华中农业大学生物化学考研试题库附答案核酸化学.doc

第5章 核酸化学一、 学大纲基本要求DNA、RNA的结构和性质以及研究技术。核酸的化学结构，碱基、核苷、核苷酸，DNA的结构,DNA的一级结构, DNA的二级结构, DNA结构的不均一性和多形性, 环状DNA, 染色体的结构。RNA的结构, RNA的类型和结构特点,tRNA的结构和功能, mRNA的结构和功能, rRNA的结构和功能。核酸的性质, 解离性质, 水解性质, 光吸收性质, 沉降特性,变性、复性及杂交。核酸研究技术,核酸的分离纯化,限制性核酸内切酶,DNA物理图谱,分子杂交,DNA序列分析,DNA的化学合成，DNA聚合酶链式反应PCR。二、 本章知识要点(一) 核酸的化学组成1元素组成核酸分子主要由碳、氢、氧、氮和磷等元素组成。与蛋白质相比较，核酸的元素组成中一般不含有硫，而磷的含量较为稳定，占核酸910。可通过测定磷含量来估计样品中核酸的含量。2物质组成核酸在核酸酶的作用下水解为核苷酸，核苷酸完全水解可释放出等摩尔量的含N碱(碱基Base)、戊糖和磷酸。因此构成核酸的物质成分有三类：包括磷酸、戊糖和碱基。戊糖可分为核糖和脱氧核糖，碱基又分为嘌呤碱和嘧啶碱两类，DNA中的戊糖和碱基与RNA有所不同。 DNA分子中的戊糖是-D-2-脱氧核糖,RNA中的戊糖是-D-核糖。 DNA分子中存在的碱基主要有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。 RNA分子中除含有A，G，C外，还含有尿嘧啶(U)，而不含有T。因此，DNA和RNA的碱基组成上，嘧啶的组成有所不同。在DNA和RNA分子中尚含有少量的不常见的其他碱基，称为稀有碱基，它们大多数是常见碱基的甲基化衍生物。3核酸的基本单位核苷酸组成DNA的核苷酸(nucleotide)称为脱氧核糖核苷酸，组成RNA的核苷酸称为核糖核苷酸。核苷酸则是由磷酸、戊糖、碱基组成。碱基和核糖或脱氧核糖之间脱水通过糖苷键(glycosidic bond)缩合形成核苷或脱氧核苷，戊糖的第1位碳原子与嘌呤的第9位氮原子相连构成l，9糖苷键，而与嘧啶的第l位氮原子相连构成1，1-糖苷键。核苷中戊糖的游离羟基与磷酸之间脱水通过磷酯键缩合生成核苷酸。因核糖核苷的糖基在2，3，5，位上均有游离的羟基，故能分别形成2-3-或5-核糖核苷酸，而脱氧核糖核苷的糖基上只有3，5两个游离的羟基，所以只能形成3-或5-脱氧核糖核苷酸。生物体内游离存在的多是5-核苷酸。5-核苷酸的磷酸基上往往可以再接一分子或两分子磷酸，生成二磷酸或三磷酸核糖核苷(NDP或NTP)和二磷酸或三磷酸脱氧核糖核苷(dNDP或dNTP)。四种NTP和四种dNTP分别是合成RNA和DNA的原料。在生物体内还有一些游离的核苷酸及其衍生物，如供能物质ATP、多种激素的第二信使cAMP，cGMP等，在生物代谢过程中起重要作用。4核苷酸的连接方式核苷酸之间靠3，5-磷酸二酯键彼此连接而组成多核苷酸链。即核苷酸戊糖的第5位碳上的磷酸基与另一个核苷酸戊糖的第3位碳上的羟基脱水缩合形成酯键。因一个磷酸基形成两个酯键，故称为磷酸二酯键。多核苷酸链是核酸的基本结构形式，由四种核糖核苷酸(NMP)通过磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链为RNA链。由四种脱氧核糖核苷酸(dNMP)通过磷酸二酯键连接而成的多核苷酸链为DNA链。DNA链和RNA链都具有两个游离末端，其核苷酸残基中戊糖的5位碳上带有游离的磷酸基的一端称为5末端，戊糖的3位碳上带有游离的羟基的一端称为3末端。多核苷酸链是以糖磷酸构成骨架，碱基在骨架内侧。在书写核苷酸链核苷酸残基(或碱基)排列顺序时，则从53方向(由左至右)描述。（二）DNA的分子结构 核酸的分子结构大体分为三级，DNA和RNA在分子的构象和碱基组成上有着显著的差异。 1DNA的一级结构DNA的一级结构是指多脱氧核糖核苷酸链中核苷酸残基的排列顺序，也就是核苷酸链中碱基的排列顺序。 DNA对遗传信息的携带和传递是依靠核苷酸中的碱基排列顺序变化而实现的。自然界基因的长度在几十至几万个碱基之间，由于碱基的排列方式不同，因而提供的DNA编码能力几乎是无限的。2DNA的二级结构DNA的二级结构是典型的双螺旋(double helix)结构。Watson-Crick双螺旋结构模型(B-DNA)的特征是： (1)反向平行双链：由两条长度相同、互为反向平行的脱氧多核苷酸链组成。碱基位于两条脱氧核糖和磷酸形成的长链骨架的内侧。 (2)碱基互补配对：两条链通过碱基间形成的氢键相连，具有严格的碱基配对关系。始终是A与T配对、G与C配对。A，T之间形成二个氢键，G，C之间形成三个氢键。碱基对(bp)平面垂直于螺旋轴。 (3)右手双螺旋：两条反向平行的脱氧核糖核酸链围饶同一中心轴盘饶成右手螺旋。每10个bp为一周，螺距为3.4nm，螺旋直径为2.0nm，相邻的bp平面沿轴旋转36，上升0.34nm。