（食品科学专业论文）桦褐孔菌多糖的提取及功能的初步研究.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究 果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发 或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：卉旃孑誊 日期：知诊年弓月) - e t 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科 技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：玮翮 日期：7 4 4 车月粥日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密il ( 请在方框内打“”) ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密匹k 请在方框内打- ”) 。 作者签名： 本易钐翟、f i i 参1 ：瑚d 挥；月册 刷磁轹张叼吃 只期：沙脾) 月垌 摘要 桦褐孔菌( 1 n o n o t u so b l i q u u s ) 是9 0 年代新兴的一种食药兼用菌，富含多种生物活性 成份。目前，国外关于桦褐孔菌多糖免疫活性的研究不多，而国内尚未见这方面的报 道。本文以桦褐孔菌子实体为材料提取粗多糖，研究不同因素对多糖浸提的得率和纯 度的影响，最终通过正交确定了最佳多糖提取条件。以提取得粗多糖为原料研究了其 对机体免疫功能的影响。 采用碳粒廓清实验研究了桦褐孔菌多糖对正常和免疫力低下小鼠的非特异性免 疫功能中巨噬细胞吞噬功能的影响；通过淋巴细胞增殖实验研究了桦褐孔菌多糖对正 常和免疫力低下小鼠的细胞免疫功能的影响；通过血清溶血素( h c 5 0 ) 测定法研究桦 褐孔菌多糖对小鼠体液免疫功能的影响。 测定了桦褐孔菌的水分、灰分、蛋白和粗脂肪含量以及微量元素和重金属的含量， 为桦褐孔菌的研究与开发提供了前期研究基础。 实验结果如下： ( 1 ) 通过传统方法用热水浸提桦褐孔菌中的粗多糖，由正交优化实验得出了最佳 提取条件。桦褐孔菌多糖热水浸提的最佳工艺参数为：料水比为l ：2 5 ，提取时间为4h ， 提取温度为1 0 0 ，此工艺条件下的桦褐孔菌多糖的得率可达1 8 4 1 。 ( 2 ) 桦褐孔菌粗多糖能显著提高低免疫模型的机体脾指数和巨噬细胞吞噬率，增 强机体非特异性免疫功能。 ( 3 ) 能显著刺激淋巴细胞转化，表明桦褐孔菌粗多糖是一种t 淋巴细胞激活剂， 使机体细胞免疫水平提高。 ( 4 ) 能显著增加循环抗体一溶血素的含量，刺激机体产生抗体的能力，使体液免 疫水平上升。 ( 5 ) 该粗多糖与环磷酰胺( c t x ) 共用，在适宜剂量条件下，有弱化甚至完全消除 该环磷酰胺造成的免疫功能低下的作用，并调节机体免疫水平至正常。 ( 6 ) 桦褐孔菌原料中含有有益的微量元素锰和硒，并且重金属含量均远低于行业 标准，不会对人体造成伤害。 本项研究表明：桦褐孔菌粗多糖是较好的免疫增强剂，该研究结果为其在医药保 健方面的开发利用提供了理论依据。 关键词：桦褐孔菌多糖；免疫活性；非特异性免疫；特异性体液免疫 a bs t r a c t l n o n o t u so b l i q “淞h a sb e c o m eak i n do fn e we d i b l ea n dm e d i c i n a ll u n g is i n c et h e l9 9 0 s i tc o n t a i n sr i c hb i o l o g i c a la c t i v i t yc o m p o n e n t s u pt od a t e n o tm u c hr e s e a r c hw a s f o c u s e do ni t si m m u n o l o g i c a la c t i v i t ya b r o a d w eh a v en o tf o u n dr e p o r t so fs u c ha s p e c t si n c h i n ay e t i nt h i sa r t i c l el n o n o t u so b l i q z l u sw e r es e r v e da se x p e r i m e n tm a t e r i a l s 。