（食品科学专业论文）天然生物防腐剂纳他霉素（natamycin）发酵工艺的研究.pdf

沈阳农业人学硕i ：学位论史 摘要 国内外目前使用的食品防腐剂的防腐效果均受微生物种类、食品成分、 p h 值和溶解性等因素的影响，且在常规使用量下，影响食品的风味，致使这 些防腐剂的使用受到限制，不能满足现代食品加工的需要。而且，随着人们 对化学合成食品防腐剂安全认识的提高，低毒、高效、广谱及经济实用的生 物防腐剂的研究和开发，受到人们的关注。 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 也称游链霉素或匹马菌素( p i m a r i e i n ) 是一种重 要的多烯类抗菌素，可以由s t r e p t o m y e e sn a t a l e n s i s 和s t r e p t o m y c e s c h a t t a n o o g e n s i s 等链霉菌发酵产生。该抗生素是一种很强的抗真菌试剂，能 有效地抑制酵母菌等真菌的生长，有些真菌能产生真菌毒素( m y c o t o x i n s ) ， 真菌毒索对人类有致癌、致畸、致震巅、致出血、致皮炎等作用。因此，纳 他霉素用于食品防腐不仅可以解决食品腐败，还能减少真菌毒素对人类的毒 害。与其他抗菌成分相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，可以广泛 应用于真菌引起的疾病，除此之外，由于纳他霉素的溶解度低，可用其对食 品的表面进行处理以增加食品保质期却不影响食品的风味和口感。美国c f r 编码：2 1 c f r l 7 2 5 5 ，其中对纳他霉素的b a i 值是o 3 m g k g ，根据我国食 品添加剂使用卫生标准( g b 2 7 6 0 ) 规定，食品中的使用量为1 0 西数量级。 因此，纳他霉素是一种高效、安全的新型生物防腐剂。目前，纳他霉素作为 一种天然的生物防腐剂已被批准用于某些乳制品、肉类、饮料、水果等许多 食品的生产和保藏之中。 目前我国几乎没有纳他霉素的研究和生产。 本文首先对生产菌种褐黄孢链霉菌s t r e p t o m y c e s g i l v o s p o r e u s ，j c m 4 7 9 5 的菌落和菌丝形态特征进行了观察，通过琼脂块法对生产纳他霉素的原始菌 株进行筛选，同时，确定了发酵液中纳他霉素的快速测定方法紫外分光 摘费 光度法；然后对纳他霉素生产菌的发酵性能作了初步研究，得到了其最佳的 培养基配方；对其发酵工艺进行了优化得到了在该培养基配方条件下的最 佳工艺参数。 确定了紫外分光光度法检测发酵液中纳他霉素的各项参数：浸提液为5 冰醋酸甲醇溶液，料液比：l ：9 ，1 0 0 0 0 r r a i n ，离心2 0 m i n 后，上清液适当 稀释即为检测液，紫外检测波长为3 0 3 r i m 。 在研究菌株性能的基础上，优化了发酵培养基配方：葡萄糖：2 4 9 l ， 糊精：8 9 l ，大豆蛋白胨：2 2 9 l ，酵母浸粉：3 5 9 l ，p h 7 5 。 通过对各项发酵参数进行优化实验，确定了最佳发酵条件：以2 的接 种量接种于装液量为5 0 m l 的2 5 0 m l 的三角瓶中，培养温度2 9 ，摇床转 速为2 0 0r m i n ，发酵时长1 4 4 h ，纳他霉素产量达到o4 5 9 l 。 微生物防腐剂以它安全、天然、健康的特点而倍受人们的关注，各国纷 纷投入人力、物力对其进行研究，许多天然生物防腐剂正在研究之中。随着 科学技术的进步、生活水平的提高和人们健康意识的增强，人们必将用微生 物防腐剂完全替代化学防腐剂。 关键词：生物防腐剂纳他霉素褐黄孢链霉菌检测发酵条件 沈阳农业大学硕士学位论文 刖置 1 9 5 5 年，s t r u y k 等人从南非纳他州的土壤中分离到纳塔尔链霉菌 s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s ，并从中分离出一种新的抗真菌物质，称为 p i m a r i e i n ( 脯) 1 1 1 ：1 9 5 9 年，b u r n s 等人在美国田纳西州的土壤中分离到 了一株恰塔努加链霉菌s t r e p t o m y e e se h a t t a n o o g e n s i s ，并从其培养物中分离到 了t e n n e c e t i n ( i 王t 纳西菌素) 。此后的研究证明匹马菌素和田纳西菌素为同一物 质，并被世界卫生组织w h o 统一命名为n a t a m y e i n ( 纳他霉素) n 1 。 一、纳他霉素的性质 纳他霉素( n a t a m y e i n ) 也称匹马菌素( p i m a r i c i n ) 、游链霉素，是一种 重要的多烯类抗菌素。可以由s t r e p t o m y e e sn a t a l e n s i s 、s t r e p t o m y c e s c h a t a n o o g e n s i s 和s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u 等链霉菌发酵产生。该抗菌素是一 种很强的抗真菌试剂，能有效地抑制酵母菌和霉菌的生长，阻止丝状真菌中 黄曲霉毒素的形成1 3 1 。