双螺旋表面具有深沟和浅沟(大沟和小沟)。深沟是蛋白质识别DNA碱基序列的基础。 (4)维持双螺旋结构稳定的力量：bp之间的氢键维持双螺旋结构的横向稳定，碱基平面间的疏水性堆积力维持纵向稳定。 DNA的二级结构尚存在Z-DNA，A-DNA等螺旋形式。在DNA分子中碱基组成有着显著的特点：既嘌呤碱的数目与嘧啶碱的数目相等。A=T，G=C，A+G=C+T：不同种生物细胞中的DNA，碱基组成不同：同一个体不同组织器官中DNA的碱基组成相同：DNA分子的碱基组成不受年龄、营养状况的影响。3. DNA的三级结构DNA的三级结构是在二级结构基础上进一步盘饶形成的超螺旋结构。如真核细胞DNA的双链缠饶在组蛋白上构成核小体。参与核小体形成的组蛋白包括H1，H2A，H2B，H3，H4五种亚基，一个完整的核小体由核心颗粒及连接区组成。每两分子H2A，H2B，H3，H4构成八聚体与DNA形成核小体的核心颗粒，H1亚基形成核小体的连接区。 DNA分子围饶核心颗粒盘饶1圈大约140bp，连接区DNA长度约为60bp，完整的核小体DNA约含200个碱基对，它是染色体的基本单位。由许多核小体形成的串珠状结构再进一步卷曲呈螺线管状排列，即为染色质纤维，染色质纤维再经几次卷曲才能形成染色单体。超螺旋结构的形成使细胞核内DNA的长度压缩了近一万倍。 （三）RNA的分子结构1RNA的类型和结构特点是指多核苷酸链中核苷酸残基的排列顺序，RNA的结构一般是以一条单链形式存在，单链折叠盘饶时存在着一些能够互补配对的核苷酸区，形成局部双螺旋结构。碱基间也有互补配对关系，A对U，G对C，A，U之间形成两个氢键，G，C之间形成三个氢键。但是，在整个RNA分子中嘌呤碱和嘧啶碱之间没有严格的相等关系。单链内不能配对的部分则被排斥在双链外，形成环状突起。这就是RNA的二级结构。细胞内含有三种主要的RNA即mRNA，rRNA，tRNA。2. mRNA的结构和功能mRNA可从DNA转录遗传信息，并作为指导蛋白质合成的模版。mRNA含量最少，仅占RNA含量的3。但作为不同蛋白质合成模版的mRNA种类却最多。其一级结构差异很大，核苷酸数变动范围在5006000bp之间，其分子为线形单链结构。成熟的mRNA来自于其前体核不均一RNA(hnRNA)的剪接而成。5-末端有一个7-甲基鸟苷三磷酸(m7-GTP)的“帽”，3-末端有多聚腺苷酸(Po1yA)的“尾”，该尾由30200个腺苷酸聚合而成。其帽和尾是在转录后加上去的。中间部位为编码区，从53每三个相连的碱基为一组密码，称为“三联体密码子”。组成mRNA的碱基共四种，每3个组成一组密码可组成64组。其中6l组为有意义密码子，分别代表20种不同的氨基酸。3. tRNA的结构和功能tRNA的功能是在细胞蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体，并将其转呈给mRNA。其分子最小，由6090个核苷酸组成，约占RNA总量的16。其分子组成特点是含有较多的稀有碱基和稀有核苷，包括双氢尿密啶(DHU)、假尿苷()和甲基化的嘌呤(mG，mA)。其二级结构呈三叶草型。其主要功能部位有二个，一个是3-末端的-CCA-OH结构，起特异结合氨基酸的作用，称为“氨基酸臂”。另一个是反密码环，环上有三联的“反密码子”，它与mRNA上的密码子反向互补。于是，由tRNA携带的氨基酸可被转运到与密码子相对应的部位上。所以，tRNA尚有阅读mRNA密码子的功能。tRNA的三级结构为倒“L”型，是天然状态下的构象。4. rRNA的结构和功能rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80。rRNA不单独存在，它与蛋白质结合为核糖体(核蛋白体)。核糖体由大、小两个亚基组成，在原核和真核生物细胞内，构成大、小亚基的rRNA的种类和数目各不相同。核糖体存在于粗面内质网和胞浆中。（四）核酸的理化性质l. 一般理化性质由于DNA和RNA的多核苷酸链上即有酸性的磷酸基团，又有碱基上的碱性基团。因此，它也是两性电解质。在一定pH溶液中可带某种电荷，可用电泳方法将其分离。核酸通常显酸性，易与金属离子生成盐。可加入乙醇或异丙醇使其沉淀析出。核酸是生物大分子，具有大分子的一般特性。如易沉淀、因呈线性结构，具有一定的粘度。因核酸分子中的碱基结构中也存在着共轭双键，所以核酸具有紫外吸收特性。核酸溶液在260nm波长处具有最大光吸收，该性质可用于核酸的定量分析。 2. DNA的变性、复性和分子杂交DNA的变性是指在理化因素作用下，DNA分子中的氢键断裂，碱基堆积力遭到破坏，双螺旋结构解体，双链分开形成单链的过程。DNA变性后表现为粘度降低、紫外吸收增加(增色效应)。在实验室使DNA变性的最常用方法是加热。加热时DNA双链逐渐发生解链，紫外吸收能力逐渐增加。当紫外吸收达到最大值一半时的溶液温度称为DNA的变性温度(Tm)，亦称解链温度或熔解温度。