a n dc o a r s e p o l y s a c c h a r i d e sw a se x t r a c t e df r o mt h e m t h ep u r p o s ew a st os t u d yt h ee f f e c to fd i f f e r e n t f a c t o r so nt h ey i e l da n dp u r i t yo fl n o n o t u so b l i q u u sp o l y s a c c h a r i d ea n df i n d t h eb e s t e x t r a c t i n gc o n d i t i o nb ym e a n so fo r t h o g o n a l t os t u d yt h en o n s p e c i f i ci m m u n o l o g i c a lf u n c t i o no fl n o n o t u so b l i q r u u $ o nn o r m a la n d i m m u n o s u p p r e s s i o nb yu s i n gc a r b o np a r t i c l ec l e a r a n c et e s t i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h e c e l l u l a ri m m u n ef u n c t i o no fl n o n o t u so b l i q u u so nn o r m a la n di r n m u n o s u p p r e s s i o n b y u s i n gt h el y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o nt e s t t os t u d yt h es p e c i f i ch u m o r a i m m u n o l o g i c a le f f e c t o fi n o n o t u sd 6 ，i q “z 岱o nn o r m a la n di i n n l u n o s u p p r e s s i o nb yu s i n gt h eh e m o l y s i nt e s t i nt h i sa r t i c l em o i s t u r ec o n t e n t ，p r o t e i nc o n t e n t ，c i n e r a t i o n gc o n t e n t , f a tc o n t e n t ，t r a c e e l e m e n ta n dh e a v ym e t a la r et e s t e d a n dt h e s ef a c t ss u s t a i n e dt h et h e o r yo fr e s e a r c ha n d d e v e l o p m e n t ， t h er e s u l t so ft e s tw e r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) 砸se x p e r i m e n tu s e dt h eh o tw a t e ri m m e r s i o nf o r m u l a t i o nt oe x t r a c tt h el n o n o t u s o b l i q u u $ p o l y s z c c h r i d e t h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tw a sb a s e do nt h o s e4c r a f tp a r a m e t e r s a n dd e s i g n e dt h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n