（食品科学专业论文）酶解咸鸭蛋蛋清制取白蛋白肽的研究.pdf

淤拄大攀蜞卡学位论文携誊 摘要 生物活性肽由于其茼效的营养价值，功能活性，是目f j 营养界研究得比较多 的一个热门课题，而成鸭蛋鬣清作为食品工业生产中的废弃物虽然含有较多的优 赝溪臼质，却毽其益分含量较离弼无法剩用遭到丢弃。 本沦文研究疆本襄裂搿价馕不大鼢藏鹦蛋蛋清为愿料，经过选择高效率的鳘 自酶水解，制取分子量小予5 0 0 0 的富含自蛋白肽的生物活性肽产品，并利用膜 过滤技术去除原有的以及水解过程中增加的盐分，使得产品中的盐含量大大降 低，符合人体食用的要求。 本文首先研究了咸鸭蛋鬣清制取自蛋自脓的工艺及工艺优化。工艺优化的重 点楚酶鳃反应条 譬的优化。通过对簿葶孛娄、底物浓度、戆浓度、酶解馋系的p l 、 黪勰瀛瘦和酶艇时闯等进于亍单因素试验，以及随后黥雁交试验综合分旃，褥到了 酶解反应的最佳条件：选用酸性蛋白酶、稀释倍数为1 、酶用量为3 0 0 0 u g 、p h 为2 5 、反应温度为4 5 、酶解时间为6 h 。 接着，本文又研究了脱盐方法的选择。根据对原料脱赫和水解以后对水解液 脱盐的优缺点的分析，选择采熙膜过滤技术对原料或水解滚避行脱赫试验。刹用 怒滤技术对域鸭蛋蛋清宣接脱摭，选用截警分子量为1 0 0 0 0 的趣滤摸可使残盐率 达到8 3 8 ，蛋白藤截蟹率达到8 6 ，l 。利蠲缡滤投术和电渗橱技术对东解液 进行脱赫，当p h3 2 时用n f 9 0 的纳滤膜使脱盐率达到9 4 3 ，蛋白质截留率 达到8 4 2 7 。在p h4 2 时利用电渗析使脱盐率达到9 6 6 9 ，蛋白质截留率达 茔07 1 4 。 关键词：成鸭蛋蛋清白蛋白肽酶解脱盐膜过滤技术 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t b i o a c t i v ep e p t i d eh a sah i i 醢n u t r i t i o no fv a l u ea n dm o r ef u n c t i o n a la c t i v i t i e s s oi ti s ap o p u l a rs u b j e c ti nn u t r i t i o nn o w t h ee g gw h i t eo fs a l t e dd u c ke g g sc o n t a i n s a b u n d a n c eo fh i g hq u a l i t yp r o t e i n ，b u ti tc a l l tb eu s e dd i r e c t l y , a n di sc o m m o n l y d i s c a r d e db e c a u s eo fi t sh i g hs a l tc o n t e n t t h a ti n d u c e ds e r i o u se n v i r o n m e n tp r o b l e m a n dg r e a tw a s t eo f t h eh i g hq u a l i t yp r o t e i n t h i sp a p e rr e s e a r c h e do nt h eb i o a c t i v ep e p t i d e sm a d ef r o ms a l t e dd u c ke g g sw h i t e w h i c hw a sr i c ho fo v a l b u m i na n dw a so fl i u l ec o m m e r c i a lv a l u et h r o u g hh y d r o l y z i n g b yp r o t e a s e sa n ds u b s e q u e n tm e m b r a n ef i l t r a t i o nt og e tr i do f t h ee x t r as a l ts ot h a tt h e f i n a lp r o d u c tc o u l db em o r eu s e f u lf o rh u m a na n da n i m a l s f i r s t l y , t h et e c h n o l o g yo fm a k i n go v a l b u m i np e p t i d e sw a so p t i m i z e d t h ee n z y m a t i c r e a c t i o nc o n d i t i o n ss u c ha s e n z y m es p e c i e s ，s u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ，e n z y m e c o n c e n 蜮i o n ，p h ，t e m p e r a t u r ea n dt i m eo fr e a c t i o nw a ss t u d i e d t h eo p t i m a l c o n d i t i o n so fe n z y m a t i ct r e a t m e n tw