DNA Tm值的大小与分子中的GC配对含量多少及分子的长度有关。G，C含量越高Tm值越大，DNA分子越长Tm值也越大。 所谓DNA的复性是指变性分开的两条单链，按照碱基互补配对原则重新形成双股螺旋的过程。通常采用降温的方法使其复性，所以DNA的复性亦称为“退火”。退火温度一般比Tm值低25。 而分子杂交是指不同来源的核酸单链合并在一起，形成杂化双链的过程。只要这些核酸链含有可以形成碱基互补配对的序列，就可以形成部分双链。核酸分子杂交在分子生物学研究中是一项应用较多的重要实验技术。（五）核酸研究技术1.核酸的分离纯化 （1）分离DNA最重要的方法有3个：一是用盐抽提，用苯酚和氯仿除去蛋白质。二是SDS存在下保温消化细胞悬液，再用苯酚和氯仿去蛋白，用RNase除去少量的RNA。三是用氯化铯密度梯度离心法分离纯化DNA。 （2）制备RNA要防止RNase的降解。器皿要高温处理或用DEPC除去RNase。破碎细胞的同是使蛋白质变性。RNA反应体系中加入RNase抑制剂(RNasin)。常用的RNA分离方法有两种，用酸性胍盐苯酚氯仿抽提。其二，用胍盐氯化铯密度梯度离心。分离Poly(A) mRNA可用寡聚(dT)n亲和层析法。核酸的测定常用紫外分光光度法、定磷法和定糖法。测定生物样品中的核酸需要预先处理，定量提取出核酸或其成分再作测定。（3）核酸的超速离心是研究核酸的重要方法。常用的是密度梯度离心法。可用来测定核酸密度、测定G十C含量和研究核酸的构象。（4）核酸的凝胶电泳是最常用的核酸研究方法。通常用的是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。2.限制性核酸内切酶（1）限制修饰系统，限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，构成一个限制修饰系统，甲基化酶使细菌自身的DNA带上标志，限制性内切酶专门用于降解入侵的外源DNA。 （2）限制酶的命名：E.coRI,第一位：属名E（大写）, 第二、三位：种名的头两个字母小写co, 第四位： 菌株R, 第五位：从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。(3) 修饰一限制酶主要有三类, 类型I酶为多亚基双功能酶，对DNA甲基化和切割由同一酶完成。该酶共有二种亚基，S亚基为识别亚基，识别位点分为两部分序列，中间隔以一定长度的任意碱基对。R亚基具有限制酶活性，可在远离识别位点至少1kb以上处随机进行切割。由于切割是随机的，这类酶在基因操作中并无实际用途。类型酶的修饰和限制活性由分开的两个酶来完成。通常这类甲基化酶由一条多肽链组成，限制酶由两条相同的多肽链组成。类型酶的识别序列常为46bp的回文序列。甲基化酶能使半甲基化DNA，识别位点上特定碱基甲基化，甲基化酶每次作用只引入一个甲基。DNA两条链都已甲基化时无反应，两条链都末甲基化则被限制酶降解。限制酶的切割位点或在识别位点内，或靠近识别位点。切割DNA或是将两条链对应酯键切开，形成平末端，或是将两条链交错切开，形成单链突出的末端。切开的两末端单链彼此互补，可以配对，故称为黏性末端。由不同微生物分离得到的限制酶。如果识别位点和切割位点完全一样，称为同裂酶。如仅仅是黏性末端突出的单链相同，称为同尾酶。类型酶为两个亚基的双功能酶，M亚基负责识别与修饰，R亚基负责切割，其修饰与切割都需要ATP提供能量，切割位点在识别位点下游2426bp处。3.DNA物理图谱 在研究某一种DNA时，弄清该DNA分子有哪些限制酶切位点是很重要的。建立物理图谱是进一步分析此DNA的基础。限制酶图谱的制作十分简单。 将纯化的DNA(往往用分子克隆法，从单一克隆中扩增而制备)，用不同的限制酶切割，进行凝胶电泳分析。根据测量凝胶电泳图上各酶切片段的长度，就可以决定各切点的位置。4.分子杂交 在DNA复性时，如把不同DNA分子或DNA与RNA分子放在同一溶液中，只要这些核酸单链分子之间存在一定程度的碱基配对关系，就可在不同分子间形成杂化双链，这种现象称核酸分子杂交。（1）Southern blotting 将限制性内切酶酶切电泳后的DNA转移至NC膜上，再与核酸探针杂交的技术。Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和基因定位。（2）Northern blotting 将电泳后的RNA转移至NC膜上，再与核酸探针杂交的技术。研究对象是RNA。 （3）Western blotting 将聚丙烯酰胺凝胶电泳后的蛋白质转移至NC膜上，再与另一标记蛋白质分子(如抗体)杂交的技术。抗原与抗体的杂交，研究基因表达产物的常用技术。5.DNA序列分析（1）化学法 化学法的原理是用特异的化学试剂修饰DNA 分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链。