（食品科学专业论文）荸荠皮抑菌物质的提取及稳定性研究.pdf

荸荠皮抑菌物质的提取及稳定性研究摘要近年来，国内外对植物资源杀菌、抑菌的研究备受重视，并且取碍了较大的进展。荸荠皮作为荸荠的加工废弃物，除一部分用作饲料外，大部分都作为废弃物扔掉，如果能将这些废弃物加以利用，对增加荸荠附加值将具有积极的意义。本文对荸荠皮抑菌物质的提取工艺、稳定性及抑菌成分的结构进行了研究。包括：采用超声波法提取荸荠皮抑菌物质并获得最佳工艺条件；研究了荸荠皮提取物的稳定性及其对多种菌的抑制作用；通过薄层层析和硅胶柱层析对抑菌物质分离纯化后对抑菌成分进行了初步的结构鉴定。超声波法提取荸荠皮中抑菌物质的实验中，通过单因素及正交实验确定的最佳工艺条件为：采用6 0 目的荸荠皮粉碎物、浓度6 5 的乙醇溶液、料液比l ：1 0 、超声波作用4 5 m i n 、提取次数一次，在此条件下提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为1 3 3 r a m 和1 4 ，3 r a m 。对荸荠皮提取物稳定性的研究表明：荸荠皮提取物对温度和紫外光的稳定性较强：提取物在不同浓度的盐溶液、糖溶液和p h 环境中其稳定性有一定的变化。提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的抑制作用较好。对荸荠皮提取物最小抑菌浓度的研究结果表明：荸荠皮提取物对细菌的抑制作用比苯甲酸钠和山梨酸钾好，对酵母菌的抑制作用比它们差。对荸荠皮抑菌物质纯化后进行的g c m s 鉴定结果显示：荸荠皮抑菌物质中含有甾醇类、有机酸类、醣类和黄酮类4 类活性成分共1 】种活性物质。关键词：荸荠皮超声波提取抑菌物质抑菌活性分离纯化s t u d i e so ne x t r a c t i o na n ds t a b i l i t yo fa n t i b a c t e r i a le x t r a c t i o n sf r o me l e o c h a r i st u b e r o s ep e e la b s t r a c ti nr e c e n ty e a r s ，p e o p l eh a v ep a i dm o r ea t t e n t i o nt ot h er e s e a r c ho fa n t i m i e r o b i a ls u b s t a n c ef r o mp l a n t s ，a n dh a v em a d eg r e a tp r o g r e s s e l e o e h a r i st u b e r o s ep e e li st h ed r o p p i n go ft h ee l e o c h a r i st u b e r o s ed u r i n gp r o c e s s i n g ，m o s to f t h e mh a v et h r o w na w a ya sw a s t e ，e x c e p ts m a l lp a r to ft h e mu s e da sf e e d i ft h e s ew a s t e sc a nb eu s e ds u 倚c i e n t l y , i tw i lb eap o s i t i v es i g n i f i c a n c et oi n c r e a s et h ev a l u eo fe l e o c h a r i st u b e r o s e 、yi nt h i sp a p e r , w es t u d i e da n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e se x t r a c t i o n 。s e p a r a t i o na n da n t i b a c t e r i a lp r o p e r t i e s t h ep r o c e s so fe x t r a c t i o no fa n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c ef r o me l e o c h a r i st u b e r o s ep e e lw i t hu l t r a s o n i cw e r es t u d i e d ；t h ep r o p e r t i e so fa n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e sw e r es t u d i e d ；a n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e sw a si s o l a t e db yt l ca n ds i l i c ag e lc o l u mc h r o m a t o g r a p h y , a n dt h es t r u c t u r eo fa n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e sw e r ei d e n t i f i e du s e i n gl i q u i dc h r o m a t o g r