a so b t a i n e da sf o l l o w s ：c h o s ea c i d p r o t e i n a s e ， d i l u t i o nr a t ew a s1 ，d o s a g eo fe n z y m ew a s3 0 0 0 u g , p hw a s2 5 ，t e m p e r a t u r ew a s4 5 ，a n dr a c t i o nf o r6 h o u r s t h e nt h ed e s a l t i n gm e t h o do ft h ef i n a lh y d r o l y z e dp r o d u c tw a sc o m p a r e da n dc h o s e n t h ea d v a n t a g ea n dd i s a d v a n t a g eo fd e s a l t i n gt ot h ee g gw h i t ea n dd e s a l t i n gt ot h e h y d r o l y z e de g gw h i t ew e r ee v a l u a t e d t h em e m b r a n ef i l t r a t i o nt e c h n o l o g yw a s c h o s e nt ob eu s e df o rd e s a l t i n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tu l t r af i l t r a t i o nb yt h e m o l e c u l a rm a s sc u t o f f10 0 0 0w a ss u i t a b l ef o re g gw h i t e 、t h ed e s a l i n i z a t i o nr a t ew a s 8 3 8 1 。a n dt h ep r o t e i nr e t e n t i o nw a s8 6 t a n dt h en a n o f i l t r a t i o na n de l e c t r o d i a l y s i sw e r es u i t a b l ef o rh y d r o l y z e dp r o d u c t t h ed e s a l i n i z a t i o n r a t ea n dp r o t e i n r e t e n t i o no fn a n o f i l t r a t i o nc o u l dr e a c h9 4 3 a n d8 4 2 7 u s i n gn f - 9 0a tp h = 3 2 t h ed e s a l i n i z a t i o nr a t ea n dp r o t e i n - r e t e n t i o no fe l e c t r od i a l y s i sc o u l dr e a c h9 66 9 a n d7 1 4 a tp h = 4 2 k e y w o r d s ：s a l t e dd u c ke g gw h i t e ，o v a l b u m i np e p t i d e s ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，d e s a l t ， m e m b r a n ef i l t r a t i o nt e c h n o l o g y 浙江大学硕士学位论文第一章引言 第一章引言 1 生物活性肽研究进展 有两个或两个以上氨基酸彼此以肽键相边所组成的有机化合物称之为肽，含 有的氨基酸少于1 0 个的称为寡肽，反之则称之为多肽。生物活性肽是指能够调 节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用的一类肽的总称。 传统观点认为人体吸收蛋白质主要是以氨基酸的形式吸收的，蛋白质必须被 消化成为游离氨基酸之后才可被吸收利用。但是现代生物代谢研究表明，人类摄 取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后，不像以前认为的那样仅以氨基酸的形式 吸收，更多的是以小肽的形式吸收，而且小肽比完全游离氨基酸更易、更快被机 体吸收利用【2 】。与氨基酸相比，以肽的形式吸收具有以下的优势，一是较氨基酸 吸收快速；二是以完整的形式被机体吸收：三是主动吸收( 氨基酸属被动吸收) ； 四是低耗，肽吸收具有低耗或不需消耗能量的特点，肽通过十二指肠吸收后，直 接进入血液循环，将自身能量营养输送到人体各个部位：五是肽吸收较氨基酸， 具有不饱和的特点；六是氨基酸只有2 0 种，功能可数，而肽以氨基酸为底物， 可合成上百上千种。而肽与高蛋白相比，首先，肽是体现信息的信使，以引起各 种各样不同的实效的正性或异性生理活动和生化反应调节：其次，活性高；第三， 分子量小，易于改造，易于化学合成，而高蛋白( 大分子蛋白质) 不具备这一特 点。可见，生物活性肽较高蛋白和氨基酸有着更好的效能和优点。 