（食品科学专业论文）采后青梅果实叶绿素降解机制及保绿措施的研究.pdf

中文摘要 研究了青梅果实( 简称梅果) 置于不同温度贮藏下果肉色泽及有关的主 要生理指标的变化。结果表明，于1 0 。c 和l 下贮藏，梅果呼吸强度、乙烯 释放量均较低，果实硬度、酸度、p h 值、f o 和f v f m 值及果肉色泽变化幅度 基本上较小，叶绿素和类胡萝h 素含量下降较缓慢，其衡量色泽a 和l l u e a n g l e 值分别在一1 0 和1 0 5 上下波动，这与感官鉴定结果相一致，果肉一直为 黄绿色。而在2 5 c 下贮藏的梅果呼吸强度、乙烯释放量分别在贮藏第6d 和 8d 均出现一个明显高峰，这说明梅果属于呼吸跃变型果实，可能与柿子的类 型相同属“晚峰型”；贮藏6d 内，果肉硬度、f o 和f v f m 值及叶绿素和类胡 萝卜素含量迅速下降，果肉急剧黄化。这表明温度对采后梅果果肉色泽及衰 老有很大的影响。低温可延迟梅果衰老和叶绿素降解，延缓果实色泽转黄的 进程，而在常温下梅果叶绿素降解速度非常快，软化和转黄速度非常也迅速。 因此在室温下梅果仅能保鲜5d 左右。 对梅果在2 5 下贮藏各指标之间关系的研究表明，果肉叶绿素含量与果 肉硬度的变化呈正相关性( r - o 9 7 5 5 ) ；类胡萝h 素与叶绿素含量之比不断增 大；a 和i l u ea n g l e 值可作为判断梅果黄化程度的指标；f o 和f v f 1 值只能 反应叶绿素含量、果实硬度和色泽变化大致趋势，不能作为梅果衰老及色泽 变化的正确指标。 在2 5 下，研究了采前喷g a ；、采后添加乙烯吸收剂和充气包装对果实有 关生理及保绿效果的影响。结果表明，三种处理均能抑制梅果呼吸强度和乙 烯释放量上升，保持果实硬度，延缓果实软化进程及叶绿素和类胡萝i - 素含 量的降解，较好她保持果实绿色，尤其是充气包装处理效果更佳。实验证明 不同气体成分处理的以6 o 。、4 c o ：和g o n ：为组合效果最好。 采用h p l c 方法检测梅果叶绿素和衍生物成分及相对含量，并研究了叶绿 素降解途径( 脱镁叶绿酸a 氧化途径) 中相关酶的活性。结果表明，在采后 梅果叶绿素降解过程中未检测到脱镁叶绿素a 、b ( p h ya 、b ) 和脱镁叶绿酸 b ( p h e ob ) 物质积累，这表明梅果叶绿素降解初始反应不存在以叶绿素a 、b ( c h la 、b ) 为底物直接脱去镁离子，说明脱镁螯合酶( m d c a s e ) 只能催化作 x 用脱植基时绿素a ( c h l j d ea ) ，并推测c h l b 在完全降解之前可能先转化为 c h la 形式。在采后梅果叶绿素降解过程中检测到叶绿素代谢衍生物有 c h l l i d ea 、b 和脱镁时绿酸a ( p h e oa ) ，参考其它高等植物时片研究文献r 可推测与梅果转黄有关脱镁叶绿酸a 氧化途径的几步降解反应：即首先c h l a 、 b 在叶绿素酶( c h l a s e ) 作用下，脱去植基形成c h l l i d ea 、b ：接下来卟啉 环中心镁离子经m d c a s e 催化脱去生成p h e oa ；然后在p h e oa 氧化酶和r c c ( 红色叶绿素代谢产物) 还原酶联合作用下，生成无色的物质。同时，通过 对衍生物积累的相对含量分析表明与采后梅果黄化密切相关的步骤可能足叶 绿索降解的第二步或第三步反应。另外，通过研究分析了充气包装和乙烯吸 收剂处理的梅果均对c h l a s e 活性无影晌，但可抑制m d g a s e 活性峰型出现， 尤其以前者处理更明显。因此推测l f i d c a s e ( 而不是c h l a s e ) 在梅果叶绿索降 解途径中起到重要作用或参与调控。 叶绿素降解除了上述的p h e oa 氧化途径外，还易发生氧化漂白降解。因 此就采前喷g a 。充气包装和添加乙烯吸收剂处理对梅果叶绿体内活性氧代谢、 j ，o x 活性及膜脂过氧化的影响进行了研究，并分析时绿体活性氧代谢和叶绿体 膜脂代谢与叶绿素降解的关系。结果表明，在2 5 c 下贮藏，与未处理相比 三者处理提高了果实叶绿体中s o d 的活性，同时抑制了p o ) 活性上升，延缓 叶绿体中的a s a 和6 s h 含量下降，抑制j ：0 ：、0 ：和m d a 生成，延缓叶绿素降 解；采后第4d ，未处理梅果的l o x 活性急剧上升。亚油酸水平急剧降低亚 麻酸比例明显提高，采前喷g a ，和乙烯吸收剂处理的也呈类似变化，但变化幅 度较小，面充气包装的l o x 活性始终处于较低水平，亚油酸和亚麻酸组分变 化不大。因此推测三者处理有可能通过维持叶绿体中活性氧代谢平衡，抑制 l o x 活性上升，减少膜脂过氧化作用，降低自由基生成含量，维持亚油酸和亚 麻酸水平，保护膜的稳定性和完整牲，从而延缓了升绿素降解。总之，通过 三种处理的效果说明叶绿体中活性氧酶系统及活性氧均参与了叶绿素代谢， 叶绿素降解稷度与叶绿体膜完整牲及膜脂脂肪酸比例成分有密切关系。 试验还研究了叶绿素降解与内源激素i a a ，c a ，a b a 的关系。