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冬虫夏草等中药材指纹图谱研究 河北大学硕士学位论文冬虫夏草等中药材的指纹图谱研究姓名:王春云申请学位级别:硕士专业:分析化学指导教师:闫正200906011摘要摘 要本学位论文共分为三章。第一章:文献综述。概括了中药指纹图谱的定义和性质,总结了中药指纹图谱研究的作用和意义,并且介绍了中药的研究现状。第二章:冬虫夏草药材的指纹图谱研究。建立了冬虫夏草的高效液相、毛细管电泳指纹图谱。采用、相结合的方法对冬虫夏草的不同成分进行研究,可以较全面地反映其化学组成,为冬虫夏草药材质量鉴别提供一种科学的方法和依据,并可为其它中药材指纹图谱的建立提供借鉴。第三章:建立了人参的毛细管电泳指纹图谱,并对人参样品进行了气相色谱和顶空气相色谱指纹图谱的初步探索,可为人参药材质量鉴别提供一种科学的方法和依据。关键词中药材冬虫夏草人参 ?指纹图谱2., . , 伊锄 、. 印 . .?3河北大学学位论文独创性声明本人郑重声明: 所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知, 除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果,也不包含为获得河北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。里日日期:过年月作者签名:蒌蠢丞学位论文使用授权声明本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本学位论文属于、保密口 年?月?日解密后适用本授权声明。、不保密请在以上相应方格内打“”4保护知识产权声明本人为申请河北大学学位所提交的题目为转瓯确珥筠甲绷耐竭嘲浙硫.指导并与导师合作下取得的研究成果,的学位论文,是我个人在导师五研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。本人声明如下:本论文的成果归河北大学所有,未经征得指导教师和河北大学的书面同意和授权,本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反本声明,本人愿意承担相应法律责任:声明人:至盍亟日期:立旦盟年?厶月日作者签名:互盘歪日日期:谴年?厶月 导师签名:日期:耸年月日5第章文献综述第章文献综述摘要:中药指纹图谱是中药发展的的关键技术。中药指纹图谱不仅提供了一种重要的中药质量控制方法,而且同样可以应用于中药的理论研究和新药开发。本章概括了中药指纹图谱的定义、分类、意义、作用以及发展现状。关键词中药指纹图谱意义现状进展近年来,人们把目光转向传统疗法和天然药物,这为中药的发展迎来了空前的机遇。我国中医药以其毒副作用小、疗效独特被世人称赞,但是中国医药在国际市场上所占份额却很少,其原因主要是中药成分复杂,不能建立好的品质评价方法和依据。中药研究一般是把成分复杂的、完整的药材,分解出可以确定其化学结构的化学成分,可是这样难以衡量中药的质量、疗效,所以宏观的综合分析成为必然趋势,指纹图谱分析就将成为鉴别中药真伪、评价质量一致性及产品稳定性的可行模式。中药注射剂指纹图谱研究的技术要求暂行条例的颁布,使中药指纹图谱研究成为我国中药研究的热点。.中药指纹图谱的定义性质“指纹来自于犯罪学和法医学,根据每个人指纹结构上微小差别用以区分不同的人。法医学的指纹分析强调的是个体的唯一性。中药指纹图谱是指中药材或中成药经过适当预处理后,利用现代分析手段,得到的能够标志该中药材或中成药个体特征的图谱。中药大部分来源于动植物,同一物种之间的遗传性导致其具有整体的相似性,但是中药材的代谢产物对后天生长环境依赖性很强,同种药材所含的代谢产物可能产生个体间较为明显的差异,这就是中药指纹图谱的分析依据。因而中药指纹图谱分析强调准确的辨认而不是精密的计算,比较图谱强调的是相似而不是相同【】。在不可能将中药复杂成分都搞清楚的情况下,指纹图谱的作用就是反映复杂成分的中药质量的均一性和稳定性【。中药指纹图谱的建立,目的在于能够比较全面的反映中药所含化学成分的种类和数量,进而用于中药的鉴别和质量控制。中药指纹图谱具整体性、模糊性、特征性、稳定6河北人学理学硕十学位论文性特性【。.中药指纹图谱的主要检测方法中药化学成分指纹图谱主要采用光谱、色谱、联用技术、波谱、射线衍射、等方法来表征中药化学成分特征。光谱最常用的是红外光谱、紫外光谱;色谱最常用的是薄层色谱、气相色谱、顶空气相色谱?、高效液相色谱和毛细管电泳;波谱最常用的是质谱、核磁共振谱矛联用技术。.