（食品科学专业论文）姜汁凝乳机理的探讨.pdf

姜汁凝乳机理的探讨 食品科学专业 研究生曾剑超指导教师马力 姜汁凝乳俗名姜汁撞奶，用经生姜打浆榨取的姜汁，按照一定比例添加到 一定温度下的牛乳中可制得具有凝乳状态的姜汁凝乳。由于其凝乳具有香纯郁 浓，甜中微辣、风味独特等特点，逐渐成为了广大人群所接受并喜爱的甜品。 凝乳酶是干酪生产中使牛乳凝固的关键性酶。随着人们生活水平的逐渐提 高，干酪的生产和消费呈现一种日益上升的趋势，对凝乳酶的需求量逐渐增加。 基于我国干酪生产中所用的凝乳酶主要依靠从国外进口的现状，针对为制取凝 乳酶而大量屠杀小牛会造成生态破坏的矛盾，为了降低我国干酪生产的成本和 提高产品品质，本文对姜汁凝乳的机理进行探讨，旨在开发出一种新型的凝乳 酶，在乳制品工业中得到广泛应用。 本文首先对姜汁凝乳的制作方法和姜汁中的具有凝乳功能的物质成分进 行了研究。以姜汁添加量、冲浆温度、酸度和杀菌条件为影响因素进行了正交 试验，结果表明，姜汁凝乳的效果均受四个因素的影响，其中受温度的影响最 大、其次是姜汁添加量和酸度。采用硫酸铵盐析法、有机溶剂提取法和水蒸汽 蒸馏法分别提取了生姜中生姜蛋白酶粗提物、姜油树脂以及姜精油，在不同条 件下进行了凝乳试验，探讨生姜中的有效凝乳成分。试验结果表明，姜油树脂 和姜精油不能使牛乳凝固，而生姜蛋白酶提取物能使牛乳凝固。生姜蛋白酶粗 提物在1 0 - - - - 1 2 添加量下，7 0 冲浆时，凝乳效果最好，其凝乳完全，质地均 匀，坚实而无裂痕。 对在不同条件下生姜蛋白酶和皱胃酶的凝乳块中钙元素含量，乳清中的钙 元素含量和唾液酸的含量进行了测定，采用u r e a - p a g e 电泳进行分析。试验结 果表明，生姜蛋白酶和皱胃酶凝乳块中钙含量和乳清中唾液酸含量随酶液添加 量的增加而增大，其随温度、p h 值改变的变化趋势也是一致的。从而说明生姜 蛋白酶对酪蛋白作用和皱胃酶是相同的，生姜蛋白酶在一定条件下水解酪蛋白 胶束外围的k 一酪蛋白，使之失去对酪蛋白胶束的保护作用，进而使生成的副 k 一酪蛋白和暴露出来的q 。，一酪蛋白及b 一酪蛋白与c a 2 + 形成网状的凝胶体，使 牛乳凝固。 对生姜蛋白酶的性质进行了研究。试验结果表明生姜蛋白酶的活力均受温 度和p h 值的影响，其中最适温度和p h 分别为6 0 、6 5 0 。在4 0 以下和p h 值为5 0 - - 6 5 内，酶活力保持稳定。n a + 、c a 2 + 、f e 2 + 和a 1 3 + 对酶活力有促进作 用，而m 9 2 + 、b a 2 + 、z n 2 + 和c u 2 + 有抑制作用。同时与皱胃酶的性质进行比较，为 之在实践生产中的应用提供理论指导。 关键词：姜汁凝乳生姜蛋白酶凝乳酶牛乳酪蛋白 d i s c u s s i o no nt h em e c h a n i s mo fc u r dw i t hg i n g e rj u i c e f o o ds c i e n c e p o s t g r a d u a t ez e n g j i a n c h a o s u p e r v i s o r m al i c u r dw i t hg i n g e ri u i c ei sc a l l e dm i l kc u r dw i t hg i n g e rj u i c eh i t t i n gi nt h ec i v i l ， t h ec u r dw i t hg i n g e rj u i c ei sb a s e do i lt h em i x t u r eo f m i l ka tac e r t a i nt e m p e r a t u r e a n dg i n g e rj u i c ef r o mg i n g e r b e c a u c eo ft h ep u r ef l a v o r - d e n s e ，s w e e t y w i t h s p i c y ，u n i q u ef l a v o r ，i tb e c o m e sa k i n do fd e s s e r tw h i c hi sa c c e p t e db yt h em a j o r i t y o ft h ec r o w dg r a d u a l l y r e n n e ti sac r u c i a le n z y m ei nt h ep r o d u c t i o no f c h e e s e a st h ep e o p l e sl i v i n g s t a n d a r