（食品科学专业论文）黑曲霉酸性α淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得金胆王些太堂 或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：名铽蠢靶 签字日期：加1 1 年4 月弼日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解金壁工些太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权金胆王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：籀著蒜 签字e t 期：1 1 年年月砑日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 需胁 签字e t 期：2 0 1 1 年4 月西1 3 电话： 邮编： 致谢 时光匆匆而逝，近三年的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上， 回首往昔，经历过的所有酸甜苦辣都已成为丝丝美好的回忆，心中有着太多的 不舍与眷恋，但更多的是无尽的感激，因为在这期间，我得到了许多让我铭记 在心的关怀与帮助，值此毕业论文完成之际，我谨向所有关心、，帮助过我的人 表示最诚挚的感谢与最美好的祝愿。 衷心感谢我的导师曾庆梅教授。本研究是在曾老师的悉心指导下完成的， 从论文的选题、实验方案的设计到论文的成稿，每一步都凝聚着曾老师的心血。 曾老师渊博的知识、严谨的科研作风和亲切、豁达的情怀，是我做人和治学的 楷模。曾老师在生活上和思想上给我的帮助和指导更是让我铭记在心，不敢忘 怀。 近三年来，潘见教授严谨的治学态度、广博的学问和犀利的见解使我在研 究中得到很多启发。谢慧明老师、袁传勋老师、张文成老师、陈彦老师、杨毅 老师、惠爱玲老师、甘昌胜老师等同样给予我很多的指导，在此向这些老师表 示衷心的感谢。 感谢张冬冬、韩抒、李志强、司文攻、靳靖、吴聪、黄博英等同学在实验 过程中给予我无私的帮助，与他们愉快的合作及交流使我受益匪浅。 感谢我的室友孟玲玲、汤忠和邱静同学在生活上给予我的关怀，怀念我们 在一起度过的美好时光。 感谢母校合肥工业大学和农产品生物化工教育部工程研究中心给我提供的 优良的科研条件和良好的科研氛围，让我度过了三年繁忙而充实的学习生活。 感谢我的父亲和母亲，他们的养育之恩和殷切希望，是我前进的力量之源。 最后，感谢国家自然科学基金项目( 3 0 8 7 1 7 3 9 ，3 1 0 7 1 5 5 6 ) 和安徽省教育 厅重点科研项目( k j 2 0 0 7 a 0 9 9 ) 提供的资金支持。 作者：魏春燕 2 0 1 1 年0 4 月2 1 日 黑曲霉酸性伍淀粉酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达 摘要 酸性a 淀粉酶的最适作用p h 范围为4 5 ，在酸性条件下保持高活性，可以 满足酸性条件下淀粉原料深加工工艺的要求，具有较大的应用前景。本论文从 黑曲霉中将编码酸性a 一淀粉酶的基因克隆并实现了将其在毕赤酵母s m d l1 6 8 中的高效分泌表达，并测定了重组酶的酶学性质。 以黑曲霉基因组d n a 为模板，p c r 扩增出酸性a 淀粉酶的结构基因，将 此基因插入载体p p i c 9 k ，构建表达载体p p i c 9 k a s a a ，并转化毕赤酵母 s m d l l 6 8 ，通过g 4 1 8 平板筛选高拷贝转化子，转化子表型为h i s + m u t + 。 在毕赤酵母a f a c t o r 及a o x l 基因启动子和终止信号的调控下，酸性a 一 淀粉酶大量表达并分泌到胞外。根据单因素试验结果，确定最佳诱导条件为： 甲醇浓度2 ，诱导p h 6 0 ，诱导温度2 8 ，诱导时间1 6 8h 。在此条件下， 发酵上清液中重组酶活可达3 2 4 8u m l 。在同等发酵时间7 2h 下，重组毕赤酵 母酸性a 淀粉酶酶活是黑曲霉原始菌株的4 6 倍。 s d s p a g e 结果显示重组酶的分子量为5 8k d a 。