（食品科学专业论文）黄色毛霉在腐乳生产中的应用.pdf

摘要 腐乳麓我函的传统大豆发酵制品。自2 0 世纪八十年代以来，腐乳生产进入快速发展阶段， 在很多地区实瑗了工业优生产，慢至今仍有很多地方沿用传统的作坊生产，产晶质墩难予控制， 对其微生物分布，发酵过程及生理功能未有研究报道。本文主要是扶黑龙江省北部地区自然发 酵鹰孥l 毛坯中分离纯饯惑蘸期发酵菌株，优化其纯辩发酵一毯生，并对发酵过程中戒分变纯及功 能性避行研究，主嚣内容及续象如下： l 、首次对黑龙江北部地区自然发酵腐乳毛坯中的微生物分布进稽研究，发现其主要微生镑是 种嗜低温的毛霉，经鉴定其为毛襟科( m u c o r a c e a e ) ，毛霉属( m u c o r ) 。黄色蓖霉( m u c o r f l a v u s ) 。 2 、通过豆汁液体培养及观察黄色壤霉在豆腐自坯的生长情况，确定了其在豆腐白坯上的蠼适生 长温度范围为8 - 1 5 ，湿度范围8 0 - 9 0 。 3 、涮宠黄色毛霉在自坯上的产蛋白酶能力，弗讨论了蛋自酶的提取条件。以0 2 m o l l p h 6 8 的 磷酸缓冲滚提欷i 小时，霹珏得到较商的酶活，并蠢黄色亳霉所产蛋国酶为酸性蛋白酶。1 3 c f 黄色毛霉在爨坯上生长9 6 小时，褥剿最赢的摄自酶滔。并依据生产窦际确定了腐乳生产豹翦 发酵融闻为8 4 小时。 4 、检测了两种盐含量腐乳生产过程中粗蛩岛、糨脂肪、游离脂肪骥、憨酸及游离氨基酸态氮等 化学成分的变化。 5 、前笈酵时期。祷乳中的p - 葡萄糖苷酶酶活缓慢上升，进入盐腌期，d 葡萄糖苻酶酶活持续上 升且上升幅度加大。p - 葡萄糖瞢酶活鼠有一定的耐盐性，但高盐分又产生抑制。腐乳生产过程 串，大豆髯黄酮含鬣和构型发生改变。在p - 葡萄糖瞢酶的作阏r 糖苷麓异黄酮向甙元型异黄酮 转佳。 6 、测定了黄色罨霉腐乳的抗戴佬、降血压、抗老年癫呆疲能力。游以雅致放射罨霉发酵的瘸乳 作为对照。黄色毛霉发酵腐乳e 雅致放射毪霉发酵腐乳具有照好始降血压能力。 关键词：腐乳，黄色毛霉，化学编成。低温，辩黄酮 a b s t r a c t g u r ui sat r a d i t i o n a lf e r m e n t e ds o y b e a nf o o d ，w h i c hi sp o p u l a ri nc h i n a m a n u f a c t u r eo f s u f uh a d b e e nd e v e l o p e dq u i c k l ys i n c e1 9 8 0 si nc h i n a , h o w e v e r , t h et r a d i t i o n a lp r o d u c i n gt e c h n o l o g i e sa r es t i l l u s e di nm a n ya r e a s i ti sd i f f i c u l tt ok e e ph i g hq u a l i t yo f s u f ui nt h e s em a n u f a c t u r e r s ，w h i c hi sr e s u l t e d f r o mt h es p o n t a n e o u sf e r m e n t a t i o na n dd o m e s t i c a lp r o c e s s i n g a l m o s tn oi n v e s t i g a t i o nw a sa v a i l a b l e r e g a r d i n gt h e i rd i s t r i b u t i o np r o f i l e so fm i c r o b e ，f e r m e n t a t i o n ，n u t r i t i o na n dh e a l t h yf u n c t i o n i nt h i s p a p e r , am l l c o rw a si s o l a t e da n di d e n t i f i e df r o ms u f up r o d u c e di nn o r t ho fh e i l o n g i i a n gp r o v i n c e ， w h i c hw a su s e da ss t a r t e rt op m p a r es u f ui no u rs t u d y , t h ef e r m e n t a t i o np r o p e r t i e s c o m p o n e n t c h a n g e sd u r i n gp r o d u c t i o n ，a n dh e a l t h yf u n c t i o no fp r e p p e ds u f uw e r ei n v e s t i g a t e d t h em a i n c o n t e n t sa r c ： i t h em i c r o b i o l o g i c a lc o m p o s i t i o ni np e h t z ew a si n v e s t i g a t e d 。