所以，用四组不同的特异反应，就可以将末端(3或5 端)用放射性标记的DNA分子形成不同长度的寡核苷酸。用凝胶电泳将这些不同长度的寡核苷酸分离开来，即可读出所测定的DNA的序列。（2）双脱氧法(dideoxy method)也称酶法(enzyme method)，是由Sanger于1977年建立的。其原理是利用2，3-双脱氧三磷酸核苷(2，3-ddNTP)来终止DNA的复制反应。大肠杆菌DNA聚合酶(或K1enow片段)在DNA复制过程中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸是接在延伸链的3-0H上。所以，如果掺入的底物中有2，3-ddNTP，延伸反应即告终止。这样设计四组反应，每组反应中都含有正常的四种脱氧核苷酸dNTP(其中一种为32P标记的)，单链DNA模板(即待测的DNA)和引物(Primer)，各组反应还加入一种2，3-ddNlP。反应结果，在加入2，3-ddATP的反应中，凡碰到需要dATP的时候，如果掺入的不是dATP，而是2，3-ddATP时，链延伸反应即告终止。用凝胶电泳分析这四组反应的产物，即可从放射自显影上读出DNA的序列。 （3）RNA的序列分析 酶裂解法，从胰脏提取的Rnase A水解嘧啶核苷酸的键，所产生寡核苷酸的3端均为嘧啶核苷酸。米曲霉中提取的RNase Tl特异水解鸟苷酸与相邻核苷酸的键。黑粉菌中提取的RNase U2在一定条件下特异水解腺苷酸的键。从多头粘菌中提取的RNase Phy I水解A、G、U 3种核苷酸，但不水解胞苷酸。利用上述4种酶可测定RNA的序列。用化学试剂裂解RNA 基本原理与DNA化学测序法相似。逆转录成cDNA 即可用DNA测序法来测定序列。6.DNA的化学合成 DNA的化学合成已有自动化仪器来完成，目前采用的是亚磷酸三酯法。 7.DNA聚合酶链式反应 DNA的聚合酶铤反应(PCR)是一种快速简便的体外DNA扩增技术，能在很短时间内，将几个拷贝的DNA放大上百万倍。是应用最广泛的生物技术。（1）它的基本步骤为：设计一对引物。优化反应体系。选择热循环温度。鉴定扩增产物。（2）工作原理：以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留复制的机制沿模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，使目的DNA片段得到大量扩增。（3）用途 目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA微量分析等。 三、重点、难点重点：本章应重点掌握核酸的分子组成、核酸的分子结构、特别是DNA的二级结构特点以及三种RNA的结构特点及功能，DNA的变性、复性及杂交的概念及意义。为基因信息的传递各章节的学习打好基础。还应该了解核酸的分离纯化,限制性核酸内切酶及DNA物理图谱,分子杂交,DNA序列分析,DNA聚合酶链式反应（PCR）等现代的核酸研究技术。难点：DNA的二级结构特点以及三种RNA的结构特点及功能，DNA序列分析和DNA聚合酶链式反应（PCR）。四、典型例题解析例题5-1：DNA热变性有何特点?Tm值表示什么?解：将DNA的稀盐溶液加热到70-100几分钟后，双螺旋结构即发生破坏，氢键断裂，两条链彼此分开，形成无规则线团状，此过程就是DNA的热变性。DNA的热变性有很多特点如：变性温度范围很窄；260nm处的紫外吸收增加；粘度下降；生物活性丧失；比旋度下降；酸碱滴定曲线改变。Tm值代表核酸的变性温度(熔解温度、熔点)。在数值上等于DNA变性时紫外吸收达到最大值半数时所对应的温度。例题5-2：简述DNA双螺旋的结构特点。解：DNA分子为两条多核苷酸链以相同的螺旋轴为中心，盘绕成右旋、反向平行的双螺旋；以磷酸和戊糖组成的骨架位于螺旋外侧，碱基位于螺旋内部，并且按照碱基互补的原则，碱基之间通过氢键形成碱基对，A-T间形成二个氢键、G-C间形成三个氢键；双螺旋的直径是2nm，每10个碱基对旋转一周，螺距为3.4nm，所有的碱基平面都与中心轴垂直；维持双螺旋的作用力是碱基堆积力和氢键。例题5-3：在pH7.0，0.165mol/L NaCI条件下，测得某一DNA样品的Tm为89.3。求出四种碱基百分组成。解：因为 (G+C)=(Tm-69.3)2.44 =(89.3-69.3)2.44 =48.8 G=C=24.4 而(A+T)=1-48.8=51.2 A=T=25.6例题5-4：有一噬菌体DNA长17M，问它含有多少对碱基? 螺旋数是多少?解：因为17m=17000nm所以此核酸分子的碱基对数：17000/0.34=5104(对)螺旋数：5104/10=5103(圈)例题5-5：将核酸完全水解后可得到哪些组分?DNA与RNA的水解产物有何不同?解：将核酸完全水解后可以得到：磷酸、戊糖、碱基三种组分。