ti nt h i sf o u n d a t i o n , a n dt h ep r o p o s i n ge x t r a c t i n g l n o n o t u so b l i q u u sp o l y s a c c h a r i d eb e s tc o n d i t i o nw a st h eb e s ts o a k sr a i s e st e m p e r a t u r ew a s l0 0 ，t h a tt h eb e s tm a t e r i a lh y d r a u l i cm o d u l u sw a sl ：2 5 ，a n dt h a tt h eb e s ts o a k sr a i s e st i m e w a s4h o u r s a n di nt h i sc o n d i t i o nt h el n o n o t u so b l 幻u u sp o l y s a c c h a r i d ey i e l dw a s1 8 41 ( 2 ) c o a r s ep o l y s a c c h a r i d e so fl n o n o t u so b l i q r i u sc a no b v i o u s l yi n c r e a s c ds p l e e ni n d e x a n dp h a g o c y t i cr a t eo fm a c r o p h a g ea n ds t r e n g t h e nn o n - s p e c i f i ci m m u n o l o g i c a ll e v e lo f o r g a m s m ( 3 ) t h e yc a nn o t i c e a b l ys t i m u l a t el y m p h o c y t e s t h e r e f o r e ，e x p e r i m e n ti n d i c a t e dt h a t c o a r s cp o l y s a c c h a r i d eo fl n o n o t u so b l i q u u sw a sas t i m u l a t i n ga g e n to fl y m p h o c y t e sw h i c h c a np r o m o t ei m m u n o l o g i c a ll e v e lo fo r g a n i s mc e l l s ( 4 ) t h e yc a no b v i o u s l yi n c r e a s et h ec o n t e n to fh a c m o l y s i nw h i c hc i r c u l a t e da n t i b o d ya n d c o u l dc a u s eo r g a n i s mt oo b t a i nt h ea b i l i t yt op r o d u c ea n t i b o d yw h i c hc a nf i n a l l yi n c r e a s e t h ei m m u n o l o g i c a l l e v e lo fb o d yf l u i d ( 5 ) w h e nw et r e a t e dc o a r s ep o l y s a c c h a r i d e sa n dc y c l o p h o s p h a m i d ea tt h eo p t i m a ld o s e ， c o a r s ep o l y s a c c h a r i d e so fi n o n o t u so b l i q “l 岱c a nw e a k e na n de v e nc o m p l e t e l yg e tr i do fl o w i m m u n o l o g i c a lf u n c t i o nc a u s e db yt u m o rc h e m o t h e r a p ya n df i n a l l ym o d i f yt h el o w