酶的最适反应p h 为4 0 ， 在p h 3 0 6 0 之间酶活力基本保持稳定，最适反应温度为7 0 ，在工业生产常 用温度5 0 下，该酶能够长时间保持稳定，并具有较高的酶活力。 关键词：黑曲霉；酸性a 一淀粉酶；p p i c 9 k ：毕赤酵母s m d l l 6 8 c l o n i n go ft h eg e n ee n c o d i n ga c i d s t a b l ea l p h a a m y l a s e f r o m a s p e r g i l l u sn i g e ra n d i t se x p r e s s i o ni np i c h i ap a s t o r i s a b s t r a c t t h eo p t i m u mp hr a n g eo fa c i d s t a b l ea l p h a - a m y l a s ei s4 - 5 ，t h ea m y l a s ea c t sh i g h a c t i v i t yi na c i d i cc o n d i t i o n s ，c a r lw o r k i ns o m es t a r c hd e e pp r o c e s s i n go fr a wm a t e r i a l s ，s o i th a sw i d e l ya p p l i c a t i o np r o s p e c t i nt h i ss t u d y ，w ee x p r e s s e da c i d s t a b l ea l p h a a m y l a s e f r o ma s p e r g i l l u sn i g e ri np i c h i ap a s t o r i ss m d 116 8w i t hh i g ha c t i v i t y ，a n ds t u d yt h e c h a r a c t e r i z a t i o no fr e c o m b i n a n ta m y l a s ee n z y m a t i c t h eg e n eo fa c i d s t a b l ea l p h a - a n l y l a s ew a sa m p l i f i e db yp c ru s i n ga s p e r g i l l u sn i g e r g e n o m i cd n aa st e m p l a t e ，t h e nt h eg e n ew a sc l o n e di n t ot h ev e c t o ro fp p i c 9 k ，t h e r e c o m b i n a n tv e c t o rp p i c 9 k - a s a aw a sc o n s t r u c t e da n dt h e nt r a n s f o r m e di n t op i c h i a p a s t o r i ss m d 116 8 ，h i g hc o p yt r a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e di ng 418p l a t e s ，a n dp h e n o t y p e w a sh i s + m u t + r e g u l a t e db yt h e 仅一f a c t o r , p r o m o t e ro fa o x lg e n ea n dt e r m i n a t i o ns i g n a lo fy e a s t g e n o m i c ，t h er e c o m b i n a n ta m y l a s ew a se x p r e s s e da n de x c r e t e do u to ft h ec e l l s a c c o r d i n g t o s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n