与其它抗菌成分相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒 性极低，可以广泛应用于由真菌引起的疾病i l l 。除此之外，由于纳他霉素的 溶解度低，可用其对食品表面进行处理以增加食品的保质期，却不影响食品 的风味和口感。目前，纳他霉索作为一种天然的食品防腐剂已被批准应用于 某些乳制品、肉类、水果、饮料等许多食品工业中p 1 。 ( 一) 物理化学性质 纳他霉素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，其分子是一种具有活性 的环状四烯化合物，含3 个以上结晶水，外观白色或乳白色，几乎无味的结 晶粉末。分子式为c 3 3 h 4 7 n o l 3 ，分子量为6 6 5 7 5 ，化学结构如图1 1 所示”1 。 3 刖蟊 饼l 搬 f 图1 1 纳他霉素的化学结构 f i g 1 - lc h e m i c a ls i r u e t u r eo f n a t a m y c i n 纳他霉素分子结构中的四烯系统是全顺式，内酯环上c 9 _ _ c 1 3 部位是半 缩醛结构，含有一个由糖苷键连接的碳水化合物基团，即氨基二脱氧甘露糖 ( m y e o s a m i n e ) 。纳他霉素是两性物质，分子当中含有一个碱性基团和一个 酸性基团，其电离常数p k a 值为8 3 5 和4 6 ，相应的等电点为6 5 ，熔点为 2 8 0 ( 2 。其结构上存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式结构，这就决定了 它在许多溶剂中的低溶解性。纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性是随着 p h 的降低或升高而增加的，在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高 于9 时溶解度增大。纳他霉素在各种典型溶剂中的溶解度盯1 如表1 1 所示。 由于具有环状结构，纳他霉素易于氧化和受到紫外线的影响，故应避免接触 氧化剂及受到阳光照射一。3 。 静众 沈阳农业大学硕十学位论文 表1 - i 纳他霉素的溶解度 t a b i fd e l i q u e s c e n c ed e g r e eo f n a t a m y c i n 溶剂溶解度 水 乙醇 8 0 乙醇+ 2 0 水 甲醇 丙二醇 丙三醇 甘油 二甲基弧砒 冰醋酸 ( 二) 活性和稳定性 纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物，室温下保存几年只有很小 一部分失去活性。三水合物同样稳定，但其无水状念不稳定，在室温密闭的 瓶子中保存4 8 小时失去1 5 的活性。中性的纳他霉素水溶液几乎和干粉一 样稳定。纳他霉素的稳定性受p h 值、温度、光照、氧化剂、和重金属等条 件的影响而变化”m1 1 。 1 d h 值：纳他霉素在p h 4 5 9 之| - 自】非常稳定，在极端p h 值下纳他霉 素迅速失活。形成各种各样的分解产物。在实际使用纳他霉素的悬浮液中， 当p h 值在4 7 时对霉菌、酵母菌的抑制活性所受的影响极微，在p h 5 7 之间时纳他霉素可保持最佳活性，在p h 3 5 时活性丧失8 1 0 ，如p h 值 小于3 或高于9 时其抑菌活性可减低3 0 。p h 值对于纳他霉素的稳定性 有一定的影响。但对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响在大部分食品 由 o 删 洲 哪 ” 他 ：2 如 ；星 前言 的p h 范围内，纳他霉素十分稳定。 2 温度：温度对纳他霉索的活性几乎没有影响( 在中性水溶液中) 。纳 他霉素在室温条件下是稳定的，5 0 1 2 放置几天或1 0 0 ( 2 短时处理，其活性几 乎无损失。1 2 0 ( 2 条件下加热不超过l h 仍能保持纳他霉索的部分活性。 3 光照：纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。y 射线也能使纳他 霉素分解。纳他霉素的粉状品或水溶液，受到日光( 紫外线) 的直接照射， 可使其活性逐步失去。 4 氧化剂：纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑 菌活性会明显下降。防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如：叶绿索、抗坏血 酸、丁基羟基茴香醚、丁基甲苯等。 5 重金属：些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、 铅、汞等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中， 也可以添加e d l a 或聚磷酸盐来防止失活。 6 鉴别用颜色反应：把纳他霉素晶体加入滴有一滴浓盐酸的点滴板上， 颜色马上变蓝；如果滴加一滴浓磷酸，颜色马上变绿，几分钟后，都会变成 浅红色。 ( 三) 抗微生物性质 纳他霉素是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某些原生动物和某些藻类的多 烯大环内酯类抗生素，但它没有抗细菌、病毒和其他微生物( 如原虫等) 活 性。