a p hm a s ss p e c t r o m e t e r i nt h es t u d yo fe x t r a c t i o no fa n t i m i c r o b i a ls u b s t a n c ef r o me l e o c h a r i st u b e r o s ep e e lw i t hu l t r a s o n i c ，o nt h eb a s i so fs i n g l ef a c t o r st e s ta n do r t h o g o n a lt e s t ，t h eo p t i m a lt e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r sw e r em a t e r i a l6 0m e s h ，e t h a n o l6 5 ，l ：10f o rr a t i oo fm a t e r i a lt ol i q u i d ，4 5 m i nf o ru l t r a s o n i ct i m e ，e x t r a c t i o nf o ro n et i m e t h ei n h i b i t o nz o n ef o re s c h e r i c h i ac o l ia n ds t a p h l o c o c c u sa u r e u sr e a c h e d13 3 r a ma n d1 4 3 m m t h es t u d yo ft h es t a b i l i t yo fe x t r a c t i o n sf r o me l e o e h a r i st u b e r o s ep e e li n d i c a t e st h a t ：t h ee x t r a c t i o nh a sg r e a ts t a b i l i t y st ot e m p e r a t u r ea n du l t r a v i o l e tl i g h t ；i nd e f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fs a l ts o l u t i o n ，s u g a rs o l u t i o na n dt h ep he n v i r o n m e n t ，t h es t a b i l i t yo f t h ee x t r a c t i o n sc h a n g e s t h er e s u l to f t h es t u d y so nt h ep r o p e r t i e so fe x t r a c t i o n si n d i c a t e dt h a t ：t h ee x t r a c t i o no fe l e o c h a r i st u b e r o s ep e e lh a sb e t t e ri n h i b i t i o nt ob a c t e r i at h a l ls o d i u mb e n z o a t ea n dp o t a s s i u ms o r b a t e ，h a sw o r s ei n h i b i t i o nt oe p i p h y t et h a ns o d i u mb e n z o a t ea n dp o t a s s i u ms o r b a t e t h es t u d i e so ns e p a r a t i o no fa n t i b a c t e r i a is u b s t a n c e sa n dt h ei d e n t i f i c a t i o nb yg c - m si n d i c a t et h a t ：e l e o c h a r i st u b e r o s e sp e e lc o n t a i n sc h o l e s t e r o l ，o r g a n i ca c i d s ，c a t e r sa n df l a v o n o i d sf o u rt y p e so fa c t i v ei n g r e d i e n t s ，a n d1 lk i n d so fa c t i v em a t e r i a l k e y w o r d s ：e l e o c h a r i st u b e r o s ep e e l ；u l t r a s o n i ce x t r a c t i o n ；a n t i b a c t e r i a ls u b s t a n c e ；a n t i b a c t e r i a lp r o p e r i t y ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o ni 【插图清单图2 ，1 不同提取剂对提取物抑菌效果的影响1 4图2 2 粒度对提取物抑菌效果的影响1 4图2 3 乙醇浓度对提取物抑菌效果的影响一1 5图2 - 4 料液比对提取物抑菌效果的影响1 6图2 5 提取时间对提取物抑菌效果的影响1 6图2 6 提取次数对提取物抑菌效果的影响。