am l z c o rw a si s o l a t e da n di d e n t i f i e d a sm u c o r f l a v u s , w h i c hw a sb e l o n g i n gt om u c o rg e n u s ，m u c o r a c e a e 2 ，t h eg r o w t ho f m h c o ri nb e a nc u r dw a so b s e r v e da td i f f e r a t et e m p e r a t u r ea n dh u m i d i t y a n dt h ed r y w e i g h to fm y c e l i u mi nl i q u i dc u l t u r em e d i u mw a sw e i g h t e da tv a r i o u si n c u b a t i o nt e m p e r a t u r ea n d g r o w t ht i m e t h eo p t i m u mg r o w t hc o n d i t i o n so fm u c o r f l a t u sw e r ef r o m8 c t o1 5 w i t ht h e h u m i d i t yr a n g i n gf r o m8 0 t o9 0 t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tm u c o r f l a v u sc o u l db eu s e di ns u f u p r o d u c t i o na tl o wt e m p e r a t u r e 3 t h ep r o t e a s ea c t i v i t yp r o d u c e db ym u c o r 础w a si n v e s t i g a t e d e x t r a c tc o n d i t i o no fp r o t e a s e a c t i v i t yw a sd i s c u s s e d p r o t e a s ec o u l db ee x t r a c t e dw e l lb y0 2 m o l lp h o s p h a t eb u f f e rw i t h i no n eh o u r t h eh i 曲e s tp r o t c a s ea c t i v i t yc o u l db eo b t a i n e di n9 6h o u r sg r o w t ho nb e a nc u r da t1 3 ( 2 4 t h ec o m p o n e n tc h a n g e si n c l u d i n gc r u d ep r o t e i n ，c r u d ef a t ，f r e ea m i n on i t r o g e n ，t h et o t a la c i da n d f r e ef a t t ya c i dd u r i n gs u f up r o d u c t i o nu n d e rt w os a l tc o n t e n tw e r ea n a l y z e d 5 tt h e - g l u c o s i d a s ea c t i v i t yw a s r e l a t i v e l yl o wi np e h t z e ，b u ti ts i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dd u r i n gs a l t i n g t h e1 3 - g l u c o s i d a s ec o u l dc o n v e i s o f l a v o n eg l u c o s i d e si n t oa g l y c o n e s 6 c o m p a r e dt os u f uf e r m e n t e db ya c t i n o m u c o re l e g a n s ，s u f uf e r m e n t e db ym u c o r f l a v u ss h o w e dt h e h i 曲wa n g i o t a n s i ni - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r ya c t i v i t y k e yw o r d s ：s u f u ，m u c o r f l a v u s , c h e m i c a lc o m p o s i t i o n + l o wt e m p e r a t u r e ，i s o f l a v o n e i l 独创性声明 本人声鞠所鬟交的论文是我个人在导帮指导下进行的研究工彳乍及敬得的礤究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获褥中国农业大学或其它教育机构的学位 或 委书_ 爵使翔过的拳考料。