1 9 5 6 年，t r e s n e r 曾测试过纳他霉索对5 0 0 种霉菌的抗性，所有菌种都 被l 一1 0 p p m 的纳他霉素抑制；1 9 5 9 年，k l i s 比较了纳他霉素、山梨酸、放 线菌酮、制霉菌索、龟裂霉素等的抑菌效果，发现纳他霉素对1 6 种肉汤和 琼脂中培养的霉菌是最有效的抑制剂h 1 。绝大多数霉菌在o 5 6 p p m 的纳他 霉素浓度下被抑制；多数酵母菌在1 0 5 0 p p m 的纳他霉素浓度下被抑制呛3 。 纳他霉素作为食品防腐剂，它的抗真菌作用是双效的：即可以防止真菌 沈阳农业大学硕士学位论文 污染：又可以舫止真菌毒索给人类造成的伤害 1 2 1 0 与其他抗菌成分相比， 纳他霉索对哺乳动物细胞的毒性极低，可以广泛应用于真菌引起的疾病。 ( 四) 安全性及毒性 纳他霉素难溶于水和油脂，大部分摄入的纳他霉素会随粪便排出，很难 被消化道吸收。据报道【1 3 l ，人体e l 服5 0 0 r a g 纳他霉素后，在血液中含量少于 l m g m l ，即说明纳他霉素很难被动物或人体的胃肠吸收。给奶牛喂食高剂 量的纳他霉素，结果表明，9 0 的纳他霉素及其分解产物可以排出 1 0 3 01 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等研究纳他霉索的急性毒性和慢性毒性。证明纳他霉素对人体 的器官没有明显的影响，也不产生伤害。经卫生学和皮肤斑点实验，表明纳 他霉索无过敏反应n ”。1 9 7 3 年h a m i l t o nm i l l e r 报道纳他霉索口服毒性最小， 静脉注射毒性极大。1 9 7 7 年，d eb o e r 和s t o l kh o r s t h u i s 研究了真菌对纳他 霉素形成抗性的可能性，他在连续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发 现真菌形成抗性的证据1 1 0 l ，使用大于m i c ( 最低有效抑制浓度) 的纳他霉索 量，人为诱导也没有发现真菌形成抗性的证据。1 9 8 2 年，r a y 和b u l l e r t m a n 报道纳他霉素能减少黄曲霉产生的黄曲霉毒素、赭嗌霉产生的赭曲霉毒素、 圆弧青霉产生的青霉酸、展开青霉产生的青霉素f 1 0 1 。因此，纳他霉紊能减少 真菌毒索给人类造成的危害。 二、纳他霉素的应用 ( 一) 作用特点 纳他霉素作为天然生物防腐剂在食品中应用具有以下的特点： 1 低剂量、高效率。纳他霉素对霉菌和酵母菌的抑制功效是山梨酸钾 的1 0 0 2 0 0 倍左右，即2 0 m g k g 的纳他霉素相当于1 0 0 0 2 0 0 0 m g k g 的山 梨酸钾。 2 适用的p h 值范围宽。纳他霉素与常用的山梨酸钾等防腐剂相比，在 p h3 - 9 范围内都有活性，其适用范围更宽。 7 3 纳他霉素是白色、无气味、无味道的粉状物，它对产品的口感特性 无任何影响，更适合作食品中的防腐剂。 4 抑制有害真菌而不作用于有益菌。由于纳他霉素对细菌不起作用， 可直接加到酸奶等发酵品中，从而抑制了接种产品中的霉菌和酵母菌，却不 作用于酸奶中的细菌( 双歧杆菌) ，保证了产品质量，而其他防腐剂尚不具 备这一功能 1 5 3 0 ( 二) 世界各地法规 纳他霉素在超过4 0 多个国家中被批准为食品防腐剂，其中欧盟规定其 编号为e 2 3 5 。w h o 和f a o 规定消费者每天纳他霉素最大摄入量( a d i ) 为 0 3 m g k g 体重，奶酪和香肠的一般消费者每天摄入量为o 0 0 2 m g k g 体重旧3 。 1 9 9 8 年。g r a s 专家组认定纳他霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油和 农家干酪非常安全。 目前，纳他霉索可用于奶酪的国家有：阿尔及利亚、巴林、比利时、保 加利亚、加拿大、智利、法国、德国、希腊、匈牙利、以色列、意大利、科 威特、墨西哥、新西兰、挪威、阿曼、菲律宾、葡萄牙、卡塔尔、萨特阿拉 伯、南非、西班牙、瑞典、美国及委内瑞拉等2 6 国 1 1 1 0 用于肉制品的国家有：阿尔及利亚、澳大利亚、比利对、智利、法国、 匈牙利、墨西哥、新西兰、南非、西班牙及委内瑞拉等l l 国 1 1 o 荷兰还批 准纳他霉素用于苹果和梨的防腐。 在中国，纳他霉素被批准用于干酪、肉制品( 肉肠、西式火腿) 、月饼、 糕点、果汁原浆以及易发霉食品加工器皿的表面，一般采用2 0 0 - 3 0 0 m g k g 悬浮液浸泡或喷洒，残留量不超过1 0 m g k g 。纳他霉素也被批准直接添加到 发酵洒、酸奶和色拉酱中，限量为i o m g k g ( 食品添j n ? u 使用卫生标准： g b 2 7 6 0 - - - 1 9 9 6 ，1 7 0 ，防腐剂) 1 0 。 沈阳农业大学硕士学位论文 ( 三) 在食品中的应用 1 9 8 2 年6 月，美国f a d 正式批准纳他霉素可以用作食品防腐荆。1 9 8 0 年1 月9 日，我国卫生部食品监督厅签发了国内第一个生物食品防腐剂n i f i n ( 乳酸链球菌素或称乳酸链球菌肽) 的使用合格证明1 1 6 1 0 到1 9 9 6 年，中国食 品添加剂标准化学技术委员会正式批准纳他霉索可作为食品防腐剂 1 1 1 0 乳 酸链球菌肽对革兰氏阳性腐败细菌有抑制作用，对酵母菌及霉菌等丝状真菌 无效；而纳他霉素对酵母菌及霉菌等丝状真菌有极强的抑制或杀灭作用n 刀， 这一点正好与乳酸链球菌肽的抑菌谱互补。