（食品科学专业论文）鸡胸软骨粉的制备及其对类风湿性关节炎的作用.pdf

摘要 摘要 类风湿性关节炎( r a ) 是一种常见的以关节组织慢性炎症病变为主要表现的全身性疾 病。它的发生是由于机体内的t 细胞因子引起了关节组织内部对特异性隐蔽抗原进行自身 免疫反应，在此过程中导致了多关节滑膜炎症，并造成软骨和骨组织的损害。作为关节软 骨主要成分的i i 型胶原被认为是介导类风湿性关节炎发病的自家抗原成分之一，因此理论 上口服补充i i 型胶原蛋白能使机体产生免疫耐受，抑制类风湿性关节炎疾病的发生。鸡胸 软骨中含有丰富的i i 型胶原蛋白和蛋白多糖，且具有来源广泛、加工便捷、价格低廉等优 点，可开发成一类天然无毒副作用，具有防治类风湿性关节炎功能的保健品。 本论文以鸡胸软骨为原料制备富含i i 型胶原的软骨粉，并测定了软骨粉的组成和生物 活性，这为开发鸡骨资源、解决家禽加工业的资源综合利用问题提供了理论基础，主要研 究内容如下： 首先以鸡胸软骨为原料，研究了酶法去除杂质、脱脂、干燥以及粉碎工艺，制备富含 生物活性i i 型胶原的软骨粉。采用胃蛋白酶去除软骨表面杂质，最优酶解条件为酶浓度 4 0 0m g l 1 ，温度2 8 ，反应时间2 4h ，料水比1 ：5 。酶法处理后的鸡胸软骨切片，浸泡 在氯仿：甲醇= 2 ：1 的混合溶剂中，匀速搅拌，可除去绝大部分脂肪，脂肪的残留率为o 0 5 。 脱脂软骨经冷冻干燥3 6h 后，仍然能保持原来的色泽和形态，水分含量降至2 1 8 。采用 冷冻研磨机在液氮低温条件下粉碎鸡胸软骨，最优粉碎工艺为预冷时间7r a i n ，撞击速度 1 0 次s 1 ，粉碎时间9m i n ，所得的软骨粉的平均粒径为7 3 3 7p , m 。 制备得到的软骨粉混悬于4m 0 1 l 1 盐酸胍中，搅拌2 4h 去除非胶原成分后，采用胃蛋 白酶酶解提取i i 型胶原，并对软骨粉i i 型胶原的纯度和结构进行了鉴定。结果显示，软骨 粉i i 型胶原在s d s p a g e 电泳谱带出现的位置与s i g m a - a l d r i c h 标准品一致，两者的 r p h p l c 保留时间接近，氨基酸组成也相似。这说明软骨粉胶原为典型的u 型胶原，其 分子可以用a l ( i i ) 3 来表示。软骨粉i i 型胶原在近紫外区2 2 0n m 附近产生最大吸收，而2 8 0 n m 处吸收很弱，表明其中芳香族氨基酸含量较少，这和氨基酸分析结果一致，园二色谱 在2 2 1n m 和1 9 8n l l l 处分别出现正负吸收峰，符合i i 型胶原左旋聚脯氨酸肽链的典型特征。 软骨粉i i 型胶原的f t - i r 分析与文献报道的天然i i 型胶原的吸收峰位基本一致。差示扫描 量热仪测定软骨粉胶原的变性温度为4 4 ，说明软骨粉i i 型胶原在制备和提取过程中结 构没有遭到破坏。x 射线衍射测定结果表明，软骨粉i i 型胶原为三股超螺旋链结构，其中 每条q 链是独立的左手螺旋结构，衍射峰的强度达到8 0 ，说明软骨粉i i 型胶原很好地保 持了三股螺旋结构，因而保持了其生物活性。 以纯i i 型胶原和完全弗氏佐剂免疫s p r a g u e d a w l e y ( s d ) 大鼠，建立大鼠的类风湿性 关节炎模型( c i a ) ，研究了口服鸡胸软骨粉和硫酸氨基葡萄糖对大鼠类风湿性关节炎病程 的影响。结果表明，口服鸡胸软骨粉能明显降低c i a 大鼠的关节炎指数，缓解关节红肿等 症状。同时，实验组大鼠的t 淋巴细胞增殖受到抑制，抑炎细胞因子白介素- 2 ( i l 一2 ) 水 坚堕奎兰堡堂篁丝奎 平高于阴性对照组，而白细胞介素1 ( i l 1 ) 和肿瘤坏死因子q ( t n f a ) 水平则显著低于 阴性对照组和阳性对照组。硫酸氨基葡萄糖的添加在一定程度上也缓解了大鼠的r a 症状。 这为开发鸡胸软骨粉制备安全有效、无副作用的保健品应用于防治类风湿性关节炎提供了 理论依据。 关键词：鸡胸软骨；i i 型胶原；胃蛋白酶；液氮低温粉碎；类风湿性关节炎；硫酸氨基葡 萄糖 i i a b s t r a c t a b s t r a c t r h e u m a t o i da r t h r i t i s ( r a ) i sap a i n f u la n do f t e nc r i p p l i n gd i s e a s et h a ti n i t i a l l yr e s u l t si n s w o l l e na n di m f l a m m e dj o i n t s ，b u to f t e np r o g r e s s e st od e f o r m e do rc o m p l e t e l yd e s t r o y e dj o i n t s r e c e n tg e n e t i cr e s e a r c hs t r o n g l ys u g g e s t st h a tt h i si sar e s u l to ft h eb o d ym i s t a k e n