1 7图3 1 温度对荸荠皮提取物抑菌活性的影响2 2图3 2 盐对荸荠皮提取物抑菌活性的影响一2 3图3 3 糖对荸荠皮提取物抑菌活性的影响一一2 3图3 - 4p h 对荸荠皮提取物抑菌活性的影响2 4图3 5 紫外光对荸荠皮提取物抑菌活性的影响2 5图4 1 不同溶剂萃取流程图3 0图4 2 不同萃取物对供试菌的抑菌效果3 3图4 3 不同萃取物对供试菌的抑菌效果图3 4图4 4 不同流份对供试菌抑菌的抑菌效果3 5图4 5 不同流份对供试菌的抑菌效果图3 6图4 6 不同流份对供试菌的撺菌效果3 7图4 7 硅胶柱分离纯化乙酸乙酯萃取物流程图3 7图4 8 流份6 的g c m s 图3 8图4 - 9 流份7 的g c m s 图3 8v i表格清单表2 - 1 正交实验设计及结果1 8表2 2 方差分析表18表3 1 荸荠皮提取物对供试菌种的抑制效果2 5表3 2 荸荠皮提取物对各种供试菌的m i c 2 6表3 3 苯甲酸钠对各种供试菌的m i c 2 6表3 - 4 山梨酸钾对各秭供试菌的m i c 2 6表3 5 荸荠皮提取物与苯甲酸钠和山梨酸钾m i c 的比较2 7表4 1 荸荠皮成分粗测结果3 2袭4 2 不同溶剂薄层层析结果3 4独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标志和致谢的地方外，论文孛不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得盒自b 工业盔堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签字：勿0 全j 蜜字日期：弘7 年，三月，f 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解盒鳇王些盔堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅或借阅。本人授权金目墨王迪盘! l 可以将学位论文的全部或部分论文内容编入有关敷据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文者签名：张金野导师签名：签字日期：岬年n 一月f 6 日学位论文作者毕业后去向；工作单位：通讯地址：煽ol签字日期：j 川年，z 月f 6 臼电话：邮编：致谢本论文是在导师王泽南教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择、试验方案的制定到论文的成稿，王老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持。近三年来，王老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，尤其在做人做事方面，给了我深切的教诲，在此谨向王老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。同时，感谢陈从贵教授、周先汉副教授、方红美老师、韩卓老师等食品工程系的老师们给予我的热情帮助和指导。感谢师兄王华，师姐王莹、魏丹在我实验的过程中给予我的指导狸建议，感谢学弟、学妹蒋云舟和王翠，同学赵平、任苏玲、刘兰花、谭炜等，师弟姜震、陶学明、卢进峰，师妹王晓倩在科研和生活中对我的帮助。最后，我还要感谢我的家人和朋友们对我整个学习过程中的大力支持，在整个研究生期间的学习和工作中，他们给了我最无私的鼓励和默默的支持，再次表示衷心的感谢!n i张全军2 0 0 7 年1 2 月1 日第一章绪论1 1 植物中杀菌、抑菌活性物质研究进展1 1 1 杀菌、抑菌植物资源人类利用植物来防治病原微生物的历史久远。较早用于植物病害防治的植物有大蒜汁、洋葱汁、棉籽饼、辣蓼、五风草等【lj ，至今人们已调查和研究了多种植物的抑菌活性，特别是种子植物的抑菌活性。植物、中草药、香料及它们的衍生香精油包含很多可能抑制细菌、酵母、霉菌代谢活动的物质，但很多还没有完全开发利用。d s d n i v a s a n 等【2 1 对印度的5 0 种药用植物的水提取物的抑菌状况进行研究，发现其中3 6 种植物具有抗菌活性，进一步对这些植物的抑菌谱进行实验，发现其中的1 2 种如姜黄、灰杨柳、柚木等具有光谱的抑菌作用。t e s s a w i 【3 1 等对巴勒斯坦地区的15 种药用植物进行研究，发现鼠尾草、金石蚕、百里香、小茴香等8 种草药对革兰氏阴性菌、阳性菌都具有极强的抑菌作用。b f o g l i a n i 等t 4 7 对采自苏格兰的5 0 种火筒树科植物的抗微生物活性进行了测试，发现4 9 种植物对尖廉孢有不同程度的抑制作用。据资料记载，我国药用植物种近5 0 0 0 余种 5 1 。从植物中寻找活性物质，特别是从中国特有的植物中寻找活性物质具有重要意义。冯俊涛等【6 】测试了采自西北地区的5 7 科1 4 9 属1 8 7 种植物样品的丙酮提取物的抑菌活性，认为苦豆子、石榴、大花金挖耳、苍耳、孜然和瑞香狼毒等1 0 余种植物具有明显的研究开发价值。冯俊涛、石勇强、张兴等 7 1 对芦苇等5 6 种植物抑菌活性进行筛选实验，但目前这些研究仍处于实验阶段，有待于进一步产品化、实用化。国内外对植物源杀菌剂的研究越来越重视，并取得了较大的进展，通过对查阅沈寅初等_ 。9 】文献，对具有抑菌、杀菌或抗菌特性的植物进行了归纳总结，得出大部分抑菌植物集中在菊科、豆科、伞形科、禾本科、唇形科、木兰科、蓼科、葫芦科、百合科、莎草科、十字花科等科。