充气包装梅 果的g a 含量较高，i a a 和a b a 含量则较低；来处理的梅果则相反，【a a 和加m 含量高，而g a t 含量较低；乙烯吸收刺处理的处于二者之间，这暗示了g a 、可 x 延缓叶绿素降解，a b a 则可能通过促进乙烯产生加速了叶绿素降解，低浓度 i a a 可抑制乙烯生成，延缓叶绿素降解，高浓度则促进了乙烯的生成，加速叶 绿素降解。 未处理梅果在2 5 贮藏6d 后，叶绿体结构发生了明显的变化，其被膜 和类囊体片层几乎瓦解，而采前喷g a 。乙烯吸收剂和充气包装处理的梅果叶 绿体被膜和类囊体相对较完整，保持时绿体周有的空问结构因此延缓了叶 绿素降解酶与叶绿素在空间上分隔的破坏，因此有可能减少了叶绿素的降解。 各处理的叶绿体超微结构的观察结果与叶绿素含量的测定结果基本一致。 关键词：梅果，采后，采前g b 乙烯吸收剂，充气包装，叶绿素，降解，活 性氧，内源激素 x l 致谢 本论文是在导师席玛芳教授悉心指导下完成的，导师严谨的科学精神、 执着的事业追求、高尚的人格情操与和蔼可亲的为人态度，时刻感染和鼓舞 着我，使我受益匪浅。本论文实验的大部分工作是在浙江万里学院宁波农产 品贮藏与加工重点实验室完成，在此得到了另一位马子骏老师的悉心教诲。 从试验方案的设计、实验准备和开展到实验结束整个过程无不凝聚着马老师 的大量心血，给予了非常多的指导和支持，并还亲自帮助耀决试验过程遇到 的许多实际困难，同对在生活上，亲自安排食宿，给予了我无微不至的关怀， 使我能顺利地完成实验，让我终生难忘! 另外，马老师富于开拓性的思维、 果断的工作作风、严谨工作态度和亲近的为人处事原则将使我受益终生! 这 一切对我今后工作都将产生重要的影响。值此论文完成之际，首先对晒位老 师三年来的谆谆教诲致以崇高的敬意和最真挚的感谢! 非常感谢浙江万里学院宁波农产品贮藏与加工重点实验室的陆胜民博士 在整个试验过程及论文撰写方面给予了大量指导和帮助，并且在生活上给予 相当多的照顾。感谢该实验室的杨性民、李共国、李瑛影、梁伏能和范德康 等老师在工作和生活上给予帮助。感谢同实验室的殷君霞、朱雷娜、孙建、 俞国窕、许晓飞和陆应等同学的帮助。 本系应铁进教授和茅林春教授对论文的设计提出了宝贵的意见，园艺系 的陶俊博士、许文平博士和本系的罗自生博士提供了建议和帮助，在此表示 衷心的感谢! 同时，还要感谢本院的领导和其他老师的关心和帮助。 感谢本校中心实验室的赵德生和洪健老师分剐在气相色谱和叶绿体超微 结构方面提供的帮助。 感谢同门师兄弟杨虎清、刘小杰、候建设、杜荣茂、傅红霞、向庆宁等 在工作和学习方面的帮助。 最后，我要特别感谢我的父母及兄姐和女友在我三年求学期间给予我的 关心、理解、支持和帮助，使我顺利地完成了学业。 谨以此文对所有关心和帮助过我的人们表示衷心的感谢! v 王阳光 2 0 0 3 年5 月于杭州华家池 a b a a s a b h t b n e d n a c h i c h l a s e c h l i d e c h l i na c v d e d t a f c c f d f i g f m f o f v f w g g a ( 3 ) g s h h h p l c h v j a a 缩略词一览表 a b s c i s i ca c i d a s c o r b i ca c i d 2 , 6 一d i t e r t b u t y l - 4 一m e t h y l p h e n o l b r a s s i c an a p u s d e g r e ec e l s i u s c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d c h l o r o p h y l l c h l o r o p h y l l a s e c h l o r o p h y l l i d e c h l o r o p h y l l i na c u l t i v a r d a y e t h y l e n e d i a m i a et e t r a c e t i ca c i d f l u o r e s c e n tc h l o r o p h y l lc a t a b o l i t e s f e r r i d o x i n f i g u r e m a x i m u m c h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c e m i n i m a l c h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c e v a r i a b l ec h l o r o p h y l lf l u o r e s c e n c e f l e s hw e i g h t g r a m g i b b e r e l l i ca c i d g l u t a t h i o n e h o u r h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y h o r d e u m v u l g a v e i n d o l e 一3 一a c