纳他霉素与乳酸链球菌肽是目前 国际上批准使用的仅有的两种生物食品防腐剂。 纳他霉素由于溶解度很低，被用于食品表面防腐剂以增加货架期，主要 在奶酪、肉制品、葡萄酒、茶饮料及果汁中添加，它不会干扰其它食品成分， 也不会带来异味。与传统的抗真菌刹比较。纳他霉素有其独特的性质，它在 很低的浓度仍具有活性。例如：在奶酪中纳他霉素比山梨酸钾活性高4 0 0 倍。 在葡萄酒中，纳他霉素能取代山梨酸钾和其它抗真菌剂，它允许减少所使用 的s 0 2 量。目前，全世界已有三十多个国家采用纳他霉素作为食品防腐剂。 1 干酪 纳他霉素应用于奶酪生产的工艺已很成熟，有关的报道从7 0 年代至今 多不胜举。纳他霉索用于干酪皮防止其表面发霉，它不会渗透到干酪内部， 仅仅停留在酪皮外层1 m m 处，而这一部分一般不会被取食，干酪放置5 1 0 周后，纳他霉索基本消失，此时酪皮变硬不易受到霉菌侵染，纳他霉素对细 菌无效，因而不会影响干酪和于酪制品的熟化。使用方法一般有浸泡、喷洒 或乳剂覆膜。2 0 0 1 年6 月，b a s i l i c o j c 等人报道o5 ( v v ) 纳他霉索用于 奶酪就可以有效防止丝状真菌的污染i i 3 2 肉制品 在肉制品中使用2 0 0 m g k g 的纳他霉素混悬液对其进行浸泡或喷洒，可 达到纳他霉素含量为8 斗g c m 2 安全而有效的防霉水平。对香肠来说，纳他霉 索可在以下数个步骤中添加：发酵前；肠衣浸泡；已灌料香肠的浸泡；己灌 料香肠的表面喷洒c 1 0 o 对于硬香肠来说，纳他霉素的报荐用量为肠衣浸渍 液质量的0 0 5 o 2 。 3 果汁 纳他霉素在果汁中的应用也很广泛对于葡萄汁，添加2 0 m g k g 纳他霉 索就能防止酵母发酵；对于2 5 4 。c 下保存的橙汁，自然条件下保存一周就 会受到真菌污染，而仅使用1 2 5 m g k g 低剂量的纳他霉素就能使保质期延 长8 周引；对于苹果汁，3 0 m g k g 的纳他霉素能在6 周内防止发酵变质，并 且使果汁的原有风味基本保持不变。 4 茶饮料 1 9 9 9 年，c i r i l i a n o m c 等人报道，纳他霉素用于茶饮料，可以有效防止 真菌腐败，并给予茶饮料更加可接受的感官特性 1 9 ) 0 5 水果 1 9 8 1 年，j g o o s t e n d o r p 报道。纳他霉素用于水果储存中，可有效防止 真菌引起的有氧降解四3 。我国也有关于纳他霉素应用于水果中的报道。将整 个苹果浸泡在含有5 0 0 p p m 纳他霉素的悬液中l 2 分钟后，经过8 个月的存 放，能有效降低苹果变质的数目。另据报道，用卵磷脂一纳他霉索混合液浸 洗苹果可有效防止水果出现的霉腐斑点。 6 焙烤食品 已经研究过纳他霉素在各种焙烤食品中的应用。当黑面包和白面包表面 洒有1 0 0 5 0 0 m g k g 的纳他霉素混悬液时，防霉效果不错。用纳他霉素对生 面团进行处理，也收到了理想效果。 此外，j g o o s t e n d o r p 还报道了纳他霉素用于卷心菜叶的防腐，以及在 草、马铃薯种子和水仙花球茎中的应用，都取得了满意的效果 1 13 0 目前， 纳他霉索在我国的应用也越来越广泛。纳他霉索用于沙拉酱、人造奶油、果 沈阳农业大学硕士学位论文 冻、酱菜和广式月饼，肪腐效果均很好渤j2 1 o ( 四) 在医疗中的应用 纳他霉素除了用作食品防腐剂，还可以药用。近几年，报道纳他霉素医 疗应用的文献越来越多，它的临床应用范围也越来越广泛，主要由于它具有 以下一些特点：1 口服毒性非常低：2 肠道无吸收；3 无过敏反应：4 无 交叉抗性。纳他霉素以集中制剂形式( 悬浮剂、乳剂、软膏和鞘状药片等) 被用于抗皮肤和粘膜的真菌感染，即可以单独使用也可以与新霉素、氢化可 的松及其他类固醇类药品共同使用。纳他霉素还可以用于阴道和肺部真菌感 染的治疗9 川。2 2 。 1 9 9 7 年9 月，k a l i u z h n a i al d ，m u r z i n ae a 报道，不同剂量的纳他霉素 用于治疗由真菌引起的儿童皮肤和粘液膜感染非常有效旺引。j a n i 等报道了用 纳他霉素和崔希杆菌抗生素油膏治疗真菌性眼角膜溃疡的病例 2 4 5 u 还有纳 他霉素和盐酸阿托品配合使用治疗该病症的报道心 。最新的文献显示，纳 他霉索已成功的用于真菌性角膜炎的治疗中，临床应用方式为使用5 混悬 液滴眼幢6 2 7 o 另外，国内外也有用纳他霉素治疗马角质层炎症、大类真菌 性外耳炎的报道阻8 ，2 ”。 目前，纳他霉素不仅已被广泛用于食品、医疗等领域，在饲料、粮食方 面的应用也渐有报道n o 3 13 0 纳他霉素在食品原料保鲜、成品防腐方面的应 用显示了很好的前景。 三、纳他霉素的研究概况 ( 一) 生产菌种 纳他霉素产生菌为链霉菌，链霉菌的基内菌丝体通常发育良好，多分枝， 无隔膜而连贯；它的气生菌丝丰茂，气生菌丝通常较基内菌丝粗颜色较深， 当菌丝逐渐成熟时，大部分气生菌丝分化成孢子丝，产生呈长链的孢子，孢 子为外鞘所包，鞘表面光滑或带各种装饰物，在电子显微镜下表现为双短杆 前言 镶嵌图，有鳞片或形状和大小不同的突起，刺或毛发等；孢子的分裂方式也 有差异，有的沿横膈中央平切，有的两端浑圆，有残余的鞘相连。 