自从b r a n t l 等人由干酪素中第一次分离出吗啡肽b - - c a s o m p o r p h i n 和由可 消化酶分解产生的食物活性肽以来，迄今生物活性肽的发现和研究已有2 0 几年 的历史【3 】。目前发现的生物活性肽有很多种其调节人体代i 身f 和生理功能的作用 也各不相同，有免疫调节、激素调节、酶调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂 等作用，可作用于高血压、高血脂、动脉粥样硬化、骨质疏松等疾病1 4 】。当前， 对生物活性肽的研究越来越热门，2 l 世纪将是“肽的世纪”，无论从吸收速度还 是生物学功能上，肽都将引发营养品革命。 浙江大学硕士学位论文第一章引言 1 1 生物活性肽的功能、作用 1 1 1 营养作用 动物摄入的蛋白质在肠道内消化可释放出游离氨基酸和寡肽，与氨基酸相 比，肽的吸收具有转运快、吸收效率高、耗能低、载体不易饱和、不竞争载体等 优点。同时作为中间产物，可直接被组织蛋白质合成利用，参与组织蛋白质的合 成与调节，而游离氨基酸没有调节作用【“。 1 1 2 生理活性调节作用 肽作为动物消化道蛋白质的主要酶解产物，是迅速吸收的氨基酸的供体，其 在小肠粘膜的吸收速度要高于相应氨基酸的吸收速度。同时，许多肽具有活性作 用，能参与机体的生命活动，起着调节动物体消化系统、神经系统、内分泌以及 免疫机能的生物活性作用。 阿片样活性肽是一类具有吗啡受体配体活性的生物活性肽，能够作为激素和 神经递质与体内的u 一、6 一和y 一受体相互作用，起到镇痛、调节人体情绪、 呼吸、脉搏和体温的功能；抗菌肽类可以在食物和动物饲料的加工过程中成为理 想的防腐剂，能够增强机体抵抗病原微生物的能力 6 l ；免疫促进肽可增强机体免 疫力；磷酸肽主要是酪蛋白磷酸肽，能够抵抗肠道中的分解作用，与钙形成可溶 性的复合物，阻止钙磷酸盐的沉淀，从而加强肠道对钙的吸收和钙在体内的保持； 还有许多其它的肽可以抗高血压【”、抗血栓、抗艾滋病、抗肿瘤等【8 】。 1 1 3 抗氧化及调味作用 生物活性肽通过抗氧化保护营养物质，通过调味作用增强营养物质摄入量， 以达到增强营养作用的效果。肌肽是一种大量存在于动物肌肉中的天然肽，可抑 制铁、血红蛋白、脂氧合酶及单线态氧催化的脂质氧化作用，可作为储存熟肉的 一种氧化型酸败抑制剂。 不同的氨基酸序列可以用来产生4 种基本的味觉( 酸、甜、苦、辣) 一j 。例如， 天冬酰苯丙氨酸甲酯是一种二肽，也是一种强烈的甜味剂，即人们熟知的 浙江大学硕士学位论文第一章引言 a s p a r t a m e ( 阿斯巴甜) ；鸟氨酸一b 一丙氨酸是一种碱性二肽，也是一种强烈的苦 味肽，寡聚谷氨酸( g l u g 1 u ，g l u g 1 u _ g 1u ) 则是一种苦味掩盖肽。 1 2 生物活性肽的分类 生物活性肽种类繁多，根据不同的划分标准有不同的分类方法，大致上可以 根据来源、生产原料和功能来划分。 按来源划分可以分为：乳源性生物活性肽和非乳源性生物活性肽。 按生产原料可以分为：乳蛋白肽、蛋清肽、大豆肽、玉米肽、豌豆肽、畜产 肽、谷酰氨肽、水产肽等。 按功能活性可以分为：抗菌活性肽、安神麻醉肽、免疫刺激肽、矿物质肽、 抗氧化活性肽、易消化吸收肽、激素肽和调节激素的肽、抗艾滋病肽和抗癌肽、 血管紧张素转换酶抑制肽、苦味肽等等。 1 3 生物活性肽的生产方法【1 1 】 目前获得生物活性肽的方法有几下几种：第一，分离、纯化天然活性肽，从 动植物组织器官中提取，但由于原料来源有限和提取难度大，产品成本较高，只 局限于生产某些有特殊疗效的肽类药物；第二，通过化学方法( 液相法或固相法) 合成，可以按人们的意愿任意合成活性肽，但这种方法存在成本高、副反应物多 等问题，严重制约着其发展，目前化学合成法只限于某些肽类药物和某些生物活 性肽理论方面的研究：第三，选择适合的蛋白酶水解各种蛋白质产生，该方法原 料来源广、生产成本低、安全性高，已经成为活性肽的主要生产方法。 1 4 生物活性肽的应用 1 4 1 在食品工业中的应用 生物活性肽作为一类特殊保健功能性因子，根据其不同的特性可以应用到不 同的食品中。根据它具有较强的吸湿和保湿特性，可以将其用到焙烤食品、肉食 浙江大学硕士学位论文第一章引言 品以及面食品，均可起到保持水分、调整食品硬度、改善风味和口感及延长食品 贮存期等作用；根据它易溶于水，遇酸无沉淀，可用于生产饮料以冷饮食品，此 类制品泡沫丰富，乳化稳定，风味独特；活性肽还可用于生产酱油等调味品，能 提高产品收率，保持产品质量稳定：根据它易消化吸收，故可将其制成特殊营养 制剂，供临床上胃肠消化功能不全及消化道术后不能直接进食患者鼻饲食用，以 维持病人正常营养需求，促进痊愈；亦可将其制成运动员特需食品，以便使运动 员高强度运动后或因特殊项目赛前减少体重者食用后能迅速给机体补充能量，消 除疲劳，恢复体力或体重，提高竞赛成绩；由于活性肽具有多种生物活性，故特 别适合于生产各种功能性保健食品，比如适用于过敏体质者的低敏性食品以及用 于减肥、抗辐射、抗疲劳、抗衰老、抗风湿、降血压、降血脂、降血糖、解酒醒 酒、促进钙、锌等微量元素及其它营养物质吸收、改善脑功能和性功能、预防心 血管疾病以及适合于婴幼儿、老年人、妇女和运动员专用的系列功能性保健食品。 其剂型有片剂、胶囊剂、颗粒冲剂和口服液等，均可供特殊人群用来防病健身， 延年益寿。