l ya t t a c k i n g t ) ，p ei ic o l l a g e n ( c i i ) ，w h i c hi st h em a j o rp o r t i o no fc a r t i l a g et i s s u e i nt h e o r y , o r a la d m i n i s t r a t i o n o f h i 曲l yp u r i f i e dt y p ei ic o l l a g e n ( c i i ) r e p r e s e n t sac u r et r e a t m e n tf o rr h e u m a t o i da r t h r i t i s c h i c ks t e m a lx i p h o i dc a r t i l a g ep r i m a r i l yc o m p r i s e sa b u n d a n tt y p ei ic o l l a g e na n dp r o t e o g l y c a n a n dc a nb ea p p l i e dt op r o d u c ea ne d i b l es u p p l e m e n tt op r e v e n to ra l l e v i a t et h es y m p t o m so fr a t h ep r e s e n tr e s e a r c hs t u d i e dt h ep r e p a r a t i o no fc a r t i l a g ep o w d e rw h i c hc o n t a i n sa b u n d a n tt y p e i ic o l l a g e nf r o mc h i c ks t e r n a lc a r t i l a g e i na d d i t i o n ，t h ec o m p o s i t i o na n db i o l o g i c a la c t i v i t i e so f t h ep r o d u c tw e r ed e t e r m i n e d m a j o rc o n t e n to ft h i sp a p e ra sf o l l o w i n g ： f i r s t l y , t h e 舶s hc a r t i l a g ew a sd i g e s t e db yp e p s i nt oe l i m i n a t ec h i c k e na n dc a r t i l a g em e m b r a n e f r o mc a r t i l a g ea n dt h eo p t i m u me n z y m a t i cc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s t h ee n z y m a t i c c o n c e n t r a t i o nw a s4 0 0m g l ，t h et e m p e r a t u r ew a s2 8 c ，t h ew e i g h tp r o p o r t i o nw a s1 ：5 ( m a t e r i a l ： l i q u i d ) t h er e a c t i o nt i m ew a s2 4h w ea p p l i e dc h l o r o f o r m ：m e t h a n o l = 2 ：1t or e m o v eg r e a s ef r o m c a r t i l a g ea n dt h er e s u l t i n gl i p i dc o n t e n tw a s0 0 5 f r e e z e d r y i n gc o u l de l i m i n a t e9 7 w a t e r f r o mc a r t i l a g e t h ec a r t i l a g ew a sg r o u n dw i t i lt h ep r e s e n t a t i o no fl i q u i dn i t r o g e na n dt h ea v e r a g e g r a n u l ed i a m e t e rw a s7 3 3 7 “m t h e n ，h y d r o c h l o r i cc a r b a m i d i n ew a su s e dt or e m o v en o n - c o l l a g e nc o m p o n e n t s ，t h e np e p s i n w a sa d d e dt oe x t r a c tt y p ei ic o l l a g e n t h er e s u l t so fs