o r g a n i s mi m m u n i t yi n t o t h en o r m a ll e v e l ( 6 ) t h e r ew e r eb e n e f i c i a lt r a c ee l e m e n ts u c ha sm na n ds e a n dt h eh e a v ym e t a l c o n t e n t sw e r ef a ro f rl e s st h a nt h et r a d es t a n d a r d t h e r e f o r e c o a r s ep o l y s a c c h a r i d eo fl n o n o t u so b l i q u u si sag o o di m m u n e s t r e n t h e n i n g a g e n t t h i ss t u d yp r o v i d e st h e o r yb a s i sf o rd e v e l o p i n gp r o t e c t i v em e d i - c i n e k e yw o r d s ：i o p ( 1 n o n o t u so b l i q u u sp o l y s a c c h a r i d e ) ，i m m u n o r e g u l a t i o n ，n o n - s p e c i f i c i m m u n i t y ，s p e c i f i ch u m o r a li m m u n i t y l 1 3 1 降血糖的作用3 1 3 2 多糖清除羟自由基活力4 1 3 3 桦褐孔菌多糖对过氧化脂质生成的抑制4 1 3 4 对f e 2 + c y s 诱导小鼠肝脂质过氧化的抑制4 1 3 5 桦褐孔菌多糖对小鼠肝线粒体肿胀的抑制4 1 3 6 桦褐孔菌多糖对实验性高脂血症模型大鼠血脂的影响4 1 3 7 增强免疫和抗氧化作用5 1 4 多糖对机体免疫功能的影响5 1 4 1 多糖对免疫器官的影响5 1 4 2 多糖对淋巴细胞的影响”5 1 4 3 对t 淋巴细胞的影响6 1 4 4 对b 淋巴细胞和抗体生成的形响6 1 4 5 多糖的抗炎症、抗病毒、抗衰老等其它活性8 1 5 多糖生物活性的影响因素8 1 5 1 多糖的化学结构8 1 5 2 多糖的分子量9 1 5 3 多糖的溶解度和粘度l o 1 5 4 多糖的来源1 0 1 5 5 使用剂量与给药途径1 0 1 6 国内外食用菌多糖的研究进展1 0 1 6 1 食用菌多糖研究现状”l o 1 6 2 真菌多糖的理化性质“ 1 6 3 真菌多糖的提取、分离1 2 1 6 4 真菌多糖开发利用”1 2 2 材料与方法1 4 l l l 2 2 2 2 3 2 1 实验材料与仪器1 4 2 1 1 材料1 4 2 1 2 主要仪器1 4 2 1 3 主要试剂”1 5 2 2 实验方法l6 2 2 1 热水浸提法1 6 2 2 2 碱液提取法”1 6 2 2 3 多糖含量分析方法( 苯酚一硫酸法) l6 2 2 4 总蛋白的测定1 7 2 2 5 桦褐孔菌多糖含量计算方法1 7 2 3 非特异性免疫研究一免疫器官变化试验”1 8 2 3 1 评价免疫功能的原理及方法1 8 2 3 2 实验的前期准备18 2 3 3 实验操作1 9 2 3 4 计算公式”l9 2 3 5 数据处理l9 2 4 体外脾细胞培养1 9 2 4 1 淋巴细胞增殖实验原理”1 9 2 4 2 实验的前期准备2 0 2 4 3 实验操作2 l 2 4 4 数据处理2 l 2 5 体液免疫功能一溶血素的测定原理一2 l 2 5 1 实验动物及材料2 2 2 5 2 实验操作_ 2 2 2 5 3 计算公式2 3 2 5 4 数据处理”2 3 2 6 测定新鲜桦褐孔菌初始特性指标的方法一2 3 2 6 1 桦褐孔菌水分测定的方法”2 3 2 6 2 桦褐孔菌脂肪含量测定的方法2 4 2 6 3 桦褐孔菌灰分含量测定的方法”2 4 2 6 4 桦褐孔菌中微量元素和重金属元素的测定2 4 3 结果分析与讨论 3 1 苯酚一硫酸法测定条件的确定2 5 3 1 1 最大吸收波长的选择2 5 3 1 2 显色时间的确定一2 5 3 1 3 葡萄糖标准曲线“2 5 h 3 2 