前景。 国内对苹果多酚的研究无论是在苹果多酚的提取、分离纯化或功效研究方面，从已查出的 1 2 引言 资料上看，有关苹果多酚的相关报道只有2 0 多篇，大多是一些综述性或苹果多酚功效研究方面 的文章，有关苹果多酚的提取和纯化方面的研究只是近5 年来刚刚开始进行的。生产出的苹果 多酚纯度大约都在2 0 4 0 “邡i 左右，纯度低，品种少，多为初级产品，销售价格与高纯度产 品相比差价很大，而且难以满足国内外市场要求。因此，开展苹果多酚的生产技术研究、开发 高纯度系列产品迫在眉睫。因此，本课题结合我国目前的苹果品种资源条件和实际生产状况， 利用苹果渣制取高纯度的苹果多酚，对于苹果加工原料的选择和工艺技术的改进及苹果多酚的 开发利用均具有重要的参考价值和现实意义。 综上所述，开展新型的苹果深加工产品的研究，从苹果渣中提取多酚物质并纯化，得到高 纯度的苹果多酚制品，不但可以提高苹果深加工产品的附加值，延长苹果加工的产业链，而且 还可使每年当成废物处理的果皮渣变废为宝，解决多年来一直困扰众多生产厂家的大难题，提 高企业经济效益，减轻环境污染，增加农民收入具有重要的经济及社会意义。 2 2 课题研究内容 2 2 1 苹果多酚的测定方法研究 2 2 2 苹果多酚的微波辅助提取工艺研究 2 2 3 苹果多酚粗提物对油脂的抗氧化性能研究 2 2 4 大孔吸附树脂初步纯化苹果多酚的工艺研究 2 2 5s e p h a d e xl h - 2 0 精制苹果多酚的工艺研究 2 3 课题研究目标 2 3 1 建立一种快速、准确、便捷的测定苹果多酚含量的适宜方法 2 3 2 确立微波辅助提取苹果多酚的最优工艺条件 2 3 3 确立大孔吸附树脂初步纯化苹果多酚的最优工艺条件 2 3 4 通过s e p h a d e x l h - 2 0 得到高纯度的苹果多酚制品 3 材料与方法 3 1 试验材料、仪器及试剂 3 1 1 试验材料 干苹果渣：由三门峡富达果胶工业有限公司提供 花生油：新鲜榨制，未经精制 1 3 结果与分析 猪油：新鲜猪板油自熬 bht ：食用级，南京中山化工二厂 3 1 2 试验仪器 1 4 l、lfi-1illil，、i，17 lillj 结果与分析 3 1 3 主要试剂 1 5 结果与分析 3 2 试验工艺路线 苹果渣 上 粉碎 l 微波辅助提取 l 离心过滤 上 真空浓缩 3 3 试验方法 3 3 1 苹果多酚的测定方法研究 3 3 1 1 主要试剂的配制 没食子酸标准溶液：准确称取没食子酸( 分析纯) 0 1 0 0 0g 溶解于7 0 的乙醇中并定容 1 6 结果与分析 至1 0 0 m l ，再用7 0 的乙醇稀释至l o 倍，即得浓度为1 0 0 m l 的标准溶液。现用现配。 f o l i i l c 硫a k u 试剂p q ：在ll 磨口回流蒸馏器中加入1 0 0g 钨酸钠( n a 2 w 0 4 ) ，2 5g 钼酸 钠( n a z m 0 0 4 ) ，7 0 0m l 蒸馏水，5 0m l8 5 磷酸。1 0 0m l 3 7 盐酸0 - t c i ) ，冷凝回流1 0h ，然后 添加1 5 0g 硫酸锂( l i 2 s 0 4 ) 和数滴溴液( b r 2 ) ，取下冷凝管，重新加热至沸。维持1 5m i n ，驱去多余 溴，冷却后补足蒸馏水至1 0 0 0m l ，用棕色试剂瓶装好，置于冰箱中长期冷藏备用，临用时稀释 3 倍。 1 0 n a 2 c 0 3 溶液：称取1 0 0 9 无水n a 2 c 0 3 ，用水溶解，定容至1 0 0 m l 。 3 3 1 2 标准品的选择及标准曲线的建立 本试验选用没食子酸作为标准品。将准确称取的没食子酸标准品配制成不同浓度的标准溶 液。再加入福林试剂1 0m l ，充分振荡后静置3 4m i n ，分别加入1 0 n a 2 c 0 3 溶液1 0m l ， 摇匀置于2 5 c 恒温水浴中反应2h ；同时做试剂空白，于7 6 5n m 下测定吸光度，以含量对吸光 度( a ) 进行直线回归，得回归方程。 