中药指纹图谱的意义中药为多组分复杂体系,现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等检测方法不能提供丰富的鉴别信息,而中药指纹图谱可以较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药品质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。在此基础上,如果进一步开展谱效研究,可使中药质量与其药效结合起来,有助于阐明中药作用机理。总之,中药指纹图谱的研究和建立,对于提高中药质量,促进中药现代化具有重要意义。同一基源的中药材由于产地不同、采收季节不同、生长年限不同、不同规格、不同炮制方法等原因导致化学成分有所区别;不同来源的同种中药材其化学组成可能存在差异,同一名称的中药材可能由于来自不同基源的植物,导致在植物分类上表现为同属不同种或同科不同属;一些中药材,特别是名贵中药材,常常有伪品与正品相混淆的现象。这种化学组成上的差异必然会影响到中医的临床疗效。另一方面由于中药的化学组成是天然形成的,需要对各种化学成分及结构进行研究,才能确定其中对质量控制有意义的物质。由于目前找到确切的药效关系比较困难,只能对中药整体化学特征进行表征。因此建立具有实用性和科学性的指纹图谱对中药质量控制是十分必要的【。.中药指纹图谱的作用中药指纹图谱的整体、宏观和模糊分析等特点,适合中医药传统理论的需要。目前在中药生产和流通中,还没有一种质量控制手段能够全面、综合地反映出中药产品的质量变异,并有效地进行全过程的质量控制。中药指纹图谱的研究和建立正是为了解决药品质量控制和监督这一关键问题。它从药材的生产、加工、贮存,制剂的原料、中间品、成品、流通等各方面,对中药样品进行检验分析,通过相似性和相关性的比较,发现质量变异和缺陷,从而全面地把握住中药的质量命脉【。.7第章文献综述对于中药新药的研究,中药指纹图谱为之带来了一种崭新的研究模式,它将化学物质与药效直接结合,形成了充分吸收中医药用理论精华、蕴含现代药物活性特征的一种新型研究方法。中药指纹图谱也从整体综合的角度把握住了药物作用的针对性,为新药产生和快速筛选提供了思路和方法【】。具体的说,中药指纹图谱是通过寻找有效部位或有效组分的图谱与活性效应之间的组效学特征来指导新药研究和筛选的一种研究方法。对于中药物质的基础,结合药效研究和相关物质成分的分离鉴定,经组效关系研究,获取中药有效组分指纹图谱;运用现代分离分析的科学手段,获取中药化学指纹图谱;将中药化学指纹图谱和中药有效组分指纹图谱用于中药材、中间体和中药复方制剂的质量控制以及药物创新等实践中,最终解决中药质量评价的科学性等中药质量关键问题,建立完备的中药质量评价体系,为中药走向世界、推进中药现代化事业的发展打下坚实的基础【。.中药指纹图谱的研究现状及研究进展.薄层色谱指纹图谱薄层色谱指纹图谱具有快速、可靠、操作简单、经济、适用范围广、重现性好等优点,被国内外学者普遍接受和使用。薄层色谱指纹图谱可以提供直观谱图,并可与色谱扫描联用得到不同层次的图谱,提高了综合分析能力。薄层色谱主要用于对中药材和中成药的种类确认、产地区分、真伪辨别、含量测定、成分研究、采收季节、炮制方法等鉴别测定。薄层色谱作为一种重要的检测方法已被我国在内的多国药典收入。林明美等【】对柴胡个品种近个样品进行薄层指纹分析研究。实验对柴胡根中的挥发油的己烷提取物及甲醇提取物,分别进行薄层层析及薄层扫描分析。结果显示不同品种的柴胡药材由于来源、外形的不同,导致其指纹图谱有明显的差异,可以作为推断药材品种、质量控制的依据。颜玉贞等【】对不同品种的黄连采用优化的溶剂系统在双槽展丌箱中两次展开,用薄层色谱分析所含生物碱,得到黄连的薄层图谱和扫描的指纹图谱,并对不同品种的黄连进行比较鉴别,可为黄连的质量控制提供参考。.气相色谱指纹图谱气相色谱法具有高选择性、高灵敏度、高分离效率、分析速度快,样品用量少等优点,适合对挥发性成分、通过衍生化后能够气化的成分进行定性和定量分析。气相色谱.气.8河北大学理学硕十学位论文法在中药材方面的应用主要体现在对药材中的挥发油等成分的指纹分析【。洪筱坤【】等对柴胡属植物挥发油进行了气相色谱研究,以色谱峰的相对保留值建立了柴胡属种植物挥发油的色谱指纹图谱,实现了图谱的数据化,可以在没有标准品的情况下对样品做出可信的鉴定,提高了样品间的可比性和色谱图上色谱峰的利用率。实验结果显示,在目前有效成分不清楚、缺乏相应的标准品的情况下,为检测和保证中药的质量提供了鉴别方法。