（食品科学专业论文）香菇多糖提取和β葡萄糖苷酶应用研究.pdf

目录 目录 中文摘要i 英文摘要。i i i 1 弓i 言l 1 1 立题背景1 1 2p 葡萄糖苷酶的研究进展1 1 2 1p 葡萄糖苷酶的理化性质1 1 2 2d 葡萄糖苷酶的催化反应机制2 1 2 3b 葡萄糖苷酶活性的测定方法3 1 2 4b 葡萄糖苷酶的应用3 1 3 香菇多糖的研究进展5 1 3 1 香菇多糖理化性质6 1 3 2 香菇多糖应用的研究。7 1 3 3 香菇多糖的临床应用研究。8 1 4 国内外香菇多糖提取方法的研究l o 1 4 1 水浸提法10 1 4 2 酸浸提法1 1 1 4 3 碱浸提法l l 1 4 4 酶提取法1 1 1 4 5 超声辅助提取法1 2 1 4 6 微波辅助提取法1 2 1 4 7 亚临界水提取法1 3 1 5 多糖的定量方法1 3 1 6 香菇多糖中除蛋白的方法比较及蛋白测定1 3 1 6 1s e v a g 法除蛋白一1 3 1 6 2 三氟三氯乙烷法1 4 1 6 3 三氯乙酸法：1 4 1 6 4 酶法脱蛋白14 1 6 5 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1 4 1 7 立题意义15 1 8 本论文主要的研究内容15 2 材料与方法15 2 1 试验材料。1 6 2 1 1 试验原料16 2 1 2 试验试剂1 6 2 1 3 试验仪器1 6 2 2 试验方法17 东北农业大学t 学硕士学位论文 2 2 1 原料分析l7 2 2 2 香菇精深加工工艺路线2l 2 2 3 香菇活性物质的提取2 1 2 2 4 香菇多糖的提取方法和纯化的研究2 1 2 2 5 香菇b 葡萄糖苷酶的应用研究2 5 2 2 6 香菇多糖的抗氧化活性研究2 6 3 结果与分析2 8 3 1 原料成分结果2 8 3 2 香菇多糖的测定方法研究。2 8 3 2 1 还原糖含量测定的标准曲线2 8 3 2 2 总糖测定方法的研究2 9 3 3 其他成分的测定方法3 2 3 3 1 蛋白质含量的快速测定方法3 2 3 3 2 高效液相色谱法测定大豆异黄酮标准曲线3 2 3 4 热水浸提法提取香菇多糖条件的确定3 3 3 4 1 提取时间对香菇多糖得率的影响3 3 3 4 2 液固比对香菇多糖得率的影响3 3 3 4 3 提取温度对香菇多糖得率的影响3 4 3 4 4 提取次数对香菇多糖得率的影响3 5 3 4 5 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定3 5 3 5 超声辅助法提取提取香菇多糖条件的确定3 6 3 5 1 提取时间对香菇多糖得率的影响3 6 3 5 2 液固比对香菇多糖得率的影响3 7 3 5 3 提取温度对香菇多糖得率的影响3 8 3 5 4 超声功率对香菇得率的影响3 8 3 5 5 提取次数对香菇多糖得率的影响3 9 3 5 6 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定3 9 3 6 微波辅助法提取香菇多糖条件的确定4 0 3 6 1 提取时间对香菇多糖得率的影响4 0 3 6 2 液固比对香菇多糖得率的影响4 1 3 6 3 提取温度对香菇多糖得率的影响4 l 3 6 4 微波功率对香菇多糖得率的影响4 2 3 6 5 提取次数对香菇多糖得率的影响4 2 3 6 6 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定4 3 3 7 亚临界水法提取香菇多糖条件的选择4 4 3 7 1 提取时间对香菇多糖得率的影响4 4 3 7 2 液固比对香菇多糖得率的影响4 5 3 7 3 亚临界水提取温度对香菇多糖得率的影响4 5 目录 3 7 4 提取次数对香菇多糖得率的影响4 6 3 7 5 正交试验结果分析及最佳提取条件的确定4 6 3 8 四种方法提取香菇多糖的比较4 7 3 9 香菇多糖醇沉条件的选择。4 8 3 1 0s e v a g 法对香菇多糖除蛋白条件的研究4 9 3 1 0 1 振荡时间对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响4 9 3 1 0 2 静置时间对香菇多糖提取液除蛋白的影响4 9 3 1 0 3 样液与s e v a g 试剂体积比对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响5 0 3 1 0 4 氯仿与正丁醇体积比对香菇多糖提取液蛋白脱除率的影响5 l 3 1 0 5 蛋白质脱除最佳条件的确定5 1 3 1 0 6 香菇多糖s e v a g 法除蛋白后的纯度测定。5 3 3 1 1 香菇b 葡萄糖苷酶液的应用研究5 3 3 1 1 1 香菇p 葡萄糖苷酶液水解豆渣的研究结果一5 3 3 1 1 2 香菇b 葡萄糖苷酶液水解大豆异黄酮的研究结果5 4 3 1 2 香菇多糖的抗氧化活性研究。5 4 3 1 2 1 香菇多糖还原能力的测定5 4 3 1 2 2 香菇多糖清除d p p h 自由基的测定5 5 3 1 2 3 香菇多糖清除羟基自由基( o h ) 的测定5 5 4 结论5 7 4 1 创新点。5 7 4 2 结论5 7 刭i 谢5 9 参考文献6 0 攻读硕士学位期间发表的学术论文6 5 c o n t e n t s c o n t e n t s c h i n e s ea b s t r a c t i e n g l i s ha b s t r a c t i i i 1p r e f a c e 1 1 1b a c k g r o u n d 1 1 2t h er e s e a r c hp r o g r e s so f t h e 3 - g l u c o s i d a s e 1 1 2 1t h e p h y s i c o - c h m i c a lp r o p e r t yo f p g l u c o s i d a s e 1 1 2 2t h em e c h a n i s m so f e n z y m e - c a t a l y z e dr e a c t i o n so 毋一g l u c o s i d a s e 2 1 2 3t h em e t h o d so f d e t e r m i n a t i o no f e n z y m ea c t i v i t yo 币一g l u c o s i d a s e 。