伴随现代蛋白质工程生物酶技术迅速发展，还将会有大量的生物活性 肽继而被发现，应用生物技术即可生产出大量的生物活性肽并应用于食品【l 。 1 4 2 在医学上的就用 乳源蛋白的酶解产物产生的大量小肽对新生儿的生长发育和成年人的某些 生理机能具有重要意义，可以应用于运动营养，在运动前和运动中添加肽可以减 轻肌蛋白的降解，维持体内正常的蛋白合成，减轻或延缓由运动引起的生理方面 的改变，达到抗疲劳的效果。糖巨肽( g m p ) 可以促进双歧杆菌增殖；糖磷肽( 6 p p ) 具有强烈的免疫刺激活性；类阿片肽可用于治疗腹泻和调节饮食；免疫促进肽可 以增强机体的免疫功能：c p p 可促进人体对钙的吸收：降血压肽可用于预防和 治疗高血压等。开发具有保健和治疗作用的生物活性肽产品将会是二十一世纪的 热点。 1 4 3 在饲料工业上的应用 将生物活性肽添加于饲料中充当饲料添加剂，具有节约蛋白质饲料、提高动 浙江火学硕士学位论文第一章引言 物生产性能的作用。一些生物活性小肽可以直接作用于胃肠道的受体或直接被转 运进入循环中发挥生理活性作用。因此，生物活性肽在动物生产中会有更好的应 用前景，将是动物营养与饲料添加剂中的一个重要研究方向。目前在饲料行业中 生活性肽的主要应用于以下几个方面：改善饲料风味，提高饲料的适口性，具有 饲料诱食剂的功能；代替部分抗生素；满足畜禽对蛋白质的需求，促进机体生 长：作为矿物元素的载体，促进机体对矿物质的吸收：作为天然防腐剂，提高饲 料品质【1 4 j 。 2 白蛋白肽的功能及其研究进展 2 1 白蛋白的重要生理作用 白蛋白是人体血液中量最大、生理作用最重要的一种蛋白，是提供平衡氨基 酸，维持血浆渗透压，增加血容量等的重要成分。在体内与钙、铜、锌等离子及 某些化合物( 如胆固醇、磷脂、胆红素、乙酰胆碱、组胺、甲状腺素等多种药物) 均有较高亲和力，发挥运输和调节作用。此外，体内代谢的产物，如胆红素等与 白蛋白结合后，经肝脏由胆汁排出。对某些药物在体内发挥作用，白蛋白也起着 重要作用，一些抗菌药物，如磺胺类、青霉素类抗菌素均需与白蛋白相结合才转 运到组织中产生作用【】5 o 如果人体缺乏白蛋白就会引起以下后果：1 细胞就得 不到合成蛋白质的原料，造成蛋白质营养不良，体内抗体减少，免疫系统功能降 低，人体就虚弱，没有活力，特别容易感冒和感染疾病。2 体内的激素分泌和 运输会受到影响，内分泌系统出现紊乱，导致机体的许多功能失调，长期受此影 响，容易产生肿瘤等多种疾病。3 营养物质，维生素，微量元素，药物缺乏载 体，不易到达相应细胞和器官，使细胞得不到营养支持，也降低了药物治疗效果 4 影响血浆胶体渗透压的f 常，如果出现自蛋白与球蛋白的比例小于i ，即白 球比例倒置，细胞和组织间液体潴留，可引起浮肿，胸肿，腹水等现象。5 会 破坏人体内酸碱平衡。但是，医学上用的白蛋白制剂是一种血浆代用品，使用对 象是出血性休克、外伤性休克、烧伤、肝硬化腹水和水肿、恶性肿瘤及肾病等患 者的某些情况。可见，白蛋白制剂是一种营养药而不是营养品，不能作为常规的 营养品来补充。 浙江大学硕士学位论文第一章引言 2 2 白蛋白肽的作用 白蛋白肽是由卵清蛋白经复合定向酶切等现代生物技术获得的，是人体功能 肽和高营养蛋白质补充剂。白蛋白肽是分子量小于3 5 0 0 d 的多肽组分，其氨基 酸序列包括1 3 个2 肽、7 个3 肽、8 个4 肽、5 个5 肽4 个6 肽、1 个7 肽、4 个8 肽、4 个9 肽、2 个l o 肽、1 个1 3 肽、1 个1 5 肽等。其中分子量在1 0 0 0 d 以下占7 8 4 ，几乎全部处于小肽分子系列。蛋白质摄入后在体内产生的生理功 能，绝大多数可以由相应的多肽来实现。根据科学家对鸡卵清蛋白的研究成果， 人们发现鸡卵白蛋白和人血白蛋白的氨基酸组成比例非常相似，其生物学效价高 达到9 4 ，是目前最优秀的蛋白质，其酶解后所得的卵清白蛋白肽，各种氨基酸的 组成和比例与人血血浆蛋白非常相似，因此，所提供的营养价值和功能是相似的。 白蛋白肽除具有补充必需氨基酸、维持血浆胶体渗透压、及各种医疗作用外，对 人体还具备多种调节功能，如调节免疫、增强肠道有益菌群的繁殖、促进食物中 核酸在肠道的吸收及在胸腺、肝脏等重要器官的分布等多种调节功能。其中，胸 腺是机体免疫功能的中枢器官，担负着重要的免疫调节作用，体内的淋巴细胞是 在这里分化、成长的。肝脏对机体物质代谢和能量代谢起着重要作用。实验表明， 给予昆明小鼠白蛋白肽灌胃4 0 天( m t t 法) ，结果显示，白蛋白肽组比对照组 提高脾淋巴细胞增殖活性达1 8 。对少年、儿童及老年人抵抗疾病的侵袭， 增强抗病能力是非常有利的。国内专家研究了白蛋白肽对人体肠道菌群和幼鼠生 长发育的影响，证实白蛋白肽具有提高食物转化率及显著提高血红蛋白的作用。 此外，在超短肠综合症病例发现，给予添加白蛋白肽的食物3 个月，不仅临床症 状有明显改善，其肠道有益菌群也有显著上升，双歧杆菌值达到北京地区1 9 4 0 岁健康男性的上限的1 4 。虽然食物中含有丰富的蛋白质，但是白蛋白吸收 是一个很复杂的过程，因为蛋白质是大分子物质，并不是能被肠、胃直接吸收， 而要转化为氨基酸。氨基酸是合成蛋白质的基本单位，早在1 9 6 0 年，国外的科 学家发现人体内存在允许肽类，特别是小分子肽类物质通过的特殊通道7j ，而 肽结合的氨基酸较游离的更易吸收。