（食品科学专业论文）黑胡萝卜色素的提取纯化及其结构分析.pdf

本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集 体己经发表或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：番l 确勾 日期：掰年月蟛日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天 津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 孑】彳面 1 7 t 蟛1 ： 甜年月力日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密il ( 请在方框内打“寸) ，在 年解密后适用本授权 书。 本学位论文属于 不保密 翊( 请在方框内打“”) 。 作者签名：移j 干旬 只期： 口年月只 导师签名： 参f 唾毫参 日期： d 年今月乒8 日 蝴 一 一 一 摘要 本论文对黑胡萝卜色素的提取、精制工艺条件、稳定性、结构的初步分析以 及体外抗氧化性进行了研究。 通过实验确定了酸水浸提法制备黑胡萝卜色素的实验条件。酸水提取最适工 艺条件：温度为7 0 ，提取时间为1 5 h ，料液比l ：6 ，提取剂p h 为1 o 。 比较几种大孔吸附树脂后，使用x 5 树脂用于黑胡萝卜色素的精制。通过动 态吸附性能的考察，确定采用黑胡萝卜色素提取液吸光度在1 5 0 2 x 2 3 2 5 2 之间， 流速为i - 2 b v h 上柱。通过动态解吸性能的考察，确定采用浓度为6 0 7 0 的乙 醇溶液，0 5 1 b v h 进行解吸。通过大孔吸附树脂，黑胡萝卜色素得到了较好的 富集和纯化，精制品色价为2 9 3 。 黑胡萝卜色素对热稳定，对常见的阳离子也表现出较好的稳定性，但f e 3 + 、 a l ”对其有显著的不良影响。黑胡萝卜色素在光照条件不稳定，使用时应避光处 理。黑胡萝卜色素受p h 值的影响很大，在碱性条件下不稳定，同时对氧化剂与 还原剂均不稳定。 采用阳离子交换树脂d 6 1 对黑胡萝b 色素进行再精制，再精制后的黑胡萝 卜色素的色价为5 2 1 ，花色苷含量也由9 4 4 提高到2 5 1 6 。 黑胡萝卜色素经初步分析，推断其中矢车菊花色苷为主要苷元，其3 位上的 糖苷配基可能为葡萄糖或槐糖。结合文献和液质联用分析推断黑胡萝卜色素可能 是含有一分子桂皮酸和一分子阿魏酸的矢车菊素3 o 槐糖苷。 对黑胡萝卜色素和再精制黑胡萝卜色素的体外抗氧化活性进行了研究。在研 究了黑胡萝卜清除d p p h 的能力的基础上，用荧光化学发光法测定了黑胡萝b 色 素和再精制黑胡萝卜色素对活性氧自由基( 0 2 、o h 、h 2 0 2 ) 的清除作用，并与抗 坏血酸进行了对比。结果表明，两者对d p p h 、0 2 。、o h 、h 2 0 2 均具有清除作 用，尤其对o h 的清除能力强于抗坏血酸，且清除作用与浓度呈量效关系。 关键词：黑胡萝卜；花色苷；结构；纯化；稳定性：抗氧化性 a b s t r a c t t h r o u g l le x p e r i m e n t ，t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n so fa c i dw a t e re x t r a c t i o n w e r eo b t a i n e d t h eo p t i m u mo fa c i dw a t e re x t r a c t i o nw e r ea c i dw a t e r ( p h - - 1 ) ， e x t r a c t i o nt i m e1 5ha t7 0 ，b l a c kc a r r o t ：s o l v e n t = l ：6 ，a n de x t r a c t e do n et i m e s a u n f yt h eb l a c kc a r r o tp i g m e n t ：x 一5t y p em a c r o p o r o u sr e s i nw a su s e d ，w h e nt h e a b s o r b e n c yo fp i g m e n tw a sb e t w e e n 1 5 0 2x2 - 3 2 5 2 ，t