e t i ca c i d v 脱落酸 抗坏血酸 叔丁基对甲酚 甘蓝型油菜 摄氏度 互补脱氧核糖核酸 叶绿素 叶绿素酶 脱植基叶绿素 叶绿酸a 栽培种 天 乙二胺四乙酸 荧光叶绿素代谢产物 铁氧还蛋白 图 最大荧光 初始荧光 可交荧光 鲜重 克 赤霉素 谷光甘肽 小时 高效液相色谱 大麦 生长素 l o x m d a m d c a s e m g m i n m i n a d p n c c n m p f c c p h e oa p h y p o d r c c r r c c r h s s o d t i n s w l i p o x y g e n a s e 脂肪加氧酶 m a i o n d i a l d e h v d e丙二醛 m g d e c h e l a t a s e脱镁螫合酶 m i l l i g r a m毫克 m i n u t e 分钟 m i l l i l i e r 毫井 n i c o t i n a m i d ea s e n i n ed i n u c l e o t i d ep h o s p h a t e 烟酰胺腺嘌二核苷酸磷酸 n o n f l u o r e s c e n t c h l o r o p h y l lc a t a b o l i t e s ：非荧光叶绿素代谢产物 n a n o m e t e r 纳来 p r i m a r yf c c初级f c c p h e o p h o r b i d ea脱镁叶绿酸a p h e o p h y t i n脱镁叶绿素 p e r o x i d a s e过氧化物酶 r c cr e d u c t a s e r c c 还原酶 r e dc h l o r o p h y l lc a t a b o l i t e s 红色叶绿素代谢产物 r e l a t i v eh u m i d i t y 相对湿度 s e c o n d 秒 s u p e r o x i d ed i s m u t a s e超氧物歧化酶 t o n 吨 t r i s ( h y d r o x y m e t h y i ) 一a m i n o m e t h a n e 三( 羟甲基) 氨基甲烷 w e e k 周 v 浙江大学博：l 论文采后青梅果实叶绿素降解机制及保绿措施的研究 第一章文献综述 叶绿素( c h l o r o p h y ，c h l ) 也许是地球上生物圈中最重要的光合色素。 早在1 9 1 3 年w l s t a e r 等学者就阐明了c h l 的基本化学结构；5 0 年后，有机 化学家r o b e r t 成功地合成了c h l a ，并因此于1 9 6 5 年荣获诺贝尔化学奖。随 后，人们一直对c h l 生物合成代谢进行了广泛、深入的研究，其生物合成途径 已为公认。然而，令人奇怪，c h l 降解代谢却研究得甚少。对于c h l 降解代谢 的研究可追溯到1 9 1 2 年，a r t h u rsl o l 】发现了参与c h l 分解的一利，酶即叶绿 素酶( c h l o r o p h y ll a s e ，c h a s e ) 。在随后几十年中，研究者对c h l 降解过程的 了解程度也还仅仅局限在于c hj a s e 。主要原因是因为：植物c h l 和动物血红 素皆属卟啉类化合物，二种化合物从谷氨酸和a 酮戊二酸至原卟啉i x 的生物 合成途径相同，该途径首先在动物中得到确认，然后逐渐在植物中被实验所证 实，但由于哺乳动物血红素的降解产物为有色化合物胆绿素( b i l i v e r d jn ) 和胆 红素( b i l jr u b in ) ，人们据此类推，一直期望c h 的降解产物也是有色化合物， 而近年研究结果表明，c h l 的降解产物是无色的，这样，上述错误推测导致了 c h j 降解代谢研究被长久忽略和进展缓慢。据i l e n d r y 等( 1 9 8 7 ) 估计，每年 约有1 0 亿吨c h l 被降解，并且几乎没有留下任何痕迹。植物叶片衰老过程中 c h l 是怎样降解的? 为什么降解? 其降解产物是什么及能否从衰老器官中输出 到植物的其它部位被再利用等问题一直是个谜。近年，随着薄层层析、高压液 相色谱、波谱技术的发展、应用和滞绿突变体的发现，c h l 降解代谢研究取得 了一些突破性进展。尤其是c h l 的无色降解代谢产物的结构被分离和鉴别，掌 握了高等植物衰老组织叶片和果实的c h l 降解代谢中大部分生物化学步骤。 l c h l 降解代谢产物 1 1 绿素类降解产物 目前已经公认检测出了几种具有完整的大卟啉环结构的c h l 降解衍生物 即绿素类降解产物( 图卜1 ) ，包括脱植基叶绿素( c h l o r o p h y l l 川e ： c h l jd e ) ( a m ir s h a p ir a 等，1 9 8 7 ；j o h n s o n 和s p e n c e r ，1 9 9 6 ：s c 和 ( ：( ) ld s c h m id l ，1 9 9 0 ；t h o m a s 等，1 9 8 9 ；y a m a u c h i 等，1 9 9 7 a ) 、脱镁叶绿素 塑翌查堂塑主堡兰 墨堕童塑墨壅生堡耋竖坚坐型丝堡堡笙堕堕! ! ! 