张敏娜等【】对个不同批次的泽泻药材进行了气相色谱研究,并且建立了泽泻药材的气相色谱指纹图谱,实验采用毛细管气相色谱法,在/石英毛细管色谱柱、程序升温、汽化室温度、检测器温度、分流比为:等实验条件下对泽泻药材进行分析,结果显示泽泻药材有个特征峰,并且不同产地泽泻药材的气相色谱指纹图谱有一定差异,为泽泻药材的质量控制提供参考。刘红等【】对个不同产地的益智挥发油进行了气相色谱研究,并且建立了益智挥发油的气相色谱指纹图谱。实验采用软件对益智挥发油的数据进行聚类分析和相似度分析,以广东阳江产益智产油率最高,并且色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的相对标准偏差符合指纹图谱的要求。.高效液相色谱指纹图谱与气相色谱相比,高效液相色谱具有不受样品挥发性和热稳定性限制、分离效能高、分析速度快、重现性好、方法成熟、可供选择的检测器种类多等优点。蒸发光散射检测器不仅可以检测挥发性低于流动相的样品,也可于分析结构未知的样品,灵敏度不受温度变化的影响;二极管阵列检测器,可以得到不同波长下的色谱图,并且可获得三维图谱,适用于成分复杂药物的定性和定量分析。王雁掣】对三七药材进行了高效液相色谱指纹图谱研究,检测波长 ,咖啡因为内标物。通过聚类分析,个不同规格、不同产地的三七样品被聚为类:地道药材优级品、地道药材、市售一般品和次品。个三七样品的相似度均在.旷.之间,个伪品的相似度均小于.。该色谱图可作为三七的指纹图谱,为三七的真伪鉴别和质量评价提供一种参考。封士兰等【】对个红芪样品进行了高效液相色谱法研究,并建立其高效液相指纹图谱。实验用指标成分毛蕊异黄酮和芒柄花素进行定位,共有个共有峰,其中号9第章文献综述峰和号峰分别为毛蕊异黄酮和芒柄花素。结果表明,个样品平均相似度在.%以上,红芪样品指纹图谱及指标成分含量测定可用于红芪药材的质量控制。石先哲等【】对参麦注射液进行了反相高效液相指纹图谱研究,实验用个特征指纹峰与内标联苯的峰面积比作为标准,结合主成分分析投影判别法,对同一厂家不同批次产品和不同厂家同类产品的化学指纹差异进行比较,给参麦注射液的质量控制提供一种参考。李卓明等【】对不同企业的批安神补脑液进行了高效液相研究,并建了安神补脑液的高效液相指纹图谱,实验在 ,.波长范围、柱温等条件下对安神补脑液进色谱柱、乙腈.水梯度洗脱、行分析检测,得到个共有峰,结果表明不同批次的定安神补脑液都具有淫羊藿、何首乌和甘草种药材的特征成分,为安神补脑液的质量评价提供了依据。.毛细管电泳色谱指纹图谱毛细管电泳技术是近年发展起来的一种新型技术,因具有分析柱效高、速度快、分辨力强、进样体积小、前处理简单、抗污染能力强、水溶性样品的“指纹特征性强、分析运行成本低等独特的优点,而广泛应用于中草药的指纹图谱。 毛细管电泳可以分析小分子酸碱盐、中性分子、生物大分子多肽、核酸和蛋白质等、手性分子等,所以毛细管电泳可用于测定中药材蛋白质、等生物分子。张朝辉等【】对种海马、海龙药材进行了研究,实验显示种间区别明显,但不同产地、不同贮存时间的同种药材的电泳图谱基本一致,说明该法可用于海马、海龙药材的鉴定。胡平等【对菟丝子种子植物蛋白进行了研究。实验表明,同属不同种菟丝子的碱溶性或酸溶性蛋白在成分和含量上有显著性差异,此方法可用于鉴别菟丝子的来源。孙国祥等【对金银花进行了毛细管电泳指纹图谱研究,并且提出了指纹图谱宏观含量相似度、定量相似度和投影含量相似度的概念,用来控制金银花的质量,为指纹图谱评价提供了一种新的方法。程伟等】采用毛细管电泳方法对种连钱药材进行分析检测,建立了连钱药材的指纹图谱,并对其进行比较,结果显示种连钱药材具有个共有峰,指纹图谱的峰重叠率低于%,相对峰面积差别较大,说明不同产地的连钱药材由于产地不同、生长环境不同,导致其主要成分差别很大,建立的方法简单快捷、10河北人学理学硕卜学位论文重现性好,为连钱药材的质量控制提供参考。孙国祥等【对复方甘草片进行了毛细管电泳研究,并对个厂家批次以上的样品进行分析。孙国祥等【】还对连翘药材进行了毛细管电泳研究,并对个不同产地的连翘药材进行对比试验。还用毛细管电泳法建立了苦碟子注射液的指纹图谱【,实验表明批苦碟子注射液的指纹图谱与共有模式问具有良好的相似性,以腺苷峰为参照物峰,确定了个共有峰,建立的指纹图谱具有较好的精密度和重现性,为苦碟子注射液的质量控制提供一种参考。.紫外光谱指纹图谱紫外光谱法是一种反映分子结构特征的电子光谱,取决于电子能级差,由于不同中药所含成分的不饱和度有所差异,导致其紫外吸收曲线的形念、峰位、峰强度也有差异,由此可以对其进行分析鉴定,但是不同的化合物会一般具有相似的吸收光谱,会造成中药中的多种成分相互干扰和吸收峰叠加现象,特征信息量也较少。