热水漫提工艺条件的确定“2 6 3 2 1 单因素实验结果及分析2 6 3 2 2 正交实验结果与分析2 9 3 3 桦褐孔菌中蛋白质的测定结果3 l 3 3 1 蛋白质标准曲线”31 3 3 2 蛋白质的测定结果3 l 3 4 碳粒廓清实验3 l 3 4 1 桦褐孔菌多糖对小鼠胸腺指数、脾指数和肝指数的影响“3 2 3 4 2 桦褐孔菌多糖对巨噬细胞吞噬功能的影响3 5 3 4 3 讨论”3 6 3 5 淋巴细胞增殖实验结果”3 7 3 5 1 桦褐孔菌多糖对淋巴细胞增殖的直观影响3 7 3 5 2 水提桦褐孔菌多糖对正常小鼠体外淋巴细胞转化的影响3 9 3 5 3 水提桦褐孔菌多糖对低免小鼠体外淋巴细胞转化的影响3 9 3 5 4 碱提桦褐孔菌多糖对正常小鼠体外淋巴细胞转化的影响4 0 3 5 5 碱提桦褐孔菌多糖对低免小鼠体外淋巴细胞转化的影响4 0 3 5 6 多糖对提高细胞免疫水平的探讨4 l 3 6 血清溶血素实验结果一4 2 3 7 桦褐孔菌初始特性指标测定结果4 3 3 7 1 桦褐孔菌水分的测定结果4 3 3 7 2 桦褐孔菌中粗脂肪含量的测定结果4 3 3 7 3 桦褐孔菌中灰分的测定结果4 3 3 7 4 桦褐孔菌中微量元素的测定结果4 3 4 结论一 5 展望 6 参考文献 7 攻读硕士期间发表论文情况 8 致谢 4 5 4 6 4 7 5 3 5 4 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 桦褐孔菌概述 1 1 1 桦褐孔菌的分类地位 目前，已被发现的真菌约有2 5 万种，在我国被药用的真菌约有3 0 0 多种。自2 0 世纪8 0 年代以来，随着对药用真菌多糖等活性物质研究的深入，真菌的营养学价值 和药用价值越来越引起人们的重视，正在成为医药工业和保健品工业的热门开发领域 之一【l 】。近年来，俄罗斯、北欧、日本、美国及韩国等国家的相关学者进一步研究了 桦褐孔菌，试图找出其活性成分，并将其用于恶性肿瘤1 2 1 、糖尿病、心血管疾病、肝 病及艾滋病的预防和治疗中【3 】。目前我国学者对桦褐孔菌的研究还处于起步阶段。 桦褐孔菌属担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、锈革孔菌科、褐卧孔菌属，学名 p h a e o p o r u so b 脚t a n s 旷，) js c hr o e t ，在外文资料中，其学名常以i n o n o t u so b 脚u u $ 或 f u s c o po r i ao b l 幻搬出现。其俗名有b l a c k b i r c ht u c h w o o d ，m a l a l o nm u s hr o o m 等【4 l 。 1 1 2 桦褐孔菌的形态特征及分布 桦褐孔菌是一种寄生在落叶树上的菌，主要寄生于白桦树银桦、赤杨等的树干或 树皮下，形成不育的木腐菌。子实体呈现瘤状，直径可达2 5 - 4 0c m ，黑色，深裂，表 面不规则，像砖块；菌肉红褐色，木栓质；菌管3 1 0t o n i ，质脆，常前端开裂，茵孔 每r n l n6 8 个，圆形，浅白色，后变暗褐色；孢子呈椭圆状至卵状，光滑，9 1 0 岬5 5 - 6 5 岬，有刚毛1 5 j ；菌丝为二系菌丝系统，具有生殖菌丝和骨架菌丝。生菌丝多为骨架菌 丝，黄褐色，宽2 0 5 5 岬，具有刚毛状菌丝和稀少刚毛；基内菌丝多为生殖菌丝， 淡黄褐色，宽1 5 7 0g u n ，有隔，无锁状联合【6 】。该菌主要分布在北纬4 5 0 5 0 0 地区的 北美，芬兰，波兰，俄罗斯的西伯利亚、o 1 y n e t s 、b a l t i c s ，中国的黑龙江和吉林，日 本的北海道和h o k k a i d o 7 1 。 图源于：众生国际博士后科研工作站 l 前言 1 1 3 桦褐孔菌的生物学特性 菌丝人工培养的特征：据韩国国立农业学院张弦酋教授等人的研究表明：桦褐孔 菌在b d a ( 桦木屑、葡萄糖、琼脂培养基) 上生长最快，每1 0d 生长6 8 3n l l n ，最适温 度为3 0 ，最适p h 为6 0 。在4 0 时，最适碳源、氮源和有机酸源分别为每1 5d ， 2 5m l 培养基中加入麦芽糖3 3 1m g 、蛋白胨3 4 7m g 、谷氨酸3 5 7m g ，最适生物素 ( b i o t i n ) 3 7 8m g l 5 d ，最适的碳氮为4 0 。 