生 ( p h e o p h y t i n ：p h y ) ( s c h o c h 等，1 9 8 1 ；a m i r _ s h a p i r a 等，1 9 8 7 ；s c h o c h 和 v je l w c r t h ，1 9 8 3 ) 、脱镁叶绿酸a ( | ) h e o p h o r b i d ea ；p h e oa ) ( a m ir s h a p ir a 等，1 9 8 7 ：，i o h n s o n 和s p e n c e r ，1 9 9 6 i r is o 和( ：0 1d s c h m idl ，1 9 9 0 ；t h o l m l s 等，1 9 8 9 ；y a m a u c h i 等，1 9 9 7 c ) 、焦脱镁叶绿素( p y r o p h e o p h y t i n ) ( s c h o c h 等，1 9 8 i ) 、焦脱镁时绿酸a ( 1 y r o p h e o p h o r h i d ea ) ( z i e g lc r 等，1 9 8 8 ； 8 h m ) k a w a 等，1 9 9 0 ；s h i ( ) i 和s h i m o k a w a ，1 9 9 0 ) 和i 32 一羟基叶绿素 a ( 1 ：31 一h y d r o x yc h la ) ( m a u n d e r s 等，1 9 8 3 ；s c h o c h 等，1 9 8 4 ； z i e g le r 等， 9 8 8 ) 等。在c h l 降解过程中，某些绿索类物质含量一般很少。这表明它们可 能只是代谢中间产物或者是在组织抽提检测过程中人为因素造成的( t h o m a s 等，1 9 8 9 ) 。例如，c h l 脱镁或一些焦合物质就很容易分别在酸性条件和叶绿 素氧 o 叶绿素a 叶绿索b m g c m g c l i oi ic o ( c i i ：,c w l h 脱植基叶绿索am g c t l ：t| ic o o c i i t 脱植基叶绿素bm g c 1 1 0 lc o o c i i t 脱镁叶绿酸a 2 t tc i i -i ic o o c i i - 脱镁什l 。绿素 l 2 1 1c 1 1 ：,l lc 0 0 0 1 = - 脱镁叶绿索b 2 1 1c l i o f | c o o c l l 一 焦脱镁叶绿酸a 2 1 1c h ：t1 i1 1 图l - 1 叶绿素及其衍生物的化学结构式 f i g 1 1 s t r u c t u r e so f c h l o r o p h y l la n di t sd e g r a d a t i o n c a t a b o l i t e s 化酶作用下发生或形成( u t h y 等，1 9 8 6 ) ，而这些物质很有可能与c h l 酶降解 途径不相关( m a t i 1e ，i9 9 2 ；z i e g le f 等，1 9 8 8 ) 。t h o m a s 等人( 1 9 8 9 ) 通过 比较了一些黄化野生型和常绿突变体型植物如羊茅草( f e s t u c ap r a t c n s i s ) 和菜豆的c h l 降解的代谢产物，研究发现常绿突变体型中有c h l j d ca 和h 、 浙江火学博i 。论文 采后青梅果实叶绿素降解机制及 ；| 绿措施的埘宄 p h e oa 积累，说明了该三种代谢物质属于c h l 酶降解途径中的代谢产物。然 而，1 3 - - 羟基叶绿素a 是否是c h 酶降解途径中的代谢产物仍然不清楚 ( m a u n d e r s 等，1 9 8 3 ；y a m u o c hl 等，1 9 9 7 c ) 。在此简单介绍c h 】a 和b 脱下的 植醇的去向。在叶片衰老过程中，植醇保持相当稳定，大部分仍然以酯的形式 存在( c s u p o r ，1 9 7 l ：p a r k 等，1 9 7 3 ：is k e r 等，1 9 8 9 ) 。1 3 0 r l l ik ( 1 9 9 0 ) 研究表明 大麦的c h l 降解的植醇与乙酸结合形成酯，积累于衰老的叶绿体的质体醌中。 1 2 红色的降解产物 l c 等( 1 9 8 7 ：1 9 8 9 ) 当运用薄层层析技术分离非黄化基因型的和黄 化野生型的羊茅草衰老叶片的提取物时，通过比较，首次发现了c h l 卟啉环的 非绿色降解物。黄化野生型的衰老叶片中该化合物在酸性条件下暴露在空气和 光下时，在硅胶层析上呈现锈红色，因此称之为红色的降解产物( r e d c h lo r o p h y l lc a t a b o l il e 8 ；r c c ) ( 图卜2 ) 。随后，b o r t j 】k ( 1 9 9 0 ) 等许多学者 分别在大麦和许多其它植物黄化叶片中发现了相同颜色的1 c c 。