d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i sa n dr p - h p l c s h o w e dt h ep r e p a r e dt y p ei ic o l l a g e ni sah i g hp u r i t yp r o d u c t t h es t r u c t u r ea n dc o m p o s i t i o no f t y p ei ic o l l a g e nw e r es t u d i e d t y p ei ic o l l a g e nh a dah i g hc o n t e n to fg l y c i n e ，h y d r o x y p r o l i n ea n d p r o l i n er e s i d u e s ，w i t h3 13 ，118a n d9 4r e s i d u e sp e r10 0 0a m i n oa c i d sr e s i d u e sr e s p e c t i v e l y , a n d s m a l la m o u n t so f t y r o s i n e ，c y s t e i n e ，h i s t i d i n ea n dm e t h i o n i n er e s i d u e sw i t h5 ，17a n d2r e s i d u e s p e r10 0 0a m i n oa c i d sr e s i d u e sr e s p e c t i v e l y t h ed e n a t u r i n gt e m p e r a t u r ew a sd e t e r m i n e db y d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t e rt ob ea b o u t4 4 0 cf o rp u r i f i e dt y p ei ic o l l a g e n t h em i n i m a l d i f f e r e n c eb e t w e e nd e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r eo fp u r i f i e dt y p ei ic o l l a g e nf r o mc a r t i l a g ep o w d e r a n di n t a c tc a r t i l a g ei n d i c a t e dt h a tp u r i f i c a t i o np r o c e s sh a sl i t t l ei n f l u e n c ef o rs t a b i l i t yo fc o l l a g e n a n a l y s i sr e s u l t so fu va b s o r b a n c es p e c t r o g r a m 、i n f r a r e ds p e c t r u ma n dc ds p e c t r o g r a mp r o v e d t h a tt y p ei ie o u a g e no fc a r t i l a g ep o w d e rr e m a i n e dn a t u r a ls t r u c t u r e a l lt h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h et y p ei ic o l l a g e ni nc h i c kc a r t i l a g ep o w d e rr e t a i n e dm o s ti n t e r m o l e c u l a rc r o s s l i n k sd u r i n gt h e p r e p a r a t i o np r o c e s s l a s t l y , t h ei n f l u e n c eo nr a tr h e u m a t o i da r t h r i t i s ( r a ) b yo r a la d m i n i s t r a t i o no fc h i c ks t e r n a l c a r t i l a g ea n dg l u c o s a m i n es u l f a t ew a ss t u d i e d t h ec o l l a g e n i n d u c e dr a tr h e u m a t o i da r t h r i t i s m o d e l ( c i a ) w a se s t a b l i s h e di nm a l es p r a g u e - d a w l e y ( s d ) r a t sw i t hi n t r a d e r m a li