d si si m p r o v e dg r a d u a l l y ，t h e c h e e s ep r o d u c t i o na n dc o n s u m p t i o na r e s h o w i n gar i s i n gt r e n d ，t h ed e m a n df o rr e n n e ti si n c r e a s i n gg r a d u a l l y b a s e do nt h e s t a m st h a tt h er e n n e tr e l ym a i n l yo nt h ei m p o r t sf r o ma b r o a d ，f o rt h ec o n f l i c t b e t w e e nt h ep r o d u c t i o no fc u r dw i t hk i l l i n go f t h em a v e r i c k s & c a u s ee c o l o g i c a l d a m a g e ，i no r d e rt or e d u c ec h i n a sc h e e s ep r o d u c t i o nc o s t sa n di m p r o v ep r o d u c t q u a l i t y , t h i sp a p e ri st oe x p l o r et h em e c h a n i s mo f m i l kc u r dw i t hg i n g e rj u i c e ，i n o r d e rt od e v e l o pan e wt y p eo fr e n n e te n z y m e ，b ew i d e l yu s e di nt h ed a i r yp r o d u c t s i n d u s t r y t h i sa r t i c l ef i r s t l ys t u d i e dt h ep r o d u c t i o nm e t h o d sa n dc o m p o n e n t sw i t ht h e f u n c t i o no fc o a g u l a t i n gi nt h eg i n g e rj u i c e t h ef o u rf a c t o r si n c l u d i n ga d d i t i o no f t h eg i n g e rj u i c e ，p u l p i n g t e m p e r a t u r e ，a c i d i t ya n dc o n d i t i o n sf o rt h es t e r i l i z a t i o n w e r es t u d i e dt h r o u g ht h eo r t h o g o n a lt e s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc u r dw a ss u b j e c t t 0e f f e c t so ft h ef o u rf a c t o r s ，t h ei m p a c to ft e m p e r a t u r ei st h el a r g e s t ，f o l l o w e db y t h ea d d i t i o no fg i n g e rj u i c ea n da c i d i t y t h em e t h o d o fs u l f a t es a l tw i t ha m m o n i u m ， t h em e t h o do fe x t r a c t i o nw i t ho r g a n i cs o l v e n ta n dt h em e t h o do fs t e a md i s t i l l a t i o n w e r eu s e dt oe x t r a c tg i n g e rp r o t e a s e ，g i n g e ro l e o r e s i n sa n dg i n g e re s s e n t i a l o i l r e s p e c t i v e l y t h ec o a g u l a t i n gt e s t sw e r et a k e du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s