DNA水解后得到的戊糖是2-脱氨核糖，碱基有胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)。RNA水解后得到的戊糖是核糖，碱基有尿嘧啶(U)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)。例题5-6：DNA与RNA的一级结构有何异同?解：DNA的一级结构中组成成分为脱氧核糖核苷酸，核苷酸残基的数目由几千至几千万个；而RNA的组成成分是核糖核苷酸，核苷酸残基的数目仅有几十到几千个。另外在DNA分子中A=T，G=C；而在RNA分子中AU，GC。二者的相同点在于：它们都是以单核苷酸作为基本组成单位，核苷酸残基之间都是由3，5磷酸二酯键相连接的。例题5-7：简述tRNA二级结构的组成特点及其每一部分的功能。解：tRNA的二级结构为三叶草结构。其结构特征为：tRNA的一级结构由四臂、四环组成。已配对的片断称为臂，未配对的片断称为环。叶柄是氨基酸臂。其上含有CCAOH3，此结构是接受氨基酸的位置。氨基酸臂对面是反密码子环。在它的中部含有三个相邻碱基组成的反密码子，反密码子可以与mRNA上的密码子相互识别。左环是二氢尿嘧啶（DHU环)，它与氨酰-tRNA合成酶的结合有关。右环是假尿嘧啶环(TCG环)，它与核糖体的结合有关。在反密码子环与假尿嘧啶环之间的是可变环，它的大小决定着tRNA的分子大小。例题5-8：一个单链DNA与一个单链RNA分子量相同，你如何将它们区分开?解：用专一性的RNA酶与DNA酶分别对两者进行水解。 用碱水解。RNA能够被水解，而DNA不被水解。 进行颜色反应。二苯胺试剂可以使DNA变成蓝色；苔黑酚(地衣酚)试剂能使RNA变成绿色。 用酸水解后，进行单核苷酸的分析(层析法或电泳法)，含有U的是RNA，含有T的是DNA。例题5-9：为什么大多数核酸酶受金属螯合剂EDTA的抑制?解：绝大多数核酸酶在发挥作用时需要Mg2+的参与。当加入金属螯合剂EDTA后，Mg2+将被螯合，从而抑制了核酸酶的活性。例题5-10：计算下列碱基的浓度：(以摩尔/升表示，溶液的pH为7.0，按260nm处的摩尔消光系数：G=7.2103；T=7.4103计算) 鸟嘌呤溶液的A260=0.325 胸腺嘧啶溶液的A260=0.090解：由公式：A260=CL公式中A260为光密度(嘌呤碱及嘧啶碱对紫外吸收的最大吸收峰是260nm) 为260nm处的碱基摩尔消光系数 C为每升溶液中碱基的摩尔数 L为比色杯内径的厚度 已知： A260(G)=0.325 (G)=7.2103A260(T)=0.090 (T)=7.4103 L=lcm 所以C=A260/L C(G)=0.325/(7.21031)=4.510-5(mol/L) C(T)=0.090/(7.41031)=1.210-5(mol/L)例题5-11：如果人体有10TM个细胞，每个体细胞的DNA量为6.4 109个碱基对。试计算人体DNA的总长度是多少?这个长度与太阳地球之间的距离(2.2109公里)相比如何?解：每个体细胞内DNA的总长度为： 6.41090.34nm=2.176109nm=2.176m 人体内所有体细胞内的DNA的总长度： 2.1761014m2.1761011km 这个长度与太阳一地球之间的距离相比为： 2.1761011/2.2109=0.99102=99(倍)例题5-12：说明在pH2.5、pH3.5、pH6、pH8、pHll.4时，四种核苷酸(AMP、GMP、CMP、UMP)所带的电荷数(或所带电荷数多少的比较)，并回答下列问题： 电泳分离四种核苷酸时，缓冲液应取哪个pH比较合适?此时它们是向正极还是向负极移动?移动的快慢顺序如何? 当要把上述四种核苷酸吸附于阴离子交换树脂柱上时，应调到什么pH值? 如果用洗脱液对阴离子交换树脂上的四种核苷酸进行洗脱分离时，洗脱液又应调到什么pH值?这四种核苷酸的洗脱顺序如何?为什么?解： PH2.5pH3.5pH6pH8pHll.4UMP负电荷最多-1-1.5-2-3GMP负电荷较多-0.95-1.5-2-3AMP负电荷较少-0.46-1.5-2-2CMP带正电荷-0.16-1.5-2-2电泳分离四种核苷酸时应取pH3.5，在该pH时，这四种单核苷酸之间所带负电荷差异较大，它们都向正极移动，但移动的速度不同，依次为：UMPGMPAMPCMP应取pH8.0，这样可使各核苷酸带较多负电荷，利于吸附于阴离子交换树脂。虽然pHll.4的核苷酸带有更多的负电荷，但pH过高对树脂不利。洗脱液的pH应取pH2.5。当不考虑树脂的非极性吸附时洗脱顺序为CMPAMP GMP UMP (根据pH2.5时核苷酸负电荷的多少来决定洗脱速度)，但实际上核苷酸和聚苯乙烯阴离子交换树脂之间存在着非极性吸附，嘌呤碱基的非极性吸附是嘧啶碱基的3倍。静电吸附与非极性吸附共同作用的结果使洗脱顺序为：CMPAMPUMPGMP例题5-13：试述三种主要的RNA的生物功能(与蛋白质生物合成的关系)。