n j e c t i o no f t y p ei ic o l l a g e ni nf r e u n d sc o m p l e t ea d j u v a n t c i ar a t sw e r et r e a t e dw i t ho r a la d m i n i s t r a t i o no f e h i c ks t e r n a lc a r t i l a g ea n dg l u c o s a m i n es u l f a t e t h ed e v e l o p m e n to fr aw a so b s e r v e di nc i a i i i 江南大学硕士学位论文 r a t sa n ds o m er e l e v a n tc h a r a c t e r i s t i c sw e r ed e t e r m i n e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t o r a l a d m i n i s t r a t i o no fc h i c ks t e r n a lc a r t i l a g eo b v i o u s l yr e l i e v e dt h ea r t h r i t i ss y m p t o m sa n dm a r k l y s u p p r e s s e dt h el y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o n i na d d i t i o n ，t h el e v e l so ft n f 一0 t ，i l la n di l - 2i nt h e e x p e r i m e n t a lr a t s w e r em a r k e d l yl o w e r e dv e r s u sv e h i c l e 仃e a t e dr a t s h e n c e o u rs t u d i e s d e m o n s t r a t e dt h a tc h i c ks t e r n a lc a r t i l a g ea n dg l u c o s a m i n es u l f a t ec o u l db ea p p l i e dt op r e v e n t a n dc u r et h er aa saf u n c t i o n a lh e a l t h yf o o dw h i c ha r es a f ea n dl a c ko fs i d e e f f e c t s k e yw o r d s ：c h i c ks t e r n a lx i p h o i dc a r t i l a g e ；t y p ei ic o l l a g e n ；p e p s i n ；f r e e z eg n n d i n g ； r h e u m a t o i da r t h r i t i s ；g l u c o s a m i n es u l f a t e i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 氇需薛 日 期：五略形归至 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签 名： 导师签名： e l 氰一孚刍眵 第一$ 镕论 1 1 软骨的组成 第一章绪论 软骨属于结缔组织，由软骨组织和其周围的软骨膜构成，略有弹性，在机体内具有支 撑重量、减少摩擦及缓冲保护等作用。软骨组织主要包括软骨细胞和软骨基质。根据软骨 组织中所含纤维成分不同，软骨可分为三种，即透明软骨、弹性软骨和纤维软骨，其中透 明软骨分布较广，人体的关节软骨、肋软骨及呼吸道的软骨均属这种软骨类型【m 1 。透明软 骨新鲜时较脆，易折断，其超微结构如图1 - 1 所示。 图1 - 1 透明软骨超微结构 f i g , 1 1 t h ea l t r a s t r u c t e r e o f h y a l i n ec a r t i l a g e 1 1 1 软骨细胞 软骨内仅有一种细胞，即软骨细胞。软骨各层内软骨细胞的大小、形奄、代谢率不同， 但均含有可合成软骨基质的细胞器。软骨细胞首先合成各种胶原、蛋白多糖和非胶原性蛋 白质，并形成软骨基质，通过不断地清除退变的基质成分和合成新的基质大分子来保持软 骨面的完整。软骨细胞的代谢非常活跃，主要以糖酵解方式获得能量，糖酵解率类似于富 含血管组织的细胞，但是软骨细胞的密度很低，故软骨组织的总代谢率很低。 新鲜软骨的软骨细胞充满于软骨基质内的小腔一软骨陷窝中，陷窝周围有一层含较多 硫酸软骨素的基质，称软骨囊。软骨细胞在软骨内的分布有一定规律，靠近软骨膜的软骨 细胞较幼稚，体积小，呈扁圆形，单个分布；位于软骨中部的软骨细胞接近圆形，成群分 布，每群有2 8 个细胞，它们是由一个细胞分裂增生而成，故称同源细胞群，同源细胞 群中的细胞分别围以软骨囊。