i no r d e rt o e x p l o r ee f f e c t i v ec o a g u l a t i n gi n g r e d i e n ti ng i n g e r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tg m g e r o l e o r e s i n sa n d 西n g e re s s e n t i a lo i lc a l ln o tm a k em i l kc o a g u l a t e d ，b u tt h ee x t r a c to f g i n g e rp r o t e a s ec a nm a k em i l kc o a g u l a t e d a tt h ea m o u n t o f10 o r12 ，p u l p i n g t e m p e r a t u r eo f7 0 ，c u r de f f e c t w a st h eb e s t ，m i l kc o a g u l a t e dc o m p l e t e l y , h a d u n i f o r ma n ds o l i dt e x t u r e ，h a dn oc r a c k s c ac o n t e n to ft h ec u r d sa n dw h e yw h i c hw e r em a d ef r o mg i n g e rp r o t e a s ea n d r e r m e ti i ld i 能r e n tc o n d i t i o n s ，s ac o n t e n tw e r e d e t e r m i n e d i ti sa n a l y s e db y u r e a p a g ee l e c t r o p h o r e s i s t h er e s u l t s s h o w e dt h a ta st h ea m o u n to fe n z y m e i n c r e a s e d c ac o n t e n ti nc u r da n ds ac o n t e n ti nw h e yk e e p e di n c r e a s i n g t h e c 】啪2 et r e n dw i t ht h ec h a n g eo ft e m p e r a t u r ea n dp hv a l u ew a st h e s a m e t h e m e c h a n i s mo fc o a g u l a t i n go fg i n g e rp r o t e a s ea n dr e n n e tw a st h es a m e u n d e ra c e r t a i nc o n d i t i o n ，g i n g e rp r o t e a s e c a nh y d r o l y s i sk - c a s e i nw h i c hi s i nc a s e m m i c e l i e s 。s ot h a ti tl o s tt h ep r o t e c t i o no fm i c e l l e s t h e r e b yt h ed e p u t y1 c - c a s e i na n d t h e 魄1 c a s e i n ，1 3 - c a s e i np r o d u c eg e lo f m e s hw i t hc a z 十，m i l kc o a g u l a t e t h en a t u r eo fg i n g e rp r o t e a s ew a ss t u d i e d a st h er e s u l t ss h o w e d ，t h ev i t a l i t y o fg i n g e rp r o t e a s ew a ss u b j e c tt ot h ei m p a c to ft e m p e r a t u r ea n dp h ，t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ea n dp hw e r e6 0 c ，6 5 0 t h ev i t a l i t yr e m a i n e d s t a b l ea tf o l l o