运用c h l 的1 c 一毗咯环饲喂生长中的大麦幼苗幼叶( p e i s k e r 等，1 9 9 0 ) 和油菜予叶 ( ( ；i n s b u r g 和m a t e ，1 9 9 3 ) ，然后分离、检测c h l 的降解产物，实验结果 证明i c c 为c h l 的降解产物。运用高压液相技术也从大麦衰老的子叶中分离到 多种水溶性c h l 的降解产物r c c 。后来，k r ；i u t l e f 等人( 1 9 9 7 ) 通过光谱和液相 等技术研究证明了r c c 是卟啉大环经加氧裂解的第一个中间产物，在波长 3 1 6 n m 和4 8 5 n m 处有两个明显的吸收峰。 1 3 荧光性的降解产物 另外，运用c h l 的c 一吡咯环示踪方法，在衰老的羊茅草和大麦叶片中 还检测到一种具有蓝色荧光特性、含量较低的c h l 降解化合物( d l j g g c l in 等 i 9 8 8 t i ：州n s b u r g 和磷a t j l e ，1 9 9 3 ) ，故命名为荧光叶绿素代谢产物 ( j ? l u o f e s c e nl c h lc a t a b o l e s ：f c c ) ( 图i 一2 ) 。g i n s b u r g 等( 1 9 9 4 ) 和 l i o fl o n s t e in e f 等( 1 9 9 5 ) 建立了一个体外合成f c c 的反应系统，即从衰老油 菜子时的时绿体膜中分离出一种氧化裂解酶，加入到含有p h e oa 反应系统中， 经过催化反应，得了一种极性很低的物质，称之为b n f c c 一2 。同时，他们又 在甜椒中分离到另一种同分异构体物质。后来m t l h e c k e r 等人( 1 9 9 7 ) 把它们 称为初级j ? c c ( f ) r a r yf c c ；pj ? c ( ) 。最近，鼬h 1e c k e v 和k r ；i u l l e f ( i 9 9 6 ) 利 浙江大学博土论文 采后青梅果实叶绿素降解机制及保绿措施的研究 用现代波谱分析方法研究油菜衰老子叶中的b nl ? c c 一2 的结构，b n l ? c c 一2 也具 有1 9 一甲酰一1 一丙酰股一胆色素，属于叶绿酸的衍生物。其可见光吸收峰在 3 6 0n i l 处，荧光最大峰在d 5 0n m 处( b a c h m a n n 等，t 9 9 4 ；g i n s b u r g ，1 9 9 3 ； m u h l e c k e 等，1 9 9 7 ) 。与n c c ( 后面介绍) 不同的是，f c c 中连接吡咯环c 和d 环的中间位点( c 一8 和c - 9 ) 有一个不饱和双键。l t c c 含量与c h l 降解速率呈正 相关，表明可能是c h l 的初级或早期中问代谢产物，而不是次级或最终降解物。 并且f c c 随着叶片衰老还会继续降解为非荧光特性的产物。 o 0 p f c c o n c c s r c c 图卜2叶绿素中间代谢和最终代谢产物r c c 、f c c 、n c c s 的化学结构 f i g 1 2 s t r u c t u r e so f i n t e r m e d i a r ya n df i n a lc h l o r o p h y l lc a t a b o l t e s ( r c c 、f c c 、n c c s l 4 浙江大学博士论文 采后青梅果实叶绿素降解机制及保绿措施的i l j f 究 1 4 非荧光性代谢产物 g in s b u l - g 和m a t i 】c ( 19 9 3 ) 发现衰老油菜子叶中合有大量的非荧光性代谢 产物( n o n f i u o r e s c e n l c h lc al a 乩jit 。s ：n c c ) 。从n c c 结构分析表明图卜z 中的几种n c c ( m uh l e c k e f 和k r i u t 】e r 1 9 9 6 ) 和从枫香( n uf r a s p e 和 m o y a n o ，1 9 9 5 ) 与连香树( c u r r y 和e n g e l ，1 9 9 6 ) 两种植物秋叶中分离到的n c c 都同属于c h t a 或脱镁c h i a 降解的衍生物。他们根据其光学特性、极性大小( 反 相高压液相色谱洗脱啦线上保留时间长短) 和所属植物种类对其进行了命名和 划分，如i i v n c c l ，2 ，3 ( 图卜2 ) ，前缀代表植物种类( 如l i v 代表大麦l o r & ，m v u j g # z y 0 。l ，2 ，3 代表在反相高压液相色谱洗脱曲线上的保留时间( 或极性) 长短或大小。荧光性代谢产物种类划分也与此类似。 许多学者研究发现，目前所有研究的植物c h l 降解的衍生物n c c 都具有一 个同样基本的结构：l g 一甲酰一i 丙酰胺一胆色素( m u h le c k e r 等，1 9 9 3 ： m u h 】e c k o r 和k r a u t lo f ，1 9 9 6 ；il u r r l s p e ，1 9 9 5 ；c u f r y 和e n g e l ，1 9 9 6 ：k r f i u t ie r 等，1 9 9 2 ) 。