软骨细胞的超微结构特点是胞质内有丰富的粗面内质网和发 达的高尔基复合体，还有一些糖原和脂滴，线粒体较少【i 捌。 1 1 2 软骨基质 软骨基质主要由组织液和结构大分子骨架组成，如图1 - 2 所示。组织液和大分子骨架 翌堕奎兰堡主兰垡笙茎 相互作用使软骨具有硬度和弹性等力学特性。组织液占软骨湿重的8 0 ，内含气体、小分 子肽、代谢产物及高浓度阳离子。阳离子可平衡蛋白多糖上的负电荷。结构大分子包括各 种胶原、蛋白多糖及大分子非胶原性蛋白质，其中胶原占软骨干重的6 0 ，蛋白多糖占 2 5 - - 3 5 ，非胶原性蛋白和糖蛋白占1 5 - - 一2 0 ，软骨胶原主要是i i 型胶原，i i 型胶原 占总胶原的9 0 9 5 。 3 1 i i 型胶原，2 水，3 透明质酸，4 蛋白多糖亚单位，5 糖胺聚糖( g a g ) 图1 - 2 软骨基质组成的示意图 f i g 1 2t h ec o m p o s i t i o no fc a r t i l a g em a t r i x 粗大而致密的i i 型胶原纤维束交织成坚固的网架，从而保持软骨结构的完整性。软骨 中的蛋白多糖是一类以巨大分子聚集体存在的糖复合物，其总分子量可达到几千万道尔 顿，它以透明质酸的重复二糖单位为主链，主链上非共价地连接或聚集着蛋白多糖亚单位。 蛋白多糖亚单位主要由糖胺聚糖( g a g ) 链共价连接于核心蛋白所组成，分子量1 1 - - , 2 2 0 k d 。这种高度羽状分支的亲水性分子结合着大量的水，使软骨保持弹性。蛋白多糖大分子 间相互交错成分子筛，并和i i 型胶原纤维束结合，共同形成软骨基质中的固态结构。软骨 内无血管，但由于软骨基质内富含水分，通透性强，软骨深层的软骨细胞仍能获得必需的 营养【3 】o 软骨细胞分泌基质大分子，并在新陈代谢过程中不断地合成和降解。基质对软骨细胞 具有保护作用，使其免于损伤，同时为其提供营养和底物，转导和传递信号。 1 1 3 软骨膜 除关节软骨外，软骨的表面均覆有较致密的结缔组织，即软骨膜( p e r i c h o n d r i u m ) 。 软骨膜分内、j l - - 层，外层纤维多，细胞少，主要起保护作用，内层纤维少，细胞较多， 其中有些梭形小细胞，称骨原细胞，可增殖分化为软骨细胞。软骨的营养来自软骨周围的 血管，并可通过软骨膜渗透至软骨内部，供应软骨细胞【l j 。 2 第一章绪论 1 2i i 型胶原 1 2 1i i 型胶原的分布 i i 型胶原常与蛋白多糖结合成高分子量的缔合物，主要分布在软骨、玻璃体、髓核、 胚胎角膜、视网神经膜等结缔组织中。i i 型胶原是软骨中最主要的有机物，能促进软骨细 胞的分化，增进骨骼健康。 1 2 2i i 型胶原的结构 蛋白质的相对分子质量有几万、几十万甚至几百万，由几百个、几千个氨基酸组成。 氨基酸中的不对称碳原子，能形成不同的构型，造成蛋白质的结构非常复杂，和大多数蛋 白质相比，i i 型胶原的结构更为复杂。 1 2 2 1i i 型胶原的一级结构 一级结构是蛋白质分子中氨基酸以肽键连接的顺序，每一种蛋白质分子，都有其特定 的氨基酸组成和排列方式，由此也决定了其不同的空间结构和功能。i i 型胶原由三条相同 的肽链组成，可用 a l ( i i ) 3 来表示，单个肽链为a l - 肽链。 在大多数蛋白质的同一多肽链中，氨基酸不会有周期性重复顺序，但是i i 型胶原的一 级结构中却有甘氨酰一脯氨酰一羟脯氨酰、甘氨酰一脯氨酰一y 、甘氨酰一x y ( ) ( 、y 代 表除甘氨酰和脯氨酰以外的其它任何氨基酸残基) 这样一些三肽的重复顺序存在，甘氨酸几 乎占总氨基酸残基的1 3 ，每隔两个其它氨基酸残基就有一个甘氨酸，故i i 型胶原的肽链 可以用( g l y - - x - - y ) 。来表示，x 位置常由脯氨酸残基占据( 约2 0 3 0 ) 。甘氨酰一 脯氨酰一y 三肽的数量为全部三肽总和的1 3 ，它的结构如图1 3 所示1 4 j 。 n 一c h li h z cc h c h 2 甘氨酰脯氨酰 g l y p r o y 图l - 3 甘氨酰一脯氨酰一y 的结构1 4 o f i g 1 - 3t h es t r u c t u r eo fg l y p r o - y 1 4 l 这种三肽重复顺序对i i 型胶原结构起着很大的作用，i i 型胶原属于纤维胶原，分子中 的胶原域由长而不中断的三股螺旋结构组成。其它非纤维胶原的胶原域中的三股螺旋是不 连续的，至少存在一个中断处，这个中断处就在三肽重复顺序中，即不是甘氨酰x y ， 而是甘氨酰一x 一甘氨酰一x y 或甘氨酸一x y x y 。 肽链的n 末端和c 末端不含重复的g l y - - x - - y ，不形成左手螺旋，称做非螺旋区。非 垩堕查兰堡! 兰竺兰兰 螺旋区的重要特征是0 1 - 肽链n 末端第9 位是赖氨酸残基，c 末端第1 6 位也是赖氨酸娥基， n 未端和c 末端的非螺旋区域，在i i 型胶原的生物合成及合成后肚链问形成交联过程中起 重要作用”j 。 