w i n g 4 0 c ，a tp hv a l u eo f 5 o o 6 5 0 n a + 、c a 2 + 、f e 2 + a n d a l 3 + c a np r o m o t e d t h ev i t a l i t y , b u tm 9 2 + 、b a 2 + 、z n 2 + a n dc u + h a d t h er o l eo fi n h i b i t i o n i tw a sc o m p a r e dw i t ht h e n a t l l r eo fr e 衄e ta tt h es a m et i m e ，o f f e r i n gt h e o r e t i c a lg u i d a n c e f o rt h ea p p l i c a t i o ni n t h ep r a c t i c a lp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：c u r d w i t hg i n g e rj u i c e g i n g e rp r o t e a s e r e n n e t m i l k c a s e i np r o t e i n 西华大学硕士学位论文 声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西华大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论 文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在西华大学读书期间在导师的指导下取得的，论文 成果归西华大学所有，特此声明。 作者签名：剖匙乒口吁年岁月争一日 导师签名： 咖多月2 0 日 西华大学硕士学位论文 1 综述 干酪营养丰富，味道鲜美，贮存期长且种类繁多，是世界食品中的重要组 成部分，素有“乳制品之王”之称。在干酪的生产工艺过程中，凝乳工艺是影 响干酪产率和产品品质的关键性工艺阶段。 目前，在乳品加工工业中凝乳的方法有很多种，其中以酶凝乳为主，凝乳 酶的种类丰富，主要分为动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶以及现代科 技产品转基因凝乳酶。凝乳酶是制造干酪过程中起凝乳作用的关键性酶。同 时凝乳酶对干酪的质构形成及干酪特有风味的形成有非常重要的作用n 3 。传统 的干酪生产一般使用的凝乳酶是一种从未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸 蛋白酶，而利用植物中的一些有效因子促使牛乳凝固并提高其消化吸收的方法 至今在国内的报道则较少比，。 据相关资料报道，目前我国的干酪年产量为4 万t 左右，随着我国社会主义 事业的快速发展和改革开放的不断深入，人民生活水平己大大提高，逐渐步入 小康水平，因此对干酪的需求量将逐渐增加，预计至f j 2 0 1 5 年干酪年产量高达1 0 万t 。但是，我国凝乳酶生产还没产业化，生产干酪所需要的凝乳酶主要依靠 从国外进口而来，而从国外进口凝乳酶则加大了干酪的生产成本。此外，我国 还是发展中国家，畜牧业还不很发达，如果单靠屠宰小牛而提取凝乳酶是不能 满足干酪生产日益扩大的需求，同时不符合我国的基本国情，也不符合中共中 央提出的建设和谐社会，坚持可持续发展观的根本要求。因此，研发一种价格 低廉、来源广泛的皱胃酶替代品已成为干酪生产中急待解决的一大问题。通过 研究发现，生姜中的某些成分具有凝乳的作用。此外，我国是世界上生姜产量 最多的国家之一，但均以消费原姜产品和出口原料为主，利用程度很低。对姜 汁凝乳成分及其机理的探讨，既提高了生姜的利用价值，对稳定生姜种植面积， 保证生姜产业持续高效发展，扩大生姜资源的利用途径，调节农业产业结构均 具有重要意义，又为凝乳工艺提供了一种全新的方法，进而寻求和开发一种新 型的凝乳剂，同时对开发新型的营养、保健制品也具有积极的作用和指导意义。 1 1 国内外凝乳酶的研究概况 西华大学硕士学位论文 1 1 1 凝乳酶的概述 通常所说的凝乳酶是指小牛皱胃酶。该酶是在未短奶小牛的第四胃中以一 种前体形式分泌的天门冬氨酸蛋白酶，它属于酸性蛋白酶。凝乳酶原分子量为 4 0 7 7 7 道尔顿，共含有3 6 5 个氨基酸，在酸性条件下n 末端的4 2 个氨基酸能够自 我剪切掉，形成分子量为3 5 6 2 2 道尔顿有活性的成熟凝乳酶( 含3 2 3 个氨基酸) 。 