所以紫外法通常作为辅助手段应用于指纹图谱研列。近年来,由于物理光学、计算机科学、电子学的发展,性能优良的分光光度计不断被推出,与统计学、数学和计算机技术相结合的计算分光光度法更加成熟, 使紫外光谱法得到了更好的发展。彭文进等【跚对长生露口服液进行了紫外分光光度法指纹图谱分析,实验标示出长生露口服液扫描波长内的个吸收峰,且峰与峰的吸收度比值的.置信区间为.?.,并确定了特征峰的归属。.红外光谱指纹图谱红外光谱的信息量比较大,是鉴定有机化合物的重要方法,可以提供分子结构带有不同基团的结构信息,但是随着物质种类的增加,混合物的红外光谱特征性会逐步下降。如果采用统一的提取方法除去植物药中同性质类的成分如蛋白质、树脂、多肤等,再对其提取物中水溶性和脂溶性成分分别研究,所得的红外光谱具有较高的特征性和可重复性。药材在种质、地域、加工方法、贮存等外界因素的差异,可以在红外光谱上得到反映。孙素琴等【删不同产地的种山药样品进行了红外光谱分析,并且结合模式识别技术法对山药样品进行了道地性与非道地性的模式识别方法学研究,构建了山药第章文献综述样品的红外指纹图谱。.射线衍射指纹图谱射线衍射法是研究物质的物相以及晶体结构的主要方法。物质组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定了物质可能产生特有的衍射图谱。射线衍射分析法以其快速简便、指纹性强、图谱稳定可靠、能立即得知样品组分等特点应用于指纹图谱研究。周俊国等【】采用粉末一射线衍射对个不同产地的蛇床子样品进行分析检测,实验将衍射图谱中的特征标记峰与衍射整体模糊图形结合,并且建立了蛇床子的特征指纹图谱,实验表明不同产地的的蛇床子样品由于生长的地理环境不同确实存在差异,为的蛇床子的质量控制提供参考。.核磁共振指纹图谱核磁共振氢谱胜有机化合物结构的重要方法。它可以获得化合物各类质子的化学位移、数量、偶合关系等结构信息。指纹法鉴定植物类中药就是根据对图谱的特点、鉴定方法的要求建立起来的。仇熙等【】对复方人参注射液人参、陈皮等进行了核磁共振指纹图谱研究,并为其质量控制探索了新的方法。实验采用核磁共振技术对复方人参注射液的中间体和成品进行指纹图谱研究,对中间体和注射液的图谱相似度进行分析。实验表明工艺流程稳定、重现性良好,可作为中成药指纹图谱研究的辅助方法,并为中药的质量控制提供一种参考。.色谱联用技术色谱联用就是将色谱法的分离能力与波谱法特有的结构鉴别能力相结合,是一种非常有效的分离、鉴定手段。对于复杂中药来说,单用指纹图谱表征有一定困难。色谱联用技术就可以建立多维指纹图谱,较好的解决了中药的整体性和复杂性的难题。目前最常用的是气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳分别与二级管阵列检测器、质谱、质谱/质谱等联用方式。国内外也有大量利用色谱联用技术控制中药质量的相关文献报道【。孙莲等四对不同产地桑叶药材挥发油进行了气相色谱.质谱.研究,建立了个不同地区桑叶样品的.指纹图谱,实验采用软件对其挥发油进行聚类.,.河北人学理学硕十学位论文分析为两类,其中阿克苏、哈密、吐鲁番、江苏、田洛普、四川、陕西、广州的药材列为一类,伊犁、乌市列为另一类。实验表明桑叶挥发油的指纹图谱有个共有峰,且图谱直观清晰,特征明显,为桑叶质量评价提供一种参考。刘思明等【对岩黄连注射液进行了高效液相色谱.质谱.联用技术分析,建立了岩黄连注射液的?指纹图谱,实验采用乙腈和水梯度洗脱,采用. 波长下分离检测,.柱 ,“色谱柱,在结合电喷雾离子阱的质谱分析,对其中的种主要成分进行了指认,并对其中的种成分进行了定量评价。.高速逆流色谱技术高速逆流色谱技术是一种较新型的液.液分配技术。该技术利用相对移动且互不混溶的两相溶剂,在处于动态平衡的两相中,将具有不同分配比的样品组进行分离。高速逆流色谱技术由于不用固相载体作固定相,克服了固相载体带来的样品吸附、污染、损失、峰型拖尾等缺点。国内外对高速逆流色谱技术应用于天然产物的分离和分析均有报道,在将高速逆流色谱和质谱联用,分析鉴定生物碱及三萜类化合物等,均得到了满意的结果。但我国的高速逆流色谱技术在中草药分离分析方面的应用还在起步阶段,但应用前景是非常广阔。顾铭等【】用高速逆流色谱分离纯化了个产地的丹参,洗脱出个组分,并且由和检测证明对应洗脱峰为同一组分。高速逆流色谱洗脱图谱不包括非共有峰,并且共有峰保留时间的%,符合规定参数。高速逆流色谱成为制订指纹图谱的可行性方法。.国外植物药指纹图谱的应用印度草药典、英国草药典、加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会承认色谱指纹图谱。