为此将卵清白蛋白降解为小分子肽和氨基 酸，有利于人体吸收。而且跟人血白蛋白相比，白蛋白肽不但价格低廉，还可以 避免感染，注射人血白蛋白除容易发生输液反应【1 8 】，更可能引起各种肝病，甚 至艾滋病的感染。再者人体内的白蛋白主要是通过肝脏来合成的，这对肝功能受 浙江大学硕士学位论文 第一章引言 损、白蛋白来源不足的人来说无疑是种负担。而白蛋白肽却是经过特殊通道由 小肠壁来吸收，直接参与机体组织的生物化学过程，无须肝脏参与其事，自然会 让肝脏大大减轻合成的负担，有利于肝脏功能的恢复。白蛋白肽的研制成功，为 补充人体的白蛋白、整体提高机体水平提供了一个安全、有效、方便、价廉的全 新途径。 2 3 白蛋白肽的国内外研究现状 白蛋白肽是将氨基酸序列与人血白蛋白极其相似的卵清蛋白酶切所得的产 物，其所具有的调整人体免疫功能，提高血清蛋白含量，改善微循环，进而增强 体质，提高防病能力的作用已被国内外研究者广泛报导。白蛋白肽制成的胶囊等 产品在市面上也已经可以找到。在日本，自蛋白肽已市售，平均分子量1 l o o ， 其水溶液呈乳状，广泛用于营养辅助食品和点心；此多肽再经高度水解后，可得 到平均分子量约3 0 0 道尔顿的药品级多肽，其水溶液透明，与蛋壳钙配合在营养 上具有协同效果，用于婴儿食品、以及老年人食用的“银色食品”。 由于功能肽产业在中国刚刚起步，但就整体的技术水平和研发能力，并不比 欧美落后多少，只是消费者和企业的认知度不够，关注的企业不少，炒概念的大 有人在，真正大投入的不多。随着功能肽产品将越来越成为营养保健品的热门产 品，政府和企业对它的认识的加深，它必将成为未来企业投资的热门产品之一。 3 成鸭蛋蛋清的利用状况 3 1 成鸭蛋蛋清的营养价值 咸蛋清中约含1 0 1 1 的蛋白质，盐含量约4 ，其余的主要是水分。卵蛋 白含人体8 种必需氨基酸，尤其是含硫氨基酸较多，动物实验证明是一种比奶酪 还好的蛋白质。这些蛋白质又可分为6 种：卵白蛋白( 约占蛋白质总量的7 0 ) 、 伴白蛋白( 9 1 5 ) 、卵球蛋白( 96 ) 、卵粘蛋白( 2 ) 、类卯粘蛋白( 1 3 0 ) 、抗 生物素蛋白( o 0 6 ) 1 9 1 。它们从形状上都属于球蛋白，但其特性各不相同。鸭蛋 蛋白的化学组成与鸡蛋蛋白相似，并且其组成模式也十分类似于鸡蛋白口。更 重要的是禽蛋蛋白是一种全价蛋白，其氨基酸组成与人体需要最为接近和相适 浙江大学硕士学位论文第一章引言 且o 3 2 咸鸭蛋蛋清利用的局限性 咸鸭蛋是我国的主要蛋制品之一。咸鸭蛋蛋黄由于其特其的质地和风味而倍 受人们喜爱，但是毫无风味可言的咸蛋清往往成为盘中的弃物。 咸蛋清的发酵分解及腐败，对周围的环境、水源都造成严重的污染。蛋清中 含有约1 0 的优质蛋白质，咸蛋清的遗弃是蛋白质资源的极大浪费。但是因为 高钠食品可诱发诸如心血管疾病的报导【2 l _ 2 4 1 也日益为人们所关注，咸鸭蛋蛋清由 于其过高的含钠量使得它的开发利用价值被极大的限制。 除居民日常消费外，食品工厂如五芳斋粽子厂每年生产的蛋黄粽在上千万只 以上，其浪费的蛋清在几百吨，使得蛋白质资源白白流失，污染环境。 3 3 成鸭蛋蛋清的利用现状 曾有报导国内某公司利用咸鸭蛋蛋清作为大水面养鱼的饲料，这不仅浪费了 大量的优质蛋白，且饲养效果还有待评估。也有人研究从咸蛋清中提取溶菌酶代 替传统的防腐剂用于畜产品上 2 ”，或依据咸蛋液较好的理化性而运用于法兰克 福香肠等【2 6 1 。但是这些方法都不能最大程度得利用好咸蛋清中营养价值很高的 蛋白质资源。因此如何利用更为有效的手段利用咸蛋清资源己逐浙引起人们的关 注。本研究将成鸭蛋蛋清直接酶解后再脱麓制取高营养价值的白蛋白肽可以说是 目前利用咸蛋清的最好方法之一。 4 当前几种可行的脱盐方法及其概述 4 1 膜技术及其在食品工业中的应用 自上世纪和6 0 年代开始，膜技术由于其独特的性能在食品工业中得到广泛 的应用。它跟传统的分离过程相比，具有以下优点：l 、有高效、节能、投资省、 工艺简单；2 、因无热效应而避免产物的热和氧化降解及受热变性等；3 、由于无 相变也不会造成溶胶的破坏，乳液的破裂和与冷冻有关的机械损伤等；4 、由于 浙江大学硕上学位论文 第一章引言 加工中不需加入溶剂和沉淀剂也不必改变离子强度和p h ，所以不会带入外部杂 质，同时还可选择地除去酸、碱或赫，从而使产品进一步纯化硼。 膜技术能据食品工业的具体要求，保留所需成份，去除不需要的物质，如 除菌、除浊、除微粒、去胶体、脱盐、脱水、脱色、脱酸、除异味等等，以实现 分离、分级、净化、精制、浓缩和回收再用等【2 8 】。膜技术作为一单元操作，在 实际工业生产中己部分或完全代替了沉淀，常规干燥、蒸发、冷冻、离心和萃取 等工艺过程。 4 1 1 超滤及其在食品工业上的应用 超滤的分离机理为筛孔分离过程，在静压差( o 1 一o 5 m p a ) 为推动力的作 用下，原料液中溶剂及小溶质分子从高压的料液侧被透过膜到低压侧，而大粒子 组分被膜所阻拦，使它们在滤剩液中浓度增大。常用切割分子量或切割相对分子 质量m w c o 来表征超滤膜的分离性能，一般认为超滤的m w c o 范围为5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 ，可分离的粒子或大分子包括病毒、蛋白质、多糖、胶粒等【2 9 l 。 