1 2 桦褐孑l 菌的化学成分及药理作用 1 2 1 桦褐孔菌的主要药用成分 有效成分据目前的研究报道，桦褐孔菌的化学成分有桦褐孔菌素【7 l 、桦褐孔菌醇、 多种氧化三萜类化合物 8 1 、栓菌酸、多种羊毛甾醇型三萜类化合物、叶酸衍生物、芳 香族的香草酸、丁香酸及丫羟基苯甲酸，还有报道称已分离出单宁化合物、类固醇、 生物碱类化合物、黑色素类、低分子多酚类及木质素类化合物1 9 1 0 l 。近来国外学者又 分离出了几种新的三萜类化合物一6 1 。 1 2 2 药理作用 桦褐孔菌( i n o n o t u so b 脚u u s ( f r ) p i l a t ) 属担子菌亚_ f - i 层菌纲非褐菌目多孔菌科桦褐 孔菌属，被广泛应用于预防及治疗各种疾病，如肝病、癌症、心脏病、糖尿病、胃肠 及食道疾病等【1 7 1 。研究结果表明，桦褐孔菌可抑制艾滋病病毒，抗辐射，并可通过抑 制蛋白质合成、抗有丝分裂及消除自由基活性等作用来抑制或延缓肿瘤细胞的生长， 预防及治疗o 1 5 7 大肠杆菌中毒【1 8 - 1 9 1 ，并对小鼠s 1 8 0 荷瘤的生长有明显的抑制作用 1 2 0 1 o 1 2 2 1 抗肿瘤作用 桦褐孔菌提取液中的三萜，特别是桦褐孔菌醇对沃克2 5 6 癌肉瘤和巨噬细胞趋化 因子7 人乳腺癌等肿瘤有明显的抑制作用【2 。据李英秀等报道【2 2 1 ，桦褐孔菌提取物在 0 5 1 6 0l x g m l 对胃癌m g c 8 0 3 细胞株均有抑制细胞增殖作用，并显示明显的量效关 系。通过对胃癌m g c 8 0 3 细胞株凋亡的形态学和生化学检测，结果显示，桦褐孔菌 提取物有诱导胃癌m g c 8 0 3 细胞凋亡作用。通过药物对胃癌m g c 一8 0 3 细胞株中b c l 一2 蛋白表达的实验，发现2i x g m l 的桦褐孔菌提取物作用4 8h 后能明显抑制b c l 2 蛋白 表达，从而导致细胞发生凋亡。此外，菌丝、菌核中的多糖有抑制细胞周期，调节酶 c d c 2 5 和c d c 2 e y e l i n b 的作用。桦褐孔菌的菌丝体和培养基中的成分能对h e l a 细胞的 g l 和g 2 期有阻碍作用，同时有激活过氧化氢酶活性的作用，但是这两种作用之间没 有必然的联系。其中培养基中成分对有丝分裂的阻碍作用是在g i 或g 2 期，而菌丝 体的作用是在m 、g 1 和g 2 期。但是对n o c a r d i a 细胞没有作用【2 3 1 。桦褐孔菌含有白 桦脂酸，1 9 9 9 年韩国学者发现这种物质能抑制2 9 3 型癌细胞达7 0 ，具有很强的抗肿 瘤性l 矧，且无毒副作用，主要通过抑制蛋白质的生物合成和抗有丝分裂来影响肿瘤细 胞的分裂生长1 2 5 之7 l ，还通过p 葡聚糖去激活免疫系统【凋，另外通过诱导肿瘤细胞凋亡 2 天津科技大学硕士学位论文 【2 9 3 0 l 而起到抗肿瘤作用。 1 2 2 2 对心血管系统的作用 据报道，三萜类化合物和类固醇有改善血液循环、调整血压、降低血胆固醇的作 用【3 i 3 2 1 ，临床研究认为桦褐孔菌对预防与治疗高血压有一定的作用。 1 2 2 3 抗病毒的作用 桦褐孔菌的提取物，特别是热干的菌丝体有强的抵制巨细胞形成的活性，在3 5 n g m l 可阻止h i v 的感染，且毒性很低，能有效激活淋巴细胞。另外该菌丝的热水提 取物中的成分能阻止h i v 病毒的增殖。 t o s h i a k i 等人发现桦褐孔菌中水溶性具高相对分子质量的木素衍生物有抗h w i 蛋白酶的作用，而其他的低相对分子质量多酚则无此作用【3 3 】。桦褐孔菌外表面黑色部 分的提取物在质量浓度为4 0 g m l 时对人流感病毒a 和b 及马的流感病毒a 有完全 的活性。抗病毒成分主要是桦木醇、羽扇豆醇和真菌甾醇，这些成分主要在桦褐孔菌 的外表面，而在内部含量很低。这种抗病毒的机制还有待进一步研究。抗病毒作用日 本学者研究发现，桦褐孔菌水提取物可抑制人类免疫缺陷病毒蛋白酶，已确定的活性 成分是一种水溶性的高分子量木质素衍生物。加拿大和芬兰等国用桦褐孔菌醇复合物 提取的高性能标准提取物来治疗流行性感冒。另外日本学者报道，桦褐孔菌对c 1 5 7 大肠杆菌中毒有很好的治疗作用。 