1 1 2 杀菌、抑菌活性物质在植物体中的分布虽然众多的植物提取物对病菌都有抑制作用，但是同一种活性物质对不同病原菌的抑制程度不同，同一病原菌对不同的提取物敏感性亦有差异。不同的抗菌、杀菌植物，其有效成分在植物根、茎、叶、花、果、种子等部位的分布不尽相同，如大蒜、洋葱存在于球茎，荸荠存在于皮中。同种植物不同部位活性成分也不相同，如黄连小蘖碱在主根、须根、叶片和叶柄中的含量差异很大。所以，研究有效成分在植物中的分布，应针对具体的杀菌、抗菌植物，分别通过对根、茎、叶、花、果实等部位提取的生物活性测定，分析和了解不同活性成分在植株不同部位的分布情况，进而有目的的进行开发利用【1 0 1 1 。1 1 3 植物体内的有效杀菌、抑菌成分目前，国内外对植物源杀菌剂的研究取得了较大进展，发现了很多具有开发潜力的抑菌、杀菌或抗菌的化学成分，其结构类型涉及萜类、生物碱类、黄酮类、苷类、皂苷、醌类、香豆素、木脂素、酯类、酚类、甾醇类、有机酸及精油类等化合物。这些具有抗菌活性的植物有效成分类型较多，主要有以下几类：( 1 ) 萜类萜类是一类天然的烃类化合物，其分子中具有异戊二烯的基本单位。其植物体内萜类化合物的抗菌作用研究较多，c h r i s t i n e 等【1 2 l 从非洲药用植物c t e r o d e n r u mu n c i n a t u m 中分离得到一种新的抗真菌的藉类化合物氢化喹琳酮二萜，对瓜枝孢霉具有强烈的抑制活性。f r a n i c h 等 1 3 1 从辐射松的针叶中分离出3 种氧化双萜类化合物，对针红斑病具有很强的抗菌能力。郁建平等【1 4 】采用g c m s 技术分析了金丝桃挥发油成分中的萜类物质，并对其进行了抑菌实验，结果表明该物质对白色菌株、绿脓杆菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用。( 2 ) 黄酮类黄酮是一个特殊类群，种类繁多，特别是异黄酮类化合物具有很强的抗菌作用，越来越多的黄酮类化合物从植物中分离出来。c o x o n 等【”】从假水仙的鳞皮中提取到三种化合物7 羟基黄烷、4 ，7 一二羟基一8 甲基黄烷，都具有较强的抗真菌作用。m t l e s 等【1 6 】从尖石榴的枝条和叶中分离出黄酮类化合物，对丝核菌和大麦网孢霉具有抑制作用。k ka t i n d e h o u 等【1 7 】由豆科刺桐属植物e r y t h r i n av o g e l i i 根皮中分离出3 种新的异戊二烯化异黄酹，可以抑制瓜枝孢菌的生长。郑永权等【1 8 l 从苦参中提取物中分离得到若参酮和槐属二氢黄酮2 个主要杀虫抑菌活性成分。( 3 ) 生物碱类生物碱是一类存在于生物界( 主要是植物) 中，大多为具显著生物活性的含氮的碱性化物，迄今为止已从自然界分出一万多种生物碱。张为民等【3 7 】将苦豆子生物碱配制成不同浓度，通过试管法测定其最小浓度；并注入小鼠体内，测定其抗炎作用。刘佳斌等【1 针对万寿菊根部生物碱类提取物抑菌活性成分进行了研究。韦平英等1 2 0 】研究了苦参生物碱对几种植物病原菌的抑制作用。( 4 ) 酚类化合物酚类化合物一般都有显著的酸性，具有不同程度的抑菌作用。d r o b y 等t 2 u得出来成熟的芒果皮中有两种5 取代的问苯二酚混合物，和抑制交链孢霉的生长。d i x 等 4 1 1 研究发现，大蒜素具有抗菌活性。杨联松等【2 2 1 研究了茶多酚对食品中些腐败菌的抑制作用，结果表明，荼多酚对一些常见的腐败细菌和霉菌2生长有明显的抑制作用。唐裕芳等f 2 ，】对茶多酚的抑菌活性进行了研究，结果表明茶多酚对细菌有较强的抑菌活性，而对酵母和霉菌抑制作用不明显。林桂芸等【2 4 l 对和厚朴酚抑茵作用进行了研究，结果表明和厚朴酚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌均有很强的抑制作用。( 5 ) 蒽醌类化合物蒽醌类物质在植物抵御病原菌侵染方面起到了很重要的作用，熊卫东等【2 5 1探讨了含蒽醌类中草药作为天然防腐剂的可行性，将大黄、虎杖、决踢子、何首乌、茜草分别提取检出蒽醌昔，进行抑菌实验及抑菌强度实验，结果表明，它们分别对某种特定的菌种有较强的抑制能力，蒽醌类中草药用傲天然防腐剂前景看好。赵瑞芝【2 6 】研究了不同提取方法对大黄游离蒽醌含量及其抑茵活性的影响，并得出最佳提取工艺。田兵，华跃进等【2 7 】研究了芦荟抗菌作用与葸醌化合物的关系，结果表明蒽醌化合物是芦荟中的抗菌成分，芦荟苷是主要抗菌有效成份之一。除以上几种具有抑菌活性的物质外，香豆素类、皂苷、糖苷等也都有一定的抑菌作用。卢成英 2 8 用化学定性检识法得出槛木很有多种抑菌活性成分，其主要活性成分可能为香豆素类。史青1 2 卅研究了无患子果皮中皂营的抗皮真菌活性及其构效关系。金继曙和都述虎【3 0 】从油菜籽饼中成功分离出一种抗真菌活性成分油茶皂苷a ，被鉴定为齐墩果烷型的五环三萜皂苷，其对红色毛癣菌、石膏样癣菌、断发癣菌的m i c 为0 1 2 5 1 0 0 0 m g m l ，对白色念珠菌的m i c 为o 0 6 2 5 0 2 5 0 0 m g mi 。朱照静等 3 1j 人从苦瓜中分得海藻祷。1 1 4 国内外植物提取物抑菌活性研究现状苁植物中寻找生物活性物质一直是我国医药领域研究的重要内容之一。