与我一潮工俸的弼恚对本硬究所骰的任何霓漱均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 好嘞 时闻：妒二年f 月f ? r 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文静复印髂和磁盘，允许论文被查阕秘氆阕，西以采耀影印、缩审或扫攒 等鬟翻手段傈存、汇编学使论文。两意中国农监大学可以用不靖方式在不围媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密嚣应遵守此协议) 研究生签名； 导师签名： 曙鸭 触x z 时间：纵，年月，日 露阉： 2 一f 军f 旁r 7 酲 露阉： 2 一军z 旁r 7 酲 1 1 研究背景 1 1 。1 研究丈曩发酵食晶麴意义 第一章绪论 大豆原产于我国，有着悠久的栽培历史和食用历史。几千年来，大豆作为我国人民的传统 食晶，在中华民族的繁衍生怠中超到极其重要的作用。现在火豆已经发展成为世界性的粮油作 秘，燕入类不可缺少静食物爨源p l 。 大豆及其耧晶跫商营养的植物蛙食品，含窍丰富孵饶鹱媸自蕊，是粮食俸镪中唯一接近全 份蛋是的优质蛋白震作物。大豆除提供优鹱麴植物爱白和油脂外，述窟含多种对人体鸯盏的生 物活性物质“。因此大豆及其制品受刘越来越多的荧注。根据大豆制鼹的生产方式，大厦可以 分为传统大豆制品和新型大煦制品两火类。新梨大豆制品包括火强油脂、人豆强自、豆奶粉和 生物活性物质等。传统大豆制品可分为非发酵( 如赢浆、豆腐、腐竹簿) 和发酵( 甄酱、腐乳、 纳豆、天培、米酱等) 制品两大类p 1 。大豆制品在发酵过程中，在微生物和酶的作用下，产生 诲多大豆本身不存在或蠢裔餐缀低的生理活性物质，提高了营养价值也赋予大豆发酵制品特 辣的感官和风妹。大豆发酵翱晶大多会有特殊的鲜香味，质构细腻。生豆中酶抗营养因子，如 大豆寡聚糖中不能被髯积鼹遒吸收魄格籽糖和_ 灰苏糖，经浸泡，船热和发酵纛也能够被努辩绒 破薜。大豆经发酵蕨，锌和铁的生物利蹦率以及维生索的舍簸都褥到提裹”i ：此外大豆巾蛇夫 分子有机物在发酵过程中分解重组，形成多肽、异黄酮及褐色色索等功能性成分，使其具有更 强的生理功能”j 。 大豆发酵食品起源于我阐，至今已有两千多年的历史，腐代大豆酿造技术传入朝鲜、日本， 渐及菲律宾、印度怒西溅等东南驻地蹶和阑家，并发展成为当地县有特色的传统食品。我国的 大豆发酵食品主要有酱池、寝乳、豆鼗和薤薮，产凝最多的怒酱油，其次是旖乳，年产量达3 0 万吨。目嚣，我国腐乳翡生产技术及生产设备经过不断更薪褪改造，露经基本步入了工韭他和 现代化的轨道。但是腐霉b 生产中也存在许多问题，如生产菌种相对单一、生产蕊端过长、生产 二艺复杂、传统腐乳盐量过高等。 1 , 1 。2 我国瘸巍的概况 腐乳她利用微生物发酵的方法改变植物蛋国风味的火豆制品，气味鲜荚、风味独特、震她 细腻、营养丰富，是我圜著名的传统酿造调味品之一腐乳古称乳腐，又称乳豆腐、霉豆腐、 酱豆腐、臭甄腐或跃毛豆腐，英文译名有s u f u ，t o s u f u ，f u r u ，f u y u 等；在日本，腐乳叫做t o f u y o ， n y u f u 或f u n y u ：在越南叫做c h a o ：在菲律宾称为t a - h u r i ，谯泰国称为t a o h u 。y i ! ”。 腐巍是我晷劳动入配的又一糟慧结晶。由甄府制成藕乳起源予一千五百年前的北魏末年， 当时吉书孛就毒记载“于豆腐鸯瑶懿成熟后为腐乳”。人类在还没有认识微生物的时候，就西经向 有害的微生物进行不凝瓣斗争，袋用旌渍等接旅，以杀薤或弹制有害镞生物的生存和生长，这 也正是豆腐乳闯世的文化背撮。曩腐巍的制造聚初可能只是聂腐盐藏的一种手段，因此早期的 腐乳都是麓蒯型豹，即砭腐晒干后奁接嗣盐腌制数霹，然箍洗去盐分，加辣椒等调味料两成。 之后人们在有意识谶抑伟4 有害微生物的同时，无意识地利p d t 有益的微生物，才出现了培菡型 腐乳，也就怒目前普及的腐乳产品，它在腌制之前有个培菌、发霉的阶段。在本草纲目拾 遗中又有“豆腐又名椒乳，以豆腐腌过酒糟或酱制者，味成甘心”。在明朝李日华的蓬拢夜 话和王士捞c 的食宪鸿秘甄书中都有关于腐乳的记载。自此，夜关腐乳的史料大见增加 例如瀵袁牧在随因食单中提到的有“广硬岛腐乳”；清汪豳桢湖雅中商：“腐乳：豆鹰 腌霉为腐乳坯。出黑镇畿肆，墩坯利成襄乳”之话。溥王士雄饮食谱中有：“腐于褥蔫避者 为腐乳，茨久愈佳，最宜瘸人”的文字等。两关于腐飘豹金掰和存参考意义的 曼载是清李石亭 的酝弱录，书中有“酱豆腐乳法”琵铡l ”l 。白明、清以赢腐乳的舷工进入了凝旺时期。箕 生产规模和生产技术承平均有了禳夫的发展。由予腐乳深受广天群众的喜爱，备地依自己不同 的口味发展形成了备具地方特色的传统名、特、优产品。 