tr e s u l t s ，o p t i m a l i n d u c t i o nc o n d i t i o n sw e r em e t h a n o l c o n c e n t r a t i o n s2 ，i n d u c t i o np h 6 0 ，i n d u c t i o nt e m p e r a t u r e2 8 ，i n d u c t i o nt i m e16 8h i nt h e s ec o n d i t i o n s ，f e r m e n t a t i o ns u p e m a t a n tf l u i di nr e s t r u c t u r i n ge n z y m e sl i v i n gc a n r e a c h3 2 4 8u m l u n d e rt h es a m ef e r m e n t a t i o nt i m e7 2h ，t h ea c t i v i t yo fa c i d s t a b l e a l p h a - a m y l a s ef r o mr e c o m b i n a n t p i c h i ap a s t o r i sw a s4 6t i m e st h a to fa s p e r g i l l u sn i g e r s d s p a g ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h er e c o m b i n a n ta m y l a s e w a sa b o u t5 8k d a t h er e c o m b i n a n ta m y l a s ee x h i b i t e dm a x i m a la c t i v i t ya tp h 4 0a n d7 0 ，t h ea m y l a s ew a sb a s i c a l l ys t a b l ea tt h ep hr a n g i n gf r o m3 0t o6 0 ，a n dk e p ts t a b l ef o r a l o n gt i m ea n dw i t hah i g hl e v e lo fa c t i v i t ya tc o m i l l o ni n d u s t r i a lt e m p e r a t u r e5 0 k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；a c i d s t a b l ea l p h a a m y l a s e ；p p i c 9 k ；p i c h i ap a s t o r i s s m d l l6 8 第一章 1 1 1 2 1 3 1 4 第二章 2 1 2 2 2 3 2 4 第三章 3 1 3 2 目录 前言1 问题的提出1 课题来源l 国内外研究进展l 1 3 1 酸性a 淀粉酶研究进展1 1 3 2 毕赤酵母表达系统研究进展6 课题研究内容8 黑曲霉酸性伍淀粉酶基因的克隆1 0 实验材料1 0 2 1 1 菌株1 0 2 1 2 培养基1 0 2 1 3 实验主要试剂l o 2 1 4 实验仪器1 1 实验方法1 l 2 2 1 黑曲霉基因组d n a 的提取1 1 2 2 2p c r 引物设计1 2 2 2 3p c r 扩增1 3 2 2 4 目的基因测序1 3 结果与分析1 5 2 3 1 电泳检测黑曲霉基因组d n a 1 5 2 3 2 电泳检测p c r 结果1 5 2 3 3 连接t 载体。