该结构是在大麦植物中首次被发现的( k r a u l e r 等，1 9 9 1 ) 。只不 过是因n c c 基本结构上的r 基不同而形成不同极性的n c c ，如b n n c c 一1 ，2 3 上的r 基分别为丙二酰基、b 一葡萄糖基和氢。此外，n c c 的连接四个吡咯环 的中间位点均饱和。因而，k r ；i u t e r 等( 1 9 9 2 ) 将t l v n c c 一】与c h 】降解前体 物质的结构进行比较，推知连接毗咯环a 和b 之间的c - 4 与c 一5 位点可能是 c h l 降解的关键位点。 目前所鉴定的大多数非绿色化合物，如f c c i 、i ；c c 2 ( b o r t 】j k 等，】9 9 0 ) 和 n c c s ( b o r t 【i k 等，1 9 9 0 ：m a t i l e 等，1 9 9 8 ；i l n d e r 等，1 9 9 6 ) 均存在于液 泡中。但也有人发现，7 的f c c 2 存在于衰老叶绿体中( d u g g e l i n 等，1 9 9 8 b ： s c h e e n b e r g 等，1 9 9 0 ) 。f c c 2 的不同分布表明f c c 2 作为c h l 的切级降解物， 先在衰老叶绿体中合成，然后被运输至液泡中。最近的许多研究证实了上种观 点。例如只有在供给a 1 、p 或葡萄糖一6 一磷酸时，在培养的离体叶绿体中才能检 测到f c c ；进一步研究发现当a t i ) 供应在叶绿体表面时，大麦的t l v f c c 2 才从 叶绿体中释放出来。这表明衰老叶绿体被膜上可能存在一种转运器，负责将新 生成的i ? c c 从衰老叶绿体中转运到细胞质( m a t j je ，1 9 9 2 ) 。在液泡膜上也发现 了一种依赖a i i ，的特异运载蛋白，负责c h l 代谢物在液泡中转运( 1 i n d e r 等， 浙江大学博士论文 采后青梅果实叶绿素降解机制及保绿措施的研究 1 9 9 6 ) 。此外，以大麦幼叶为试材的示踪实验还证明吡咯环中的标记碳，既不 以二氧化碳气体形式释放，也不从衰老叶片中运输到植物的其它部位( p e i s k e r 等，1 9 9 0 ) 。因此推测在叶片衰老过程中，c h l 的许多水溶性卟啉衍生物从衰 老叶绿体被转运到液泡中贮存起来。 2c h l 酶降解途径及有关酶的特性 虽然人们对许多植物的衰老叶片或成熟果实的c hl 降解途径( 一般指p h c o a 氧化酶降解途径) 作了大量的研究，然而，大部分研究主要集中在c h l 降解 途径的前几步，譬如c h l 降解成c h lj d e 、p h e oa 及其它绿色色素等步骤。而 对c h l 降解途径的随后几步就知道甚少。图卜3 是根据前人的研究结果总结的 c h l 降解途径示意图。c hj 降解途径最少包含6 步反应，其中前四步反应是将 绿色的c h l 转变生成无色的p f c c 。首先c h l 在c h l a s e 作用下，脱去植基形成 c h d c ；随后卟啉环中心镁离子经脱镁螯合酶( m gd e c h e a t a s e ，m i ) c a s e ) 催 化脱去生成p h e oa ；接下来，在p h e oa 在脱镁叶绿酸a 氧化酶( p h e o l o x y g e n a s e ) 和r c c 还原酶( r c cr e d u c t a s e ；r c c r ) 联合作用下，连续经过两步 反应，p h e oa 中的卟啉大环加入两分子氧和四分子氢后裂解，经过中问产物 r c c 生成无色的p f c c 。由于卟啉环的裂解与叶片和果实色素( 绿色) 丧失有关， 因此该步是叶片和果实衰老转黄的关键步骤。最后，p f c c 经过c 8 位羟基化、 d 环双键和y 次甲基桥异构化的两步反应生成最终代谢产物n c c 。下面就各步 反应分别详述。 2 。1 脱植基反应及叶绿素酶的特性 人们对c h l a s e ( ec 3 1 14 ) 研究已有8 0 多年的历史，关于其特性有大量 的研究报道( i l o l d e n ，1 9 6 1 ；s h i o i 和s a s a ，1 9 8 6 ：d r a z k i e w i c z ，i 9 9 4 ： y a n a g is a k u 等，1 9 9 4 ) 。尽管对c h l a s e 有较多研究，但是在c h l 降解中起到 什么作用及机理仍然不十分清楚。l h 从s t o l l 在植物绿色叶片内发现后，研究 者都认为c h l a s e 属于叶绿体酶，以c h l a 、b 或p h e o p h y t i n 为底物，催化脱去 植基，是c h i 降解起始步( t l y n n i n e n ，1 9 7 3 ：m c f e e t e r s ，1 9 9 5 ) 。c h i a s e 存在 于叶绿体什么位置的研究结论仍不明确。大多数学者推测该酶位于叶绿体被膜 上( m a t i1e 等，1 9 9 7 ；b r a n d is 等，1 9 9 6 ) 。