1 3 桦褐孔菌多糖的药理作用 1 3 1 降血糖的作用 桦褐孔菌的菌丝和菌核中的多糖有降低血糖的作用，水溶性和非水溶性多糖对糖 尿病小鼠都有降血糖作用，活性成分主要是1 3 葡聚糖、杂多糖和蛋白复合物，菌丝多 糖并没有明显的抗酶特性，但在给小鼠注射了桦褐孔菌的菌丝和菌核中提纯的多糖之 后其降低血糖的作用维持了3 0 - 4 8h 。其作用机制还有待进一步研究【3 4 1 。在桦褐孔菌 菌核中含有1 种糖蛋白和1 种水溶性多糖，均有明显的降血糖作用，尤其是桦褐孔菌 多糖提取液，其降血糖作用时间可持续4 8h 。此外还发现栓菌酸对非胰岛素依赖型糖 尿病有效。 金光、杨恩月实验结果表明，采用水提醇沉淀法所得到的桦褐孔菌多糖对小鼠 s 1 8 0 肉瘤具有较强的抑制作用，桦褐孔菌多糖大、小剂量组的肿瘤抑制率分别为 5 6 3 1 和4 4 3 4 ，且实验小鼠的一般状态良好，胸腺指数和脾脏指数均接近于正 常对照组。据报道，一氧化氮合酶和一氧化氮含量与肿瘤的分级有关，分级越高一氧 化氮的合成越多，持续的合适浓度的一氧化氮可能在肿瘤细胞信号传导途径中起作 用，调节细胞增殖相关基因的表达，同时还可能促进肿瘤内血管的形成，促进肿瘤生 长，而唾液酸作为肿瘤标志物对肿瘤的诊断、分期、肿瘤状况、转移范围、疗效评价、 预后估计和疾病有无复发等均有重要意义【3 5 l 。本实验结果示，接种瘤株后小鼠的血清 一氧化氮合酶、一氧化氮含量及唾液酸浓度均显著升高，与上述报道相符，但桦褐孔 菌组小鼠的血清一氧化氮合酶、一氧化氮含量及唾液酸浓度较阴性对照组低，接近正 l 前言 常组。综上所述，桦褐孔菌多糖对小鼠s - 8 0 肉瘤的生长具有明显的抑制作用，但对 其它肿瘤( 包括人类肿瘤) 的抑制作用还有待于进一步研究【3 6 j 。 1 3 2 多糖清除羟自由基活力 回晶、宋雅娜、孙秀娟等人对桦褐孔菌多糖清除羟自由基活力的测定 3 7 1 ，0 6 2 5 m g m l 的桦褐孔菌多糖样品对o h 有一定的清除活力，在一定浓度范围内桦褐孔菌粗 多糖样品的清除活力随浓度的增大而增大，1 2 5m g m l 样品对羟自由基的清除活力己 达到8 7 以上，即在这个范围附近，桦褐孔菌多糖对羟自由基的清除活力达到最高， 浓度再高的样品清除活力变化不大。数据差异达极显著水平，说明桦褐孔菌多糖具有 明显的o h 清除作用。 1 3 3 桦褐孔菌多糖对过氧化脂质生成的抑制 回晶、宋雅娜、孙秀娟等人利用组织匀浆在体外温育自氧化产生丙二醛( m d a ) ， 用硫代巴比妥酸法对桦褐孔菌多糖样品的抑制过氧化脂质( l p o ) 生成的活力进行了测 定。测定结果：在所测定的浓度范围内，桦褐孔菌多糖的抗氧化作用随浓度的增大而 增大，数据差异达极显著水平，可见桦褐孔菌多糖对自发性脂质过氧化具有显著的抑 制作用。 1 3 4 对f e 2 + - c y s 诱导小鼠肝脂质过氧化的抑制 回晶、宋雅娜、孙秀娟等人在一定的样品浓度范围内进行实验，桦褐孔菌多糖对 f e 2 + c y s 诱导的小鼠肝脂质过氧化的抑制作用随浓度的增大而增大，并且小于相同浓 度时对小鼠自发性脂质过氧化的抑制率，但与对照组比较，差异极显著，说明桦褐孔 菌多糖对f e 2 + c y s 诱导小鼠肝脂质过氧化也具有较好的抑制作用。 1 3 5 桦褐孔菌多糖对小鼠肝线粒体肿胀的抑制 回晶、宋雅娜、孙秀娟等人各组在5 2 0 衄处吸光值均下降，说明线粒体膜被氧 化损伤而发生了肿胀。桦褐孔菌多糖组较对照组下降趋势减缓，表明桦褐孔菌多糖可 抑制o h 所致氧化损伤，减轻肿胀。而且高浓度多糖组损伤程度小于低浓度组，与 对照组相比差异显著，这表明桦褐孔菌多糖对小鼠肝线粒体肿胀的抑制作用呈剂量依 赖关系。 1 3 6 桦褐孔菌多糖对实验性高脂血症模型大鼠血脂的影响 多糖类是被公认的调节血脂的功能因子之一，主要作用机制可能是通过提高 l t a c 活性，促进h d l 2 c 的合成，将外周组织中游离的胆固醇转移至肝脏，并促进 胆固醇转化为胆固醇酯：通过提高l p l 活性，催化t g 水解成甘油和脂肪酸，并促进 h d l 3 - c 转化为h d l 2 c ，促进胆固醇的逆向转运和代谢，从而降低血清t c 含量。 另外，多糖类可与胆固醇或与胆固醇转化物胆酸相结合，从而抑制胆固醇在肠道内的 吸收，促进降解和排泄，降低t c 、t g 、l d l c 的含量，从而发挥抗动脉粥样硬化的 作用。桦褐孔菌中主要成分为多糖类物质，它调节血脂的作用机制可能与改善血管内 皮功能，增强抗氧化活性，预防脂质过氧化和自由基损伤等有关。