1 6 2 3 4 阳性转化子筛选结果1 6 2 3 5 酶切验证结果1 6 2 - 3 6 测序结果1 7 小结1 8 毕赤酵母表达载体的构建1 9 实验材料1 9 3 1 1 质粒1 9 3 1 2 实验主要试剂1 9 3 1 3 实验仪器1 9 实验方法1 9 3 2 1 毕赤酵母表达载体构建流程1 9 3 2 2p m d l 8 t - a s a a 与p p i c 9 k 酶切2 0 第 第 3 2 3a s a a 与p p i c 9 k 大片段连接2 0 3 2 4 质粒克隆2 0 3 2 5 质粒提取2 0 3 2 6 质粒酶切验证j 2 0 3 3 结果与分析2 0 3 3 1 表达载体p p i c 9 k a s a a 结构示意图2 0 3 3 2 电泳检测p p i c 9 k a s a a 酶切结果：2 l 3 4 小结2 2 四章重组质粒的转化及筛选2 3 4 1 实验材料2 3 4 1 1 菌株2 3 4 1 2 培养基2 3 4 1 3 实验主要试剂2 3 4 1 4 实验仪器2 4 4 2 实验方法2 4 4 2 1 表达载体线性化2 4 4 2 2 毕赤酵母转化2 4 4 2 3 转化子表型鉴定2 5 4 2 4 高拷贝转化子筛选2 5 4 2 5 毕赤酵母基因组提取2 5 4 2 6 转化子p c r 鉴定2 5 4 3 结果与分析j 2 6 4 3 1 转化子表型鉴定2 6 4 3 2 高拷贝转化子筛选2 6 4 3 3 转化子的p c r 鉴定- 2 6 4 4d 、结2 7 五章重组毕赤酵母的诱导表达2 8 5 1 实验材料2 8 5 1 1 培养基2 8 5 1 2 实验主要试剂2 8 5 1 3 实验仪器2 9 5 2 实验方法2 9 5 2 1 酸性仅淀粉酶酶活测定方法2 9 5 2 2 重组毕赤酵母的诱导方法2 9 5 2 3 重组毕赤酵母的诱导条件优化2 9 5 2 4 重组毕赤酵母的遗传稳定性研究3 0 5 3 结果与分析3 0 5 3 1 高表达转化子筛选3 0 5 3 2 重组酸性a 淀粉酶最佳诱导条件3 1 5 3 3 重组毕赤酵母的遗传稳定性研究3 3 5 4 小结3 4 第六章重组毕赤酵母表达产物的分析3 5 6 1 实验材料3 5 6 1 1 实验主要试剂3 5 6 1 2 实验仪器3 6 6 2 实验方法3 6 6 2 1 粗酶液的制备3 6 6 2 2 重组酸性a 淀粉酶酶活测定方法3 6 6 2 3 重组酸性a 淀粉酶分子量测定3 6 6 2 4 重组酸性a 淀粉酶最适反应条件测定j 3 7 6 2 5 重组酸性a 淀粉酶稳定性测定3 7 6 3 结果与分析3 7 6 3 1 重组酸性a 一淀粉酶分子量3 7 6 3 2 重组酸性a 淀粉酶最适反应条件3 9 6 3 3 重组酸性( i t 淀粉酶稳定性4 0 6 4d 、结4 1 第七章结论与展望4 2 7 1 结论4 2 7 2 展望4 2 参考文献4 3 _ 行录4 7 插图清单 图1 1 重组质粒插入3 a o x l 7 图1 2a o x l 位点的基因被取代7 图1 3 质粒插入形成双拷贝h i s 4 h i s 4 基因8 图1 4 多拷贝插入8 图2 。lp p i c 9 k 载体结构示意图：1 2 图2 2p m d l 8 t 载体结构示意图1 3 图2 3p m d l 8 t - a s a a 载体构建示意图1 4 图2 4 黑曲霉基因组d n a 琼脂糖凝胶电泳1 5 图2 5p c r 产物琼脂糖凝胶电泳1 5 图2 6p m d l 8 t - a s a a 琼脂糖凝胶电泳1 6 图2 7 蓝白斑筛选1 6 图2 8p m d 18 t a s a a 酶切琼脂糖凝胶电泳1 7 图2 9b l a s t 结果1 7 图3 1 表达载体p p i c 9 k a s a a 构建示意图2 0 图3 2 表达载体p p i c 9 k a s a a 结构示意图2 l 图3 3p p i c 9 k 酶切、p p i c 9 k a s a a 及酶切琼脂糖凝胶电泳2 1 图4 1 重组酵母基因组d n a 的p c r 鉴定2 6 图5 1 高表达转化子筛选结果3 0 图5 2 甲醇浓度对酸性a 淀粉酶活力影响3 1 图5 3 诱导p h 对酸性伍淀粉酶活力影响一3 1 图5 4 诱导温度对酸性a 一淀粉酶活力影响一3 2 图5 5 诱导时间对酸性a 淀粉酶活力影响3 2 图6 1s d s p a g e 标准曲线3 7 图6 2 酸性a 淀粉酶基因在毕赤酵母中表达的s d s p a g e 3 8 图6 3 重组酸性a 淀粉酶分子量预测结果3 8 图6 4 重组酸性a 淀粉酶糖基化位点分析3 