目前，报道的纳他霉索产生菌有三种： 1 褐黄孢链霉菌s t r c p t o m y c 七s g i l v o s p o r e u s ，j c m 4 7 9 5 孢子丝螺旋形： 孢子呈球形或圆形，孢子带刺。 2 恰塔努加链霉菌s t r e p t o m y c e s ，c h a t t a n o v g e n s i s ，a t c c l 3 3 5 8 孢子丝圈 至螺旋形，有时柔曲；孢子呈球形或椭圆形，表面带细刺珏羽。 3 纳塔尔链霉菌s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s i s ，j c m 4 6 9 3 孢子丝2 5 圈松散 螺旋形：孢子呈球形或卵圆形，表面带小刺 3 2 3 0 ( 二) 抑菌机理的研究 纳他霉素是一种高效、广谱的真菌抑制剂，它是2 6 种多烯烃大环内酯 类抗真菌剂的一种，多烯是平面大环内酯环状结构，能与甾醇化合物相互作 用且具有高度亲和性，对真菌有抑制活性。其抗菌机理在于它能与细胞壁及 细胞膜上的甾醇化合物反应，尤其是麦角甾醇形成一种复合物，由此引发细 胞膜结构改变而破裂，导致细胞内物质的渗漏使细胞死亡1 3 3 1 。纳他霉素对于 抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于破坏休眠的细胞则需要较高的浓 度。纳他霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。当某些微生物的细胞壁及细 胞膜不存在这些类似固醇的化合物时，纳他霉索就不产生抗菌活性，因此纳 他霉素被列为抗真菌类产品。 ( 三) 发酵生产研究现状 早在1 9 6 0 年，c y a n a m i d 就报道了发酵生产纳他霉索的方法。但接下来 的相关报道比较少直到九十年代，有关纳他霉索的生产研究才重新受到关 注。 1 9 9 3 年，m a 艾森申克的专利c n l 0 7 1 4 6 0 a 报道了发酵法生产纳他霉 素的菌种培养和繁殖方法。要求用一种适宜的生孢子琼脂培养基，种菌繁殖 沈阳农业大学硕士学位论文 所用的孢子悬浮液应包含的孢子浓度约为1 0 5 l o ”c f u i m l 。适宜的种菌细 胞密度含有约1 s g l l 的干细胞重，并且是纳他霉素生产培养基体积的o 1 1 0 3 钔。 专利c n1 0 7 2 9 5 9 a 中报道，通过控制培养基的p h 值可以提高纳他霉素 的生产速率；在纳他霉素发酵主阶段即抗生素生产阶段，向发酵液中加入适 宜的p h 控制剂( 如n a o h 、k o h 、c a ( o h ) 2 等) 以控制发酵液的p h 值，使 其维持在5 9 6 1 ，可提高纳他霉素产生速率和产率，一般生产时间可减少 2 0 6 0 ，产量可达5 e l l 3 钉。 同年，p 一奥尔森的专利c n1 0 7 0 6 8 8 a 报道了连续发酵生产纳他霉素的 工艺。第一阶段，进行有效的苗体繁殖，伴随部分纳他霉素的产生。在发酵 的第二阶段进行连续生产，维持发酵液的体积基本不变，使加入的培养基的 速度和取出发酵液的速度基本一致，这样最终产量可达6 1 2 9 l 3 6 3 0 1 9 4 4 年，e i s e n s c h i n k ，m i c h a e la l l e n 等人的专利报道了流加碳、氮源进 行纳他霉素发酵的方法。指出发酵培养基至少应有1 5 9 l 的蛋白类氮源和 8 0 - - 2 5 0 9 l 的碳源，其中碳源要不断流加使其浓度保持在5 3 0 9 l ，纳他 霉素产量可以达到5 9 r lc 3 7 。 2 0 0 0 年，e n s h a s yh a ，f a r i dm a 等人报道了接种物类型和培养条件对 纳塔尔链霉菌产生纳他霉素发酵的影响。指出用孢子悬液而不用营养细胞接 种，且孢子悬液浓度应在1 0 8 个m l 。培养条件主要研究了溶氧水平对发酵 的影响，并指出向培养基中添加水溶性生物聚合物如褐藻酸钠可以降低溶解 氧，使纳他霉素的产量下降”。同年，他们报道了通过最佳碳、氮源的选 择及其e b 例的优化。但其发酵水平比较低，仅为1 5 9 ln 蚰。 ( 四) 基因工程研究进展 目前，世界上对纳他霉素产生菌基因工程方面的研究刚刚起步，相关报 道较少。 1 9 9 9 年，a 口a r i c i oj f ，c o l i n a a j 等人研究了纳他霉素产生菌纳塔尔链 霉菌的生物合成基因簇，发现其染色体组包含1 1 0 k b 碱基对。他们还报道了 由功能基因分隔的两个亚簇编码的聚酮合酶基因组，包含两个主要的基因 p i m s o 基因和p i m s l ，p i m s o 编码一个相对较小的( 约1 9 3 k d a ) 乙酸激活聚 酮合酶( p k s ) 基因，p i m s l 编码一个大约7 1 k d a 的多酶基因旧3 。 2 0 0 0 年，a p a r i c i oj e ，f o u c e sr 等人报道了纳塔霉索生产菌纳塔尔链 霉菌的个含1 6 个开放读码框，8 4 9 8 5 b p 基因簇序列，这是继制霉菌素后报 道的第二个多烯大环生物合成基因簇，它编码聚酮合酶( p k s ) 的1 3 个同源 酶基因，p k s 被分配在五个巨大的多霉系统中( p i m s o - - p i m s 4 ) 4 1 o 同年， m a r t av m e n d e s ，j e s u sf a p a r i c i o 等人有研究报道纳塔尔链霉菌中的一个隐 蔽质粒p s n a l 的基因图谱和全部核苷酸序列，d n a 分子大小为3 6 7 b p ，g + c 的含量占7 1 3 ，拷贝数3 0 。