近年来超滤技术被广泛地应用于食品加工中，主要用于分离、分级、净化、 澄清和浓缩等。目前已经利用超滤技食品加工有以下：果蔬汁的灭菌和澄清、乳 白蛋白浓缩、牛乳清浓缩、豆渣中蛋白的纯化等3 0 1 1 3 ”。 由于咸鸭蛋蛋清中的盐分含量较高，蛋清中蛋白质的分子量基本上在几万， 最小的也在5 千以上，而盐分相对于蛋白质来讲分子量就显得很小。考滤利用超 滤的分离作用，可以直接对原料进行脱赫处理，经脱盐处理后得到的料液方便进 行下一步的酶解作用。 4 1 2 纳滤及其在食品工业上的应用 纳滤是介于反渗透和超滤之间的一种膜【3 2 】，它的表层孔径范围在纳米级 ( 1 0 4 m ) ，平均孔径为2 r i m ，相对分子质量截留范围为2 0 0 - - 1 0 0 0 。纳滤膜的分 离层通常荷负电化学基团，多数纳滤膜表面荷负电。 纳滤膜因也是以压力差为推动力的膜分离过程，其分离机理可以运用电荷模 型、细孔模型以及近些年来提出的静电排斥和立体阻碍模型等来描述。因纳滤膜 浙江大学硕士学位论文第一章引言 结构和性能上的特点，使得纳滤膜分离技术在食品工业领域得到广泛的就用。目 前纳滤膜分离技术应用在氨基酸和多肽的分离、低聚糖的分离、油脂中游离脂肪 酸的分离和果汁的浓缩等方面，都取得不错的效果【3 3 。 蛋白质酶解之后所得到的水解液所含的肽分子量在1 0 0 0 5 0 0 0 之间还含 有少量的游离氨基酸分子。利用其他的方法，很难将其中的盐分基本去除而又对 有效成分造成的损失少。纳滤膜的孔径更适合截留低分子量的肽成分而去除盐 分。 4 1 3 电渗析及其在食品工业上的应用 电渗析膜技术是将阴、阳离子交换膜交替排列于正负电极之间，并用特制的 隔板将其隔开，在直流电场的作用下，以电位差为推动力，利用离子交换膜的选 择透过性，把电解质从溶液中分离出来，从而实现脱盐的目的【3 ”。电渗析同其 他的膜过滤技术相比，具备的优点是：能量消耗低：药剂耗量少，环境污 染小；对原水含盐量变化适应性强；操作简单，易于实现机械化、自动化； 设备紧凑耐用，预处理简单：水的利用率高。 电渗析目前在食品工业上的应用主要有从发酵液中提取乳酸，柠檬酸、苹果 酸等其他有机酸的分离，从海带浸泡液中提取甘露醇，脱除葡萄酒中的钾盐，对 脱蛋白后的乳清进行脱盐等1 3 5 j 。 咸鸭清中的盐分含量很高，而电渗析在高盐浓度下其工作效率不会降低，也 很适合这个体系的脱盐。 4 2 离子交换树脂及其在食品工业上的应用 离子交换技术有相当长的历史，某些天然物质如泡沸石和用煤经过磺化制得 的磺化煤都可用作离子交换剂。但是，随着现代有机合成工业技术的迅速发展， 研究制成了许多种性能优良的离子交换树脂，并开发了多种新的应用方法，离子 交换技术迅速发展，在许多行业特别是高新科技产业和科研领域中广泛应用。离 子交换树脂是5 0 年代初发展起来的一种塑料聚合物。表面具有带电基团，阴离 子交换树脂的表面是带正电的基团；而阳离子交换树脂的表面是带负电的基团。 浙江大学硕士学位论文第一章引言 在工业应用中，离子交换树脂的优点主要是处理能力大，脱色范围广，脱色容量 高，能除去各种不同的离子，可以反复再生使用，工作寿命长，运行费用较低( 虽 然一次投入费用较大) 。 刘湘菊”等人报导了利用苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂的盐型柱，根据氨 基酸与苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂之问既存在离子间的静电作用又存在疏 水作用，且二者之间存在协同作用，而盐在盐型苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂 柱上不保留的原理用，水作为洗脱剂使盐和氨基酸配制的盐和氨基酸混合液及含 盐的毛发水解液得到分离。这种方法脱除氨基酸中的盐简单易行，用水作为洗脱 剂既廉价由不造成污染，盐型树脂不用再生即可用于下次运行。 5 试验内容简介 本课题的主要研究内容包括 5 1 成鸭蛋蛋清脱盐方法及效果的研究 目前对咸鸭蛋蛋清进行脱赫较为可行的路线有两条：原料直接脱盐或酶解以 后水解液再脱盐。脱盐的方法主要利用膜过滤技术脱盐。选择前一种方法，其优 点是原料蛋清脱盐以后，其成份跟新鲜蛋清相似，可能有利于下一步酶解过程中 酶的选择及作用效率，因为在高浓度盐的作用下酶可能会被抑制而使酶活下降， 酶解效率降低。而同时原料先脱盐所存在的缺点是，原料蛋清本身比较粘稠，容 易附着于过滤膜，脱盐效率降低，对膜容易造成污染，应该在有一定预处理的情 况下，彳可以脱盐。另一个缺点是虽然原料已经脱盐完毕，但是酶解过程中调节 p h 值时加酸加碱还是会带入一部分的盐，水解完成后盐的含量又上升，可能需 要再一次的脱盐，增加生产工序。选择先酶解后脱盐，优点是用酶解液来脱盐， 本身粘度相比原蛋清下降很多，脱盐过程容易，脱盐可以一次完成。而同样存在 着缺点水解液中成分组成复杂，这对膜过滤脱盐是不利的，另外就是要选择在高 盐浓度下高效酶解咸蛋清的酶及酶解参数。 浙江大学硕士学位论文 第一章引言 5 2 咸鸭蛋蛋清水解工艺研究 通过蛋白酶对脱盐咸鸭蛋蛋清或咸鸭蛋蛋清进行酶解处理，获得白蛋白肽 产物。由于影响酶解反应的因素很多，其中，底物和酶的特性是最重要的。本课 题计划在参考一些文献的基础上，拟确定以下几个工艺参数。