凝乳酶蛋白为肾形，它具有酸性蛋白酶家族的类二折叠对称的结构特点，与其 他真核细胞天冬氨酸蛋白酶具有高度的同源性，变异范围在3 0 一- - 6 0 之间。通 过x 线衍射研究发现，凝乳酶分子可分为由1 一- - 1 7 5 氨基酸残基组成的n 端区域和 由1 7 6 - - - 3 2 3 氨基酸残基组成的c 端区域，两个区域之间是一个深沟状的活性部 位嘲。在n 端区域和c 端区域的分离裂沟底部发现两个天冬氨基酸活性位点， a s p - 3 4 和a s p - 2 1 6 。氨基酸残基和水分子在活性位点形成广泛的氢键网状结构 以维持凝乳酶的类二折叠对称结构。二硫键c y s - 2 5 0 和c y s 一2 8 3 对于酶的活性有 重要影响，如果将这两个二硫键羧基化或汞化，可使酶活性降低2 5 h 1 。 凝乳酶等电点为p h 4 5 。干燥物活性稳定，但是水溶液不稳定。对牛奶凝 固的最适p h 为5 8 6 0 ，最适温度为3 7 4 3 ，在1 5 以下和5 5 以上时 不呈活性。几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚。凝乳酶以两个等位基因a 和b 的其中 一种形式表达，等位基因a 的2 4 4 位点为a s p ，而等位基因b 为g l y ，凝乳酶a 和b 活性的不同归因于a s p 2 4 4 的强电子活性导致的键亲和力增加。凝乳酶a 对k 一酪 蛋白有更强的活性，但比凝乳酶b 缺少稳定性。凝乳酶c 是凝乳酶a 的自溶产物， 它是由凝乳酶a 自行切除a s p 2 8 6 一g l u 2 8 7 一p h e 2 8 8 而产生的哺6 1 。 1 1 2 凝乳酶活性的影响因素及其机理 凝乳酶作为一种蛋白酶，因此能影响酶活性的各种因素均能影响牛乳的凝 固。其中包括牛乳的温度、p h 值、s l 中c a 2 + 浓度及底物浓度等因素n 1 们。 1 1 2 1 温度对凝乳酶活性的影响 牛乳受凝乳酶凝固，在4 0 一4 2 。c 发生最快，1 5 。c 以下或6 5 c 以上则不 凝固。有人作温度对凝乳酶凝固一次相及二次相的影响实验，其结果为一次相 的温度系数与一般反应相同，在0 - - 4 0 。c 范围内，温度每上升i o 。c ，反应速度增 西华大学硕士学位论文 加二倍；二次相温度系数很高，温度每升高1 ，反应速度增j j l l l 3 - - - 1 6 倍。 牛乳温度明显影响凝结速度n ”n 引。但在干酪的实际生产中，乳温一般保持在 3 0 3 5 1 7 1 。 1 1 2 2p h 值对凝乳酶活性的影响 凝乳酶属于酸性蛋白酶，又称天冬氨酸蛋白酶，因为这类酶的活性中心部 位有两个天冬氨酸，这两个天冬氨酸的r 一羟基一个以离子化形式存在，一个以 质子化形式存在。p h 是通过对凝乳酶活性中心天冬氨酸的解离形式而影响酶的 活性，从而影响凝乳反应第一阶段的反应进程。酸性蛋白酶的最适p h 值在1 5 5 o 左右。在干酪生产中，乳的p h 值越低，凝乳速度越快n 驯。在酸性环境中凝 乳酶活力最强，p h 值低，受凝乳酶凝固时间较短，凝乳较硬，其最佳p h 值为4 8 左右；若超过中性，则凝乳酶很快失去活性n 2 1 3 h 1 。 1 1 2 3 钙离子对凝乳酶活性的影响 钙离子浓度的增加可以缩短凝乳时间，增加凝块的硬度。c a 2 + 不仅对二次 相有影响，对一次相亦有影响。在乳中添加钙离子，通过钙离子与氢离子之间 的交换而降低p h 值，间接增加了酶促反应的速率。由于钙离子与酪蛋白胶束中 的胶体磷酸钙进行离子交换，使k 一酪蛋白胶束的表面电荷进一步减少，使胶 束间的空间斥力减少而彼此逐渐靠近，导致胶束的凝聚n 2 】【1 聊“引。 1 1 2 4 其他因素的影响 底物浓度对酶促反应是有影响的。底物浓度的增加能加快酶促反应的速 率。牛乳中蛋白质浓度提高对凝乳时间有一定的影响，凝乳反应第一阶段时间 的缩短与体系中蛋白质浓度呈指数关系，增加凝乳剂的浓度具有相同的作用。 负离子基团对凝乳酶的作用和乳的酶凝固具有抑制作用。经研究还发现，n a 2 + 、 f e 2 + 和e d t a 对凝乳酶活性有促进作用，而m 9 2 + 、c u 2 + 和b a 2 + 对凝乳活性有抑制作用， k + 对凝乳酶活性的影响并不明显n 引o t 。 1 1 3 凝乳酶代替品的研究进展 为了提高干酪的产量，降低成本，保护生态环境，对凝乳酶代替品的研究 西华大学硕士学位论文 与开发是相当有必要的。小牛皱胃酶代替品应具备以下的特点：凝乳活性与蛋 白分解活性之比适当；干酪制品的质地及风味可以被接受；贮藏期间性质稳定； 对人体无毒副作用，来源广泛，成本及价格较小牛皱胃酶竞争低等特点。在自 然界中，几乎所有的蛋白分解酶在适当条件下都能使乳凝固。