9 图6 5 重组酸性0 【淀粉酶的最适反应p h 3 9 图6 - 6 酸性仅淀粉酶的最适反应温度4 0 图6 7 酸性a 淀粉酶的p h 稳定性4 0 图6 8 酸性a 淀粉酶的温度稳定性4 l 表格清单 表1 1 些国家的酸性a 淀粉酶菌种2 表1 2 黑曲霉酸性仅淀粉酶的酸稳定性2 表1 3 黑曲霉酸性a 淀粉酶的热稳定性3 表2 1 实验试剂l o 表2 2 实验仪器l l 表3 1 实验试剂1 9 表3 2 实验仪器1 9 表4 1 实验试剂2 3 表4 2 实验仪器2 4 表4 3g 418 梯度平板筛选结果2 6 表5 1 实验试剂2 8 表5 2 实验仪器一2 9 表5 3 重组毕赤酵母的遗传稳定性试验结果3 3 表6 1 实验试剂3 5 表6 2 实验仪器3 6 第一章前言 1 1 问题的提出 a 淀粉酶酶学编号为e c 3 2 2 1 ，即能够从淀粉分子内部随机切开a 一1 ，4 糖 苷键，起液化作用的一类酶。a 淀粉酶占整个酶制剂市场份额的2 5 左右，它 在粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业中被大量应用。 我国的淀粉资源( 如玉米、薯类等) 非常丰富，相应产生的淀粉深加工行 业非常壮大。在这个行业中，淀粉的液化和糖化过程是关系到生产成本的主要 问题。为降低成本，大多数情况下采用淀粉酶和糖化酶协同处理淀粉原料的方 法，但这种方法存在一个明显缺陷，糖化酶作用最适p h 约为4 ，中温和高温0 【- 淀粉酶作为国内外市场最常用的两种淀粉酶，其适用p h 范围为6 7 ，在p h 4 以下 容易失去活性，因此不能与糖化酶协同处理淀粉原料。而酸性a 淀粉酶的最适 作用p h 范围为4 5 ，在酸性条件下可以保持高活性，可满足此方法的要求。另 外，酸性a 淀粉酶还可用于其他领域，如纺织品退浆、高麦芽糖浆生产、新型 助消化剂开发以及工业废液处理等，因此具有较大的应用前景。 黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 是中国、日本、韩国、尼日利亚及欧洲的酸性a - 淀粉酶工业生产菌种。日本的y a s u j im i n o d a ，m o t o oa r a i 等研究者对来源于黑 曲霉的酸性a 淀粉酶进行酸稳定性的研究，发现该酶酸稳定性良好【l 】。我国对 酸性o l 淀粉酶的研究相对国外较晚，产酶菌株的酶活也有待提高。 本课题克隆黑曲霉的酸性a 淀粉酶基因，转化毕赤酵母，筛选多拷贝转化 子，并利用毕赤酵母表达载体的强诱导型启动子a o x l ，高效表达酸性0 【淀粉酶， 可为该酶的大规模制备及后续的工业化应用奠定基础。 1 2 课题来源 自拟项目。得到了国家自然科学基金项目( 3 0 8 7 17 3 9 ，31 0 7 1 5 5 6 ) 和安徽 省教育厅重点科研项目( k j 2 0 0 7 a 0 9 9 ) 的资金支持。 1 3 国内外研究进展 1 。3 1 酸性位淀粉酶研究进展 ， 1 3 1 1 酸性a 淀粉酶主要产酶菌种 目前应用于工业领域的酸性a 淀粉酶主要来源于微生物中的芽孢杆菌和曲 霉2 1 ，较为熟知的有b a e i d o c a l d a r i u s a 2 【3 】_ ，b a c i d o c a l d a r i u s a t c c 2 7 0 9 4 1 ， b 1 i c h e n i f o r m f s 【5 】，b d o c a l d a ，f “j 1 0 1 【6 】，a a c f 咖c 口，如，f “s 【7 1 ，a n i g e r t 8 】， a c i n n a m 伽口“s ，a k a w a c h i i 9 1 ，t 1 a n u g i n o s u s t l 们，b s t e o r o t h e r m o p i l i u s 1 1 】等等。 而来源于不同菌株的酸性a 淀粉酶的性质并不相同，它们在耐酸性、耐热性及 淀粉的水解程度等方面均有差异。 一些国家的酸性a 淀粉酶菌种见表1 1 。 