美国申明,允许草药保健品在申报资料中提供色谱指纹图,并且在年草药评价指导原则中对此也有规定,在植物药的制备及成品的活性成分不明时,可以用色谱指纹图谱证明产品质量的一致【。美国草药典已经针对的热点植物药五味子、甘草等制定了质量标准,并且确定了比较稳定可靠的、指纹图谱,为其药材生产和应用提供科学的依据。其中尤其以德国研制的银杏叶提取物制剂突出。该实验检测了银杏叶提取物的个化学成分的含量,制定了标准指纹图谱,通过第章文献综述药效和化学成分相关性研究,发现银杏黄酮、银杏内酯的提取物具有最佳疗效。.展望中药指纹图谱的研究已经成为近年来的一个研究热点,并且取得了很大的进展,我国分析化学界、中药界的学者都发挥了重要的作用。在目前看来,采用指纹图谱来鉴别中药的真伪、控制其质量是可行的,并且具有科学依据。指纹图谱技术也将有望成为中药质量控制的标准方法,在中药国际化过程中发挥重要的作用。然而,当前的指纹图谱研究在指纹图谱的评定、指纹图谱数据处理遵循标准、指纹图谱与中药的临床药效药理作用的结合等方面还存在着一些需要解决的问题,这需要各界人士的共同努力,结合先进的分析手段,力争建立中药材的标准图谱库和数据库,为中药品种鉴定和质量控制起到积极的推动作用【。: . .,.河北大学理学硕十学位论文第章冬虫夏草药材指纹图谱的研究冬虫夏草 ,为麦角菌科真菌,一般以虫体丰满肥大、质柔韧、断面充实白色,菌草短壮,有草菇气香者为佳,是我国传统的名贵中药材之一。主要生长于高寒山区,常见于海拔 以上的高山上,分布于我国西藏、青海等地【】,以西藏那曲为上品。研究表明,冬虫夏草对于肺结核、痰血、气喘、盗汗、腰酸背痛,阳痿和遗精等病症均有疗效,且临床上用于多种疾病的治疗。随着人们生活水平的不断提高,人们对名贵的滋补中药材冬虫夏草的需求也愈来愈多,但冬虫夏草由于生长的地理环境不同,导致价格差别很大,所以鉴别它的产地是当务之急。为了给人们提供冬虫夏草的科学依据,我们对不同产地冬虫夏草进行了高效液相色谱、毛细管电泳的指纹图谱研究。很容易区别冬虫夏草的产地,可为不同产地冬虫夏草药材质量控制提供参考。.冬虫夏草的高效液相指纹图谱研究摘要:建立了冬虫夏草的高效液相指纹图谱。研究了不同的预处理方法、流动相组成、检测波长、色谱柱温度等操作因素对冬虫夏草指纹谱图的影响,并对不同产,地冬虫夏草药材的指纹图谱进行了比较。色谱条件:不锈钢填充柱.;流动相为乙腈.%磷酸水溶,岬色谱柱;检测波长为液梯度洗脱;流速为. /;分析时间为 ;柱温为。关键词 冬虫夏草高效液相色谱指纹图谱中国药典法【钢是以腺苷的含量衡量冬虫夏草的质量,姜丽霞等【刀也采用测定了冬虫夏草主要核苷及其碱基的含量,但都未能区分冬虫夏草的产地,不同产地冬虫夏草的的鉴别也尚未见报道。为了给人们提供冬虫夏草的科学依据,我们对不同产地冬虫夏草进行了高效液相色谱的指纹图谱研究。本文采用了高效液相色谱法,建立的冬虫夏草药材指纹图谱化学信息比较丰富,获得个峰,很容易区别冬虫夏草药材的产地,可为不同产地冬虫夏草药材质量控制提供参考。.实验部分一仪器及其试剂仪器高效液相色谱仪,美国公司;自动控温溶剂回流连续循环强制传质液固萃取装置自制;电子天平, ;旋转蒸发器.第章冬虫夏草药材指纹图谱的研究.上海亚荣生化仪器厂;鼓风式干燥箱上海分析仪器厂; 超声振荡器上海科导超声仪有限公司。样品及试剂冬虫夏草青海;冬虫夏草西藏;冬虫夏草西藏那曲。试剂:尿苷、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、黄嘌呤标准品中国药品生物制品检定所提供;乙腈色谱纯,天津市科密欧化学试剂开发中心:磷酸分析纯,天津市鼎盛化工试剂厂;甲醇色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;四氢呋哺色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;醋酸分析纯,天津市鼎盛化工试剂厂;二次蒸馏水.岫纤维素膜过滤。色谱条件色谱柱: , . , ;检测波长:流动相:乙腈.%磷酸水溶液梯度洗脱;流速:. /;进样量:;柱温:;梯度洗脱程序见表。表梯度洗脱程序.圆样品的制备对照品溶液的制备精确称取尿昔、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤核苷、黄嘌呤对照品适量,加水溶解制成./的对照品溶液,.“滤膜滤过,备用。供试品溶液的制备将冬虫夏草药材于烘箱内干燥 ,粉碎、过筛收集细粉,称量. 二次水提取 ,提取液旋转蒸发,二次水定容,加至.,.岬滤膜滤过,取滤液作为供试品溶液。