a m i n ( 1 9 6 9 ) 、m a h a j a n ( 1 9 8 2 ) 等1 3 2 】报道黄连小蘖碱对许多植物病原真菌和细菌有明显的抑制作用，v i n c e n t 等【3 3 用硫酸小蘖碱处理大麦种子减轻了大麦条纹花叶病毒病的危害，e b e r h a r d 等f 】用小蘖碱防治马铃薯晚疫病取得成功并获得专利。n o u y e n v a n c h u y e n 等口5 l 从k u m a z a 分离到醋酸、丙炔酸、苯甲酸、苯乙酸、水杨酸、3 - 羟基苯甲酸、0 茴香酸、苯酚、邻甲氧基苯酚和4 乙基苯酚等抗菌成分。s c h o n b e e k 等 3 6 】把4 8 科1 3 9 种植物分成花、叶、茎、根各部分，用4秸菌为检定菌分别在各部分中检索抑菌活性成分，发现8 3 的植物具有一定的抑菌活性。k o u s h i ks e e t h a r a m a n 等【3 7 】从禾本科植物高粱属中分离的抗真菌蛋白质( a f p ) 能抑制f u s a r i u m m o n i l i f o m l e 等真菌孢子的萌发。r a f i k a l i a m o m i n j首次报道了由旱芹种子中提取分离的具灭蚊、杀线虫和杀菌活性的化合物芹菜籽交酯，s e n k y u n o l i d e n 和s e n d k y u n o l i d e j 。边才苗 3 9 1 从白花蛇草中提取了对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等有抑杀作用的物质。鲍敏等【4 0 】对藏药翁布水体物和醇提物对大肠杆菌等9 种菌的最低抑菌浓度的最低抑菌浓度进行了测定，发现有显著的抑菌作用，同时他们还对雪灵芝不同提取物进行了抑菌实验，发现雪灵芝水提物的体外抑菌效果比醇提物效果显著。纪丽莲1 4 u 从荷叶中提取了对细菌和酵母菌等具有较强抑制作用的物质，其最低抑菌浓度( m i c ) 大都不超过8 ，且在弱碱条件下效果最好，月对发现提取物较稳定，能耐高温短时及超高温瞬时的热处理。蒋志国【”】等研究了1 0 种中草药提取物对果蔬致病菌扩展青霉和黑曲霉的抑制作用，发现丁香提取物抑菌活性较强，并从中分离出1 4 种化合物。吴周和等1 4 3 3 研究了藿香中天然防腐剂的提取方法和抑菌作用，结果表明，用藿香酸性提取物对常见食品污染菌有较强的抑制作用。姜萍等f 4 4 】对苦楝提取物的提取及提取物对真菌的抑菌活性进行了研究，结果表明，乙醇提取物对黑曲霉、绿色木霉有很好的抑制作用。卢成英等【4 s 对红槛木花红色素提取物抑菌活性进行了研究，结果表明提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和痢疾杆菌生长有明显的抑制作用。陈丽等【46 j 对黄硬皮马勃提取物抑菌活性进行了初步研究、研究结果表明提取物对5种细菌和3 种霉菌均具有不同程度的抑制作用，且对于细菌的抑制作用效果要明显强于霉菌。1 2 植物中有效成分的提取、分离和检测方法1 2 1 植物中有效成分的提取方法植物中有效成分的提取方法很多，传统上的提取方法主要有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、分子蒸馏法等。溶剂提取法有浸渍法、回流提取法等。传统的提取方法不需要特殊的仪器，应用比较普遍。现代提取方法是以现代先进的仪器为基础或新发展起来的提取方法，主要有超临界流体萃取技术、超声波提取技术、微波提取技术、酶法提取、仿生提取等。下面主要对超临界流体萃取、超声波提取和微波提取技术做介绍。1 2 1 1 超l 晦界流体萃取技术超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，缩写s c f e 或s f e ) 是一种新型的提取分离技术，它利用流体( 溶剂) 在临界点附近某区域( 超临界区) 内，与待分离混合物中的溶质具有异常相平衡行为和传递性能，且对溶质的溶解能力随压力和温度的改变而在相当宽的范围内变动，这种流体可以是单一的，也可以是复合的，添加适当的夹带剂可以大大增加其溶解性和选择性。利用这种超临界流体作溶剂，可以从多种液态或固态混合物中萃取出待分离的组分【4 ”。2 0 世纪5 0 年代美国的t o d d 和e l a i n 从理论上提出s f e 用于萃取分离的可能性。6 0 年代以后，前联邦德国对这一技术酋先做了大量基础和应用研究。直到7 0 年代才用于提取分离操作。李箐【48 】等用超临界c 0 2 技术从当归中萃取挥发油，后经g c m s 鉴定出3 8 个成分，其中乙酸十五酸甲酯等2 8 个成分为首次从当归中4得到。李仙义等【4 9 】采用超临界c 0 2 技术萃取荜茇中的胡椒碱，收率2 9 2 ，既省时又高效。姜继祖等i ，0 j 对光菇子中的秋水仙碱用超临界c 0 2 技术进行萃取，收率为溶剂法的1 2 5 倍，减少萃取时间5 5 。1 2 1 2 超声波提取超声波提取是利用超声波具有的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子运动速度，增大介质的穿透力，造成生物细胞壁及整个生物体破裂，同时加强了胞内物质的释放、扩散及溶解。被浸提的物质在被破碎瞬间生物活性保持不变。超声波法提取不用加热，对有效成分无不良影响，超声波提取是一个物理过程，在整个浸提过程中无化学反应发生，不影响大多数药物有效成分的生理活性，同时超声波破碎细胞能力强，可以取得现有的机械或化学方法有时难于取得的理想破碎效果。