解： mRNA是信使RNA，它将DNA上的遗传信息转录下来，携带到核糖体上，在那里以密码的方式控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序，作为蛋白质合成的直接模板。rRNA是核糖体RNA，与蛋白质共同构成核糖体，核糖体不仅是蛋白质合成的场所，还协助或参与了蛋白质合成的起始。tRNA是转运RNA，与合成蛋白质所需的单体氨基酸形成复合物，将氨基酸转运到核糖体中mRNA的特定位置上。例题5-14：线粒体电子转移链中的一种重要蛋白质：酵母细胞色素氧化酶由7个亚基组成，但是只有其中的4种亚基的氨基酸顺序由酵母核内DNA编码，那么其余三种亚基的氨基酸顺序所需的信息来自何处?解：除了核内DNA外，酵母细胞的线粒体内还含有少量DNA，这些DNA编码其余三种亚基的氨基酸顺序。例题5-15：胰脱氧核糖核酸酶(DNase l)可以随机地水解溶液中的DNA的磷酸二酯键，但是DNase I作用于染色体DNA只能使之有限水解，产生的DNA片段长度均为200bp的倍数。请解释。解：真核生物染色体DNA含有核小体结构，核小体是由大约200bp的DNA双链围绕组蛋白核心组成的，彼此相连形成念珠状结构，即染色体DNA。围绕组蛋白核心的DNA不被Dnase I水解，而核小体与核小体之间起连接作用的DNA的磷酸二酯键对DNase I敏感，因此水解产生长约200bp的DNA片段。例题5-16：什么是细菌的限制-修饰系统（Restriction-modification system, R-M system）解： 细菌中有作用于同一DNA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DNA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。例题5-17： 细菌的限制-修饰系统有什么意义？解： 不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。例题5-18：什么是限制性片段长度多态性？解： 当DNA序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism, RFLP）。例题5-19：计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平均距离。Alu I: 5AGCT 3EcoR I: 5GAATTC 33TCGA 53CTTAGG 5Acy I:5GPuCGPyC 33CPyGCPuG 5解： Alu I：（1/4）4 = 1/256 EcoR I：（1/4）6 = 1/4096 Acy I：（1/4）4（1/2）2 = 1/1024例题5-20：为了绘制长为3.0kb BamH限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR、Hpa 、EcoR+Hpa 消化这一片段的三个样品。然后通过凝胶电泳分离DNA片段、溴化乙锭染色后观察DNA带型（图5-1）。请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明EcoR和Hpa 、识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）。解： 图5-1是BamH I片段的限制性图谱。倒装法绘图是同样有效的，制作这种图谱的一种方法如下：画一条适当长度的线段表示3.0kb的BamH I片段。由于Hpa 只切割一次，Hpa 的位点可以明确地定位，从片段的任一端起1.6kb处标出其位置。EcoR I切割片段两次，如果你从片段的任一端起1.7kb处确定EcoR I位点的位置，你会发现它与Hpa 的距离同那些用双酶消化所得到片段的大小不相符，因此1.7kb的片段必定位于中间，两个EcoR I位点必定离两端各为0.4和0.9kb。例题5-21： PCR的基本原理是什么？PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？解： （1）DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。（2）至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。例题5-22：在DNA分离过程中， 酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么？解： 原因是酚和水有一定程度的互溶，所以单独使用酚抽提DNA，最终不能除去酚，残留的酚会使起切割和连接作用的限制性内切核酶和连接酶变性。氯仿也是蛋白质性剂，它不与水互溶，但是能够同苯酚互溶，这样，酚和氯仿联合使用，就可以带走残留的酚。例题5-23：什么是同裂酶？