方法学考察指纹图谱建立与分析根据多批样品指纹图谱给出的相关参数,所有主组分在 全部出峰,记录内的色谱图。最佳检测条件下西藏那曲冬虫夏草的指纹图谱见图。分别用保留时间定性法和峰高加高定性法确定了冬虫夏草指纹图谱的主组分峰,其中号峰为河北大学理学硕十学何论文次黄嘌呤、号峰为腺嘌呤、号峰为尿嘧啶、号峰为黄嘌呤、号峰为黄嘌呤、号峰为尿苷、号峰为鸟嘌呤核苷。由于号峰尿苷峰与邻组分分离好且出峰位置合适,因此作为内参照峰。搬 .鄹 赫.翻 . 刖. . . . . . 柏. . . 弱. .。田西藏那曲冬虫夏草咿指纹图谱.,【方法精密度的测定取同一供试品溶液,按最佳色谱条件,平行测定次,计算其中个分离度好的主组分峰相对于内参照峰的相对保留时间和相对峰面积值,结果见表,图谱见图。表仪器精密度的测试结果.结果显示,相对峰面积的为.%.%,相对保留时自的为.%.%,表明精密度良好。方法重现性测定取同一样品五份,分别进行样品处理,按最佳色谱条件,每份分别平行测定次,计算其中个分离度好的主组分峰相对于内参照峰的相对保留时间和.第章 冬虫夏草药材指纹图谱的研究相对峰面积值,结果见表,图谱见图。表方法重现性的测试结果. . . . . . . . . . . . . . . 。 . . 。 . 。 . . . . . . . . . . . . . . . 。 . 。 。 . 。 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 。. . . . . . . . . . . .结果显示,相对峰面积的为.%.%,相对迁移时间的为.%.%,说明方法重现性良好。样品稳定性测定取同一供试品溶液,按最佳色谱条件,分别在,平行测定次,计算其中个分离度好的主组分峰相对于参照峰的相对保留时间和相对峰面积值,结果见表,图谱见图。表样品稳定性的测试结果.结果显示,相对峰面积的为.%.%,相对迁移时间为为.%.河北大学卿硕卜学位论文.%,说明样品至少在 内稳定。.结果与讨论样品预处理方法的选择取冬虫夏草以相同色谱件下的色谱峰数目为考察指标,对研磨颗粒度、提取方式、提取溶液、提取时间、提取溶剂质量分数和浓缩体积进行实验分析。具体实验结果表明:冬虫夏草用倍其质量的二次水利用自动控温溶剂回流连续循环强制传质液固萃取装置提取 ,浓缩体积为提取液体积的/效果最佳,详见表。表不同样品处理的结果.峰数量差分离程度 一般 一般 一般 一般 一般 一般 一般 一般色谱条件的选择检测波长的选择考察了不同波长下 冬虫夏草供试溶液的色谱图,结果显示在 处检测到的电泳峰数目最多,峰的分离也较好,所以确定 为检测波长。流动相的选择试验比较了不同比例甲醇一水、乙腈一水、甲醇一乙腈一水种体系加入磷酸、四氢呋喃、醋酸进行等度洗脱,所得色谱峰堆积,分离度差,并且色谱峰数目较少。采用以上溶剂体系进行梯度洗脱时谱图比上述等度洗脱体系有较大改善,以乙腈一磷酸水溶液最佳;比较了乙腈.不同比例磷酸水溶液体系,结果显示,以乙腈.%磷酸水溶液作为流动相峰形较好,分离度好,色谱峰信息较多。所以选用乙腈.%磷酸溶液系统作为本试验的流动相。同时还考察了不同柱温对分离的影响,结果显示在下分离最好。第章 冬虫夏草药材指纹图谱的研究.不同产地冬虫夏草指纹图谱的比较制备不同产地冬虫夏草的供试溶液,多次进样记录色谱图,见图,其中个峰为共有峰单峰面积大于总峰面积%.对种不同产地的冬虫夏草供试溶液分别平行测定次,记录各产地所有组分峰面积和保留时间平均值见表。圈西藏那曲冬虫夏草指纹图谱.【圈西藏冬虫夏草指纹图谱 .图青海冬虫夏草指纹图谱.河:匕人学理学硕十学何论文表不同产地冬虫夏草指纹图谱检测结果. ;由图表可知,西藏那曲、西藏、青海三个产地的冬虫夏草的指纹图谱共有峰的保留时间差别较小在.%.%之间,说明以上三个产地的冬虫夏草至少含有个相同的化学成分。但是所有峰峰面积差别显著在.%之间,这说明以上三个产地的冬虫夏草药材由于生长的地理环境、气候条件不同,导致了其主.第章冬虫夏草药材指纹图谱的研究要化学成分的差异。该实验方法所建立的冬虫夏草药材的指纹图谱信息较全面,预处理方法简单,可为冬虫夏草药材质量鉴别提供一种科学方法和依据,并可为其他中药材指纹图谱的建立提供借鉴。更详细、更全面的冬虫夏草质量评价方法的研究仍在进行中。: 曲 . 、, , . :., . ,一.%:. /; ; . .冬虫夏草的毛细管电泳指纹图谱研究摘要:建立了冬虫夏草的高效毛细管电泳指纹图谱。研究了不同的预处理方法、检测波长、分离电压、缓冲体系对冬虫夏草指纹图谱的影响,并对不同产地冬虫夏草的指纹图谱进行了比较。采用毛细管区带电泳法测定指纹图谱,电泳条件:岬未涂层石英毛细管有效长度 ,以 . /的硼砂.