陈素艳等瞄1 】研究了超声波提取仙人掌中黄酮类化合物的研究。得出最优条件下提取的黄酮含量为3 2 3 8 1 r a g 1 0 0 9 ，加标回收率为9 7 7 。屈平等【5 2 】用超声波辅助提取苦荆茶中多酚类物质，得到最优条件下得率为1 2 8 ，纯度为6 3 5 ，比常规方法的得率和纯度均要高。钟振声等【5 3 】通过超声波法提取人参多糖的研究中得出在超声波功率2 0 0 w 、超声波作用时闯3 0 r a i n 料液比1 ：5 0 ，人身粒度8 0目条件下，提取的多糖质量分数比常规提取3 h 得到的多糖质量分数高2 3 。1 2 1 3 微波提取天然植物中的有效成分往往包埋在有表皮保护的内部薄壁细胞或液泡内，破壁非常困难。微波加热导致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量的热，使胞内温度迅速升高，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的空洞，进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞或裂纹的存在使胞外液容易进入细胞内，溶解并释放胞内产物。李安平等1 5 4 1 对桔黄色素微波萃取进行了研究，得出微波作用下所得桔皮色素不仅收率最高，而且性能稳定，质量较好，孙萍等【5 5 1 首次采用微波提取覆盆子果总黄酮，大大缩短了提取时间，提高了提取效率为该药材的迸一步研究和合理利用提供了基础资料。此外，酶法提取和仿生提取技术、固相萃取和固相微萃取技术，都是近年来发展较快的提取技术，这些技术还解决了传统分析中溶剂带来的不良影响，无溶剂或少溶剂样品萃取方法发展较快。1 2 2 植物中有效成分的分离方法植物有效成分的分离方法很多，柱色谱法、薄层色谱法、纸色谱法、等。主要有萃取法、沉淀分离法、膜分离法、气相色谱及其联用技术，高效液相色谱法1 2 2 1 萃取法萃取法根据萃取两相状态的不同可分为液液萃取、液固萃取和气液萃取。液一液萃取法是天然有机化合物分离中常用的分离方法，当对一种植物进行系统分离分析时，往往不知道化合物的结构，而植物浸提液常是含有极性差别很大的有机化合物的混合物，如果直接用结晶、柱层析等分离方法无法分离，这是般先用不同机型的有机溶剂萃取，把植物提取物分成不同极性范围的部分( 部位分离) ，然后再对每一部位进行逐步的分离分析，这种方法是系统分析法。1 2 2 2 膜分离法用天然或人工合成的高分子膜，以外界能量或化学位差为推动力，对混合物进行分离、分级、提纯和浓缩的方法，统称为膜分离法。目前，膜分离主要包括微滤、超滤、纳滤、反渗透、渗透、电渗析、渗透蒸发等。在实际生产中常常是几种膜技术联合起来，共同完成对天然有机化合物的分离。王后廷等 6 】应用两只不同孔径的中空纤维素柱超滤截留六味地黄汤中活性多糖，得到相对分子质量3 0 0 0 0 左右的活性多糖组分，提取工艺简单，生产周期短。薛伟明等【5 采用二醋酸纤维素膜纯化侧柏时总黄酮，并与传统的蒸干转溶法除杂比较，除杂效率高，分析过程无相变，分析步骤简化，准确度和精密度皆优于后者。1 2 2 - 3 柱色谱法柱色谱是将待分离混合物均匀地加在装有固定相的柱子中，再加适当的溶剂冲洗，由于固定相和移动相对各组分的亲和力不同。试样中个组分在两相中的分配不同，再柱中随流动相移动的速度不同，对固定相亲和力最弱的的组分洗脱剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。在色谱法中常把那种起分离作用的柱管称为色谱柱，在桂内进行的这种色谱分离法称为柱色谱法。柱色谱主要有吸附柱色谱、分配柱色谱、离子交换柱色谱、凝胶柱色谱、大孔树脂柱色谱、亲和柱色谱、改进型柱色谱等。( i ) 吸附柱色谱吸附柱色谱的分离效果取决于吸附剂的活性、溶剂的极性和被分离物质的极性这三个因素。常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅酸镁、硅藻土等。这里只对硅胶柱色谱进行介绍，层析用硅胶通常用s i 0 2 x h 2 0 表示，是常用的吸附剂，约9 0 以上的分离工作都可采用硅胶。硅胶是一种酸性吸附剂，适用于中性或酸性成分的分离分析。同时又是一种弱酸性阳离子交换剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。王彬等1 ”】研究了瑞香狼毒石油醚提取物硅胶柱层析分离组分的体外抗肿瘤作用。董亮等【”】采用硅胶柱层析分离苦豆子系列生物碱。6( 2 ) 大孔吸附树脂法大孔树脂色谱是以大孔吸附树脂为固定相，是天然产物提取液通过装有大孔树脂的柱子，其中的有效成分有选择性的吸附在树脂上，而杂质成分不被吸附，再经适当的溶剂洗脱。大孔吸附树脂对天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮、香豆素及其他一些萤类成分都有一定的吸附作用，对色素的吸尉作用较强，对糖类的吸附能力较差。向大雄等【60 l 采用3 种大孔吸附树脂来分离纯化葛根总黄酮，发现a b 型树脂综合性能最好，在稳定性实验中第1 1 个周期总黄酮收率为9 1 3 ，纯度为8 6 o 。杨桦等 6 h 利用大孔吸附树脂从川草乌中提取总生物碱，提取率达8 5 ，水溶住固体杂质的去除率为8 2 。1 2 2 3 气相色谱技术气相色谱是利用试样中各组分在色谱柱中的气相和固定相中的分配系数不同进行分离的方法。