1 1 型胶原含有较多的脯氨酸和赖氨酸残基，以及其它蛋白质中少见的羟脯氢酸和羟赖 氨酸，缺乏色氨酸，芳香族氨基酸和半胱氨酸的含量也比较少，在营养上为不完全蛋白。 1 1 型胶原分子中的脯氨酸和4 - 羟脯氨酸含量高达1 5 3 0 ，同时还含有少量的3 羟脯氨 酸和5 羟脯氨酸。羟脯氨酸残基可以通过分子内氢键稳定胶原分子。天然存在的i i 型胶原 在4 2 变性，而在缺乏脯氨酸羟化酶条件下合成的i i 型胶原在2 4 即变性转变成明胶。 羟赖氨酸残基位点是潜在的糖基化位点，可结合半乳糖葡萄糖苷，与特定组织的组成有关 如软骨基质中的1 1 型胶原常和糖胺聚糖结合形成复杂的分子聚集体。1 1 型胶原被胶原酶切 割的位点是甘氨酸一异亮氨酸肽键 4 1 。 1 2 2 2i i 型肢原的二级结构 二级结构是指肽链主链的局部空间结构，即肽链问相邻氨基酸形成的局部有序的空间 结构。i i 型胶原的二级结构是由三条肽链组成的三股螺旋，在这种超螺旋体中每一股又是 一种特殊的左手螺旋体，它与a 一螺旋体不同，超螺旋体中各条肽链借助甘氨酸残基的肽键 之间形成的氢键交联在一起。 i i 型胶原分子为细棒状，长2 8 0r u n ，直径15n m ，用透射电子显微镜进行观察，可见 纤维状胶原具有特殊的周期性的横纹带区，每个横纹周期平均为6i u i l 。胶原分子单位称为 原胶原，胶原是由原胶原按规则顺序排列的，原胶原的排列规则是首尾相接。 i i 型胶原分子中每条肽链有1 0 0 0 个左右氨基酸残基，相对分子质量介于9 5 ，0 0 0 1 0 0 ，0 0 0 之间，所以一个i i 型胶原分子的相对分子质量大约为3 0 万。三条肽链则以平行、 右手螺旋形式缠绕成草绳状的三股螺旋结构( 图1 4 ) f 4 j ，螺距为o9 5l t m ，每一螺圈含有 33 个氨基酸残基，每一残基沿轴向距离为o2 9r i m 。 图1 - 4i i 型胶原的右手螺旋结构i ” f i g 1 - 4 t h er i g h t - h a n d e ds u p e r c o i ls t n e t u r eo f t y p e l lc o l l a g e a 1 2 2 31 1 型腔原的三级结构 就实质而吉，三级结构主要揭示蛋白质分子中肽链之问次级键的作用，也就是氨基酸 残基侧链的极性基团产生的离子键、氢键和范德华力以及非极性基团产生的疏水键、范德 4 第一蕈绪论 华力等作用力，使得三级结构得以保持稳定。除了这些次级键外，胶原分子内和分子间还 有三种交联：醇醛缩合交联，醛胺缩合( 席夫碱) 交联，醛醇组氨酸交联。这三种交联把 i i 型胶原的三条肽链牢固地连接起来，使胶原具有很高的拉伸强度【4 ，6 1 。 1 2 2 。4i i 型胶原的四级结构 四级结构是指由多条肽链组成的大分子蛋白，原胶原按规则平行排列成束，首尾错位 l 4 ，通过共价键搭接交连，形成稳定的胶原微纤维，并进一步聚集成束，形成胶原纤维( 图 1 - 5 ) 。胶原分子通过分子内或分子间的作用力成为不溶性的纤维，故胶原属于不溶性硬蛋 白。i i 型胶原分子氨基酸组成中缺乏半胱氨酸，不可能像角蛋白那样以二硫键相连，而是 通过组氨酸与赖氨酸间的共价交联，一般发生在胶原分子的c ( 羧基) 末端和n ( 氨基) 末端之间【4 7 】。 卜7m 蚧镪黻基 藤一 、一从砾 7 产。8 7 a 1 玉：企! 上佥鲨上! 翌团型! 釜立囫 甘脯y甘脯羟脯甘x 羟脯甘一x 羟赖甘 图1 - 5i i 型胶原纤维的结构1 4 i f i g 1 5t h es t r u c t u r eo fp r o c o l l a g e n l 4 i 1 2 3 型胶原的提取 生物体提取胶原蛋白始于1 9 4 7 年欧列霍维奇等人的研究。由于胶原蛋白不溶于水， 要想将它从生物组织中分离并提取是一件非常困难的事。加之在提取过程中需要很好地保 持胶原蛋白的三股螺旋结构，不致因过度处理而使胶原进一步分解为明胶，使得胶原蛋白 的提取研究进展缓慢【8 】o i i 型胶原的提取方法除了早期的中性盐盐析提取外，目前为了提高胶原蛋白的提取率 和保持胶原蛋白的生物活性，从生物体提取胶原蛋白的方法主要有酸提取、碱提取和酶法 提取，而且针对不同的用途提取方法也各不相同。 酸水解法是利用酸溶法提取胶原，迅速且提取率高，但色氨酸全部被破坏，丝氨酸和 酪氨酸部分被破坏，产品得率低，严重腐蚀设备，并产生二次污染。碱水解法与酸水解法 类似，利用浓碱液进行提取，虽具有操作简单、产量高的优点，但含羟基和巯基的氨基酸， s 垩堕奎兰堕主堂垡丝奎 全部被破坏且产生消旋作用。据资料介绍1 1 ，生物体内常见的2 0 种氨基酸，除了甘氨酸 没有不对称碳而没有旋光性外，其它都是旋光性化合物。在热碱性溶液中，不对称碳原子 经过对称状态的中间阶段，发生消旋现象，并转变为d 型和l 型的等摩尔混合物。原则 上，只有l - 型氨基酸才可作为高等动物的有效氨基酸源，d 型氨基酸不能作为有效氨基酸 源，它的浓度若高于l 型氨基酸，则会抑制l 型氨基酸的吸收，有些d 型氨基酸有毒， 有的甚至有致癌、致畸和致突变的作用。 