p s n a i 包含七个开放阅读框，分别编码不同 的蛋白质 4 2 3 0 2 0 0 1 年，m a r t avm e n d e s ，e l i s e or e c i o 等人报道了从纳他霉素产生菌 纳塔尔链霉菌中获得的目的基因片段p i m d ，它编码的细胞色素p 4 5 0 环氧酶， 负责将4 ，5 一去还氧匹马霉素( 4 ，5 - d e - c p o x y p i m a r i c i n ) 转变成匹马菌素。4 ， 5 去还氧匹马霉素是一种生物活性物质，是从纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌 的一个重组突变体中分离得到的f 4 ：3 3 。 目前，基因工程在抗生索生产中的应用还是初步的，关键问题是对抗生 素生物合成途径和代谢调节机制的认识非常有限，但随着人们对抗生索合成 基因研究的不断深入，基因工程在提高抗生素产量方面是大有可为的，它是 目前生物技术研究中最接近产业化的领域之一。 ( 五) 纳他霉素的检测 1 生物检测法 纳他霉素效价的生物检测法主要采用管碟法。管臻法利用抗生索在琼脂 4 沈阳农业大学硕士学位论文 培养基中扩散渗透作用，将己知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有敏 感性试验菌的琼脂表面进行扩散渗透，由于对被试菌的抑制作用而产生抑菌 圈，抑菌圈的大小和抗生素的浓度之间有一定的比例。这个方法利用抗生素 抑制敏感菌的特点，符合临床使用的实际情况而且灵敏度高，不需特殊设 备，因此被国际公认【4 叭。 2 紫外分光光度法 h a r r yb r i k 研究了在含有o 1 醋酸的甲醇溶剂中纳他霉索的紫外光谱， 乙酸作为波长稳定剂。纳他霉素的紫外光谱显示，在a = 2 9 0 ，3 0 3 ，3 1 8 r i m 处 有尖锐的最大吸收峰，因此紫外分光光度法可检测纳他霉素。在2 2 0 n m 处有 宽峰，可以把它同制霉菌素与两性霉素区分开。2 8 0 3 2 0 n m 之间出现的吸 收峰是由于具有四烯环的性质。 f l a o u f i s d j 等人研究了紫外分光光度法分析奶酪和奶酪皮中的纳他霉 素的方法。检测样品与酸性水合乙氰混匀，过滤，滤液在3 2 2 6 n m 下直接测 定，测定范围0 5 2 0 m g k g ，可得到较好的线性关系( r - - 0 9 9 8 8 ) 【4 l 】。 紫外分光光度法可用于鉴定和分析纳他霉素。 3 高效液相色谱( h p l o ) 法 高效液相色谱( h p l c ) 法由于其操作简便、精密度高，因此广泛地用 于检测食品中残留纳他霉毒的含量。高效液相色谱( h p l c ) 法检测纳他霉 素广泛采用c 。8 反相柱，纳他霉素在3 0 3 n m 处有最大吸收峰，所以检测器采 用u v 检测器，常用流动相如表1 - 2 所示。 高效液相色谱( h p l c ) 法选择性高，可进行微量及常量测定，是分析 纳他霉素常用方法1 。 此外，还有薄层层析法。 虽然管碟法是国际上通用的检测抗生素浓度的标准方法，但它对环境因 素( 温度、无菌条件等) 、材料因素( 菌种、培养基等) 、操作技术要求较高， 测试过程较繁杂，且在发酵异常时误差较大；薄层层析法主要用于定性分析； 前言 用高效液相色谱法检测纳他霉索资料较少，文献中报道韵多集中于食品中纳 他霉素残留量及高纯度纳他霉索产品的检测；本文首次利用紫外分光光度法 对发酵液中的纳他霉素定性和定量测定进行了研究。结果表明该方法准确可 靠，是一种比较理想的定性定量检测方法。 表卜2h p l c 法检测纳他霉素常用流动相 t a b t h ec o m m o f lf l u x i o no f h p l ci nn a t a m y c i 】ni n s p o c f i o n 配比( v v ) r a t i o ( v v ) 甲醇：水 甲醇：水：冰醋酸 甲醇：水：冰醋酸 甲醇；水：四氢呋哺 甲醇：水：磷酸 6 5 ：3 5 4 8 ：3 2 ：l 6 0 ：4 0 ：5 4 4 ：4 7 ：2 ( 含1 的醋酸氨) 5 5 ：4 5 ：3 四、本文的立项背景 纳他霉素是一种广谱高效的抗生素，是国际上被美国f d a 正式批准的 仅有的两种生物防腐剂之。已经广泛地应用于食品、医疗等领域。其对真 菌极为敏感，使用微量即可起作用，作为防腐剂的用量仅为山梨酸钾的 1 5 0 1 1 0 0 。而且其适用韵p h 值范围更广，在p h 值3 9 具有活性。纳他 霉素是白色、无气味、无味道的粉状物，故对产品的口感特性无任何影响， 更适合作为食品的防腐剂。纳他霉素可以直接添加到酸奶等发酵制品中，只 抑制其中的霉菌和酵母菌，却不作用于酸奶中的细菌( 双歧杆菌) ，而其他 防腐剂尚不具备这一功能。展望未来，可以预测天然食品防腐剂纳他霉 素在乳制品、肉制品、果蔬汁、焙烤食品中具有极其广阔的应用前景。 美国已有几个公司生产销售纳他霉素，例如：美国的c y a n a m i d 公司生 产的纳他霉素的商品名是m y p r o z i n e ；美国的g b 发酵工业公司生产的纳他 1 6 沈阳农业大学硕士学位论文 霉素的商品名是d e l v o c i d 等。