腐乳鼠起源于我国，却不仅限于我国。明朝时腐乳就已传入朝鲜，公元一千七百年间腐乳 的制作技术即随落真和尚为 渡流传至日本，之后绍必顶方红腐乳更魁远销印度、缬旬、泰国、 马来毪亚等地，极大地丰富了鹰乳的饮食文化，促进了腐乳在海内外的发展。然藤传统大豆发 酵食品的生产要实现现代他，必须进行缨致蛇科学硒究，注入现代食晶加工技术麴活力i 。 瓣 l 搬攘工艺类型腐乳可分为四羊申：霉藏纯种发酵型，天然堵蓠跫，细藏发酵整，腌铺型； 撮据叛色和气味，瓣乳可努为茳建乳、自腐巍、青藕乳及花色腐乳：还可搬据大小分为大腐乳 和小腐毳；稚据形状分为方瘸乳和圆腐乳嘏。 现在腐乳生产中使用最普遍的毛霉型纯种发酵，其制备过程是将大豆浸泡，经磨浆、滤浆、 煮浆、点脑、压榨、切块制成豆腐白坯，再经过接种、前期发酵、搓毛、盐腌成盐坯，此后， 将配制好的汤料与盐坯一同装入坛中密封。经自然域保漏发酵丽成 9 1 。 1 2 研究现状 近代对于我国腐乳的研究始于2 0 世纪= 十年代。在1 9 2 8 年，魏岩寿、祝汝佐首先对生产 腐乳所用毛霉菌进行了研究。其羼，凌世升对广东、甥江、江苏、福建、云南等省所产名特腐 乳，如红蛰璃乳、香糟腐乳、玫瑰红腐乳等产品进行了初步分析。1 9 4 2 年，我翻发酵业老藏辈 方心芳先坐对几种四川霉嫠进行了分离鉴定，扶腐乳坯上分离出酌毛霉镶共有豳个种，分剐憝 离太亳霉( m c o rm u c e d o ) 、总状毛霉( m u e o rr a c e m o s u s ) 、黄色毛霉( m u c o rt l a v u s ) 及个 新种五通桥毛霉( m u c o r w u t u n g k i a o ) 。国内现行的瘸乳生产工艺约建立于六十年代，得益于魏 出寿、方心芳等对腐乳生产微生物的研究结果；这是腐乳生产的一大进步，它以纯粹培养替代 自然培菌，使培菌时阐由7 天左右缩短到1 - 2 天，并使毛坯的质量有所保证和稳定。以后台湾 和受国的一批学者分别对几株毛霉的鬣自酶进行了研究，我国大陆也在八十年代初开始报道有 关腐乳生产菌选育、酿造过程生物化学变化及生产中一些坶题的研究续粱。这些研究t 佟对腐 乳生产中各个阶段的内部反应和外观变化作出秘步瓣解释，逐步形成了一个耀对稳定麓生产理 论体系，整个腐乳行业得到了较大发展，尤其在螽湾、f 。东等气候适寅、经济较发这魁隧【毪t ”。 2 1 2 。1 鹰裁憋微生物研究进袋 赵玉莲、郑学翔”4 等对腐乳生产用的菡种进行了研究，也从各地的腐乳中分离出了一些微 警物( 不包括生产用菌) ，现将常翔豹搿乳中分离到的微生杨列予表l 一1 ，将腐乳生产搿菌列于 袭1 - 2 。 彀卜 窿乳串分裹到的挂生糖 紫红曲霉舰群甜p 皿辨腓黼) 姜l 桶孔墨广j 承 黄色蓖霉( i u c o rf l a v u s ) 耀川 溶胶根霉( r h i z o p u sl l g “s f a c i e n s ) 江苏 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a a ) 江苏、鲫川 青霉( p a n i c i l l i u # s p p , ) 江苏 酵母蘸( s a c c h a r e r 口y c e s ) 江嚣 芽袍枰菌( b a c i l l u s s p p ) 删川、黑心江 枝孢霉( c a d o s p o r i u t as p p ) 链球蓊( 肼。r o o 嚣c 淞s p y ) ) 棒状转墓( c o r y n e b a c t e r f “m 睇) 藤黄小球菌( j y c r o c o c c u sl u t e u s ) 芽枝霉( d a 出印 f s p p ) 致穗鼍毒碡t s c h i z o s 8 c c h r 锄9 c e ss p p 、 华报霉( r b i z a p 口sc 女i n e n s i s ) 普雷恩毛撵( e a c o rp r a i n i i ) 江苏 江苏 辽苏 黑龙江 湖北 湖北 台湾 台湾 粘质沙雷氏菌( s e z a t i am ”f ”s ) 浙江 五通桥毛霉( a f u c o rw u t a a g k l a o ) 腐乳毛霉( g ”c o rs u f u ) 想状罨霉( 瓶r a c e 口o s u s ) 矬致放射毛霉( 加 姗* f 船 e l e g 黝s ) 根霉( r h i z o p u s ) 四川、蠢通轿 浙江、绍兴、江苏、荞州 台南 北京 南京 王润芝、王庆周l l ”对克永腐乳翦期发酵的微生物分离鉴定，筛选并证明了克系腐乳主要微 生物娄群为细菌；方霭祺、陈有为i l ”对云南著名调昧品路南腐乳产生菌高大毛霉( t t t h # o r m u c e d o ) 进行分离筛选藏鉴定，并进行了人工纯培养，在培养温度2 0 - 2 5 及相对湿度7 0 8 5 桷条件下，缩短了黎薛周期 鲍桧林“1 在浙江家制毛匾腐上分离到一栋腐乳生产菌，初步鉴 定为毒氏袭霉( m u c o r p r a i n i i ) ，捧褥瞧结论：滚度和相对湿凌对布氏毛霉在腐乳自坯上的生长 条件及产酶特镊影噙显蓉；赵玉莲等l l 啦敞鼍霉m u c o r z 31 8 出发，采捌诱交育种获穆了交异菌株 m 。