表1 1 一些国家的酸性q 淀粉酶菌种 t a b 1 1s t r a i n so fa c i d s t a b l ea l p h a - a m y l a s ef r o ms o m ec o u n t r i e s 国家 酸性a 淀粉酶菌种最适p h 最适温度 。 b a c i d o c a l d a r i u s l 0 4 1 a 4 56 0 6 3 慝大利 a c i d o c a l d a r i u $ 1 0 13 5 7 5 一 b a c i d o c a l d a r i u sa 2 3 5 7 0 b a c i d o c a i d a ，- i “s11 2 2 06 5 日本 韩国 美国 尼日利亚 欧洲 印度 中国 b 1 i c h e n i f o r m i sf e r m b p - 4 4 9 0 a n i g e r 彳妇w a c h i i a n i g e r 占a e i d o c a l d a r i u sa t c c 2 7 0 0 9 彳n i g e r 4 n i g e r b g l o b i s p o r u s 彳n i g e r b s t e o r o t h e r m o p i l i u s b s t e o r o t h e r m o p i l i u $ t 1 a m u g i n o s u s 4 0 5 5 4 0 5 5 4 0 5 5 4 o 3 o 4 0 5 5 3 5 4 o 4 0 5 0 4 5 4 5 5 0 9 0 “o 4 0 5 5 6 0 7 5 6 5 - 7 0 5 0 6 0 6 0 6 5 届1 l c e 以l t o r m l 5 _ _ - _ - _ - - _ _ _ _ - 一- - j _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - - _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ - - _ - _ _ - _ _ _ - - _ _ _ _ _ - - 。“。一 1 3 1 2 酸性a 淀粉酶特性 ( 1 ) 酸性a 淀粉酶的耐酸性 据报道，中性a 淀粉酶的最适p h 范围为6 7 ，而酸性a - 淀粉酶为4 5 ，后 者的酸稳定性明显的高于前者。在早期的研究中，日本的研究者，如y a s u j i m i n o d a ，m o t 0 0a r a i 等对来源于黑曲霉的两种0 t - 淀粉酶进行了比较i t 2 】。 由表1 2 可知，酸性a 淀粉酶在p h l 8 时，残余酶活为5 8 ；在p h 2 2 时， 残余酶活为8 7 ；p h 3 0 时，残余酶活为9 5 。中性a 淀粉酶在p h 2 2 时即完 全失活；在p h 3 0 时，酶活仅剩4 ：在p h 4 0 时，残余酶活为4 2 。由此可 见，酸性a 淀粉酶的酸稳定性明显的高于中性0 【淀粉酶。 表1 2 黑曲霉酸性a 淀粉酶的酸稳定性 t a b 1 - 2a c i ds t a b i l i t yo fa c i d - s t a b l ea l p h a - a m y l a s ef r o ma s p e r g i l l u sn i g e r 。 酸性旺淀粉酶 中性洳淀粉酶 p h 酶活( ) 酶活( ) 1 4 l0 1 85 8 0 2 2 8 70 3 09 5 4 3 4l o o 7 4 0l o o 4 2 5 01 0 0 1 0 0 6 01 0 0 1 0 0 6 41 0 0 1 0 0 7 09 3 1 0 0 7 43 0 1 0 0 8 28 9 8 9 2 57 9 2 ( 2 ) 酸性a 淀粉酶的耐热性 据报道，酸性a 淀粉酶的热稳定性明显高于中性a 淀粉酶。日本的y a s u j i m i n o d a 等研究者对来源于黑曲霉的两种a 淀粉酶进行了热稳定性的研究( 见 表1 3 ) 1 3 ，1 4 】。在6 0 时，中性淀粉酶已完全失活，而酸性淀粉酶仍然保留 8 8 的酶活。 表1 - 3 黑曲霉酸性a 淀粉酶的热稳定性 坠鱼：! ：i ! 垒曼墅型塑曼迪zq ! 塑i 亟地! 