但是由于上述条 件的限制，能够实现商品化的凝乳剂却为数极少。目前，国内研究范围涉及其 他动物器官、高等植物及细菌、真菌。虽对皱胃酶代替品的研发尚处于初级阶 段，不过已经取得一定阶段性的研究成果。 1 1 3 1 动物性凝乳酶 凝乳酶的传统来源是将处于哺乳期小牛的第四个胃( 皱胃) 切成薄片，再 用1 0 - - - 2 0 左右的盐水浸提，经过滤，盐析纯化后，得到凝乳酶原液，再经酸化， 即可得到具有高凝乳活力的凝乳酶。随着小牛的成长，胃中的凝乳酶逐渐减少， 而分泌的其它蛋白酶却增多，而从老牛胃中提取的皱胃酶含有9 0 - - - 9 4 的胰蛋 白酶和6 - - - 1 0 的凝乳酶。牛胰蛋白酶也有凝乳活力，并且也用于商品化生产。 而牛胃蛋白酶的蛋白降解专一性类似于凝乳酶，有较好的凝乳效果，但是它的 蛋白水解活力比较大，易造成凝块的过度水解，因此可部分的代替凝乳酶。相同 的道理，其它哺乳动物如羊、猪等的胃中也含有凝乳酶。与小牛一样，哺乳期的 羔羊、小猪的胃中所含凝乳酶含量较高。 因此，人们在设法提高皱胃酶产量的同时也把焦点转向其它动物的胃蛋白 酶，对猪、小羊等动物的胃蛋白酶的性质进行了研究。我国生猪年产量很大， 猪胃蛋白酶易于获取，对其研究较多。刘文宗等啪1 研究加入不同水平的小牛皱 胃酶、乳猪胃酶、育肥猪胃酶对干酪生产的影响，结果表明乳猪胃酶能以5 0 9 6 6 6 7 的比例替代小牛皱胃酶，育肥猪胃酶则不能用来替代。我国每年要屠宰 大量的羔羊生产羔皮和裘皮。羔羊皱胃酶具有充足的原料资源。张富新等幢 研究了不同因素对羔羊皱胃酶凝乳活性的影响。但羔羊皱胃酶凝乳性较低影响 了它的使用价值。报道从金枪鱼胃粘膜中提取出来的粗胃蛋白酶可作为凝乳酶 的代替品，该酶来源广泛，因此价格低廉，是一种较好的凝乳酶代用品乜劓。苑艳 辉等心5 1 综述了从金枪鱼胃粘膜中提取凝乳酶的方法。小鸡胃蛋白酶也具有一定 的凝乳活力，但因其蛋白水解活力高，制作出来的奶酪有特殊气味等原因，仅在 西华大学硕士学位论文 以色列等少数地区使用。 1 1 3 2 植物性凝乳酶 在古代，葡萄牙人从一种名为做刺菜蓟的植物中提取出一种凝乳酶，并取 名为c y n a r ac a r d u n c u l u s 。该酶被用来制作s e r r a 和s e r p a 印奶酪，他们甚 至认为使用刺菜蓟的效果比犊牛皱胃酶好，但是这些植物来源的凝乳酶因有太 高的蛋白水解活力或本身具有毒性而不能用于奶酪生产。因此，很多植物性凝 乳酶没有得到大规模商业化生产，仅限在一部分国家和地区生产和使用。人们 发现很多植物中也含有能使牛乳凝固的酶，现在全世界仅约有1 的凝乳剂是从 植物组织中分离得到的。植物凝乳酶来源广泛，己知木瓜、无花果、菠萝、南 瓜、合欢树、银杏等植物中都含有能使乳凝固的蛋白酶。目前研究最多的是木 瓜凝乳酶类，菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶等。张富新等啪1 对无花果蛋白酶的凝 乳特性进行了研究，发现其有较好的凝乳特性。薛彦斌分别从合欢树的叶子、 树皮和果实中提取出合欢凝乳酶，作用于牛奶，经过三周成熟的软质干酪在质 地和风味上都不逊色于小牛凝乳酶制造的干酪。近年来，日本信州大学的大谷 元教授以周围常见的1 5 0 种树木的树叶为对象，调查其制造欧式干酪时有无凝 乳活性，发现其中有将近三分之一的树木有凝乳活力。我国植物资源丰富，价格 低廉，若能充分而合理地开发和利用，一定会产生巨大的经济效益。 本文作者也用姜汁和生姜蛋白酶粗提物进行了凝乳试验研究，试验结果 表明在一定的工艺条件下，凝乳完全，坚实而质地均匀，且无裂痕。凝乳的表 观特性和风味可以与小牛皱胃酶产生的凝乳相媲美。现可认为姜汁或生姜蛋白 酶很有望代替小牛皱胃酶而在乳制品加工中得到应用。 1 1 3 3 微生物凝乳酶 人们在寻找合适的微生物蛋白酶替代皱胃酶方面开展了大量的研究，从上 世纪6 0 年代中期起，国外已用微生物凝乳酶取代小牛凝乳酶制造干酪，用微生 物凝乳酶生产的干酪目前已占世界干酪总产量的三分之一。 微生物凝乳酶来源广泛，目前发现有近4 0 余种微生物可产生一定量的凝乳 酶。有资料报道从总状毛霉( m u c o rr a c e m o s u s ) 、乳白耙霉( i r p e xl a c t e u s ) 、 易脆毛霉( m u c o rf r a i l i s ) 、米黑毛霉( m u c o rm i c h e i ) 、寄生内座壳菌( e n d o t h i a 西华大学硕士学位论文 p a r a s i t i s a ) 等微生物中都可产生凝乳酶。张红梅2 1 综述了几种微生物产生凝 乳酶活力大小顺序依次为：米曲霉 东京根霉 卷枝毛霉 少根根霉 爪哇根 霉。