为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高？解： 同裂酶是一类识别序列不完全相同，但是产生的黏性末端至少有四个碱基相同的限制性内切核酸酶。用这些限制性内切核酸酶处理载体和外源DNA得到的末端可以通过黏性末端连接法连接。同裂酶产生的黏性末端虽然可以像完全亲和的黏性末端那样进行连接，但是它与完全亲和的黏性末端连接不同的是，连接后的产物往往失去原有的限制性内切核酸酶的切点，但是能够被另外一种同裂酶识别。这样用同裂酶进行体外重组时，在限制性内切核酸酶切割反应之后不必将原有的内切酶失活，就可直接进行重组连接。由于连接体系中有原有的限制性内切核酸酶的存在，载体自连不会发生，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷反应而得到最高的连接效率。反应中通常要涉及三种不同的限制性内切核酸酶，其中两种是识别六碱基的酶，另一种是识别四碱基的酶。例题5-24：说明Sanger DNA测序法的原理。解：Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1) 核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5端向3端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)个延伸的引物必须能提供游离的3羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。 例题5-25：某学生在用EcoR I切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?解：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。例题5-26：用Klenow酶填补的办法可使5黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失?BamH I(G十GATCC)；TaqI(T十CGA)，BssH(G十CGCGC)。解：BssH不会。例题5-27：采用什么措施保证DNA化学合成的定向性和专一性?解：(1)将不必进行反应的基团保护起来，这样可保证定向。(2)每一循环之后，清除多余的单核苷酸，并将未反应的固着核苷酸链封闭起来，保证下一个反应的专一性。例题5-28：说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。解：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名十种名+株名的各一个首字母，再加上序号。 基本原则： 34个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号； 首字母： 取属名的第一个字母，且斜体大写； 第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写； 第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写； (2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。 第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。 顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、等，用正体。例题5-29： Northern印迹与Southern印迹有什么不同？解： Northern印迹的原理同Southern印迹相比有两点不同：(1)转移的对象不同，Southern印迹是将限制性内切核酸酶酶切、电泳后的DNA转移到固相支持物上。Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，转移到固相支持物上的过程。(2)虽然RNA电泳前不需像DNA那样进行酶切，但也需要变性。不过变性方法是不同的，它不能用碱变性，因为碱变性会导致RNA的降解。例题5-30： 说明Southern杂交的原理和方法。解： 1975年Southern建立起来的一种杂交方法，属固相液相杂交。该法的主要特点是利用毛细管现象将DNA转移到固体支持物上，称为Southern转移或Southern印迹(Southern blotting)。它首先用合适的限制性内切核酸酶将DNA切割，进行电泳分离后，利用干燥的吸水纸产生毛细管作用，使液体经过凝胶，从而使DNA片段由液流携带从凝胶转移并结合在固体支持物表面。