此外从叶绿体膜提取c h l a s e 时， 需要用表面活洼剂如7 阡il o nx 1 0 0 ( m i c h a j s k i 等，1 9 8 8 ；f ) i e d o r 等，1 9 9 2 ： 浙江火学博士论文采后青梅果实叶绿索降解机制及保绿措施的研究 叶绿素b 脱植基n t 叶绿素b 还原酶 叶绿素a 脱镁螯合酶 脱镁叶绿酸a 氧化酶 绿索a m 9 2 。 脱镁n 1 绿酸a o 。一、i i r c c 还原 1 ) p + 。，。p 1 c 循环葡萄糖- 6 - 磷酸 8 2 一羟基化l 去甲基化 共轭； 修饰共轭f c c 非酶异构效应 n c l s 图卜3 衰老组织中叶绿素降解途径( 脱镁叶绿素酸a 氧化途径) f i g 1 - 3t h ep a t h w a yo f c h l o r o p h y l ld e g r a d a t i o ni ns e n e s c e n to r g a n ( t h ep a t h w a y p h e o p h o r b i d e a o x i d a t i o n ) 注：p h y t o l 植醇，c h l l i d ea 脱植基叶绿素a ，r c c 红色叶绿素代谢产物， p h e oa 脱镁叶绿酸a ，p h o t o s y s t e mi 光合系统i ，f e r r e d o x i n 铁氧还蛋白， p f c c 初级荧光叶绿素代谢产物，n c c 非荧光叶绿素代谢产物 7 浙江大学博j 二论文 采后青梅果实叶绿索降解机制发保绿措施的研究 m c f e e t e r s 等，1 9 9 5 ；7 f r e b is h 等，1 9 9 3 ) 、或其它溶剂如丙酮和甲醇( 1 1 0 1d e n ， 1 9 6 1 ：i c h i n o s e 和t s u t o m u ，1 9 9 3 ) 处理，酶才表现有活性，这也说明了c h l a s e 是与叶绿体被膜相结合的。s c h e l le n b e r g 和m a t i t e ( 1 9 9 5 ) 采用密度梯度离 心方法分离叶绿体各组分时，发现c h l a s e 活性出现的位置非常接近光系统i i 的捕光色素复合物( l i e i i ) 的位置；b r a n d i s 等( 1 9 9 6 ) 在纯化的l c i i 颗粒 中未能检测到c h l a s e 活性。m in g u e z m o s q u e r a 和c a l l a r d o g u o f f o r o ( 1 9 9 6 ) 等多次研究发现c h l a s e 活性不仅在c h l 降解过程中而且在c h l 合成过程中表 现很大。有些研究甚至发现c h l a s e 活性随着叶片衰老而呈下降( y a m a u c h i 和 w a t a d a ，1 9 9 l ；m in g u e z m o s q u e r a 和g aj 1 a 1 4 d o g u e r r e r o ，1 9 9 6 ) 。因此推测 c h a s ( 很可能在叶片衰老前就已经合成了，只是以潜伏形式存在。并且认为 c h l g s o 可能与其催化反应的底物c h l ( 位于类囊体膜上) 在空间上被隔离 ( m a t j ie 等，1 9 9 7 ；b r a n d is 等，1 9 9 6 ) 。m a t i l e 等( 1 9 9 7 ) 认为c h l “o 可 能存在于叶绿体被膜中，并推测随着衰老叶片的c h l 降解，一种新的蛋白质被 合成，将类囊体色素蛋白质复合体上的c h l 转运到叶绿体被膜降解位点上去。 c h i a s o 活性大小将受影响叶片和果实衰老的因素如乙烯和激动素的调节 ( t r e b is h 等，1 9 9 3 ：p u r o h jl 等，1 9 8 2 ：f a n g 等，1 9 9 8 ) 。植物的c h a s e 分子大小不尽相同，柑桔( t r e b i s h 等，1 9 9 3 ；s h i m o k a w a ，j 9 8 2 ) 和小球藻 ( n i s h jy a m a ，1 9 9 4 ) 的分子量分别为2 7k 1 ) a 和6 5k d a ，而其它种类的大约为 4 0k i ) a ( t a m a i 等，1 9 7 9 ；t e r p s t r a ，1 9 8 l ；t a n a k a 等，1 9 8 2 ；7 r s u c h i y a 等， 1 9 9 7 ) 。另外，l r e b i s h 等( 1 9 9 3 ) 和t s u c h i y a 等( 1 9 9 7 ) 分别从柑桔和藜 树( c v l e n o p o d i u n la l b u m ) 中获得c h l a s e 的n 一端序列也有差异。近来， 1 a c o b w ilk 等( 1 9 9 9 ) 克隆了柑桔的c h a s e ，并将其受于大肠杆菌中表达， 其表达产物也具有叶绿素酶固有的活性。 