当样品进入进样口时，瞬问气化被载气带入色谱柱中，组分在两相中连续多次反复分配，由于固定相对各组分的吸附或解吸附能力不同，经过定长度的色谱柱后，彼此分离，由载气洗脱出色谱柱，进入监测器，而监测器把不同时间出来的组分转变成离子流讯号，经放大由记录仪描绘出电信号强度( 也就是蜂高或峰面积) 与对闯( 保留时闺) 的关系图，称为色谱图。许利平等【6 2 】建立了桂枝挥发油中桂皮醛含量测定的气相色谱法。李丹华等 6 3 1 采用气相色谱法分析了常用食用植物油中的脂肪酸组成和各种油的营养特色。杨永利【6 4 】利用铜沉和醇沉法提取纯化多糖，以薄层色谱和气相色谱法进行定性和定量分析，建立了苦豆子胶多糖组分分析方法。王和兴f 65 j 建立保健食品中甘露醇的毛细管气相色谱分析方法。1 2 2 4 高效液相色谱葛效液相色谱的分离原理与气相色谱的分离原理相同，在检测时，高效滚相色谱的流出物采用在线检测技术，当组分从柱内流出时溶液的浓度变化可通过检测器转化为光学或电学信号而被检出。张晓波【6 6 】研究建立了大豆提取物中大豆异黄酮高效液相色谱测定方法。张甜等f 67 i 研究了用微柱高效液楣色谱法测定葛根中的葛稂素的方法。向仲朝1 6 s j建立了食品中致癌染色剂苏丹红l 号的高效液相色谱定量测定方法。1 2 4 植物中有效成分结构鉴定方法2 0 世纪下半叶，光谱学已成为有机化学的基础课程。3 0 年代发展的紫外( u v ) 光谱和4 0 年代的红外( i r ) 光谱为化学家提供了识别有机化合物生色基和官能团的有效方法。研究者可以采用极少量的样品，非破坏性的实验得到有关结构的信息。5 0 年代发展起来的质谱( m s ) 方法进一步带来革命性的影响m s 实验可给出化合物的分子式，并且通过裂解方式提供分子的结构信息。1 2 4 1 紫外可见光谱( u v v i s ) 法7紫外可见光谱法比较简单，由图谱提供的结构信息也比较少。一般情况下由u v v i s 推断可靠的分子骨架是比较困难的，因为即使碳骨架相同，当共轭体系中断时其u v 吸收峰也会有很大区别。即使两个化合物结构并非属于一类，并且分子量相差甚远，只要生色基相同，会有几乎相同的u v 谱线。因此，再利用u v v i s 鉴定结构肘，其作用要出与次要位置。如果有大量的有规律性冉勺探讨和参考文献，使用u v v i s 图谱推断生色骨架和助色基的位置很有参考价值。1 2 4 2 红外光谱( i r ) 法2 0 世纪5 0 7 0 年代，i r 一直是有机化合物结构鉴定的最重要的方法，但现在i r 的作用已退居到比较次要的地位。但在有些情况下i r 是有决定性作用的，特别是羰基的鉴定，羧酸和酸酐的鉴定，羰环大小的鉴定等。在有标准图谱和对照样品的情况下，i r 用于化合物的鉴定是方便而可靠的，这是由于i r 的指纹鉴定功能，范积平等1 6 9 1 用近红外光谱法测定要用大黄中4 种蒽醌类成分，结果显示近红外光谱测定中药组分的预测模型建立完成后，准确度、精密度逼近建立模型时所用的含量测定参比方法，但更简便、快速。1 2 4 3 质谱法( m s )质谱法是鉴定有机物结构的重要方法，灵敏度高。m s 可以测定分子量、分子式。近几年来，m s 与其他仪器的联机给m s 增加了更大活力，应用范围进一步扩大。气相色谱质谱联用( g c m s ) 已成为鉴定天然有机混合物中各组成结构的有力手段之一，几乎所有用g c 可分离组分都可以使用g c m s 法得到效果比较满意的图谱。刘照娟等【7 0 】采用蒸馏萃取法提取紫花苜蓿中的挥发性成分，通过气相色谱质谱联用技术分离出8 3 种成分，并坚定了其中7 2 种化合物。龚钢明等p u 对高山红景天超临界c 0 2 萃取物进行了气相色谱质谱分析，鉴定出4 5 种组分。1 3 荸荠综述1 3 1 荸荠的资源开发与综合利用荸荠( h e l e o c h a r i st u b e r o s es c h u l t ) 别名马蹄、地粟、乌芋、鸟茈等，是莎草科多年生浅水草本植物，原产中国南方和印度，以其地下球茎作为食用器官，在我国已有2 0 0 0 余年的栽培历史【7 2 1 。大多数学者均认为荸荠源于中国和印度1 7 ”，中国关于荸荠的最早记载见于尔雅( 约公元前2 世纪) ：“芍，凫茈”，郭璞( 3 1 4 年前后) 注：“生下田，苗似龙须而细，根如指头，黑色，可食”。荸荠的驯化栽培则比较晚，关于荸荠栽培最早的见于两宋之际的古籍，南宋嘉泰元年( 1 2 0 1 年) 浙江吴兴志：“凫茈，今下田种”。以后安徽、浙江、湖南的地方志中陆续有荸荠栽培的记载。便民图纂( 1 5 0 2 年) 中首次述及荸荠的具体栽培方法【7 4 】。8荸荠营养十分丰富。富含蛋白质、碳水化合物、多种矿物质、维生素等有机成分，是一种优良的水生果蔬，作水果生吃，肉质洁白，脆嫩多汁。于饭后食之，则开胃下食除胸中实热，疗五种胸气，消宿食：煮熟作零食，则香甜脆美，更为儿童所喜食；作蔬菜或炒、或蒸做成多种甜食，也可作配莱拌菜做冷盘，甜脆爽口，色味俱佳；炒荸荠肉片，成甜脆嫩，耐人品味；作粉食之，明耳目，厚人肠胃，能解毒；拔丝荸荠，更是色美味香，风味独特( 75 1 。近年来，国内外对荸荠的研究已经取得了巨大进步。荸荠的加工技术也取得了很大发展，合肥工业大学的魏丹 7 6 1 对孳荠果皮不溶膳食纤维的提取工艺进行了研究，胡晓浩【7 7 3 】对荸荠片和荸荠饮片的加工工艺迸行了研究。其它方面的研究主要有以下几点：荸荠淀粉的加工、荸荠饮片的加工、荸荠罐头的加工、速冻荸荠、荸荠果脯、荸荠糖等的加工【7 9 】。