五、单元自测题 (一) 名词解释1核酸， 2核酸一级结构，3DNA二级结构，4碱基互补规律，5稀有碱基、稀有核苷酸，6环化核苷酸，7多磷酸核苷酸，8增色效应，9减色效应，10发卡结构11分子杂交，12Tm值，13. 回文序列，14. 同裂酶，15. 限制性物理图谱（二）填空题1核酸可分为和两大类，其中主要存在于中，而主要存在于。2核酸完全水解生成的产物有、和， 其中糖基有 ，碱基有和两大类。 3生物体内的嘌呤碱主要有二种，和，嘧啶碱主要有、 和，某些RNA分子中还含有微量的其它碱基，称为。4DNA和RNA分子在物质组成上有所不同，主要表现在和的不同，DNA分子中存在的是和，RNA分子中存在的是和。5RNA的基本组成单位是、，DNA的基本组成单位是、，它们通过键相互连接形成多核苷酸链。6DNA的二级结构是结构，其中碱基组成的共同特点是(若按摩尔数计算)、。7测知某一DNA样品中，A0.53mol，C0.25mol、那么Tmol，Gmol。 8嘌呤环上的第位氮原子与戊糖的第位碳原子相连形成键，通过这种键相连而成的化合物叫。9嘧啶环上的第位氮原子与戊糖的第位碳原子相连形成键，通过这种键相连而成的化合物叫 。10. 有两个主要的环核苷酸是、，它们的主要生理功用是。11写出下列核苷酸符号的中文名称：ATP、dCDP。12. DNA的Tm值的大小与其分子中所含的的种类、数量及比例有关，也与分子的、有关。若含的AT配对较多其值则、含的GC配对较多其值则，分子越长其Tm值也越。13组成核酸的元素有、 、等，其中的含量比较稳定，约占核酸总量的，可通过测定的含量来计算样品中核酸的含量。14DNA双螺旋结构的维系力主要有和。15. DNA分子中G，C含量高分子较稳定，同时比重也较、解链温度也。 16RNA主要有三类，既、和、它们的生物功能分别是 、 和 。17RNA的二级结构大多数是以单股的形式存在，但也可局部盘曲形成结构，典型的tRNA二级结构是型结构。18在生物细胞中主要有三种RNA，其中含量最多的是、种类最多的是、含有稀有碱基最多的是。19. tRNA三叶草型结构中，氨基酸臂的功能是，反密码环的功能是。20. tRNA氨基酸臂3末端中最后三个碱基是，反密码环中有三个相连的单核苷酸组成。 21. 成熟的mRNA在5末端加上了构成帽的结构，在3末端加上了形成尾巴。22类限制性内切核酸酶分子量较小一般在2040KDa，通常由 亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA，极少数类酶也可作用于单链DNA，或DNARNA杂合双链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，类酶既具有 专一性，也具有 专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有 ，产生 或 的DNA片段。作用时需要 作辅助因子，但不需要 和 。23. 完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1) (2) 。24SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用： (1) ； (2) ； (3) ； (4) 。25酚是蛋白变性剂，用酚抽提细胞DNA时，具有两方面的作用：(1) ; (2) 。26用酚氯仿抽提DNA时，通常要在氯仿或酚氯仿中加少许异戊醇。这是因为异戊醇 。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。27同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K具有两个显著的优点：(1) ;(2) 。28在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是 。29用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是 。30浓缩DNA的方法有：(1) ;(2) ;(3) ; (4) 。31. 通常可在三种温度下保存DNA：45、-20、-70，其中以 最好。32在用SDS分离DNA时，要注意SDS的浓度，0.1和1的SDS的作用效果是不同的，前者 ，后者 。33在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素很多，主要有(1) ；(2) ；(3) 。34在分离DNA时，常用 法、 法、 法及 法等方法去除蛋白质。35在DNA保存液中，常加一滴氯仿，主要是起 作用。36在简并引物的设计中，常常要用到dI(次黄嘌呤)，原因是 。37在分离DNA时，要戴手套操作，原因是 。38简并引物PCR主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计 引物来合成相应的基因。39SSC是由NaCI和柠