2 2 脱镁反应及脱镁螯合酶的特性 有许多学者虽然对衰老叶片和成熟绿色子叶的m d c a s e 特性作了大量的研 究( z i e g 】o r 等，1 9 8 8 ：s c h o c h 等，j 9 8 1 ：s e h o e h 和v i e l w e t t h ，1 9 8 3 ： a m i r s h a p ir a 等，1 9 8 7 ；v ie e nl in i 等，1 9 9 5 b ；j l a id 1 等，1 9 8 5 ；o w e n s 和 h 1 1 k o w s k i ，1 9 8 2 ；l a n g m e i e r 等，1 9 9 ：3 ：s h i o i 等，1 9 9 6 b ；c o s t a 等，2 0 0 2 ) ， 但仍未得到一致的结论。s c h e lie n b e r g 和m a t ilo ( 1 9 9 5 ) 和i j a n g m e je r 等( j 9 9 3 ) 8 浙江大学博i 论文采后青梅粱盛叶绿索降解射l ：0 搜保绿措施的l i ) f 充 分别在未衰老、衰老的大麦和油菜叶绿体中均检测到m d c a s e 活性，因此推测 m d c a s e 与c h lg t s c 类似，也是一种以潜伏形式存在的组成酶，在植物叶片或果 实衰老前已经合成。l a n g m e i e _ 等( 9 9 3 ) 研究认为保持耐o c a s e 酶活性需要不 断有新的蛋白质合成。s c h e l l e n b e r g 和m a t ij e ( 1 9 9 5 ) 研究表明m d c a s e 活性 与光合系统复合体f 有关。但另一些人认为m 1 ) c u s e 与c h l a s c 同位于叶绿体被 膜上( v f c ( 2 r lo ；n f 等，1 9 9 5 b ；s ( ：h 。) e n b c r g 和m ；- t l ； o ，i 9 9 5 ) 。应用凝胶层析 方法从藜树叶片提取物中分离出一种具有热稳定性、分子量低于5k 1 ) a 的小分 子物质( s h i0 i 等，1 9 9 6 b ；v i c e i l c jn i ，1 9 9 6 ) ，该物质具有m d c a s e 酶功能， 能以c f l f ；d e 。( s h i o i 等，i 9 9 6 5 ) 或c h u r o p h y f i n ( y i c e i l t in i 等，1 9 9 5 h ) 为 底物，催化2 l l 置换m 矿，生成p h e oa ，但不能以c h l a 、c h 】b 、单乙烯原c h id o a 和m g 原卟啉l x 二甲基作为底物。由于m d c a s e 仅能催化去植基色素 ( l a n g m e i e f 等，1 9 9 3 ：v i c e r to i n i 等1 9 9 5 b ) 或不能倦化c h j ( 酯化j 脱去m _ ( s h i0 i 等，1 9 9 6 b ) ，因此p h e oa 是m d c a s e 反应的唯一产物，所以该反应过 程将不会有脱镁叶绿索( p h y ) 物质生成。但是，许多研究者却检测到p h y 弋 加 m 帅 阳 浙江大学博士论文 采后青梅果实叶绿素降解机制及保绿措旌的研究 2 5 8 5 t x g g - f w 降到第6d 的4 3 4 g ，第1 0d 仅有j3 2 垤g 。l ? w ；而在 i o 。c 和l 下的梅果其总叶绿素含量下降比较缓慢，到贮藏第1 0w 分别为 j 7 i 3 t - j - g | g 。f ? w 和1 8 4 g g 、g 刚。在各温度下贮藏梅果的类胡萝卜素含量变化 与总叶绿素的变化相类似( 图2 6 b ) 。 芒 磐 u 2 三 u 16 0 1 4 0 l2 0 一 【0 0 _8 0 印 磬6 0 一 4 0 2 0 o b u z 【jr t db 0 】w8 d1 0 d2 w3 w4 w5 wb w8 wjo w sl o r a g et i m e ( do rw ) 图2 - 6 a 、b 不同贮藏温度下梅果果肉叶绿素和类胡萝p 素含量的变化 f i g 2 6 a 、bc h a n g e si nc h l o r o p h y l la n dc a r o t e n o i dc o n t e n to f f l e s hi ng r e e n m u m ef r u i t sd u r i n g s l o r a g e a tv a r i o u st e m p e r a t u r e s 2 7 梅果采后叶绿素荧光参数f o 和f v f m 的变化 在荧光分析中，最常用的基本荧光参数是1 ：d ，f m 和f v f m 。f o 为初始荧 光，是陌i 【反应中心全部开放时的荧光水平；f m 为最大荧光，是i ，si i 反应中 心全部关闭时的荧光水平；i ? v 为f m 与ir o 之差，称为可变荧光：f v f m 被称为 p s1 i 的光化学效率。f o 和f v f m 值可反应采后果实的衰老状态。2 5 c 下梅果 的i ? o 和f