3 1 2 4t h ea p p l i c a t i o no f p - g l u c o s i d a s e 3 1 3t h er e s e a r c hp r o g r e s so f l e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 5 1 3 1t h ep h y s i c o c h m i c a lp r o p e r t yo fl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 6 1 3 2t h ea p p l i c a t i o no f l e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 7 1 3 3t h ec l i n i c a lr e s e a r c ho f l e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 8 1 4t h ee x t r a c t i o nm e t h o d so f l e n t i n a np o l y s a c c h a r i d eo f d o m e s t i ca n do v e r s e a s 1 0 1 4 1w a t e re x t r a c tm e t h o d 1 0 1 4 2a c i de x t r a c t i o n 1 1 1 4 。3a l k a l i n ee x t r a c t i o n 11 1 4 4e n z y m ee x t r a c t i o n 11 1 4 5u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n 1 2 1 4 6m i c r o w a v ee x t r a c t i o n 1 2 1 4 7s u b c r i t i c a lw a t e re x t r a c t i o n 1 3 1 5t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i sm e t h o d so f p o l y s a c c h a r i d e 1 3 1 6r e m o v i n gf r o ml e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ea n dd e t e r t i m i n a t i o no f p r o t e i n 1 3 1 6 1s e v a gm e t h o d sr e m o v i n gp r o t e i n 1 3 1 6 2t r i f l u o r o t r i c h l o r o e t h a n e 1 4 1 6 3t f i c h l o r o a c e t i ca c i d 1 4 1 6 4e n z y m a t i cr e m o v a lo f p r o t e i n 1 4 1 6 5c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nc o n t e n t 1 4 1 7s i g n i f i c a n c e 15 1 8t h em a i nr e s e a r c hc o n t e n t s 15 2m a t e r i j l i sa n dm e t h o d s l5 2 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 16 2 1 1e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l s 16 2 1 2e x p e r i m e n t a ln e a g e n t s 1 6 2 1 3a p p a r a t u s 1 6 v 东北农业大学硕上学位论文 i ii l l 2 2t b s tm e t h o d s 1 7 2 2 1a n a l y s i so f m a t e r i a l 1 7 2 2 2t h er o u t eo f f i n ea n dd e e pp r o c e s s i n go f l e n t i n a n 。2 1 2 2 3e x t r a c t i o no f a c t i v es u b s t a n c ef r o ml e n t i n a n 2 1 2 2 4s t u d yo ne x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fi e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 21 2 2 5t h ea p p l i c a t i o no fl e n t i n a n1 3 - g l u c o s i d a s e 2 5 2 2 6s t u d yo nh ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 2 6 3r e s u l t sa n dd i s c u s s i o n 2 8 3 ia n a l y s i so f m a t e r i a l 2 8 3 2s t u d yo nt h ed e t e r m i n a t i o no f l e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 2 8 3 2 1d e t e r m i n a t i o no f r e d u c i n gs u g a rc o n t e n to f t h es t a n d a r dc u r v e 一2 8 3 2 2d e t e r m i n a t i o no f t o t a ls u g a r 2 9 3 3t h ed e t e r m i n a t i o no f o t h e rc o m p o s i t i o n 。