皇型2 坠鲤丑璺璺曼塑尘塑星堡型坐丝堑 温度c 絮。麓譬 中性a 淀粉酶 酶活( ) 1 3 1 3 酸性a 淀粉酶耐酸机理 酸性a 淀粉酶为何在强酸性环境中保持高活性是个值得探讨的问题。酸性 a 淀粉酶的酸性和碱性氨基酸的含量比中性a 淀粉酶少了3 0 。因此研究者推 测酸性a 淀粉酶的耐酸性与其在酸性条件下的带电性有关。酸性条件下，p h 低于酶蛋白的等电点，其碱性氨基酸残基带正电荷，大量正电荷相互排斥导致 酶蛋白结构展开，从而影响催化中心的活性。而酸性a 淀粉酶的酸性和碱性氨 基酸的含量非常低，在酸性条件下带电量较小，p h 的变化对酶活的影响不大i 所以带电氨基酸的含量较低可能是酸性a 淀粉酶具有酸稳定性的原因i l 引。 酸性0 【淀粉酶c 端的一段氨基酸序列富含苏氨酸( t h r ) 和丝氨酸( s e r ) ，故这 段序列称为t s 区域。这被认为是酸性a 淀粉酶的特征性结构【l6 1 。t s 区域及下 游序列是酸性0 t 淀粉酶的生淀粉吸附位点，去掉t s 区域及下游序列之后，酸 性0 【淀粉酶仍然具有耐酸性，但不能水解淀粉【l 。 所以，我们推测带电氨基酸的含量较低以及t s 区域及下游序列的存在， 是酸性a 淀粉酶具有酸稳定性的基础。 1 3 1 4 获得酸性伍。淀粉酶高产菌株的措施 ( 1 ) 野生菌株的筛选和诱变 产酸性a 一淀粉酶的菌种一般可以从酒曲、酒糟、醋醅中筛选得到。许多研 究表明，通过物理因子( 紫外线、微波、激光、x 一射线、丫射线、快中子、离子 注入等) 、化学因子( 烷化剂、碱基类似物、脱氨剂、移码诱变剂、羟化剂、金 属盐类等) 单独或复合诱变选育高活力菌株是一种切实可行的方法，至今仍被广 泛应用。 3 国外的研究者开展工作较早。日本的久留岛通俊等研究者利用紫外线诱变 处理肉挂色曲霉，使其酸性a 淀粉酶的活性比原菌株提高了6 倍。欧洲的研究者 对黑曲霉进行复合诱变处理，改变了其产酶路径，使其不能生产糖化酶和转移 酶，只能产生酸性i x 淀粉酶，从而提高了产量。 近年来国内也有人进行了研究。李勃【1 8 】等从酒曲中筛选得到1 株高产酸性 a 淀粉酶的黑曲霉，命名为t x 7 8 ，经过紫外线和亚硝基胍复合诱变，获得了遗 传稳定的高产菌株u n 7 8 3 5 8 ，其产酶量可以达到1 1 2 0u m l 。刘永乐【l9 】等从酒 糟中筛选得到1 株产酸性a 淀粉酶的黑曲霉，命名为a s y ，经过紫外线和甲基 磺酸乙酯的复合诱变法，获得了得到遗传稳定的高产菌株a s e u l l l ，其酸性a - 淀粉酶的酶活由野生株的6 4 3u g 提高至突变株的1 9 8 8u g 。谷海先【2 0 1 等采用 淀粉和p h 4 0 的缓冲溶液制成平板筛子，从醋醅中筛选得到一株产酸性a 淀粉酶 的菌株，其最适作用p h 为5 0 ，最适作用温度为7 0 。在p h 4 0 时酸性a 淀粉酶 酶活力是最高酶活力的8 6 8 。在5 0 下，酸性0 【一淀粉酶在p h 4 6 以下的酸性条 件下基本保持不失活，具有较好的耐酸性，但他们未对该菌株进行鉴定。胡欣 洁【2 l 】等从醋醅中筛选得到一株产酸性a 淀粉酶的菌株，鉴定为水生假丝酵母 ( c a n d i d aa q u a t i c a ) ，命名为a s a 1 ，对其进行紫外、硫酸二乙酯复合诱变，获 得了产酶更高的a s a u d 8 6 菌株，酶活达到了1 4 6u g 。 ( 2 ) 培养基优化 工业生产使用的培养基应遵循几个原则，即来源丰富、价格低廉、质量稳 定。对某一个微生物和产品来说，需要经过一系列实验的摸索，才能确定一种 既有利于微生物的生长，又能保证得到高产的、优质的、较为理想的培养基配 方【2 2 1 。 g c u g u r u 2 3 】等对马铃薯皮做碳源的液体培养基进行优化，得到黑曲霉产 酸性a 淀粉酶最佳培养条件，该条件下酸性a 淀粉酶最适作用温度和p h 分别为 7 0 和5 5 。m a b e ls a l a sh e r n a n d e z t 2 4 1 等用响应面法对添加了其他原料的啤酒 厂废水及肉制品加工厂废水培养基进行优化，得到黑曲霉u o 1 产酸性0 【淀粉酶 最佳培养基。s d j e k r i f - d a k h m o u c - 。 