h ea d s o r p t i o nc u r r e n tv e l o c i t y w a s1 2 b v l i - d e s o r b e da t6 0 - 7 0 e t h a n o la se l u a n tw i t hd e s o r p t i o nc u r r e n t v e l o c i t yw a s0 5 lb v 1 1 b l a c kc a r r o tp i g m e n tw a sg r e a t l yr e f i n e db ym a c r o p o r o n s 1 7 1 r e s i n , 1 1 1 eb l a c kc a r r o tp i g m e n tp o w d e ro w n e dz - 。l c m = 2 9 3 c o n c l u s i o nf r o mt h es t u d yo fs t a b i l i t y ：t h eb l a c kc a r r o tp i g m e n ti ss t a b l et oh e a t , s u i t a b l ef o rf o o dp r o c e s sa n dh i g ht e m p e r a t u r es t e r i l i z a t i o n i ti sa l s os t a b l et of a m i l i a r c a t i o n ，b u tc a nb ed e s t r o y e db ya i ”、f e s + d i s t i n c t l y t h eb l a c kc a r r o tp i g m e n ts h o u l d b ed e a l 、 ，i t l la v o i dl i g h tf o ri th a sn os t a b i l i t yo nl i g h t ，a sw e l lo no x i d a n ta n dr e d u c e r t i 圮v a l u eo fp hh a sg r e a te f f e c to ni t p u r l f yt h eb l a c kc a r r o tp i g m e n tt h es e c o n dt i m e ：d 6 1t y p er e s i nw a su s e d ，a f t e rt h e s e c o n dp u r i f y , b l a c kc a r r o tp i g m e n tw a sg r e a t l yr e f i n e db ym a c r o p o r o u sr e s i n , 1 1 1 e f 1 b l a c kc a r r o tp i g m e n tp o w d e ro w n e dd l a w = 5 2 1 t o t a la n t h o c y a n i n so fb l a c kp o w d e r i si m p r o v e df r o m9 4 4 t o2 5 16 a f t e ra n a l y z e db yt l ca n dl c m s ，i tw a sl i k e l yt oc o n t a i nc y c a n i d i nm a i n l y t h e t h r e e sp l a c eo nc y c a n i d i na n t h o y a n i n si ss u b s t i t u t e db yg l u c o s i d e a f t e ra n a l y z e db y l c m sa n dc o m b i n e dw i t hl i t e r a t u r e ， w ec a n s p e c u l a t e t h a t t h e y w e r e c y c a n i d i n - 3 g l u c o s i d ew i t ho n em o l e c u l ec i n n a m i ca c i da n do n e m o l e c u l ef e r u l i ca c i d i nt h i sp a p e r , t h ev i