此外，枯草杆菌和灵杆菌产生的凝乳酶也用于素食乳酪的生产。郭光远等1 在对云南省的不同地区放线菌区系及资源的考察过程中，对所分离到的2 5 0 2 株 放线菌、真菌、细菌进行了凝乳酶产生菌的筛选，结果发现放线菌中链霉菌属 ( s t r e p t o m y c e s ) 、小单胞茵属( m i c r o m o n o s p o r a ) 、马杜拉放线菌属 ( a c t i n o m a d u r a ) 等和9 8 的真菌及细菌中都有一定的产酶活力。刘振民m 1 等人发现酒药中的主要菌系为根霉，它具有一定的凝乳活力，可作为凝乳酶的 潜在生产茵。孙健等口发现总状毛霉可以产凝乳酶，且产量较高。目前微生物 凝乳酶应用最多的是微小毛霉生产的凝乳酶。a r i m a 发现毛霉属微小毛霉 ( m u c o rp u s i l l u s ) 可以产生高活力凝乳酶，之后许多科学家都对其展开了大 量的研究。中科院微生物所的钱世均等5 1 从1 9 株毛霉中筛选出一株微小毛霉 菌株，完成了菌种培养、酶提取和纯化。朱宏等m 1 用微小毛霉凝乳酶单独使用 或与粗制皱胃酶按照一定比例混合来生产干酪，均取得了较好的生产效果。 l - 1 3 4 基因工程凝乳酶 基因工程凝乳酶是将牛凝乳酶基因克隆进一个合适载体并转入宿主中表 达产生酶。凝乳酶是首个应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移到细 菌或真菌中生产的一种酶。基因工程生产的凝乳酶都有与天然牛凝乳酶相似的 结构并且对r 酪蛋白有较严格的特异性m 4 1 倒。在1 9 9 0 年美国f d a 己批准基因 工程凝乳酶在乳酪生产中使用，f d a 认可了三种凝乳酶产品：克氏乳酸菌凝乳 酶，黑曲霉菌凝乳酶，大肠杆菌k - 1 2 凝乳酶h 3 1 4 4 o 俄罗斯科学家培育出的转基 因母绵羊所产的奶中含有凝乳酶，该凝乳酶与小牛皱胃酶的各方面相比均无差 别h 司 4 6 o 直至目前为止，我国所用的凝乳酶大部分还是依赖于进口。世界上已 有美，英，意等1 9 个国家能够生产基因工程凝乳酶，且大部分奶酪是由基因工 程酶制得，我国却还没有跨入此列h 。因此，广大科研工作者需要更加地奋发 图强，不懈不怠，兢兢业业，刻苦钻研，为我国此项事业的发展而不断努力奋 斗。 西华大学硕士学位论文 1 2 生姜的概述 1 2 1 生姜的简介及其功能 姜( z i n g i b e ro f f i c i n a l er o s e ) ，又名地辛、百辣云，系姜科多年生宿根 草本植物姜的根茎，是一种广泛应用的药食两用植物。原产于太平洋群岛，我 国中部、东南部至西南部广为栽培，河南、山东、湖北、江苏、广东、四川、 云南等省种植较多，著名的品种有东北丹东、安徽铜陵的白姜、山东莱芜的片 姜、湖北来凤、黄冈的黄瓜姜、台姜、江西上高的白丝姜、黄丝姜、东北大肉 姜，云南玉溪的黄姜、广东疏轮大肉姜和密轮细肉姜、贵州长顺生姜、四川成 都的“蜀姜”、浙江义乌生姜等m 1 。 据史书记载，我国早在周秦时代就有种植、食用和医用生姜的习惯。生 姜”一词实在出自神农本草经，其中品干姜条下云：“主胸满咳逆上气， 温中，止血，出汗，逐风湿痹，肠擗下利，生者尤良，久服去臭气，通神明 。 根据张仲景等名医的用药经验，名医别录将生姜分条立名，谓其“主伤寒 头痛鼻塞，咳逆上气。 本草经集注增补其“归五脏，祛风邪寒热，止呕 吐，去痰下气，除风湿寒热 。药性论亦认为其“主痰水气满，下气，生 与干并治嗽，疗时疾，止呕吐不下食 。这一时期的本草主要记述其发散风寒、 和中止呕、化痰止咳方面的主治功能概况。此后的本草则主要增补其解毒与急 救昏厥方面的应用，在概括功效方面均较扼要而中肯，张元素言其“益脾胃， 散风寒”；李时珍言其“生用发散，熟用和中 m 1 。 现代药理学研究证实了生姜具有很多功效。国外采用生姜为原料已研制出 防晕生姜胶囊、强心剂、抗肿瘤剂和抗过敏制剂等，在保健品开发方面，还制 成了脱毛剂、口腔卫生制剂、戒烟剂等，亦有用作为脑血管障碍的治疗剂。国 内姜产品，特别是药用产品或保健产品还是个空白，也没有已成型的制剂供 应临床。这种状况提示了姜产品的开发，尤其是药品和保健品的开发，还存在 很大的潜力与发展空间。 1 2 2 姜油树脂和姜精油的成分 姜油树脂( g i n g e ro l e o r e s i n s ) 与姜精油( g i n g e re s s e n t i a lo i l ) 是目前 姜的两种主要的深加工产品，二者均是从姜中抽提出来的微量、高价的浓缩物 西华大学硕士学位论文 质，是姜调味的主要成分，在食品工业中有很高的应用价值与发展潜力h 1 。