崔鹤松、金光研究 4 天津科技大学硕士学位论文 结果表明，桦褐孔菌多糖可降低高脂血症大鼠血清t c ，t g ，l d l c ，m d a 含量， 并可提高h d l c 含量及s o d 活性，提示桦褐孔菌多糖对高脂血症模型大鼠有明显的 降血脂作用。桦褐孔茵多糖中、大剂量组大鼠血清t c ，t g ，l d l c ，m d a 含量低 于阴性对照组大鼠，而h d l c 含量明显高于阴性对照组大鼠，相比较均有显著性差 异( p o 0 5 ，p 料液比 粒度 2 最优方案：提取温度1 0 0 ，提取时间4h ，料液1 七1 ：3 0 ( 3 0m l 水儋桦褐孔菌原料) ， 物料粒度4 0 - 6 0 目。 天津科技大学硕士学位论文 3 2 2 5 热水浸提法最佳工艺验证实验 按最优方案提取桦褐孔菌多糖，得多糖得率和纯度分别为1 8 4 1 、3 4 3 2 ，优 于正交实验及单因素中的任何一组实验，因此可以确认该方案为最优。 3 2 2 6 碱提可溶粗多糖、碱提不溶粗多糖的提取 各种提取参数均采用水提多糖的参数：提取温度1 0 0 ，提取时间4h ，料液比 1 ：3 0 ( 3 0m l 水g 桦褐孔菌原料) ，物料粒度4 0 6 0 目，只对碱液浓度进行考察。 表3 6 多糖得率和纯度的影响 t a b l e3 - 6t h e y i e l da n dp u r i t yo fp o l y s a c c h a d d e 由表3 - 6 得出在提取时碱液的浓度采取o 7 5m o l l ，碱提可溶多糖为3 6 ，纯度 为3 6 5 ，碱提不溶粗多糖的得率为5 2 。 3 3 桦褐孔菌中蛋白质的测定结果 3 3 1 蛋白质标准曲线 o 嵋 o 垢 o o 埋 篓玑1 叠0 0 8 o 0 6 0 0 4 o 0 2 o om 3 0 4 05 05 0t o 番白展浓度lh ，i d 图3 - 7 蛋白质标准曲线图 f i g 3 7s t a n d a r dc u r v eo fp r o t e i n 3 3 2 蛋白质的测定结果 表3 7 桦褐孔菌中蛋白质含量的测定结果 t a b l e3 - 7t h er e s u l to fp r o t e i ni ni n o n o t u so b l i q u u s 3 4 碳粒廓清实验 机体的免疫由特异性免疫和非特异性免疫所组成。非特异性免疫是特异性免疫的 3 结果与讨论 基础，特异性免疫所产生的免疫物质又能增强非特异性免疫的作用，因此，增强机体 的非特异性免疫对提高机体的整个免疫功能意义重大。单核巨噬细胞是非特异性免疫 的重要组成细胞之一。当细菌、异物等抗原性物质进入机体后，可迅速被机体单核巨 噬系统吞噬和清除，因而巨噬细胞的吞噬能力直接影响着抗原物质在体内的去留，而 巨噬细胞廓清指数k 的多少可以反映其吞噬功能的强弱。 实验首先研究了桦褐孔菌多糖对小鼠免疫器官指数的影响，然后测定多糖对小鼠 吞噬指数的影响。 3 4 1 桦褐孔菌多糖对小鼠胸腺指数、脾指数和肝指数的影响 实验动物接触外源化学物后，对免疫系统的影响可以表现为淋巴器官重量的改 变。在对小鼠连续灌喂桦褐孔菌多糖1 5 天后，将小鼠拉颈脱臼处死，取胸腺、脾、 肝称重，计算小鼠的胸腺、脾指数、肝指数，其结果如下图所示。 0 t 8 0 1 6 0 1 4 豢0 - 1 2 颦0 1 耋。灌 0 o 咀 0 屹 0 空白组 阳性对照水溶多德碱溶多越碱不溶多挂 图3 8 三种多糖对正常模型胸腺指数的影响 f i g 3 - 8e f f e c to fn o r m a lt h y m u si n d e xo ft h r e ep o l y s a c c h a r e i d e s 注：与空白对照组相比较，表示p o 0 5 ，表示p o o l 3 2 天津科技大学硕士学位论文 空白组 阳性对照 水溶多檀 碱溶多镛碱不溶多镛 图3 - 9 三种多糖对正常模型脾指数的影响 f i g 3 - 9e f f e c to fn o r m a ls p l e e ni n d e xo ft h r e ep o l y s a c c h a r e i d e s 注：与空白对照组相比较，表示p o 0 5 ，表示p o 0 1 空白组阳性对照 水溶多溏 碱溶多挂碱不溶多镛 图3 1