t r oa n t i o x i d a n ta c t i v i t yo ft h eb l a c kc a r r o tp i g m e n ta n dt h e s e c o n dp u r i f i e db l a c kp i g m e n tw a ss t u d i e d b a s e dt h es c a v e n g i n ge f f e c to fp i g m e n t a g a i n s t d p p h w a ss t u d i e d ，i t s s c a v e n g i n ga c t i v i t ya g a i n s to x y g e n f r e e r a d i c a l s ( 0 2 、o h 、h 2 0 2 ) w a sd e t e r m i n e db yf l u o r e s c e n tc h e m i l u m i n e s c e n c em e t h o d a n dc o m p a r e dw i t ht h ea s c o r b i ca c i d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tr e m a r k a b l es c a v e n g i n g e f f e c t sa g a i n s td p p h 、0 2 - 、o ha n dh 2 0 2w e r ed e t e c t e d ，a n di t se s p e c i a l l ys t r o n g a g a i n s t o h ，e v e ns t r o n g e rt h a nl - a s c o r b i ca c i d s f u r t h e r m o r e ，s c a v e n g i n ga c t i v i t y a n da n t h o c y a n i n sc o n c e n t r a t i o ns h o w e dap o s i t i o no fd o s e - r e s p o n s er e l a t i o n s h i p k e yw o r d ：b l a c kc a r r o t ；a n t h o c y a n i n s ；s t r u c t u r a t i o n ；p u r i f y ；s t a b i l i t y ；a n t i o x i d a n t 目录。 1 前言 目录 l 1 1 黑胡萝卜概况l 1 2 黑胡萝卜色素提取方法。l 1 2 1 溶剂提取法l 1 2 2 微波提取法2 1 2 3 超临界提取法3 1 2 4 超声波提取法3 1 2 5 生物技术生产天然色素3 1 3 黑胡萝卜色素的精制方法4 1 3 1 大孔吸附树脂法4 1 3 2 酶法精制法。6 1 3 3 超滤精制法6 1 3 4 凝胶层析精制法6 1 4 天然功能性色素的稳定化技术。6 1 4 1 加入稳定剂6 1 4 2 加入抗氧化剂6 1 4 3 加入金属离子鳌合剂6 1 4 4 天然色素的改性7 1 4 5 天然色素的微胶囊化一7 1 5 花色苷的化学结构7 1 5 1 葡萄花色苷的研究进展。7 1 5 2 花色苷的性质9 1 5 3 花色苷类色素含量表示方法9 1 6 花色苷类色素组分的分离纯化方法9 1 6 1 纸层析( p a p e rc h r o m a t o g r a p h y , p c ) 9 1 6 2 薄层层析( t h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t l c ) 1 0 1 6 3 柱层析( c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , c c ) 10 1 6 4 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 。