7 - 3 2 8 ，确定了该藏株的适宜培券条俘，劳发现毛霉菌丝能渗透剿豆坯的最深疾；邓芳寐、刘 索纯口以毛霉稿m u c o r m 2 为出发菌株，经紫外线”c o 一射线复台诱变，获褥一高产蛋自酶突 变株凳霉m 2 6 3 该菌株生长速度快，蓖丝旺盛，且沾白致密；胡巅，赵学慧i z i j 发现在3 5 条 中营表业大学硕士学位论文 第一章绪论 目_ i i i i i i i i ii i i i l l i i l 健下，耐热性毛撵h 4 菠株在豆腐坯上生长、发酵是好；陈娇娣、陈绪娥1 2 2 收集了1 1 号诸种进 幸亍筛选，冀串有4 弩毛霉菌能在3 5 4 0 c 下生长。在这4 号蒲株中m 9 号曾在广东的夏天进行过 生产实验，3 8 ( 21 z 生长正常，腐乳质鬣优良，该菌种可全年使用。h a n 日3 】比较了在制备毛坯时， 温度和相对温度对雅致放射亳霉和少孢摄霉生长秘产酶蛉影响，两个蘸挣的媛遗生长条锌分别 为2 s 、9 5 9 7 掰1 13 5 c 、9 5 - 9 7 ，并褥到“少孢撤霉可代替雅致放射毛霉作为夏天生产腐乳的 耐热菌种”的结论。 近些年对庭乳生产菌所产蛋白酶，也有较多的报道。这些研究为菌秘的下业应用奠定了良 好戆瑾论支持。陈躬瑞口”等对毛霉红瘸乳蛋自蕊进行研究，遗过电泳、色谱、氨基酸组成分析 等，说明了腐乳蛋由质被降解的程度。李理口q 报道毛霉蛋白酶在腐乳成熟中的作用，其有较强 的肽酶活性，能以大豆蛋白或多肽为底物酶促降解生成大鹫的水溶性肽，为蛭期嗜盐蕴的生长 提供了可供利用的遮效氮素营养，还具套消除苦味、形成鲜味物质豹作用，；瘸乳风妹形成有 美。鲁绻口5 借助超声波、电泳和高驻液裾色谱对雅致放射毛礞胞外和胞内蛋白酶进行了研究。 证明在前期培菡阶段，雅致放射毛穰同时分泌胞外及胞内蛋白酶，且酶活力变化趋势基本相嗣。 1 2 2 腐乳生产过程中的化学变化 刘伯文予1 9 3 2 年摄晕摄道嶷乳酿造过程中的化学交纯，葵后该方爵的完整文献极少觅，因 此箕数据在狠长段时间被j 。泛应闫。直到八十年代，芙于化学变化的报道逐渐增多。h a n l 2 7 】 研究了腐乳生产番阶段总鲺基酸和游离氮基黢的变化，证明自坯、毫坯和盐坯中总蟹纂酸含蜃 育艇不同；经雅致放射毛霉发酵后，蓖坯和盐坯中游离氨基酸含量商予自坯。鲁绯1 2 s i 对王致和 腐乳厂生产腐乳在霸酵过程中的粘度、主要作用酶活力、酸度、氯基酸态氯和总酯的含量进行 了研究，发现腐乳质构的变化主要发生在后酵4 0 天内；坯体触汤料酸度逐灏增加，发酵5 0 天 后t 酸度趋于一致；游离氨基酸的含擞随着发酵时闽蛇延长嚣增热，与酸艘的增加相对应。余 差黔例镣对广东j 。台腐乳有限公司所生产腐乳生产捕期发酵的化学变化进行了报道，实验表 明，腐乳后薛过程中可溶性蛋白质及氨基酸含鬣的变化较直观地反映了腐乳的成熟憧况。当可 溶性缳自质含量选到1 8 - 2 0 ( 干基) ，镰基酸态氮含量达碧归o s 时建乳已基本残熬。对后酵 期阅的瘸乳进行蟹自质凝胶电泳，发现5 周盾哥溶性蛋自以低分子多肢为主。沈子林”| 介绍了 绍兴腐乳发酵过程中主要成分变化。h a n p l l 研究了历期发酵过程中食盐对腐乳质地变化的影响 和对蛋白质和脂肪水解的影响。s d s - p a g e 证明，在质期发酵6 0 炎最，低盐( 8 和1 i n a c i ) 鹰乳中的蛋自质全部被分瓣，而瘫盐( 1 4 n a c ! ) 腐乳中餐有蛋白痿存在。游离脂肪酸在后期 发酵中不断增拥，在低盐腐乳后酵前期( 3 0 - 4 0 天) ，游离脂肪酸增长迅速，而随后增长速度减 慢。对腐乳后酵过程中蛋白质、脂肪降解的影响，结果表明蛋白质在后酵兹四周就已经完全降 解。c h o u p 2 j 聚姆雅致放射毛霉和台湾分离到的一转毛霉利成腐乳，研究己薛对腐乳螽醇过程中 蛋白囊、艚肪隶解的影蝻，发现酵的加入能够撺制蛋自质的降解，脂肪含鬣却呈现了不同的状 态。菌种酊选用和是否添加乙醇对成熟腐乳的脂肪酸组成都不会产生影响。游离月肪酸含量嚣 高尤其是亚油酸。 4 中国农业又学硕士学位论文第一章缝论 | 1 i i i l l l ii i i i i i i 1 2 。3 瘸乳螅旗能牲静 究 1 2 ，3 1 瘸乳懿营养戒份 腐乳是中匿传统的大露发酵制晶，至今仍燕重耍的家庭後餐品和调味品。它具有较高的营 养晶痿黔”l ，腐乳酌主要稽养成份觅表t - 3 。大豆锎成腐乳衙，保留了大甄中的营养成分，大 豆中对人体不利的溶血索和胰蛋由酶抑翻物也得到击除，发酵后水溶性强自质及甄基酸增多且 酗香浓郁、滋味鲜黄，增食欲助消化，营养成分更易为人体吸收。大厦在制作驻腐乳的过程中， 蛋白质变性凝聚而成豆腐，此时豆腐中水溶性蛋白禽鬃为3 6 1 ，碱溶性蛋白禽量力9 1 2 5 。 经过培菌阶段，毛攥或根霉繁殖产生墨馥酶，耍腐中的蛋自质开始被水解为水涛性蛋白，培耱 结藤厢垤中水溶性缓怠矮增至5 5 5 4 ，碱溶性爱囱质则下降到2 9 3 0 ，说明瘸乳比豆瘸容易 漶此。 