我国目前几乎没有纳他霉素的研究和生产。随 着人们对化学合成食品防腐剂安全性认识的提高，低毒、高效、广谱及经济 实用的生物食品防腐剂的研究和开发，将愈来愈受到人们的关注。 五、论文研究的主要内容 本课题的研究首先确定发酵液中纳他霉素的快速检测方法：然后对纳他 霉素产生菌出发菌株的发酵性能进行研究，在此基础上优化发酵培养基配 方，优化发酵工艺，提高纳他霉素的产量，得出最佳培养基配方和发酵工艺 参数。 1 纳他霉索检测方法的确定 2 菌种的活化、筛选和保藏 3 菌种生产性能的初步研究 4 各种发酵条件的研究 5 培养参数优化 材奉 与方法 材料与方法 一、实验材料 ( 一) 菌种 出发菌株：褐黄孢链霉索菌s t r e p t o m y c e s g i l v o s p o r e u s ，j c m 4 7 9 5 ( 二) 实验药品 m a l te x t r a c t生化试剂 大豆蛋白胨生化试剂 酵母浸粉生化试剂 酵母浸膏生化试剂 胰蛋白胨生化试剂 蛋白陈生化试荆 木糖生化试剂 葡聚糖生化试剂 麦芽糖生化试剂 牛肉膏生化试剂 琼脂生化试剂 果糖生化试剂 可溶性淀粉分析纯 乳糖分析纯 糊精分析纯 葡萄糖分析纯 甘油分析纯 北京惠泽奥公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京奥博星生物技术责任有限公司 北京奥搏星生物技术责任有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 上海生化制药厂 北京化学试剂公司 北京化工厂 上海化学试剂批发市场 中国医药公司北京分公司 四川省彭县军乐化工厂 沈阳化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 沈阳农业大学硕士学位论文 蔗糖 氯化钠 氢氧化钠 柠檬酸三钠 硫酸亚铁 亚铁氰化钾 乙酸锌 铬酸钾 五水硫酸铜 盐酸 甲醇 冰乙酸 硫酸链霉素 霉克 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 ( 三) 实验仪器 h z q - f 全温振荡培养箱 超净工作台 t g l - 1 6 c 台式离心机 电热恒温培养箱 电子分析天平 p h 计 恒温振荡器 数显恒温水浴锅 玻璃仪器气流烘干器 光学显微镜 沈阳试剂三厂 沈阳沈一精细化学品有限公司 沈阳化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 沈阳试剂厂 沈阳试剂三厂 沈阳试剂厂 沈阳试剂厂 沈阳试剂三厂 沈阳化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 沈阳化学试剂厂 上海生化制药厂 江苏昆山索亚特有限公司 哈尔滨东明医疗仪器厂 苏州安泰空气技术有限公司设备厂 上海安亭科学仪器厂 南京电器三厂 北京赛多利斯天平有限公司 上海理达仪器厂 常州国华电器有限公司 常州国华电器有限公司 河南巩县英峪仪器厂 美国尼康( 中国) 有限公司 材料与方法 数显电热鼓风干燥箱上海泸南科学仪器有限公司 低温冰箱青岛海尔电器有限公司 电子万用炉北京永光明医疗仪器厂 压力蒸汽灭菌器上海博迅实业有限公司 超声波清洗器北京谱析通用仪器有限公司 紫外分光光度计日本日立仪器有限公司 u v - 1 1 0 0 型紫外分光光度计北京瑞丽分析仪器公司 微量进样器法国 紫外诱变箱实验室自制 ( 四) 主要培养基 液体活化培养基( g 几) ：葡萄糖2 0 ，蛋白胨5 ，酵母浸粉l o ，麦芽浸粉1 0 ， p h 7 3 斜面保藏培养基( g ，l ) ：酵母浸粉2 0 ，可溶性淀粉1 0 ，琼脂1 5 ，p h7 3 平板分离培养基( g 几) ：葡萄糖1 5 ，蛋白胨5 ，酵母浸粉3 ，麦芽浸粉3 ， 琼脂1 5 ，p h7 5 种子培养基( g ，l ) ；葡萄糖2 0 。大豆蛋白胨6 ，酵母浸粉6 ，n a c l1 0 ，p h 7 3 发酵培养基( g l h 大豆蛋白胨2 0 ，酵母浸粉4 5 ，p h 7 5 葡萄糖( 5 0 葡萄糖单独灭菌) 4 0 敏感菌活化培养基( g l ) ：( y d p a 培养基) 葡萄糖2 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母粉 1 0 ，p h 6 0 敏感菌斜面保存培养基( g l ) ：葡萄糖2 0 ，蛋白胨2 0 ，酵母粉1 0 ，琼脂1 5 ， p h 6 0 生物鉴定培养基( g l ) ：上层：y d p a 培养基添加1 5 的琼脂，p h 6 0 下层：琼脂粉1 5 生孢培养基( g ，l ) ：牛肉浸膏1 0 ，酵母浸膏1 0 ，胰胨2 0 ，葡萄糖1 0 ，硫 沈阳农业大学硕士学位论文 酸亚铁痕量。琼脂1 5 0 ，p h 7 5 高氏培养基( g ，l ) ：硝酸钾1 0 ，磷酸氢二钾o 5 ，氯化钠0 5 ，硫酸镁0 5 ， 硫酸亚铁0 0 1 。可溶性淀粉2 0 ，琼脂1 5 ，p h7 5 麦芽汁培养基( g ，l ) ：葡萄糖4 ，酵母浸膏4 ，c a c 0 32 ，琼脂1 5 ，麦芽 汁7b x o1 l ，p n7 5 以上培养基灭菌条件：1 2 1 ，灭菌1 5 - 2 0 m i n 。 