11 1 7 花色苷类色素结构的鉴定方法l l 1 7 1 色谱法二l l 1 7 2 光谱法1 2 1 7 3 质谱( m s ) 及液质联用( l c m s m s ) 1 3 1 7 4 核磁共振波谱法( 1 、m 依) 1 4 1 7 5 花色苷的水解分析法1 4 1 8 氧自由基与天然抗氧化剂1 5 1 8 1 自由基与活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 15 1 8 2 天然抗氧化剂一l5 1 8 3 测量活性氧、自由基及脂质过氧化物的荧光化学发光技术1 6 1 9 本课题的研究目的和主要内容1 8 1 9 1 研究目的与意义1 8 1 9 2 研究的主要内容1 8 2 材料与方法。一。一。一。一一2 0 2 1 实验材料2 0 2 2 主要仪器2 0 2 3 主要试剂2 0 2 4 酸水浸提黑胡萝卜色素的研究2 l 2 4 1 黑胡萝b 色素最大吸收波长的确定2 2 2 4 2 提取工艺流程。2 2 2 4 3 黑胡萝卜色素浸提条件的单因素实验2 2 2 4 4 黑胡萝卜色素浸提条件的j 下交实验一2 2 2 5 大孔吸附树脂纯化黑胡萝b 色素的研究2 3 2 5 1 黑胡萝卜色素粗提液的制备2 3 2 5 2 大孔吸附树脂的选型2 3 2 5 3 几种大孔吸附树脂对黑胡萝b 色素的静态吸附和解吸性能的考察2 3 2 5 4 不同因素对x 5 动态吸附效果的影响2 4 2 5 5 黑胡萝b 色素成品制备2 5 2 6 黑胡萝b 色素理化性质研究2 5 2 6 1 溶解性考察。2 5 2 6 2 黑胡萝b 色素对p h 的稳定性2 5 2 6 3 黑胡萝b 色素对光的稳定性2 5 2 6 4 黑胡萝b 色素对热的稳定性2 5 2 6 5 黑胡萝b 色素对金属离子的稳定性2 6 2 6 6 黑胡萝卜色素对抗坏血酸的稳定性2 6 2 6 7 黑胡萝b 色素对氧化剂h 2 0 2 的稳定性：2 6 2 6 8 黑胡萝卜色素对还原剂n a 2 s 0 3 的稳定性2 6 2 6 9 黑胡萝卜色素对防腐剂苯甲酸钠的稳定性2 6 2 7 阳离子交换树脂对黑胡萝卜色素的再次纯化2 6 2 7 1 两种阳离子交换树脂对黑胡萝卜色素的静态吸附的考察2 6 h 2 7 2 再次纯化的黑胡萝卜色素的制备2 6 2 7 3 纯化后的黑胡萝卜色素与纯化前黑胡萝卜色素的比较2 7 2 8 黑胡萝卜色素结构的初步分析2 7 2 8 1 黑胡萝卜色素的h p l c 分析2 7 2 。8 2 花色苷苷元的分析i 翻2 7 2 8 3 黑胡萝卜色素紫外可见光谱分析2 8 2 g 4 黑胡萝卜色素的糖苷基组分的确定2 8 2 8 4 黑胡萝卜色素的h p l c m s m s 鉴定2 9 2 9 黑胡萝卜色素和和再精制胡萝卜色素的抗氧化性实验2 9 2 9 1 清除d p p h 自由基能力2 9 2 9 2 超氧阴离子自由基清除能力测定( 鲁米诺化学发光法) 2 9 2 9 3 过氧化氢清除能力测定( 鲁米诺化学发光法) 3 0 2 9 4 羟自由基清除能力测定( 鲁米诺化学发光法) 3 0 3 结果与讨论一3 2 3 1 黑胡萝卜色素酸水浸提条件实验3 2 3 1 1 最大吸收波长的确定3 2 3 1 2 黑胡萝卜色素酸水浸提单因素实验3 2 3 1 3 黑胡萝卜色素浸提条件的正交实验3 4 3 2 黑胡萝卜色素大孔吸附树脂的精制实验研究3 6 3 2 1 不同型号的树脂对黑胡萝卜色素的静态吸附效果3 6 3 2 2 不同因素对x 5 动态吸附效果的影响3 7 3 3 黑胡萝卜色素的色价和得率4 0 3 4 黑胡萝i - 色素的稳定性的研究4 0 3 4 1 溶解性考察。4 0 3 4 2 黑胡萝卜色素对p h 值的稳定性4 0 3 4 3 黑胡萝卜色素对光的稳定性4 l 3 4 4 黑胡萝卜色素对热的稳定性4 2 3 4 5 黑胡萝卜色素对耐金属离子的稳定性4 2 3 4 6 黑胡萝卜色素对常用食品添加剂一抗坏血酸的稳定性4 3 3 4 7 黑胡萝卜色素对氧化剂h 2 0 2 的稳定性4 3 3 4 8 黑胡萝卜色素对还原剂n a 2 s 0 3 的稳定性4 4 3 4 9 黑胡萝卜色素对防腐剂苯甲酸钠的稳定性4 5 3 5 阳离子交换树脂对黑胡萝卜色素的再次纯化4 5 3 5 1 阳离子交换树脂的选择4 5 3 5 2 纯化后的黑胡萝卜色素与纯化前黑胡萝卜色素的比较4 5 3 6 黑胡萝卜色素结构的初步分析。