3 2 3 3 1r a p i dd e t e r m i n a t i o no f p r o t e i nc o n t e n t 3 2 3 3 2d e t e r m i n a t i o no f s t a n d a r dc u r v eo f s o y b e a ni s o f l a v o n e sb yh p l c 3 2 3 4t h ec o n d i t i o n so f e x t r a c t i o nb yh o tw a t e re x t r a c t i o n 3 3 3 4 1t h ee f f e c to f t i m eo nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 3 3 3 4 2t h ee f f e c to fr a t i oo fl i q u i d o no n l e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。3 3 3 a 3t h ee f f e c to f t e m p e r a t u r eo nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。3 4 3 4 4t h ee f f e c to f e x t r a c t i o nt i m e so nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 3 5 3 4 5t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sa n do r t h o g o n a lt e s ta n a l y s i s 3 5 3 5t h er e s e a r c ho fu l t r a s o u n de x t r a c t i n gl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 3 6 3 5 1t h ee f f e c to f t i m eo nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。3 6 3 5 。2 t h ee f f e c t o f r a t i o o f l i q u i d o n o n l e n t i n a n p o l y s a c c h a r i d e y i e l d 3 7 3 5 3t h ee f f e c to f t e m p e r a t u r eo nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。3 8 3 5 4t h ee f f e c to f u l t r a s o n i cp o w e ro nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 3 8 3 5 51 1 1 ee f f e c to f e x t r a c t i o nt i m e so nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 3 9 3 5 6t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sa n do r t h o g o n a lt e s ta n a l y s i s 3 9 3 6t h er e s e a r c ho f m i c r o w a v ee x t r a c t i n gl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 4 0 3 6 1t h ee f f e c to f t i m eo nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d ：一4 0 3 6 2t h ee f f e c to f r a t i oo f l i q u i d o no n l e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。4 1 3 6 3t h ee f f e c to f t e m p e r a t u r eo nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 4 1 3 6 4t h ee f f e c to f m i c r o w a v ep o w e ro nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 4 2 3 6 5t h ee f f e c to f e x t r a c t i o nt i m e so nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。4 2 3 6 6t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sa n do r t h o g o n a lt e s ta n a l y s i s 4 3 3 7t h er e s e a r c ho fs u b c r i t i c a lw a t e re x t r a c t i n gl e n t i n a np o l y s a c c h a d d e 4 4 3 7 1t h ee f f e c to f t i m eo nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。