磷酸氢二钾缓冲体系做背景电解质,分离电压 ,检测波长 ,气压进样 ,进样压力 ,温度为室温。关键词冬虫夏草高效毛细管电泳 指纹图谱中国药典法【】是以腺苷的含量衡量冬虫夏草的质量,】等人用毛细管电泳的方法对冬虫夏草、人工培育品、亚香棒草等进行了鉴别,但不能区分其产地,不.河北大学理硕十学位论文同产地冬虫夏草的的鉴别尚未见报道。因此为了能给人们提供冬虫夏草的科学依据,本实验对不同产地冬虫夏草进行了高效毛细管电泳法的指纹图谱研究,本文采用毛细管区带电泳法,建立的冬虫夏草药材指纹图谱化学信息比较丰富,很容易区别冬虫夏草的产地,可为不同产地冬虫夏草药材质量控制提供参考。.实验部分一仪器及其试剂仪器.高效毛细管电泳仪,保定天惠分离科学研究所;.色谱工作站北京创新通恒科技有限公司;电子天平,旋转蒸发器.,上海亚荣生化仪器厂;干燥箱上海分析仪器厂;.型酸度计上海伟业仪器厂;毛细管柱未涂渍弹性石英毛细管, ,永年锐沣色谱器件有限公司;。样品及试剂冬虫夏草青海;冬虫夏草西藏;冬虫夏草西藏那曲;冬虫夏草购于保定药店;苯丙氨酸中国药品生物制品检定所提供。无水乙醇分析纯,天津恒兴化学试剂制造有限公司;四硼酸钠分析纯,天津市华东试剂厂;磷酸氢二钾分析纯,天津市天大化工实验厂;尿素分析纯,天津市天大化工实验厂;氢氧化钠分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;二次蒸馏水.纤维素膜过滤。/的硼砂实验条件毛细管柱 ,有效长度 ;缓冲溶液:。;有机添加剂:%尿素水溶液; 检测波长: ;分离电压:.磷酸氢二钾;进样时间: ;进样压力: ;冲洗气:空气;温度:室温一。毛细管柱冲洗:每 用无水乙醇、 /氢氧化钠溶液、二次水均用.、 、肛纤维素膜过滤分别冲洗 ;每次进样前用缓冲溶液.弘。纤维素膜过滤冲洗样品的制备样品供试液:将冬虫夏草药材于烘箱内干燥 ,粉碎、过筛,收集,合并细粉,称量. 二次水,在下热回流提取次,每次,加滤液后旋转蒸发,定容至. ,阴冷处放置,取上层清液,.岬纤维素膜过滤,作为供试品溶液。对照品溶液的制备精确称取苯丙氨酸对照品适量,加水溶解制成./的对照品溶液,.滤膜滤过,备用。卿方法学考察第章冬虫夏草药材指纹图的研究指纹图谱建立与分析根据多批样品的指纹图谱给出的相关参数, 后无明显组分峰,记录 内最佳工作条件下的西藏那曲冬虫夏草指纹图谱见图。分别用迁移时间定性法和峰高加高定性法确定号峰为苯丙氨酸见图。由于号峰苯丙氨酸峰与相邻组分分离良好,因此将其作为内参照峰。图冬虫夏草的指纹图谱产地:保定药店.科方法精密度的测定取保定药店冬虫夏草样品供试品溶液,按最佳实验条件,平行测定次,计算其中个分离度好的主组分峰相对于内参照峰的相对迁移时间和相对峰面积值,结果见表,图谱见图。表仪器精密度的测试结果.河北人学理。硕十学何论文结果显示,相对峰面积的相对标准偏差为.%一.%,相对迁移时间的为.%.%,表明精密度良好。方法重现性测定取保定药店冬虫夏草样品五份,分别按最佳实验方法处理,然后将个供试溶液按最佳实验条件,每份分别平行测定次,取平均值,计算其中个分离度好的主组分峰相对于内参照峰的相对迁移时间和相对峰面积值,结果见表,图谱见图。表方法重现性的测试结果.结果显示,相对峰面积的为.%一.%,相对迁移时间的为.%.%,说明方法重现性良好。样品稳定性测定取同一定药店冬虫夏草样品,按最佳试验方法处理成供试品溶液,在最佳实验条件,分别在, 平行测定次,取平均值,计算其中个分离度好的主组分峰相对于内参照峰的相对迁移时间和相对峰面积值,结果见表,图谱见图。第章冬虫夏草药材指纹图谱的研究表样品稳定性的测试结果.结果显示,相对峰面积的为.%.%,相对迁移时间为为.%.%,说明样品至少在 内稳定。.结果与讨论样品预处理方法的选择取同一产地冬虫夏草药材,以相同电泳条件下的电泳峰数目为考察指标,对冬虫夏, ,一草药材的研磨颗粒度 、提取方式回流法,自制的自动控温溶剂回流连续循环强制传质液固萃取法,超声法、提取溶液甲,醇,乙醇,高纯水以及与水的不同混合比例体系、提取时间 , 、提取次数次,次,次、提取溶剂和水的体积比%,%,%、提取溶剂质量分数药材重量的倍,倍,倍和浓缩体积提取液体积的/,/,/进行大量的实验分析。对实验结果进行综合考虑,研磨颗粒度为 的冬虫夏草药材用倍其河北人学理学硕十学位论文质量的高纯水回流次,每次提取 ,浓缩体积为提取液体积的/效果最佳,详情见表。表不同样品处理的结果.电泳条件的选择检测波长的选择考察了不同波长下 冬虫夏草供试溶液的电泳图谱,发现在 处检测到的电泳峰数目最多且分离度较好,将 作为实验的最佳检测波长。