二、实验方法 ( 一) 纳他霉素分析方法 1 生物检测法对纳他霉素产量的测定 1 ) 敏感菌悬液的制备 取一环敏感菌接种于装有5 0 m l ，活化培养基的2 5 0 m l 三角瓶中，回转 式摇床1 8 0 r m i n ，2 9 c 培养4 8 h ，使敏感菌液浓度达到1 0 8 个，m l ( 血球计 数板计数) 。 2 ) 样品溶液的处理 取1 0 m l 发酵液，在振荡器上充分振荡后离心( 1 0 0 0 0 r m i n ，2 0 m i n ) 除 去链霉菌菌丝体，所得上清液即为待测液。做二剂量管碟生物检测时，需要 适当稀释，使其在检测范围内。 3 ) 双层检测平板的制备 下层：将敏感菌下层的培养基融化，每个平皿倒入1 0 m l 使之冷凝，在 此平板上对角放上四个无菌牛津杯( 两牛津杯之间距离要足够远) 。 上层：将敏感菌上层培养基融化，待冷却到5 0 c 左右时，用无菌吸管 吸取敏感菌液( s t 球计数大约在1 0 8 个m l ) 以l ：l o 的比例加入到上层培 养基中混匀，迅速吸取1 0 m l 铺于己制备好的下层培养基上。待冷凝后，将 牛津杯取出。 2 材料与方法 4 ) 发酵液中纳他霉素含量的测定 在每个平板的对角两个牛津杯孔中，用微量取样器分别滴加3 0ul 高浓 度及低浓度的标准品溶液，其余两个成对角位置的两个牛津杯孔中分别滴加 3 0ul 相应的高、低两种浓度的供试样品。2 9 3 2 恒温培养2 4 h ，测定抑菌圈 大小，与标准曲线对照并求得其含量。 5 ) 标准曲线的制备 准确称取0 0 1 9 n a t a m y c i n ，用无菌发酵培养基溶解后转移到1 0 0 0 m l 容 量瓶中再定容至1 0 0 0 r a l ，配成纳他霉素浓度为l o m g & , 的标准使用液，根 据具体实验进行稀释，作出不同浓度标准溶液。按照4 ) ，5 ) 两步骤进行实 验，结果得到不同的抑菌圈，由此可测得纳他霉素生物效价的标准曲线。 2 紫外分光光度计法检测纳他霉素的含量 1 ) 提取试剂的确定：在用紫外分光度计测定之前，对纳他霉素发酵液 进行预处理。根据纳他霉素在相关溶剂中溶解度( 表1 1 ) 和相关文献报道 【7 l 【4 2 l ，试验以下几种提取试剂：( 1 ) 甲醇( p h 6 8 ) ；( 2 ) 冰乙酸+ 水( 5 + 4 0 ) ： ( 3 ) 甲醇+ 水+ 冰乙酸( 6 0 ：4 0 ：5 ) ；( 4 ) 甲醇+ o 1 冰乙酸( p h 4 4 ) ；( 5 ) 甲醇 + l 冰乙酸( p h3 4 ) ，( 6 ) 甲醇+ 5 冰乙酸( p h2 7 ) ，( 7 ) 甲醇+ 1 0 冰乙 酸( p h 23 ) 。 2 ) 样品的预处理：取l m l 纳他霉素发酵液，加入9 m l 5 冰醋酸甲醇 溶剂，在振荡器上充分振荡后离心( 5 0 0 0 r m i n ，2 0 m i n ) 除去菌丝体，取l m l 上清液，用5 冰醋酸甲醇溶液进行适当稀释后高速离心( 1 0 0 0 0 r m i n ， 2 0 r n i n ) ，所得上清液即为待测液。 3 ) 标准曲线的制备：吸取n a t a m y c i n 标准使用液( 1 0 m g l ) 1 0 、2 0 、 3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 o m l 分别置于i o r a l 具塞比色管中，加培养基定 溶至l o m l 即得到i m g k ，2m g ，l ，3m g l ，4m g ，l ，5m 班，6m 班，7m g l ， 8m g ，l 的标准系列。取标准系列l m l 加入9 m l 5 冰醋酸甲醇溶剂进行提取， 在振荡器上充分振荡后高速离心( 1 0 0 0 0 r m i n ，2 0 r a i n ) ，所得梯度处理液各 沈阳农业大学硕士学位论文 分为两部分，一部分进行紫外扫描得扫描图谱，另部分在波长3 0 3 n m 处进 行紫外测定。以各标准系列的浓度为横坐标，3 0 3 n m 处的吸光度a 为纵坐标， 绘制吸光度a 与浓度c 的关系曲线，制得标准曲线。 4 ) 定性与定量测量：处理好的发酵液在波长2 0 0 3 5 0 n m 范围内进行波 长扫描，将图谱与纳他霉素的紫外扫描图谱进行对照。在3 0 3 n m 处测定其吸 收峰值，根据3 0 3 n m 处的吸光度值及所做出的标准曲线进行定量。 ( 二) 菌种性能的研究方法 1 菌种活化 从安瓿管中接一环于装有5 0 m l 液体活化培养基的2 5 0 m l 三角瓶中，2 9 ，1 8 0 r m i n 振荡培养2 d ，涂布于平板分离培养基上，2 9 c 恒温培养7 d ， 转接于保藏斜面，2 9 ( 2 恒温培养7 d ，待斜面完全被孢子覆盖后，冰箱( 4 ) 保存备用。 2 孢子悬浮液的制备与孢子计数 用适量无菌水洗下琼脂斜面上生长旺盛的孢子，将孢子悬液置于装有有 机玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，使孢子均匀分散，在光学显微镜下观察孢 子，稀释平板法进行计数，使每次制各的孢子悬浮液浓度达到1 0 8 个m l 。 3 敏感菌液的制备 如( 一) 1 1 ) 中所述。 4 琼脂块法分离纯化菌种3 i ) 孢子悬浮液的制备：按( - - ) 2 中的方法制各孢子悬液。 2 ) 单菌落培养 吸取o 2 m l 孢子悬浮液涂布于铺有15 m l 分离培养基的平板上，连涂3 块