4 4 3 7 2t h ee f f e c to f r a t i oo fl i q u i d o no nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 4 5 v i c o n t e n t s i l l 3 7 3t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r eo nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。4 5 3 7 4t h ee f f e c to f e x t r a c t i o nt i m e so nl e n t i n a np o l y s a c c h a r i d ey i e l d 。4 6 3 7 5t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sa n do r t h o g o n a lt e s ta n a l y s i s 4 6 3 8t h ec o m p a r i s o ne x t r a c t i o na m o n gt h ef o u rm e t h o d s 4 7 3 9t h ec h o i c eo fa l c o h o lp r e c i p i t a t i o nc o n d i t i o n 4 8 3 10s e v a gm e t h o du s e db yr e m o v i n gp r o t e i nc o n c e n t r a t i o nf r o ml e n t i n a np o l y s a c c h a r i d e 4 9 3 1 0 1t h ee f f e c to f s c i l l a t i o nt i m eo np r o t e i nr e m o v a lr a t e 4 9 3 1 0 2t h ee f f e c to f s t a n d i n gt i m eo np r o t e i nr e m o v a lr a t e 4 9 3 1 0 3t h ee f f e c to f l i q u i da n dr e a g e n tv o l u m er a t i oo f s e v a go np r o t e i nr e m o v a lr a t e 5 0 3 1 0 4t h ee f f e c to f v o l u m er a t i oo f c h l o r o f o r ma n db u t a n o lo np r o t e i nr e m o v a lr a t e 5l 3 1 0 5d e t e r m i n a t i o no f o p t i m u mc o n d i t i o n so f p r o t e i nr e m o v a l 5 l 3 1 0 6t h ed e t e r m i n a t i o no fl e n t i n a na f t e ru s i n gs e v a gm e t h o d 5 3 3 1 lt h ea p p l i c a t i o no fl e n t i n a ne n z y m ep g l u c o s i d a s e 5 3 3 1 1 1t h er e s u l t so f l e n t i n a n1 3 - g l u c o s i d a s eh y d r o l y s i sr e s i d u e 5 3 3 11 2t h er e s u l t so fs o y b e a ni s o f l a v o n e sh y d r o l y s i sr e s i d u e 5 4 3 1 2t l l l er e s u l t so f a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f l e n t i n a np o l y s a c c h a d d e 5 4 3 1 2 1t h er e s u l t so f r e d u c i n gp o w e r 5 4 3 1 2 2t h er e s u l t so f d p p hf r e er a d i c a lr e m o v a l 5 5 3 1 2 3t h er e s u l t so f h y d r o x y lr a d i c a lr e m o v a l 5 5 4c o n c l u s i o n s 5 7 4 1i n n o v a t i o n 5 7 4 2c o n c l u s i o n 5 7 a c k n o w l e d g e m e n t 5 9 r e f e r e n c e s 6 0 p u b l i s h e da r t i c l ed u r i n gs p e c i a l i z i n gt h ed e g r e eo fm a s t e r 6 5 v i l 独创声明了学位论文版权使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 逵! 塑遗直基丝益噩挂别直明的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：喜冕崭 日期：加，啤6 月，饵 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) h 学位论文作者签名：辆宠羊 b g q - 山f 。年6 月i ，日 导师签名：亏段稗嗍炒年月，日 捅要 i i i i 摘要 香菇中的香菇多糖具有抗癌、抗肿瘤等多种生物活性。香菇p 葡萄糖苷酶在食品加工、 生产中有着广泛的应用。本试验以香菇为原料，探索从其中提取香菇p 葡萄糖苷酶，水解大 豆异黄酮和豆渣：提取香菇b 葡萄糖苷酶后剩余的香菇渣中还含有部分的香菇多糖，对其进 一步提取纯化，主要通过热水浸提、超声辅助提取、微波辅助提取和亚临界水提取四种方法 提取香菇多糖，醇沉后并用s e v a g 法除去香菇多糖中的蛋白。