3 3 1 3 原料的处理 准确称取苹果渣5 0 0 0g 于锥形瓶中，加, , k s om l 7 0 的乙醇，在8 0 c 的水浴中热回流提取3 次，每次2 h ，4 0 0 0r m i n 离一6 , 2 0m i i l ，收集合并上清液，用旋转蒸发仪在0 0 9m p a v 浓缩并回 收乙醇，浓缩液用7 0 的乙醇定容至5 0m l 待测。 。 3 3 1 4 测定原理及方法 多酚类化合物分子上有极易氧化的羟基，在碱性条件下与f o l i n - c i o c a l t c u 试剂反应后呈显 兰色，此反应物在7 6 5n m 处有最大吸收，一定条件下遵从朗伯一比耳定律，以没食子酸为基准 物质可测定苹果多酚的总量。根据这一测定原理，从上述5 0m l 待测液中吸取溶液3 0p l ，按标准 曲线制作法测定吸光度，根据回归方程可求得3 0p l 待测液中多酚的含量，再进一步计算出1 9 样 品中酚类物质的含量( 以没食子酸计唱，g ，d w ) 。 3 3 1 5 结果计算公式 样品中多酚物质含量( 以没食子酸计r a g g ) = ( a 1 v o ( v 2 m ) a l 样液中多酚的含量( p g ) v l 样液的体积( r n l ) v r 搬4 定取样液的体积( p 1 ) m 称样量( g ) 1 7 结果与分析 3 3 2 苹果多酚的微波辅助提取工艺研究 3 3 2 1 苹果多酚的微波提取 称取苹果渣0 5 0 0g 于2 5 0m l 的锥形瓶中，按照试验设计的条件进行微波提取，提取液经 离心后取上清液，冷却定容至5 0m l 待用。 3 3 2 2 苹果多酚的定量 采用f o l i n - c i o c a l t e u 法：碱性条件下反应物与f o l i n - c i o c a l t e u 试剂作用后呈显兰色在7 6 5n n l 处有最大吸收，一定条件下遵从朗伯一比耳定律，以没食子酸为基准物质可测定苹果多酚的总 量。从3 3 2 1 制备的5 0m l 待测液中吸取1 5 0 儿与f o l i n 试剂反应后，以相应溶剂做空白，于7 6 5 n m 处测定显色液的吸光度，根据回归方程求得1 5 0 1 a l 待测液中多酚含量，进而计算样品中多酚物 质的微波提取得率( 以没食子酸计m g g ，d w ) 。 3 3 2 3 试验方案的设计 先进行单因素试验，然后在单因素预实验的基础上选取萃取时间、功率、乙醇浓度、料液 比四个因素，采用四元二次通用旋转设计优化苹果多酚的微波提取工艺参数。试验设计因素水 平见表3 1 ，方案设计见表3 - 2 。 裹3 - 1 试验因素水平衰 ! 坐生：! 垃! ! ! 塑垒墼塑垡! 监墅幽型 水平编码( 萃取时x l 问，s )( 功，w )( 溶剂亲爱，坳 瓦 ( 料液比，g ：n i l ) + 2 + 1 0 l - 2 j 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 7 5 0 6 0 0 4 5 0 3 0 0 1 5 0 8 0 7 0 5 0 4 0 1 0 l ： l ：醪 1 ：5 0 l ：3 5 l ：2 0 1 8 结果与分析 表3 - 2 试验设计方案及试验结果 t a b i e3 - 2e x p e r i i i t e n t a id e s i g ns c h e m ea n dr e s g i t 结果与分析 3 3 2 4 统计分析方法 以测得的苹果多酚的吸光度a 为目标函数，以萃取时间、功率、乙醇浓度、料液比为自变 量，采用浙江大学编制的d p s 数据处理软件嗍分析结果，得到微波辅助提取苹果渣中苹果多酚 的最佳工艺条件。 3 3 2 5 提取方法比较试验 本文对微波辅助提取、传统的热回流提取与超声波提取进行了比较试验，作了同等条件下 的提取得率比较试验。进一步验证微波辅助提取的高效、节能等优点。 3 3 3 苹果多酚粗提物对油脂的抗氧化效果 3 3 3 1 油脂过氧化值的测定 称取花生油、猪油各5 0 0 9 放入广口瓶中，按油重的o 0 2 计算苹果多酚粗提物和b h t 用 量，称取后溶于l m l 无水乙醇中，然后把乙醇溶液加入瓶中