4 6 3 6 1 黑胡萝卜色素的h p l c 分析4 6 3 6 2 黑胡萝卜色素苷元的分析4 7 3 6 3 黑胡萝b g 色苷紫外可见光谱分析4 9 3 6 4 黑胡萝b 花色苷中糖苷组分的确定5 0 3 6 5 黑胡萝卜花色苷的h p l c m s m s 鉴定5 l 3 7 精制和再精制黑胡萝b 色素体外抗氧化性的研究5 2 3 7 1 精制和再精制黑胡萝卜色素清除d p p h 自由基的能力5 2 3 7 2 精制和再精制黑胡萝卜色素对邻苯三酚体系产生的0 2 。的清除作用5 3 3 7 3 精制和再精制黑胡萝b 色素对o h 的清除作用5 3 3 7 4 精制和再精制黑胡萝卜色素对h 2 0 2 的清除作用5 5 3 7 5 黑胡萝卜色素与再精制黑胡萝卜色素的比较结果。5 5 4 结论。! ；7 4 1 热浸提法提取黑胡萝卜色素5 7 4 2 黑胡萝卜色素的精制5 7 4 3 黑胡萝b 色素稳定性5 7 4 4 黑胡萝b 色素的再精制5 7 4 5 黑胡萝b 色素结构的初步分析5 7 4 6 黑胡萝卜色素和再精制黑胡萝卜花色苷的抗氧化性5 7 1 ；展望。! ；8 6 差参考文献。5 9 7 攻读硕士期间论文发表情况 8 致谢 i v 6 4 6 5 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 黑胡萝i 、概况 萝卜富含很多有益于人体健康的成分，是一种很有营养价值的农作物资源。胡萝 卜现在已经被认为是大众所接受的主要农作物之一，但是黑色的和紫色的胡萝b 仍然 不为大众所知，尽管他们的种植历史要比胡萝i - 的种植历史要古老很多【l 】，黑色的和 紫色的胡萝卜在一些东方国家诸如土耳其、埃及、印度和一些远东国家仍然作为传统 的种植项目进行种植和消判2 , 3 , 4 , 5 】。根据准确的植物学定义，萝卜的变种栽培被细分为 花青素组和胡萝i - 素组【6 】。 现在，黑胡萝b 正在逐渐成为制作天然着色剂的一种非常流行的原料。由于严格 了对食品色素的使用标准，同时现在消费者对天然食品的要求不断提高，传统的合成 色素产品正在逐渐被来自于天然产物中提取的天然色素所代替【7 1 。 酚酸提取自黑胡萝卜的根部和黑胡萝卜汁的浓缩汁，其成分特点通过高效液相色 谱已经被探知。混合物中的大部分成分已被确定为由对羟基桂皮酸、阿魏酸组成的缩 酚酸。另外，三种羟基酸派生物和一种五羟配糖也已经被发现。5 氧氯原酸是混合物 中的主要成分，在根中达到6 5 7 m g k g ，在浓缩液中达到5 8 1 5 m g k g 。同时还探知4 - 氧 氯原酸和一些其他的氢氧根酸酯，存在于混合物当中，但不属于缩酚酸类【3 j 。糖类物 质对黑胡萝i - 色素的产生有着一定的影响，因此对糖类物质的评价显得尤为重要。在 所有的胡萝1 - 根部的糖类中蔗糖所占比重相当大，根据品种的不同最低占到总糖量的 3 9 5 ，最高达到9 3 4 ，一般的范围是在6 0 9 0 之间，与以前的相关报道蔗糖的 含量是致的。相比较之下橙色的黄色的和白色的萝卜的蔗糖含量只占到总糖含量的 3 9 * 0 4 9 。果糖和葡萄糖的含量就相应的很低，葡萄糖的百分率在3 5 * , - 3 4 2 ，果糖 的百分率3 1 2 6 4 。总量的范围在1 4 2 0 4 2 4 9 9 k g t 9 1 。 1 2 黑胡萝i 、色素提取方法 1 2 1 溶剂提取法 i o l 溶剂提取法是将原料用适当的溶剂在常温或温热条件下浸提出有效成分的一种 方法，取适量粉碎后的原料，置于有盖容器中，加入适量的溶剂密盖，搅拌或振荡， 浸渍在规定时间内有效成分充分浸出，倾取上清液、过滤、压榨残渣、合并滤液和压 榨汁，过滤浓缩至适宜浓度。浸提法有冷浸和热浸之分，冷浸适用于提取遇热易被破 坏的物质及含淀粉、树胶、果胶、粘液质的样品，热浸由于提高提取成分的溶解度故 提取效果较冷浸好。 浸渍法适用于粘性的、无组织结构的、新鲜及易于膨胀的原料的提取，尤其适用 于有效成分遇热易挥发或易破坏的原料，但操作时间长，浸出溶剂用量大，往往浸出 效果差，不易完全浸出；若以水作溶剂夏季易霉变；浸渍法也不适用于有效成分含量 低的原料。 1 前言 溶剂提取的效果主要取决于选择合适的溶剂和提取方法。此外，原料的粉碎度， 提取温度，浓度差，提取时间，操作压力，原料与溶剂的相对运动等因素也不同程度 影响提取效果。 原料的粉碎粒度原料经粉碎后粒度变小，面积增加，浸出速度加快，但粉碎 度过高，样品表面积过大，吸附作用增强，反而影响扩散速度，并不利于浸出，许多 不溶性高分子物质微粒进入浸液中，给过滤造成困难。一般而言，粒度以2 0 - - 6 0 目为 宜。 浸提温度温度增加可增大可溶性成分的溶解度、扩散系数。