并测定香菇多糖的抗氧化活性。 测定多糖的方法主要是用3 5 二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，通过苯酚硫酸法测定 溶液中的总糖的含量，换算得到多糖的含量。本试验对苯酚硫酸方法进行了进一步研究，确 定了该方法有很好的稳定性和重现性，确定测定多糖最佳波长为4 9 0 n m ，最佳的提取液稀释 倍数为2 0 0 倍。 采用热水浸提法提取香菇多糖时，通过单因素试验和正交试验，确定了最佳的热水浸取 条件：提取温度1 0 0 * c ，液固比4 0 m l g ，提取时间3 h ，提取2 次。采用超声辅助法提取香菇 多糖时，通过单因素试验和正交试验，确定了最佳超声辅助提取条件：提取温度7 0 。c ，超声 时间4 5 m i n ，液固比3 0 m l g ，超声功率8 0 w ，提取2 次。采用微波辅助法提取香菇多糖时， 通过单因素试验和正交试验，确定了最佳微波辅助提取条件：浸提温度9 0 ( 2 ，微波萃取时间 l o m i n ，液固比2 5 m l g ，微波功率是8 0 0 w ，提取2 次。采用亚临界水法提取香菇多糖时， 通过单因素试验和正交试验，确定了最佳亚临界水法提取条件：亚临界水温度1 5 0 ( 2 ，液固 比3 0 m l g ，浸提时间为5 m i n ，浸提次数为2 次。 四种方法最佳条件下提取香菇多糖得率为：热水浸提法4 9 0 ，超声辅助提取法5 17 ， 微波辅助提取法4 8 3 ，亚临界水法7 6 3 ；提取时间依次为：3 h ，4 5 m i n ，1o m i n ，5 m i n ： 液固比依次为4 0 m l g ，3 0 m l g ，2 5 m l g ，3 0 m l g ：提取温度依次为1 0 0 * c ，7 0 c ，9 0 c ， 1 5 0 ( 2 。由以上数据可知，热水浸提法提取香菇多糖的耗时最长，料液比较大，温度要求高： 超声辅助提取法相对于传统热水浸提法，提取时间缩短很多，液固比也减小，温度要求最低。 微波辅助提取法提取时间相对于以上两种方法提取时间又缩短一些，液固比也相对减小，但 是香菇多糖的得率稍微有所下降。亚临界水提取方法提取率最高，提取瞬间完成。在实际生 产过程中，要根据实际情况选择适宜的提取方法。 通过醇沉试验选择的最佳乙醇醇析终浓度为8 0 。s e v a g 法除蛋白的选定因素、水平进 行正交试验。得到s e v a g 法对香菇多糖提取液除蛋白的最优条件振荡时间为2 m i n 、静置时间 2 0 m i n 、样液与s e v a g 试剂体积比为2 ：i 、氯仿与正丁醇体积比为3 ：l 。粗多糖样品经四次s e v a g 法纯化多糖纯度达到9 2 2 6 。 进行了香菇p 一葡萄糖苷酶水解豆渣的研究。香菇p 葡萄糖苷酶水解鲜豆渣试验中，水溶 性多糖含量由0 2 1 9 l 增加到0 2 7 9 l ；水解5 5 ( 2 下烘干豆渣试验中，水溶性多糖含量由 0 8 0 9 l 增加到1 2 4 9 l ：水解9 0 c 下烘干豆渣试验中，水溶性多糖含量由0 5 2 9 l 增加到 0 7 8 9 l 。采用豆渣酶解途径进行放大实验，取5 5 c 下烘干豆渣l o o g ，选用香菇p 葡萄糖苷 酶进行水解，水溶性多糖含量由o 8 2 9 l 增加到1 2 6 9 l ，水溶性多糖含量增加了5 4 。 进行了香菇p 一葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮的研究。香菇p 葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮后， 得到产品1 6 9 ，黄豆苷水解率为9 8 1 5 ，染料木苷水解率9 4 2 3 。 东北农业大学硕上学位论文 对香菇多糖进行了抗氧化活性测定研究，研究结果表明，香菇多糖具有抗氧化活性，可 以有效清除d p p h 自由基，其清除率可达5 5 o ；羟基自由基清除率可达7 6 5 ，与同浓度 下的v c 接近。 关键词香菇多糖：i s - 葡萄糖苷酶；提取；纯化：抗氧化活性 i i a b s t r a c t t h es t u d i e so fe x t r a c t i o no fl e n t i n a na n d a p p l i c a t i o no f b - - g l u c o s i d a s e a b s t r a c t p o l y s a c c h a r i d e s i nt h el e n t i n u s e d o d eh a v ea n t i - c a n c e r , a n t i - t u m o ra n do t h e rb i o l o g i c a l a c t i v i t i e s t h e1 3 - g l u c o s i d a s eh a sw i d e s p r e a da p p l i c a t i o ni nt h ef o o dp r o c e s s i n ga n dp r o d u c t i o n i n t h i ss t u d y , t a k i n gl e n t i n u s e d o d e sa st h er a wm a t e r i a l t h ee x t r a c t i o no fp - g l u c o s i d a s ea n dt h e e n z y m a t i ch y d r o l y s i so fs o y b e a ni s o f l a v o n e sa n ds o y b e a nr e s i d u eh a db e e ne x p l o r e d i nt h i s e x p e r i m e n t s o m ep o l y s a c c h a r i d e sr e m a i n e di nt h er e s i d u eo fl e n t i n u s e d o d e s t h ee x t r a c t i o no f p o l y s a c c h a r i d e sf r o ml e n t i n u s e d o d e s w e