酶水解法是利用酸性条件下酶消化的方法进行提取。该法具有其它方法无可比拟的优 越性，反应速度快、时间短、无环境污染，提取的胶原蛋白纯度高、水溶性好、理化性质 稳定，而且随着生物技术水平的提高，酶制剂的来源广泛，活性也不断提高，价效比也大 幅度降低。酶工程技术属于现代生物技术，酶水解法提取软骨中的蛋白质属于高新技术范 畴【l2 1 。 1 3 类风湿性关节炎概述 1 3 1 类风湿性关节炎的病因 类风湿性关节炎( r a ) 发病方式多样，病情轻重迥异，发病机制迄今不明，现在普遍 认为r a 是一种与细菌、病毒、性激素、遗传等众因素密切相关的疾病。b r u c k n e r 发现以 链球菌胞壁碎片水悬液注入鼠腹腔，可产生慢性关节炎，关节出现增殖性、糜烂性滑膜炎 症，说明细菌感染会引发类风湿性关节炎。类风湿性关节炎患者的h l a - - d r w u 抗原检出 率明显升高，提示发病可能与遗传有关【1 4 1 。h o l ml 等还发现r a 患者粪便可培养出大量产 气荚膜杆菌，在病人的关节滑膜中找到病毒颗粒【1 5 j 。 随着免疫学的发展和对类风湿性关节炎研究的深入，有学者提出类风湿性关节炎是免 疫系统调节功能紊乱所致的炎症反应性疾病。研究发现r a 患者的关节滑膜及其附近组织 有淋巴细胞和浆细胞浸润【l ”。应用免疫荧光技术，在滑膜组织中发现有免疫球蛋白、补体 及免疫复合物沉着，关节滑液中补体活性降低，滑膜液中存在沉淀素等。患者体内感染因 子紊乱，结缔组织出现代谢异常，在关节滑膜中产生抗原性变，这些抗原刺激关节滑膜中 浆细胞产生抗体。抗原抗体复合物形成后，抗体因免疫识别错误转变为异体，刺激关节滑 膜中浆细胞产生类风湿因子，抗原抗体复合物还能促进吞噬并引起溶酶中酶的释放，滑膜 细胞的溶酶体膜很易脆裂，其释放的酶导致关节组织损伤和发炎1 1 6 1 。 1 3 2 类风湿性关节炎的主要症状 类风湿性关节炎的主要症状分为关节表现和关节外表现两方面。类风湿性关节炎起病 缓慢，患者多先有几周到几个月的疲倦无力、体重减轻、胃纳不佳、轻度发热和手足麻木 刺痛等前驱症状。 晨僵是关节表现的第一症状，般早晨明显，午后减轻，患者关节僵硬，活动不灵活 且会引起关节疼痛不适，但关节活动增多晨僵现象反而会减轻或消失。在病理方面，类风 湿性关节炎最先累及关节滑膜，导致滑膜充血、水肿、增生，淋巴细胞及多核粒细胞侵润， 6 第一章绪论 滑膜毛细血管及成纤维细胞增生形成肉芽肿，逐渐向关节软骨蔓延，形成血管翳，破坏关 节软骨。关节内纤维组织增生，出现纤维僵直，关节囊及周围韧带、肌肉也同时受累。晚 期关节软骨被广泛破坏，软骨下骨质暴露，形成反应性新骨，导致关节骨性僵直 】。 关节外表现是类风湿性关节炎全身表现的一部分和其并发症。类风湿性关节炎的关节 病变可能会致残，不会致死，但关节外表现如果没有及时控制会致死。常见的关节外表现 包括类风湿性血管炎、类风湿性心脏病、类风湿性肺病、肾脏损害、眼部葡萄膜炎、f e l t y 综合症、干燥综合症、消化道损害等【l7 1 。 1 3 3 类风湿性关节炎的治疗 目前对类风湿性关节炎尚无一个较好的治疗方法，多数治疗是针对症状而不是去除病 因。早期对关节行滑膜切除可以有效地延缓病变的发展过程，但如果病变已经到了晚期， 关节软骨完全破坏，关节畸形明显，则除了关节置换，别无其它选择。当前药物治疗的主 要目标是缓解痛苦，减轻和控制炎症，保护肌肉和关节功能，但基本上只能缓解症状，不 能从根本上治愈类风湿性关节炎。有些药物使患者免疫系统受到普遍性的抑制而导致严重 感染，副作用大，不宜长期应用l l g - 1 9 。 近年来，对类风湿性关节炎的基因治疗也成为一个新动向。已经证明，白细胞介素1 ( i l 1 ) 是介导类风湿性关节炎发病的主要因子。i l 1 的作用在一定程度上是通过一氧化 氮分子实现的。n o 可以促使滑膜细胞分泌金属蛋白酶，从而导致关节软骨基质的破坏和 i i 型胶原分子的降解。由于机体对已经暴露和降解的i i 型胶原分子不能辨认，可能激发自 家免疫反应的程序，导致关节的炎性反应的发展。基于这种理论，基因治疗便以i l l 为目 标，由于i l 1 必须要结合到滑膜细胞膜表面的受体上，才可以发挥作用，而i l 1 受体拮 抗蛋白可以有效地降低i l 1 结合到细胞上的能力。因此，基因治疗类风湿性关节炎的主要 研究都是以i l 1 受体拮抗蛋白为目的基因。实践证明，以i l 1 受体拮抗蛋白为目的基因 对类风湿性关节炎进行基因治疗，确实可以在一定程度上减轻关节软骨损害的程度。基因 治疗的一个比较大的障碍是载体的选择，由于载体的限制，目前基因治疗仍不能成为临床 应用的常规方法【l 剀。 总之，目前类风湿性的药物疗效和基因治疗尚不能令人满意，这促使临床学家和免疫 学家寻找更合理的治疗方法。随着类风湿性关节炎被归结自身免疫性疾病，1 3 服免疫耐受 为类风湿性关节炎的预防和治疗提供了新的思路。 免疫耐受是机体免疫系统接受外来免疫原刺激后产生的一种特异性无反应状态，具有 记忆性。通过口服方式使机体产生免疫耐受，因其方法简便而受到重视，为人类自身免疫 性疾病的治疗和预防提供了新的途径。口服耐受是指口服某种抗原物质后机体对该抗原再 次接触时表现的一种免疫无应答状态。