电泳条件的选择研究了不同种类缓冲溶液硼酸盐、磷酸盐、硼酸.磷酸盐、柠檬酸、胶束、微乳液、微乳液构成的缓冲体系其中微乳液的组成为正丁醇正己烷,微乳液的组成为正丁醇正庚烷,考查了缓冲溶液浓度/、值、有机添加剂尿素、乙腈、甲醇以及其体积分数%对冬虫夏草提取液分离的影响。对不同种类缓冲体系、不同浓度、添加不同有机添加剂、调节了不同都进行了大量的实验,胶束和微乳液虽然可得到较多的电泳峰,但是分离度和重现性较差,且基线不平稳。硼砂的缓冲体系也可以得到较好的分离效果,但不如硼砂.磷酸氢二钾缓冲溶液的电泳峰丰富,而有机添加剂尿素的加入使电泳峰的以上时分离得到的峰形以及分离情况均得到改善。值的改变对分离影响最大,电泳峰比较多,但分离度不好,而且缓冲体系不稳定,但是在低于以后,电泳峰明显减少。考查了分离电压 ,毛细管温度对冬虫夏草提取液分离的影响。提高分离电压有利于缩短分离周期,但太高导致分离度降低、基线不稳定,可.第章 冬虫夏草药材指纹图谱的研究是电压过低会造成电泳峰数目的明显减少;毛细管温度对分离效果有一定的影响,尤其在高电压下控制毛细管的温度对分离效果有改善,但我们使用的电压范围内,温度在之间对分离的影响不明显。/综合考虑,最优电泳条件为:电泳缓冲体系为含%体积分数尿素的.;检测波长 ;分离电压 ;毛细管温度为室温的硼砂一磷酸氢二钾。.不同产地冬虫夏草指纹图谱的比较制备不同产地冬虫夏革的供试溶液,在最佳电泳条件下对每个产地的样品平行测定次,记录电泳图见图。对种不同产地的冬虫夏草药材进行谱图比较,发现其中、号峰为冬虫夏草药材的共有峰单峰面积大于总峰面积的%,结果显示不同产地的冬虫夏草有显著性差异在%一%,详见表,表明冬虫夏草的主要化学成分因产地不同而有较大的差异。图冬虫夏草的咿住指纹图谱:地:西藏那曲 图冬虫夏草的指纹图谱产地:西藏 . 咿旺 印 。 【明圈冬虫夏草的指纹图谱来源:青海 圈冬虫夏草的指纹图谱来源:保定药店. 咿住 . 河北人学理学硕十学位论文裹 不同产地冬虫夏草指纹图谱检测结果.由图表可知,不同产地冬虫夏草药材由于生长的地理环境、气候条件不同而导致其主要化学成分有所差异。该实验方法所建立的冬虫夏草药材的指纹图谱信息较全第章冬虫夏草药材指纹图谱的研究面,预处理方法简单,可为冬虫夏草药材质量鉴别提供一种科学的方法和依据,并可为其他中药材指纹图谱的建立提供借鉴。更详细、更全面的冬虫夏草质量评价方法的研究仍在进行中。:.、?.:脚【 : ,/ ,?,. .河北大学理学硕十学位论文第章人参药材指纹图谱研究初探人参,为多年生草本植物,属于五加科植物的干燥根。主根肉质,圆柱形或纺锤形,须根细长;根状茎芦头短,上有茎痕芦碗和芽苞。人参主要产于大小兴安岭和长白山。其中以长白山地区出产的人参品质更优。人工种植的人参一般称为“园参;将园参刺成蜂窝状后用糖水浸泡,晾干后就称为“白参;将幼小的野山参移植于田间或将幼小的园参移植于山野而成长的人参称为“山参”。人参有效地调节中枢神经系统、提高心脏的收缩能力和频率、刺激内分泌系统、降低血糖、增进性机能、促进消化液的分泌、增强人体免疫力、抵抗癌细胞的扩散和转移、强化骨髓的造血机能等功效,是滋补强壮的名贵中药材。但是由于人参种类、生长的地理环境、炮制方法不同,导致价格差别很大,所以鉴别人参的真伪、优劣是当务之急。为了给人们提供人参药物成分的科学依据,我们对不同产地、种类、炮制方法的人参进行了毛细管电泳、气相色谱、顶空气相色谱的指纹图谱研究。很容易区别人参的产地、种类,可为人参药材质量控制提供参考。.人参的毛细管电泳指纹图谱研究摘要:建立了长白山人参的毛细管电泳指纹图谱。研究了不同的预处理方法、检测波长、分离电压、缓冲体系对人参指纹图谱的影响,并对原产地长白山人参和人工种植人参的指纹图谱进行了比较。采用毛细管区带电泳法测定指纹图谱,电泳条件:未涂层石英毛细管有效长度 ,以 /的硼砂缓冲体系做背景电解质,分离电压 ,检测波长 ,气压进样 ,进样压力 ,温度为室温。关键词:人参毛细管电泳指纹图谱长白山【、杨高阳【等用高效液相色谱法对人参的指纹图谱进行了分析研究,伟峰【】等先后用胶束电动毛细管色谱对西洋参的人参皂苷进行了研究,但利用毛细管电泳对人参指纹图谱的研究目前尚未见报道。本文采用毛细管区带电泳法对人参进行了指纹图谱研究,建立的人参药材指纹图谱化学信息比较丰富,获得个峰,很容易区别人参的产地、种类,可为原产地人参药材质量控制提供参考。.实验部分仪器及其试剂.第章人参药材指纹图谱研究初探仪器一高效毛细管电泳仪,保定天惠分离科学研究所;.色谱工作站北京创新通恒科技有限公司;超声振荡器上海科导超声仪有限公司;电子天平,;旋转蒸发器.,上海亚荣生化仪器厂;干燥箱上海分析仪器厂;.