酶的确定反应 时间，酶解进程曲线水解p h 的确定酶解温度的确定底物浓度的确定酶 用量的确定。 浙旺大学硕士学位论文第二章白蛋白肽的制备 1 引言 第二章白蛋白肽的制备 目前，世界上人工合成多肽的方法有十多种，如固相合成法，液相合成法， 微生物发酵法，酸解法，碱解法，电泳法，动物脑腺分离法，植物提取法，酶解 法，克隆法，基因法等。 其中，酶法生产活性肽安全性极高、能在温和的条件下进行定位水解分裂产 生特定的肽，且水解过程易控制口”，近几年报道的活性肽的制各方法皆为酶解 法。酶法水解所生产的多肽具有极强的活性和多样性，具有重要的生物学功能， 最易被人体吸收，可参与人体生理过程，参与人体的神经、激素内分泌系统和循 环系统，对人体健康起着奇特的作用。考虑到以上诸多优点，本文决定用酶法生 产白蛋白肽。 本章的主要内容是对以成鸭蛋蛋清为原料来制备白蛋白肽的工艺流程进行 优化，工艺优化的重点为蛋白酶酶解反应。酶解反应从酶的种类、反应时间、底 物浓度、酶浓度、反应体系的p h 值和温度等因素着手，以水解度( d h ) 、得率 为主要指标，来研究酶解反应的最佳条件。 2 材料、试剂和设备 材料：成鸭蛋蛋清( 浙江余杭顺风祥禽蛋专业合作社提供) 、各种蛋白酶( 酸性 蛋白酶，无锡酶制剂厂：碱性蛋白酶，上海宝丰生化有限公司；中性蛋白 酶，无锡酶制剂厂；风味蛋白酶，广西南宁庞博生物技术有限公司) 试剂：氢氧化钠( 分析纯) 、盐酸( 分析纯) 、溴甲酚绿一甲基红指示剂、浓硫酸 ( 分析纯) 、硫酸铜( 分析纯) 、硫酸钾( 分析纯) 、硼酸( 分析纯) 、9 5 乙醇、三氯乙酸( 分析纯) 、甲醛( 分析纯) 设备：恒温磁力搅拌水浴锅、p h s - - 3 c 型酸度计、凯氏定氮的系列装置、离心 机、高效液相色谱仪、7 5 2 紫外可见分光光度计 浙江大学硕士学位论文第二章白蛋白肽的制备 3 试验方法 3 _ 1 工艺流程 原料一加水稀释一预处理一在设定温度的水浴锅中保温一调节溶液的p h 于 设定条件下一加入酶开始酶解一用0 5 m o l l 的h c l 或n a o h 保持溶液p h 不变一 搅拌酶解到一定时间一调节溶液的p h 至等电点终止反应一8 5 保温搅拌3 0 分钟 一冷却后4 0 0 0 r p m m i n 离心一取上清液 3 2 分析方法 3 2 1 得率的测定方法一一半微量凯氏定氮拍町 蛋白质含量测定： 准确称取o 2 2 0 9 固体样品或1 0 2 0 m l 液体样品，移入l o o m l 干燥的1 0 0 m l 消化管中，加入o 2 9 c u s 0 4 、3 9 k z s 0 4 和2 0 m l 浓h 2 s 0 4 ，稍摇匀后于瓶口放一小 漏斗，置于消化炉消化，直至管内的液体成蓝绿色且澄清透明后，再继续消化 o 5 h ，取下冷却，加2 0 m l 水，完全冷却后定容至1 0 0 m l ，摇匀。取出1 0 m l 置于 简易式半微量凯氏定氮仪，并加入1 0 m l4 0 n a o h 溶液，用1 0 m l2 硼酸溶液 ( 加入三滴甲基红和溴甲酚绿混合指示剂) 为接收液，进行蒸馏定氮。最后，以 o 0 5 m o l l 盐酸标准液滴定至接受液由蓝色变为蓝紫色。则 样品中蛋白质的含量：! 堡二堡! ! ! ! ! ：! ! ! 。f 。1 0 0 ( 或g 1 0 0 m 1 ) m 1 0 1 0 0 。 v ，一样品消耗盐酸标准液的体积m 1 v 2 一试剂空白消耗盐酸标准液的体积m i m 一样品的质量或体积g 或m 1 c 一盐酸标准液的浓度m o l l 1 4 一氮的摩尔质量g m l f 一氮换算为蛋白质的系数 得率= 产品中的蛋白质原料中的蛋白质1 0 0 浙江大学硕士学位论文 第二章白蛋白肽的制各 3 2 2 水解度的测定 水解度b i t ( d e 伊e eo f h y d r o l y s i s ) 的定义【3 9 1 ： d t t = h h t o t 1 0 0 式中：h 一水解后每g 蛋白质被裂解的肽键毫摩尔数( m t o o l g ) h t 。一每克原料蛋白质的肽键毫摩尔数( mm o l g ) 水解液中一n h 2 的含量测定( 甲醛滴定法) 4 0 1 吸取样品v 3 m l ，定容到1 0 0 m l ，吸取2 0 o o m l 置于烧杯中，加水6 0 m l ，开 动磁力搅拌器，用o 0 5 m o l ln a o h 标准液滴定p h 至8 2 。加入l o 0 0 m l 中性甲 醛溶液，混匀，在用0 ，0 5m o l l n a o h 标准液继续滴定至p h 为9 2 ，记下消耗氢 氧化钠标准液的毫升数。同时取水8 0 m l ，作空白试验，则 样品中氨基氮的含量= 翌土望丢篆掣g m l vz u ， v - n 定用样品加入甲醛稀释后消耗氢氧化钠标准液的体积m l v 2 一试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准液的体积m l v 3 一样品液取用量m 1 c 一氢氧化钠标准液的浓度m o l l 1 4 - - 氮的摩尔质量g m l 水解液中蛋白质含量的测定：利用凯氏定氮法测定 利用上述结果计算出水解度： 。h一!呈!二二!；i；i；掣+一，。，。 