人类对口服耐受的研究己有九十多年的历史。1 9 1 1 年，w e l l s 发现喂食豚鼠外源性蛋白数周后，对注射该蛋白引起的严重免疫反应有抵御作 用【1 8 】。1 9 4 6 年，c h a s e 给豚鼠口服半抗原二硝基氯苯( d n c b ) 后发现动物对该蛋白再次 接触时引起的皮肤反应降低【1 9 1 。后来，许多学者研究中发现，动物喂食卵清蛋白( o v a l b u m i n ， o v a ) 或绵羊红细胞后再次接触时对o v a 或绵羊红细胞表现为免疫无应答或免疫低反应， 7 江南大学硕士学位论文 但对其它抗原的免疫应答依然正常【2 0 】。 最近十儿年来，由于人们开始意识到口服免疫耐受可以作为治疗许多疾病特别是自身 免疫性疾病的手段，口服免疫耐受才真正成为免疫学和临床研究的热点。国内外很多文献 报道【1 6 - - 2 2 1 口服i i 型胶原蛋白产生免疫耐受可使类风湿性关节炎的发病受到抑制，在动物实 验和临床观察中均发现令人鼓舞的结果。由于其简单可行、效果确切、成本不高、安全无 副作用，因此受到关注。 1 4 骨粉的加工 骨组织在动物体中约占体重的2 0 , - , 3 0 ，是一种营养价值非常高的肉类加工副产品， 它含有大量的蛋白质、脂质、矿物质等营养成分。目前由于对骨粉认识上的不足，动物骨 头的浪费严重，骨粉的营养价值也未得到充分利用。面对我国的肉类加工产量逐年上升， 抛弃的动物骨头越来越多的状况，开发利用动物骨头成为十分重要的课题，其中把骨头加 工成不同粒度的骨粉( 泥) 的形式，再对其进行深加工和应用，从而提高它的附加值，是当 前较为热门的工作【2 4 1 。 1 4 1 硬骨粉的加工 动物硬骨中含有丰富的矿物质、优质的蛋白质、脂肪酸、粘多糖，蓄积了人体所需之 精华。将鲜骨制成骨粉，既有效地保存了骨的营养成分，又便于包装、贮藏、运输，扩大 了其应用范围。大部分硬骨粉都是畜禽的杂骨经脱脂、脱胶制成的，蛋白质含量较高，脂 肪含量相对较低，属典型的高营养、低热能食品。此外，骨粉中的矿物质含量显著高于其 它食品，人体骨骼细胞对相同组织细胞有较强的亲和力，因而利用率较高，这也是硬骨粉 发挥其补钙作用的原因。 硬骨粉加工按照其加工温度的不同可分为高温高压法、常温法及低温冷冻法。目前应 用最广的是高温高压法，此法先将硬骨烫漂2 3m i n ，1 1 0 预煮3 0m i n 后，再在0 1m p a 、 1 2 1 条件下蒸煮，直到鲜骨酥软，然后烘干、粉碎。低温冷冻法主要是将鲜骨在1 5 - - , 2 5 充分冻结脆化，然后粉碎、磨细。常温法无需冷冻或高温蒸煮，在常温下利用钢柔 复合材料超细粉碎机制备超细骨粉，所得产品在表观状态、粒度分布、营养成分等方面都 优于高温高压法制备的骨粉。常温法加工骨粉的具体过程是将清洗烘干的骨头通过强冲击 力，使其破碎成1 0 - - - 2 0m l t l 的骨粒团；再对骨粒团粗粉碎，通过剪切力、研磨力使韧性组 织被反复切断，通过挤压力、研磨力使钢性骨粒进一步粉碎至l - - 2f i l m 的骨糊，接着通过 剪切、挤压、研磨的复合力场的作用，使骨料得到细粉碎或超细粉碎【2 5 1 。 随着纳米技术、粉碎技术的发展，我们将更容易获得最有利于人体吸收的骨粉颗粒， 酶工程、发酵工程在提高骨粉利用价值方而也将起到越来越大的作用。骨粉不仅可作为食 品配料添加到其它食品中，生产出众多骨食品，还可以制成不同类型的保健品，充分发挥 其营养价值。 8 第一章绪论 1 4 2 软骨粉的加工 软骨是没有血管、神经和淋巴系统的组织，在机体内的分布不如硬骨广泛。目前肉制 品加工企业的下脚料软骨大部分用作提取i i 型胶原和硫酸软骨素。上世纪初，人们发现鲨 鱼软骨具有多种活性，如溶菌酶活性、细胞生长促进活性、对蛋白酶抑制活性等，鲨鱼软 骨中的活性蛋白、硫酸软骨素能阻止肿瘤的生长和蔓延，而且不产生任何副作用，同时软 骨中的粘多糖能促进人体的免疫功能，增强人体免疫力。科学研究证明，鲨鱼软骨几乎浑 身是宝，如果只提取利用其中的某一种或两种成分，就会产生资源浪费，于是有学者提出 在不破坏软骨活性的基础上，直接把鲨鱼软骨加工成软骨粉，应用于保健品领域【2 引。 软骨中的活性物质不耐热，在加工过程中如果遇热就会变性而丧失其生物活性功能， 因此加工过程中的热处理程度决定了软骨粉的质量。目前，美国、澳大利亚、加拿大等地 的一些生产厂商在生产鲨鱼软骨粉时，为了追求效率，使用化学腐蚀剂去除软骨表面的肉 片，采用热烘干方式去除软骨水分，在制粉时采用机械搅拌撞击，这些都严重破坏了鲨鱼 软骨粉固有的质量和功能。日本的b i os h a r kg e n e r a lf o o d s 公司采用手工去除鲨鱼软骨上的 大部分肉片，然后把软骨浸入海中，利用海底微生物自然分解残存肉片，然后再利用自然 光和自然风蒸发水分，这两道工序前后就花去了一年多的时间，在最后的制粉的工序中， 他们采用特殊的冷冻粉碎技术，完好无损地保持了鲨鱼软骨原有的成分和功效，这种纯天 然百分之百的软骨粉占据了日本同类产品的9 5 的市场份额1 2 。 软骨粉的质量好坏还在于是否能被人体吸收，如果