扩散速度加快有 利于浸提，并且温度适当升高，可使原料中的蛋白质凝固、酶破坏而增加浸提液的稳 定性，但温度过高，会破坏不耐热成分，并且导致浸提液的品质变劣。提取的杂质含 量增高，给后续精制工艺带来困难，一般浸提温度控制在6 0 - - - 1 0 0 。 浓度差浓度差是原料组织内的浓度与外周溶液的浓度差异。浓度差越大，扩 散推动力越大，越有利于提高浸出效率。当内外浓度达到平衡时，停止扩散，成分不 再浸出。在浸提过程中不断搅拌或更新溶剂，可以增大扩散层中的有效成分的浓度差， 以提高浸提效果。 浸提时间原料中的成份随提取时间延长，提取的得率增加，但时间过长，杂 质成分溶解也随之增加，给后续精制造成困难，一般而言，热浸提1 3h ，乙醇热回 流提取l 2h 。 黄酮苷类以及极性稍大的配基一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水或某些 极性较大的混合溶剂进行提取。其中用的最多的是甲醇水( 1 ：1 ) ，一些多糖苷类可以用 沸水提取。在提取花青素类化合物时，可加入少量酸( 如0 i h c i ) 。但一些黄酮苷类 成分在酸性条件下易水解，应谨慎使用。为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解， 也常按一般提取苷的方法先破坏酶的活性。大多的苷元宜用极性较小的溶剂，如乙醚、 氯仿、乙酸乙酯等来提取，多甲氧基黄酮类苷元，甚至可用苯来提取。 目前，溶剂提取法对于黄酮类花色素的提取已有较成熟的工艺研究，并实现工业 化生产。如通过溶剂提取法对黑豆皮色素，黑米色素，紫甘薯花色苷，越桔花色苷， 甜菜红色素等一系列天然色素的提取工艺的研究1 4 1 。 1 2 2 微波提取法 微波提取( m i c r o w a v e a s s i s t e de x t r a c t i o n ，简称m a e ) 的应用始于1 9 8 6 年，当时美 国科学家利用微波炉通过适当操作进行了有机化合物的提取，发现它较溶剂浸提法具 有热效率高、节约能源、迅速、省时、产品质量高、原料的利用率高、设备简单、造 价低等诸多优点，从此微波提取受到了人们的广泛关注。后来加拿大的c w t t r a n 国际公司与e sf o x 公司联合深入研究m a e 技术，并成功地开发了m a e 生产设备i l 卯。 随着微波提取技术的不断研究，现在微波提取技术可用于芝麻、丁香、茴香、鼠 尾草等中药以及植物精油的提取和柑桔、辣椒等色素的提取。y o u n g 采用微波萃取 2 天津科技大学硕上学位论文 ( 2 4 5 0 m h z 7 5 0 w ) 法从真菌代谢物中成功地提取了麦角甾醇；c a n z l e r 等人最早采用了 微波提取的技术并研究了从蚕豆中提取蚕豆嘧啶糖苷以及从棉籽中提取棉籽酚，发现 比传统的索氏提取法更有效【1 5 】。陈猛等采用微波萃取法从辣椒中提取辣椒素，提取产 率明显高于乙醇室温浸提法和丙酮4 5 ( 2 浸提法【l6 1 。同时由于物料受热时间短，很好 地保持了色素的稳定性。目前微波提取法在天然色素提取物中的应用正在得到逐步推 广。 1 2 3 超临界提取法 超临界流体萃取( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，简称s f e ) 是新兴的一项萃取分离 技术，与传统的化学溶剂萃取法相比，其优越性是无化学溶剂残留、无污染、避免萃 取物在高温下的热变性、保持生理活性物质的活性及萃取物的天然风味等【1 7 l 。2 0 世 纪5 0 年代，美国的t 0 d d 和e l i g i n 从理论上提出了超临界流体用于萃取的可能性。6 0 年代，西德首先对这一领域做了大量基础和应用的研究。近几十年来，s f e 技术迅速 发展，目前己广泛应用于油脂、胆固醇、香精、香料等的萃取分离。据郭孝武报道， 澳大利亚等国利用该技术萃取啤酒花，从奶油和鸡蛋中去除胆固醇，从天然产物中萃 取药用成分等【1 3 】。近年来，人们开始尝试将s f e 技术应用于天然色素的提取，大大提 高了色素的溶解性和色价，并获得了良好的精制效果。白寿宁将s f e 技术应用于枸杞 色素中b 一胡萝卜素的研究【1 9 1 。但目前影响其应用的主要问题是超临界萃取设备的投 资费用高，而且由于c 0 2 的低极性使得这种方法对极性物质( 如花色苷) 的分离不理想。 