3 2 3 肽的分子量分布的测定1 主要试剂：超纯水，乙腈( 色谱纯) ，三氟乙酸( 分析纯) ，聚乙二醇分子量 标准品系列( a g i l e n t ) ，肽类分子量标准品( 细胞色素c ， m w l 2 4 0 0 ；抑肽酶， m w 6 5 0 0 ：杆菌肽，m w l 4 5 0 ：乙氨酸一乙氨酸一酪氨酸一精氨酸，m w 4 5l ；乙 氨酸一乙氨酸一乙氨酸，m w l 8 9 ；进口试剂分装) 主要设备：w a t e r s 色谱分离系统，2 9 9 6 二极管阵列检测器，t s k 系列凝胶 浙江大学硕士学位论文第二章白蛋白肚的制各 色谱柱( g 2 5 0 0 p w x l7 - 8 3 0 0 m m ) 微孔过滤器 样品预处理 固体样：取1 9 样品用流动相定容至2 5 0 m l ，经0 4 5 1 t m 微孔滤膜过滤后上机 测定。 液体样：根据待测样的粗蛋白含量而定，即取相当于含有1 9 蛋白的液体样， 用流动相动容至2 5 0 m l ，经04 5 ”m 微孔滤膜过滤后上机测定。 色谱条件 流动相：4 5 乙腈+ 5 5 水+ 0 1 三氟乙酸 流速：0 5 m l m i n 温度：室温 样品浓度：用流动相稀释，含量为0 1 ( w v ) 进样量：1 0 l - tl 3 2 4 氨基酸组成的测定h ” 主要试剂：氨基酸标准品( b d hc h e m i c a l sl i dp o o l ee n g l a n d ) 、乙腈( 色 谱纯) 、甲醇( 色谱纯) 、异硫氰酸苯酯( 化学纯) 、三乙胺( 分析纯) 、醋酸钠( 分 析纯) 、磷酸氢二钠( 分析纯) 、无水乙醇( 分析纯) 、正己烷( 分析纯) 主要仪器：w a t e r s2 6 9 5 高效液相色谱仪、w a t e r s2 9 9 6 二极管阵列检测 器、反相c 。柱、真空干燥器、z k b 一9 9 型循环水多用真空泵、安瓿管、万分之 一电子天平、k q - - 2 5 0 b 型超声波清洗器、数显电热鼓风干燥箱 肽水解成游离氨基酸 称取l m g 的蛋白质样品于安瓿管中，加入6 m o l lh c i 溶液i m l 后真空烧 结封口，移入1 5 0 恒温箱中加热1 5 h ，取出冷却。用微量注射器吸取2 0ul 水 解液于1 5 m l 离心管中，并在水浴中蒸发干燥备用。 氨基酸的衍生化反应 溶液配制 再干燥液：乙醇：水：三乙胺= 2 ：2 ：1 ( v v ) 衍生溶液：异硫氰酸苯酯：乙醇：三乙胺：水= 1 ：7 ：1 ：l ( v v ) 。 样品稀释液：取3 5 4 m g n a 2 h p 0 4 1 2 h2 0 加2 0 0 r a l 蒸馏水溶解，用磷酸一乙腈 浙江大学硕士学位论文 第二章白蛋白肽的制各 ( 9 5 5 ) 溶液调至p h7 4 ，备用。 氨基酸标准储备液：准确称取氨基酸对照品各1 0 m g 于2 5 m l 容量瓶中，加 0 1 m o l h c i 超声溶解并定容。 衍生条件 取1 0ul 氨基酸标准储备液和蛋白水解液分别置于0 5 m l 离心管，真空干燥； 加1 0 ul 再干燥液，真空干燥；加2 0 ul 衍生剂溶液，超声处理后放置2 0 r a i n ， 再真空干燥。取干燥后的样品，加1 0 0ul 样品稀释液，超声溶解，离心分离 吸取适量上清液，进行色谱分析( 也可将干燥后的衍生物储存于0 1 0 。c 冰箱中， 备用) 。 h p l c 分离 色谱柱：c 1 8 ( 2 0 0 4 6 m m ，5um ) 柱温：3 8 进样量：1 0 pl 检测波长：2 5 4 n m 流速：1 0 m h m i n 流动相：a ：0 1 m o l l 醋酸钠一乙腈( 体积比9 7 ：3 ) 溶液 b ：乙腈一水( 体积比4 ：1 ) 溶液 表2 一l 梯度洗脱时间表 t a b l e2 一it h ep r o c e d u r eo fg r a d i e n te l u t i o n 浙江大学硕士学位论文 第二章白蛋白肽的制各 3 2 5 蛋白酶活力测定紫外分光光度法 蛋白酶在一定温度与p h 条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯醋酸终止 酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光 度法测定，根据吸收度计算酶活力。 酶活力定义 在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1 “g 酪氨酸相当的产物所需的酸性蛋 白酶的量，为1 个活力单位。 试剂 酸性稀释液一乳酸缓冲液 甲液称取乳酸( 8 0 9 0 ) 1 0 6 9 ，加水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 乙液称取乳酸钠( 7 0 ) 1 6 9 ，加水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 使用溶液取甲液8 m l ，加乙液l m l ，混匀，稀释一倍，即成o 0 5 m o l l 乳酸 缓冲液。 碱性稀释液一硼酸缓冲液 甲液称取硼酸钠1 9 0 8 9 ，加水溶解并定容至10 0 0 m