2 s 等将生产废弃物桔皮粉碎作为黑曲霉 a t c c1 6 4 0 4 产酸性0 淀粉酶的主要原料，并添加淀粉、酵母提取物( 作为维生 素源) 、c a c l 2 、f e s 0 4 7 h 2 0 、m n s 0 4 和m g c l 2 6 h 2 0 进行统计设计，得到最 佳培养基。h i r o s h is h o j i 2 6 等比较葡萄糖、淀粉、带壳大麦、带壳粉碎的大麦 四种原料，得h t a s p e r g i l l u sk a w a c h i i n b r c 4 3 0 8 产酸性a 一淀粉酶的最佳培养基为 带壳大麦，酸性a 淀粉酶活性为7 7u m l 。 刘春莉【2 7 】等利用正交试验的方法对产酸性a 淀粉酶的白曲霉基因工程菌株 t r l 2 的发酵条件进行了研究，获得了最佳摇瓶发酵培养基配方：玉米粉4 、 玉米浆1 5 、黄豆粉2 、麸皮4 。并且用2l 的通气发酵罐进行了放大试验， 酶活可达到8 3 6u m l 。朱龙宝【2 8 】等采用b o x b e h n k e n 实验设计对黑曲霉产酸性 4 a 淀粉酶的培养基进行了优化，最佳培养条件为：7 6 麸皮、1 2 玉米淀粉、 1 0 5 豆饼、1 5 n h 4 c i 、料水比1 ：1 。黑曲霉在最佳培养基上3 0 时发酵7 2h ， 产酶达可1 9 8 4u g ，酸性0 【淀粉酶的最佳作用p h 4 4 5 。 ( 3 ) 基因工程技术 基因工程是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离或合成的基因经过 改造，插入载体中，导入宿主细胞，使其进行扩增和表达，从而获得大量的基 因产物，或者让生物表现出新的性状。国内外研究者利用基因工程技术对酸性 a 一淀粉酶做了大量研究工作。 日本的研究者【2 9 】为增加么k a w a c h i i 的酸性a 一淀粉酶的产量，将该酶基因克 隆到原菌株中，产酶能力提高了2 4 倍。美国的研究者将来源于b a c i d o c a l d a r i u s 的酸性a 淀粉酶基因分别在芽孢杆菌和乳酸杆菌中表达，获得了酸性a 淀粉酶 的高产。欧洲的研究者【3 0 】为提高b 1 i c h e n i f a r m i s 酸性0 【淀粉酶的热稳定性，利用 基因技术进行改造，改造方法改变原菌株氨基酸序列，即用其他任意一种氨基 酸来替代n 1 8 8 位的天冬氨酸残基，使其n 1 5 或n 1 9 7 位的蛋氨酸残基缺失。通过 改造得到的高产菌株所产生的a 淀粉酶最适p h 降低到了5 0 ，而且可在1 0 0 1 1 0 保持活性。 2 0 0 3 年，王海燕【3 1 】等人构建了酵母表达黑曲霉酸性a 淀粉酶的表达元件， 利用酵母醇脱氢酶( a d h l ) 的启动子和终止子，用酸性伍淀粉酶自身的信号肽序 列构建该元件，与黑曲霉糖化酶c d n a 的表达元件同时插入到酵母r d n a 序列引 导的同源整合的酵母y i p 型的表达载体p w h y 中，构建酸性a 淀粉酶与糖化酶双 基因表达的分泌载体p w a g 。并且采用了p w a g 与酵母y e p 型g 4 1 8 抗性表达质粒 的共转化，将两个基因表达元件整合到酿酒酵母菌株a s 2 3 4 6 的染色体r d n a 序 列中，获得了同时表达胞外酸性a 淀粉酶和糖化酶的双功能的酿酒酵母工程菌。 2 0 0 4 年，袁铁铮【3 2 】等人克隆酸热脂环酸杆菌a a c i d o c a l d a r i u s 的酸性a 淀粉酶基 因，将其分别克隆到了大肠杆菌e c o l i 表达载体p e t - 2 2 b ( + ) 和毕赤酵母户p a s t o r i s 表达载体p p i c 9 a ，并分别在大肠杆菌和毕赤酵母中得到了表达，两个系统的表 达产物都有酶活性。而且他们研究了毕赤酵母表达的a 淀粉酶的酶学性质，发 现其最适作用p h 为3 2 ，在p h2 5 。4 6 的范围内，酶活性可保持在5 0 以上，最 适作用温度为6 5 ，在7 0 下保温3 0m i n ，酶活性可维持在5 0 以上，基本 上保留了原菌株a 淀粉酶的耐热