1 2 4 超声波提取法 这种方法目前在中草药化学成分的提取中应用的较为广泛，它是利用超声具有空 化、粉碎、搅拌等特殊作用，对植物细胞进行破坏，使溶媒渗透到植物的细胞中，以 便于植物中的化学成分溶于溶媒中，通过分离、提纯、获得所需的化学成分。与常规 的提取法相比，超声波提取法具有：实验设备简单、操作方便、提取时间短、产率高、 无需加热等优点1 2 例。 1 2 5 生物技术生产天然色素 由于天然色素使用天然原料来提取，随着自然条件的变动，原料的质量、产品和 价格均易波动。为了解决这个问题，人们开始采用生物技术来生产天然色素。采用生 化技术选取含有植物色素的细胞，在人工条件下，进行培养、增殖，可在短期内培养 出大量的色素细胞，然后再用通常方法提取【2 。这种方法不受自然条件的限制，能在 短期内生产大量的色素。目前报道过的用植物细胞培养生产的色素有胡萝卜素、叶黄 素、单宁、黄酮等。 1 9 8 7 年和1 9 8 9 年r i d e r 和f r a n c i s 建议用植物细胞培养的方法来生产花青素。在 此之后，有许多研究单位和工厂进行了深入细致的研究。目前己报道的能产生花青素 的植物有：大戟属( e u p h o r b i am i l l i ) 、翠菊属( c a l l i s tp e p h u sc h i n e n s i s ) 、甜生豆、矢车 菊属( c e m n t a u r e ac y a n u s ) 、玫瑰花、紫菊属( p e r l l af r u t e s c e n s ) 、苹果、葡萄、胡萝卜、 1 前言 野生胡萝卜、葡萄滕、土当归、商陆( p h y o l a c aa m e r i c a n a ) 、筋骨草属( a j u g ar e p t a n s ) 、 靶苔属等。同时也报道了植物细胞培养生产花青素的代谢途径、高产细胞株的选育、 最佳培养基的成分、细胞生长时期与花青素积累的关系，产物的提取等的研究工作【2 2 1 。 1 3 黑胡萝i 、色素的精制方法 1 3 1 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂也叫大网格吸附剂，是7 0 年代以来在离子交换树脂的基础上发展 起来的有机高聚物吸附剂，多为苯乙烯型或2 一甲基丙烯酸酯型，具有较好的吸附性 能。它的化学结构与离子交换树脂类似，区别在于后者引入可进行离子交换的酸性或碱 性基团。大孔吸附树脂在国外多用于污水处理、临床鉴定与治疗等，在国内则多用于 抗生素和中草药化学成分的提取与分离】。 1 3 1 1 分离原理 大孔吸附树脂理化性质稳定，不溶于水、酸、碱及常用有机溶剂。显微形状为球 形颗粒，内部有很多网状孔穴而具有很大的比表面积。比表面积愈大，吸附能力愈强。 另在树脂合成时可引入酰胺基、酚羟基等极性基团，使树脂具有适当的极性，可用于 极性化合物的吸附。 大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料，它的吸附作用是通过范德华 引力和形成氢键来实现的，同时其本身的多孔状结构又具有筛选作用，吸附和过筛作 用以及本身的极性使得大孔吸附树脂具有吸附、富集、分离不同结构化合物的功能。 使用时可根据待分离物的性质选择树脂的孔径、比表面积和极性，使有机化合物因吸 附力或分子量的差异，经一定的溶剂洗脱而被分开【2 4 】。 1 3 1 2 影响分离纯化的因素【冽 首先要考虑树脂本身化学结构的影响。大孔吸附树脂是一种表面吸附剂其吸附力 与树脂的比表面积、表面电性、能否与被吸附物形成氢健等有关。被吸附化合物的分 子量大小不同，要选择适当孔径的树脂才能达到有效分离的目的，在孔径合适的情况下 树脂对分子量大的化合物吸附作用较大。使用极性树脂时，化合物的极性增加时，树脂 对其吸附力也随之增加；若树脂和化合物之间能产生氢键作用，吸附作用也将增强。 其次洗脱剂的种类、浓度、p h 值，树脂和样品预处理方法，样品与树脂用量比 等都能影响分离纯化的效果。通常一种物质在某种溶剂中溶解度大，树脂对此物质的 吸附力就小。故可通过调节p h ，改变溶解性等方法来改变树脂吸附力。 1 3 1 3 树脂在花色苷类色素分离中的应用 大孔吸附树脂在中草药化学成分的提取中有独特的作用，在黄酮类色素的分离提 取也有良好的效果。常用于黄酮类色素纯化的树脂型号是天津南大化工厂生产的 a b 8 、x 5 、s 8 、n k a i i 或沧州远威化工厂生产的y w d 0 1 、y w d 0 1 b 、y w d 0 3 等已用于紫甘薯色素、紫苏色素、萝i - 红色素、紫荆花红色素、火龙果色素、紫菜薹 色素、甜菜红色素等的精制纯化工艺中。