在发酵避程中，聪肪酶将稻辫水解溅甘油和脂肪酸，甘油进一步转化为有机酸，这些有机 酸与配料中的酒精成分合成各种酯类，构成腐乳诱入食欲的特殊番气。发酵中骚向酶水解蛋白 质为氨基酸，其中备氨酸和天门冬氨酸赋予腐乳以鲜味。此外微生物菌体自溶后降解生成核萤 酸，又增加了腐乳的鲜味。腐乳不但是膳食中很好的蛋白质来源，也是其他营养素的很好来源。 寰卜3 腐乳的生冀营弊戚船( 以1 0 0 克囊 蛘腐霉l 计) t a b l e l - 3p r o x i m a t ec o m p o s i t i o na n dc o n t e n to f c o m m e r c i a ls u f u ( p e rl a o gs u f uf r e s hw e i g h t ) 成镑禽簧 水分( g ) 蛋岛质( g ) 脂肪( g ) 粗纤维( g ) 碳水化金物( g ) 灰份( g ) 钙( r a g ) 磷( r a g ) 铁( r a g ) v b i ( r a g ) v b 2 ( m g ) 烟酸( f n g ) v b n ( 雌， 能量( 搿) 1 2 。3 2 降斑压功齄 天体内的血管紧张索l 在斑管紧张素转纯酶( a c e ) 的作用下生成m 管紧张索i i ，血管紧 张索i 是融知的最高内源升压腻，它会健进血压升高。a c e 抑制剂能阻止舡管紧张繁的生成， 因此，可以作为降血压的药物。 倪莉娜等测定腐乳中多肽与胴酸的结合堂及其m 管紧张素转换酶( a c e ) 抑制活性，结粱 寝明腐乳中的窘氨物质主疆是分子质量 蕊落体形态疆察 将分离出的毛霉以三三点式接种于p d a 培养基和c a 培养基，在1 3 。c , n2 5 。c 瀛度下培养， 观察菌落形态。具体步骤为：在倒好的培养基平皿中，用接种针从斜面挑取少许孢子在培弗皿 中按三角形顶点位鬣三点式接种。三种培养基分别在弼个温度f 培养7 天左右，对形成的菌落 进行特征观察并记录。 2 ) 菌丝形态联察9 ” 采用裁片培养戏察法： 冕萤培养题的准备：先在培葵盟底部铺一张壹径略小予培葬噩的圆形滤纸，在滤纸上艘一 块载玻片，盖上皿盏屣按常规包扎灭菌。 将无菌p d a 培养基冷却至5 0 c 左右加入待观察的霉菌孢予，搦匀后迅速用无菌滴管吸取 滴獭子璩脂混合液，滴加在温室内载玻片中央。 将镊子在火焰上灼烧灭蔼后取原放在皿内的盏玻片盏在培养皿上，用镊子轻压。 在滤纸上加注2 m l 2 0 的无藩甘油，l 奠保证瀣室内的适宜湿度。 盏上培养藏盖，于2 0 恒溢培养箱中观察3 - 5 天。 将培养好的载璇片墩出，将背瑶擦干，予显微镜下弱察。 2 。3 实验缩果与讨论 2 3 。1 低瀛发戆瘸乳生产蘧的微生稳分枣 生产菌样品中细菌、芽胞菌、酵母和霉菌的数最见图2 - 1 。 9 8 7 蜘8 芝5 兰4 3 2 1 0 l 缓 ，扇搦 霉菌 酵母菌细菌芽孢落 陶2 - 1 生产蕾中的徽生物分布 f i g u r e 2 * 1v a r i e t i e sa n dp o p u l a t i o no fm i c r o b e 作为低温腐乳生产的起始菌丝，霉菌和细菌是主要的微生物苗群，分别达到了7 8 1 0 7 c f u g 聊5 9 6 1 0 3 c f u g t 芽胞菌豹数量为9 7 2 x 1 0 2 c f u g ，酵母菌数量较少。腐乳发酵在相对开放的 中国农业大学硕士学位论文 第二章低温发酵腐乳生产菌的微生物鉴定 空间进行，参与发酵的微生物较为复杂。细菌中鬣白酶和淀粉酶等产量较高的多为芽胞菌，菌 丝体中细蘸数爨虽离，但芽孢菠数量较低，所以主要信用菌应为霉馥。 我国各她生产瘸乳在藏麓发酵的过程孛使用不同的主要莹辩，餐主要还是毛霉蕊糠( 个别 地方使用根霉或细菡) 。如四川赢通桥毛霉，从绍兴及苏州等地分离得到的腐乳毛霉、鲁氏毛霉， 从北京腐乳及台湾腐乳中分离得到的雅致放射毛霉，从宜兴选育的新奔3 号根霉，江苏的溶胶 根霉及酵母荣株，从黑龙江克东腐乳中分离到的藤黄微球菌等。现又从黑龙江北部地区发酵菌 丝体中分离到一撩嗜低温毛霉。 2 3 2 霉箧构鉴定 通过p d a ，c a 两种培养纂，在1 3 和2 5 分离纯化，筛选出一株毛霉。其中，该毛霉在 c a 培葬基上生长迟缓，在p d a 培养萋上可以正常生长。1 3 o p d a 培养基中，3 6 小时可见生 长，萤丝法自，随后静2 4 小时内，雍满整个培养瓶，菌丝徽黄，生长瘫好。2 5 + 0 时1 2 小时可 见菌丝生长，3 6 小时菌丝长约0 5 一l c m ，褐黄匍钢，严重老化。没有使用价值。由此可见菌丝 体样品只有这一种低温型的毛霉。 对此菌种的菌落形态、蘸熊形态和产孢结构见图2 - 2 、2 - 3 。 圈2 吨葚种在p 馘上的菌落形态 f i g u r e 2 - 2m y c e l i a lc o n f i g u r a t i o no f s t r a i no np d a 掘2 峙蔫种黥声孢嚣梅 f i g u r e 2 - 3h y p h a ! c o n f i g u r a t i o no f s t r a i n 撼述及鉴定结粜叙述如下： 霉萤在察氏凉培葬鏊分别予 3 和2 5 下培养5 天，菌丝稀疏不能很好的生跃。 