蒋侬辉 8 0 1 对荸荠脯、清水荸荠罐头、荸荠爽饮料、荸荠果肉饮料、攀荠蜜饯的加工工艺及操作要点都进行了介绍。黄文等1 8 1 】研究了荸荠皮棕色素的提取及稳定性研究。荸荠的综合利用虽然已取得了不少成就，但需要研究和探索的问题还很多。贮藏保鲜方面鲜果的贮藏生理及保鲜方法研究的报道还不多见，应进步加强荸荠鲜切及鲜果贮藏研究，完善其采后商品化操作规程是当务之急。加工方面，充分发掘其加工利用价值，澄清荸荠饮料、复合荸荠饮料和发酵饮料的开发是荸荠饮料的研究方向。此外对荸荠的综合加工利用方面还可以加强对果皮中功效成分、抗菌成分的分离提取研究【7 9 1 。1 3 2 荸荠皮中抑菌活性物质的研究进展新近医学研究发现，荸荠中富含一种抗菌成分“荸荠英”。实验证实，它对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气杆菌及绿脓杆菌等，均有不同程度的孑审制作用。并能抑制流感病毒。上海肿瘤病防治研究协作组等单位。从筛选中发现，荸荠含防治癌症的有效成分，它的各种制剂，在动物体内，均显抑瘤效果，对降低血压也有作用。所以荸荠既为美食，又是良药i7 5 】，先前已有报道，荸荠皮中含有能够抑制细菌生长的功效。荸荠皮是荸荠加工过程中的废弃物，如果能将这些废弃物加以利用，生产出天然抑菌防腐剂，对增加荸荠附加值将具有积极的意义。目前，对荸荠皮抑菌物质的研究文献还不太多，也仅局限于两到三个单位。曾莹等1 8 2 | s 3 】对荸荠皮提取物在食品中的抗菌效果进行了研究，得出提取物对多数食品都有明显的抑菌效果，能有效延长食品的保质期，她还用一般的热浸提法对抑菌物质的提取工艺进行了研究；王金华等1 8 4 对荸荠皮叶茎提取物抑菌性作了分析检测，发现对细菌、酵母菌和霉菌都有较强的抑菌特性，并有较好的热稳定性。刘欣等l s 鼻拍】用硅胶板层析技术，采用二元溶剂对荸荠皮粗提物乙酸乙酯部分进行了分离，并对荸荠皮抑菌物质的抑菌活性进行了初步研究，同时，他们对抑菌物质进行了初步分离纯化最终9检测出一种抑菌活性成分2 4 乙基7 胆甾酵。总体来说对荸荠皮抑菌成分的研究还不够完全，比如其中的抑菌成份不可能局限于一类，还有待于继续研究。1 4 研究背景及内容1 4 1 研究背景和意义植物具有杀菌、抑菌的能力是它们在自然界中与病原菌长期斗争的结果，活性物质在植物中应该是广泛存在的。现阶段，关于植物生物活性的研究已有很多，但植物杀菌、抑菌作用的研究仅占其中极小的部分，于是，在植物体内寻找新型的杀菌、抑菌活性物质成为热点内容之一。荸荠作为我国的特产果品，其营养丰富，汁多味甜，自古有“地下雪梨”之称，北方人则视之为“江南人参”。除了营养价值外，它的医疗保健效果也很好，据记载，荸荠性味甘寒，功效清热化痰、生津开胃、明目清音、消食醒酒，还有抗肿瘤、抗菌、防治呼吸道疾病、利肠通便和利尿排淋等作用。荸荠中含有一种抗菌成份，它对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气杆菌及绿脓杆菌等具有不同程度的抑制作用，本论文既是在此处出发进行了研究。我国有着丰富的荸荠资源，对荸荠的开发研究已取得了很大的进展，荸荠加工过程中产生了大量的废弃物如荸荠皮，荸荠皮通常作为废弃物扔掉，或作为饲料，利用率极低。近年来，有报道称孳荠皮中含有抑制细菌生长的活性成分，因此，如果能将这些废弃物重新利用，提取其中的抑菌活性成分并将其开发成为一种新型的天然抑菌防腐剂将是一件非常有意义的事情。1 4 2 研究内容( 1 ) 超声波提取荸荠皮抑菌物质的工艺研究：采用超声波法提取荸荠皮中的抑菌物质。以抑菌圈直径为评价指标，通过单因素和正交实验，最后得出最佳提取工艺。( 2 ) 荸荠皮提取物的稳定性及多菌种的抑制作用的研究：研究了提取物在不同条件下的稳定性，测定了提取物对多种供试菌的抑制效果，又测定了提取物对供试菌的最小抑菌浓度，并与苯甲酸纳和山梨酸钾的最小抑菌浓度进行了比较。( 3 ) 荸荠皮孛化学成分测定及抑菌物质的分离鉴定：首先对荸荠皮中的化学成分进行了粗测；随后对抑菌物质进行了不同溶剂的萃取分离和进一步的柱层析分离，同时进行抑菌效力的测定；最后选择抑菌效果较好的部分进行g c m s结构检测。1 0第二章荸荠皮抑菌物质的提取工艺研究2 1 实验材料与设备2 1 1 实验材料与主要试剂原料：荸荠皮( 合肥市宁国路菜场)实验菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌( 由合肥工业大学生物与食品学院微生物资源与应用实验室提供)培养基：牛肉膏蛋白胨培养基主要试剂：乙醇( 分析纯)上海振企化学试剂有限公司乙酸乙酯( 分折纯)上海化学试剂有跟公司乙醚( 分析纯)上海化学试剂有限公司丙酮( 分析纯)上海化学试剂有限公司牛肉膏( 生化试剂)北京奥博生物技术有限公司蛋白胨( 生化试剂)北京奥博生物技术有限公司2 1 2 仪器与设备r 2 0 1 旋转蒸发仪d g z 2 0 4 1 型真空干燥箱电热恒温培养箱s w c j - 1 f 单人双面净化工作台手提式压力蒸汽灭菌锅s h z d ( ) 循环水式真空泵d h g 一9 2 4 0 a 鼓风干燥箱h h 2 数显恒温水浴锅b t l 2 0 0 恒流泵2 2 工艺流程与实验方法2 2 1 工艺流程上海申胜生物技术有限公司南京实验仪器厂上海跃进医疗器械厂苏州净化设备有限公司上海华线医用核子仪器有限公司巩义市英峪予华仪器厂上海一恒科技有限公司金坛市杰瑞尔电器有限公司上海琪特分析仪器有限公司荸荠皮一5 0 烘干一粉碎一5 0 水浴下6