陈勇等 2 6 1 通过对6 种树脂( a b 8 、x 5 、s - 8 、 4 天津科技大学硕士学位论文 n k a 9 、d 3 5 2 0 、d 4 0 2 0 ) 进行筛选实验，发现a b 8 对紫甘薯色素的吸附能力较强， 并考察了a b 8 型大孔吸附树脂富集纯化紫甘薯色素的吸附性能与洗脱参数，指出在 吸附过程中a b 8 对p h = 2 5 的紫甘薯色素提取液吸附性能较好于其他，在解吸过程中， 乙醇浓度为7 0 的洗脱效果最好，乙醇浓度过高或过低，解吸效果都会下降。张晴 2 7 1 通过对8 种树脂( n k a 9 、d 4 0 0 6 、d 4 0 2 0 、n k a i i 、s 8 、a b 8 、d 3 5 2 0 、x - 5 ) 进行 筛选实验，发现a b 8 型对紫苏色素的吸附能力最强n k a 9 最差。文中指出紫苏色素 的主要成份紫苏素和紫苏宁都是可溶于水的弱极性有机化合物，与a b 8 大孔吸附树 脂的表面极性相匹配，从而决定了其对天然色素具有较高的吸附能力。张晴【2 酊考察了 x 5 树脂富集纯化萝i - 红色素的吸附性能和洗脱参数。高虹等1 2 9 j 通过s 8 、x 5 、 d a 2 0 1 、a b 8 、n k a - 9 和d 2 9 0 等大孔树脂对紫荆花红色素吸附性能的研究，确定 非极性树x 5 为色素提取的最佳吸附树脂，丙酮为色素吸附树脂的解吸剂。正交动态吸 附实验结果表明：原花液浓度2m g m l 左右，吸附流速l m l m i n ，径高比2 ：3 时，为较适宜 的吸附工艺条件。丙酮流速为1 5m l m i n 时，对吸附色素的树脂解吸百分率最高。按优 化条件提取分离紫荆花红色素，总收率达到3 8 左右，色素色价提高4 7 倍。龚敏等【3 0 】 用大孔吸附树脂s 8 精制浓缩火龙果色素，以0 2 h c i - 4 0 乙醇溶液作为洗脱液，色素 的回收率达到9 3 4 ，浓缩倍数达到1 7 倍以上，不仅降低了能耗，同时避免了在减压浓 缩过程中色素的降解与变性。陈效兰等1 3 i j 从4 种树脂( a b 8 、x - 5 、n k a i i 、d 3 5 2 0 ) 筛选出n k a 9 对紫菜薹色素提取液进行吸附，以0 3 柠檬酸6 0 乙醇溶液作洗脱剂， 色素的回收率可达9 2 8 ，浓缩倍数可达l o 倍以上。 1 3 1 4 树脂法分离步骤 树脂的预处理及再生 新购树脂含有未聚合单体、致孔剂、分散剂等残留的杂质成分，使用前必须加以 处理。使用一段时间后的树脂吸附有样品杂质，颜色加深，亦应再生处理，再生后的 树脂可重复用于下一轮相同植物成分的提取分离。一般情况下，纯化同一种目的物的大 孔树脂。当其吸附量下降3 0 以上时，则应视为不宜再用。树脂处理方法可根据具体情 况，选用甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇等有机溶媒配合酸、碱、水等以适当浓度进行回 流或洗脱，以洗涤液不含溶质为终点；可观察颜色等外观变化，或借助必要的手段来 检测树脂处理是否符合要求。 样品液的预处理 用水或醇提取的样品液，须先将样品转入水相，经过过滤、沉淀、调节p h 等处 理，除去部分杂质，制成澄清的溶液，以防堵塞树脂。这样既能提高纯化效果，也能 延长树脂的使用寿命。 上柱、吸附、沈脱 树脂湿法装柱，加样吸附。花色苷被树脂吸附后，选择适当的洗脱剂，一般先用 去离子水，再用浓度递增的低碳醇，并控制洗脱剂的用量与流速，洗脱，收集合并花 色苷的组分，达到与提取液中糖类、无机盐等杂质分离的过程。洗脱过程中应结合简 1 前言 便的监控方法。 1 3 2 酶法精制法 酶是具有专一性的高效催化剂，其催化作用常常在常温、近中性的条件下就能进 行，这就特别适合耐热性不强的天然色素的精制。酶法精制就是利用酶的专一、高效 的催化作用，使天然色素粗制品中的杂质通过酶促的反应被除去，达到精制的目的。 日本专利报道，从蚕砂中提取的叶绿素粗品中加入脂肪酶的活化液，可以除去异味， 制得优质叶绿素【3 2 】。 1 3 3 超滤精制法 天然色素工业可选用适当孔径的超滤膜，使水分子甚至小分子杂质通过超滤膜， 而使溶剂中有效成分被阻留，从而使色素达到某种程度的纯化和高倍数浓缩。国外己 有使用超滤膜精制天然色素的报道。 1 3 4 凝胶层析精制法 凝胶层析( 凝胶过滤) 的应用始于2 0 世纪5 0