霉菌在p d a 培养鏊1 30 c 和2 5 r 培养三天，菌落赢径约3 0 r a m ，菌丝浩白，菌落中间的 菌丝直立，高约1 c m ，周围的菌丝匍匐在培养基上，向四周扩散。培养五天，莹丝黄褐色，穗 满整的培养皿。壤葬至2 0 天左出，滋出黄色滚体。显徽镜观察，孢子堆孛 状( 长宽比为2 ：i ) ， 长约5 - 1 2 9 i n ，生长过程中，气生糖丝翅长，尖端膨大，犹麴一个个小蝌蚪。头部一 l 生有一隔膜， 将头部和长丝分开。萤丝无假报，孢囊梗不成策，疆生孢予囊；孢予囊大，球形，壁薄而平滑， 禽孢子数摄比较多。 生梃温度较低，2 5 不适宜生长。 鍪定结果：该腐乳生产主要用菌经箍定为琵霉科( m u c o r a c e a e ) 。毛罪属( m u c o r ) ，黄色 毛簿( m u c o r 。lavus) 2 4 本章小缩 本牵对黑就江北部县某腐乳厂生产j = f = i 菌的微生物分椎进行分析，并对其中的一据毛霉分离 纯化，在不同培养基，不尉温度f 培养，观察菌落形态及蓥丝形态，弗戏察秘测甓冀孢子影态 及尺寸，进行了鉴定。本章结论如f ； 1 、发酵菌丝主要微生物为霉莹帮继蕾，酵母菡数鬣较少，藕乳生产是一自然发酵过程。 2 、芽鼹菌数量也较少，低温f 芽脆落作粥靛力有一定抑锏，发醇过程i 上霉菌为主。 3 、在不同培养基，不同温度下培养纯化，其霉菌是种嗜低温的毛霉。 4 、对菌落及产孢情况的观察，鉴定其为毛霉科( m u c o r a c e a e ) ，毛霉属( m u c o r ) ，黄色毛霉( m u c o r f l a v u s ) 。 3 第三章黄色鼍霉在豆腐白坯上的生长及蛋白酶特性 3 。1 弓l 誊 毛霉戮腐乳蓠期发酵就是在白坯上培养毛霉，使甄腐坯上长满萄丝，形成具有细致而坚韧 的皮膜。前期发酵好白坯表面荫丝丛生，覆盖严密，不但可使腐乳块形完熬，并能分泌大量 的蛋白酶，在蕨期发酵中，可把鬣自旗逐渐转变成氮基酸，最终使成品昧遵鲜美，组织细腻。 如霉菠生长不好，酶豹作硐力不强，生产麴产品色泽差，容爨破碎，甚至污染杂藏，使豆瘸乳 发臭变质。所以前期发酵目的归纳起来有两点；一是使豆腐坯生长层软韧坚厚的菌膜于袭面， 紧密绝包着豆搿坯，二是培养毛霉分泌和积檠大臻的蚤白酶娃便矮自旗水解为各种氨基酸p “ 删。 蛋白酶活力的高低及其酶学特性廒接影响到后期熟成的进程和效果，因此有必要将蛋白酶 作为前期培菌的主要参数遥行检测。本试验对未经纯化精制的酶液进彳j ：性质铡试，燕点不是纯 酶学性质，焉蹩与腐巍切实相关瓣蛋囟酶酶系性矮，强的在于对腐巍生产进抒科学截辑劳对箕 工艺改进提供理论依据。 利用分离纯化出的黄色毛鬻，通过液体培养绘制生长曲线，并观察不同温度和不同湿度下 毛霉在自坯上黯生长状况，确定其适宜生妖豹温度和漫度范潮，释对黄色毛襟在自坯上f l 孽产蛋 白酶能力以及鬣自酶的提取条l 牛进行了测定。 3 。2 材糕与方法 3 2 1 材料及试剂 表3 - 1 材料及试剂 t a b l e 3 - 1m a t e r i a l sa n dr e a g e n t s 材料及试剂名称生产厂家 黄色毛霉 大豆( 科丰六号) 酪蛋斑、熬瓴酸、f o | i a 酚 其他试剂为分析纯 实验室分离纯化 澜托省海燕县种子公司 北束普博歇生物辩技公司 j b 京化学试剂公司 3 2 2 仪器和设备 1 4 寰3 _ 2 主嬖的搜爨设备 t a b l e 3 - 2i n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t s 3 2 3 实验方法 3 2 ，3 1 孢予悬浮液静制备 麸皮培养基；取麸皮1 瞻，蒸馏水t 4 9 ，搅拌均匀，置予三悫勰中密封。培养基均在1 2 下炎越2 e 分钟后备用。 嗣接种针在勰面上挑少许孢予接种于灭菌后的麸皮墙莽基，生眭嚣天翳选择菠丝生长最好 的一瓶，要求蔼种纯，蔼丝气壮浓密，无杂菌感染，瓶底无花纹斑点。选好后瓶内倒入无菌水， 搅碎菌丝体，以无菌滤布过滤后，菠波倒入装有六颗玻璃珠的无菡三角糕中。培养基再洗涤 次，收集在令瓶中。震荡播匀，使孢予成悬浮混合状态。 3 2 3 2 獭予悬浮液的孢予浓度的测定棒1 1 孢予悬浮液中孢予含蘩的测定通过盘球计数板法：将血球计数板及兼玻片擦拭干净，并将 盏玻片盏在计数板上。用无麓滴瞥吸取孢子悬液，在盖玻片边缘淡一小漓，让其渗入计数室内。 静置3 分钟，置于4 0 倍是微镜”f 观察，数如盘球计数板五个中格( 左上、右上、左下、右下、 中间) 中舶孢子总数。 计算公式：孢予浓度( 个矗n l ) = ( 5 个中格总包子数5 ) x 2 5 x 1 0 4 本试验孢子怒浮液均稀释到l 旷个孢子m l 。 3 , 2 3 + 3 蓠熊：f 重测定方法【6 7 j 大矗汁培养纂；取大豆2 0 0 9 ，加水1 5 0 0 r a l ，煮汁浓缩至约1 0 0 0 m l ，过滤渡称鬟著添加 o , 0 5 m g s 0 4 to 1 k h 2 p 0 4 to 0 5 ( n h 4 h s 0 4 ，o 2 5 可溶性淀粉，调节p i 为5 5 65 置于 三角瓶中密封。在1 2 1 下灭菌2 0 分钟后备用。 在2 5 0 m l 的三角瓶中加入5 0 m l 的豆汁培养基，灭菌冷凉至室溢麝。相入o 5 m l 孢予菌怎 液，分别在i o c ，1 5 。c ，2 e 恒湓培养箱中1 5 0 r p m 震荡培养。从4 8 小时开始，每1 2 小时取 样一次。用l o o 目纱布将培养基过滤，滤去要汁，燕丝用蒸馏水洗涤蘸遍，8 0 烘箱干燥至恒 重，冷却蠢称重。每个温度做两个平行缎，取平均整并计算偏差a 3 2 3 4 自连的翻各 称取挑选后的大豆8 0 0 9 ，清洗三遍。加入2 0 0 0 9 蒸馏水室温下浸泡至豆粒饱满，除去没有 被完全吸收的水分。8 倍予大豆重量的水磨浆厥，崩通电加热设备加热至9 5 。c ，保持嚣分钟e 称敷5 0 0 0 9 熟豆浆冷却至8 0 ，并在8 0 c 承浴锚保温1 0 势钟罱t 搅拌中加入9 8 m l l m o i l 的 氯化镁溶液，静麓蹲脑2 0 分钟，月： t 0 x t x 7 c m ( l x w x h ) 的塑料敞i s i 容器作为成型盒，先 强3 8 9 c m 2 压力下自n 压1 0 分钟，质在7 6 9 地m 2 压力下加压4 0 分钟，降温熙切块使之成为3 x 3 l c m 豹爨坯。 3 2 3 5 毛坯的镧备 前期培菌结束，白坯表面长满菌丝体，此时的豆腐坯叫做毛坯。将8 0 r o l l 07 个孢子m l 的 蘸悬渡接种至白坯上，于不蹋溢度不同湿度条件f ，观察黄色毛霉的生长情况。 3 2 。3 。6 不穗箍理粗簿液的刷备 提取液不同租酶液的制备：称取5 9 腐乳坯体，研碎后分别用2 5 m l 蒸馏水、0 , 3 m o l l 的氯 化钠溶液和o 2 m o l t lp h 6 ，8 的磷酸缓冲液室温提取l 小时，过滤特测。 提取时闻不阏糨酶液翘制备：称敬耗腐l 坯体，研碎后阁2 5 m l 0 2 m o l lp h 6 8 的磷酸缓 冲液室温下分别提取3 0 ，6 0 ，9 0 ，1 2 0 分钟，过滤待镬4 。 不同p h 磷酸缓冲液粮酶液的制簧：称取翘腐乳坯体，研碎厩，分别用2 5 m l 0 ，2 m o l m p h 4 ， 口h 6 ，8 ，p h 9 舱磷酸缓冲滚室温f 分别提取6 0 分钟，过滤待测。 缓冲液的配制：分别配制0 2 m o l l 的磷酸= 氯钠和磷酸氢二钠溶液，在酸度计下配比达到 所需p h 值。 3 2 3 。7 蛋白酶活力测定州1 强翻酶活力的溯定采用f o l i n 酚法：取l m l 粗酶液于4 0 水浴傈温3 分钟，加入l m l2 韵酪蛋囱，震荡后恒温反应2 0 分钟( 以秒计) ，加入2 r o l l 0 的三氧乙酸溶液以终j e 反应。继 续保温l o 分钟，来反应究的酪蛋臼被三氯己酸沉淀，离心后取上漕渡o 5 m l ，加入o 4 m o l l 的碳酸钠溶液2 5 m l ，l m o l l 的福棒试裁0 s m l 。保湓2 0 分钟后溺定o d 6 。在酪蛋白之前先 加三氯己酸溶液，其他操作相同作空白。4 0 c 下每分钟水解酪氍臼产生l 烬酪氨酸，定义为一 个蛋白酶活力单位( u ) 。每组为三个平行样，测最后取平均值。 3 。3 结果与讨论 3 3 。1 瀑度对豆汁液体墙养蓠丝予蓬的影响 在溢度对菌缝干重影响的实验中，测定了黄色毛霉在1 0 。c ，1 5 和2 0 三个湿度下的生长 情况见圈3 - l 。在第一章的分离纯化过程中，已观察出2 5 不适合黄色毛攥的生长，所以设置 l o ，1 5 帮2 。三个温度。液体培养中菌丝千羲的称量，能较好的反映出菌株的生长情况， 影晌菌株生长餐的园素根多，本试验避为了主要考察温度的影响，其它因素保撼致。 6 率星农业大学磁士举位论文第三章黄色毛霉在自坯上的童长及产酶特性 l j i i - i i ii l l li 目自 l 2 霉 t 翟o 8 嚣帅 o 4 o 2 0 。”一一1 一一一 4 86 07 28 49 61 0 8 1 2 0 1 3 2 1 4 4 1 5 6 笈酵时间( 小时) 豳扣l 萃辩基寝下黄色羲霉涟体培弊弱营簇早重 f i g u r e 3 - | c h a n g ei nm y e e t i n mw e i g h ta td i f f e r e n ti n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e s 在三个不同的溢度下液体培养4 8 小时，1 5 和2 0 c 起始的菌丝曩均为0 4 1 9 5 0 m l ，比l o 的菌体量离出了近一倍，黄色毛霉在较赢湿度f 能够缀快的生长，停滞期较短。隧蒋发酵时 闻的延长，2 0 cf 萤丝量缓慢生长至7 2 小黠后，几乎没有了任何增长，生长情况较差，菌丝鼙 保持在o 5 5 0 m l ，1 5 荫丝量总体还是上升的趋辨，生长1 5 6 小时，生长趋势还是良好。丽 在1 0 下，虽然起始菌体犍较少，生长增长率也不寒，在7 2 小时后快速增长，至9 6 小时菌丝 量已达到o 7 0 9 5 0 m l ，达到霹期1 5 舱蘑丝量