两 者的区别就在于姜油树脂是通过有机溶剂萃取而得，含有高沸点物；姜精油是 通过水蒸气蒸馏出来的物质，几乎不含高沸点成分( 如倍半萜烯类物) 。 姜油树脂的主要成分为姜辣素以及高沸点的倍半萜烯类等物质。姜辣素由 于产地不同其含量相差较大，可分为姜酚类、姜烯酚类、姜酮类、姜二酮类、 姜二醇类等不同类型。3 0 以上是6 一姜醇。根据u v 光谱，发现7 种主要辛辣成分 分别为6 一姜酚，8 一姜酚，l o - 姜酚，6 一姜烯酚，8 一姜烯酚，1 0 - 姜烯酚和6 一姜二 酮i s l 。姜油树脂具有一定的应用开发潜力，除了作调味料外，还可用于开发 天然抗氧剂、天然抗菌剂以及医疗和保健品。 姜精油是指从姜根茎中得到的挥发性油份，几乎不含高沸点成分，具有 浓郁的芳香气味，主要应用与食品及饮料的加香、调味，也是目前国内外市场 抢手且价格不匪的香精原料和药用原料。其主要成分为单萜类物质，如a 蒎 烯、b 一水芹烯，b 一倍半萜类的a 一姜烯、b 一红没药烯等3 7 种成分。已发现的 挥发油中倍半萜烯类占5 0 一- 6 0 ，氧化倍半萜烯类占1 7 ，其余主要是单萜烯 类和氧化单萜烯类嘲捌。从姜中提取挥发性精油的方法一直以水汽蒸馏法为 主，该法操作简便，投资少，但缺点是蒸馏时间长，效率比较低。姜精油具有 很大的开发应用潜力，是用于化妆品，特别是男士用香水的理想香精香料， 也可作为天然的食品香料，除此之外，它还具有很高的药用价值。 1 3 生姜蛋白酶的概述 1 3 1 生姜蛋白酶的简介及其功能 在现代工业、医药行业中对生姜的应用主要是进行深加工。而生姜蛋白酶 则是生姜深加工综合利用的高附加值产品之一。 生姜蛋白酶是从生姜根茎中提取的一种酶，它是蛋白水解酶之一，是一种 巯基蛋白水解酶类，具有蛋白酶和胶原蛋白酶双重性质。它可以水解胶原蛋白 和肌动蛋白而使肉类嫩化，广泛地应用于肉制品的改性上嘲矧。日本学者把生 姜根茎中的蛋白酶作为一种新的肉类嫩化剂加以研究，其最佳作用温度为6 0 ，当温度升至7 0 时，该酶将变性失活。该酶对胶原蛋白的水解活性要比对 肌动球蛋白的大好几倍，安本教传等报道的对肉嫩化的生姜酶制剂及其制法 西华大学硕士学位论文 中，制得的酶制剂具有很好的稳定性，在2 5 下可保存6 个月，所含的蛋白酶 活性基本不变。唐晓珍等做的生姜汁对猪肉的嫩化效果的研究中指出，生姜汁 最佳用量5 ，最佳p h 为7 0 ，最佳预处理温度为4 0 ；俞沛初等旧1 通过对鸡 肉、牛肉注入不同剂量生姜汁以及牛肉在生姜汁中浸泡的试验，初步探明了生 姜汁对肉类的嫩化工艺、适宜用量和嫩化效果。国内也有资料报道了生姜蛋白 酶透过肌纤维膜，水解肌原纤维和其他物质，提高肉的嫩度。周雁等嵋刀做的生 姜蛋白酶对若干食物蛋白消化作用的研究中指出，以食物原料为底物时，生姜 蛋白酶的最适消化p h 为5 0 ，最适消化温度为6 5 。消化温度高于7 5 后， 其活性显著降低。 水解酶的特性则以使啤酒、葡萄酒等酒类澄清，这有利于改变酒类市场利 用甲醛做澄清剂的现状。能水解食物中的蛋白质，使食品中含有易于消化吸收 的肽、氨基酸，从而提高食品的功能性质，对酪蛋白、大豆分离蛋白等有很好的 消化用。由唐晓珍等所做的生姜蛋白酶对啤酒的澄清效果的研究中指出，生姜 蛋白酶对啤酒具有良好的澄清效果。用量一般在0 0 5 - 一5 0 m g l ，其中0 0 5 m g l 效果最好，预处理温度为6 0 。姜汁不宜作为酶原直接用于啤酒的澄清中，因 为直接加入原汁会影响啤酒的色度、澄清度和口感。用0 0 5 5 0 m g 几生姜蛋白 酶处理啤酒，不仅能够提高啤酒澄清度、色度质量、蛋白质含量，而且能较长 时间保持其澄清度效果及各指标的稳定性旧1 。用生姜蛋白酶处理啤酒后，啤酒 的蛋白质含量、澄清度、稳定性等指标都提高了，这是生姜蛋白酶使酒样中的 大分子蛋白质分解生成了一些能与考马斯亮蓝反应、可溶于酒中且稳定的小分 子多肽等物质，此过程与木瓜蛋白酶澄清啤酒后，大分子蛋白质减少而低分子 量的蛋白质含量增加的情况相吻合。这说明生姜蛋白酶处理酒样确实可以提高 其蛋白质含量、澄清度等各指标的稳定性。蛋白质含量的适当增加有利于提高 啤酒的品质和营养价值。 生姜蛋白酶作为一种新的植物蛋白酶，具有绿色环保、天然健康、风味独 特等特点。它不仅具有一般植物蛋白酶的性质，而且还赋予食品特殊风味，是 继菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、木瓜蛋白酶后一种新的植物水解蛋白酶类。我 国是生姜生产大国，生姜蛋白酶是有待开发利用的新型植物蛋白酶，进行生姜 蛋白酶的提取和纯化、酶学性质及其在食品工业中的研究和应用，可以改善我 西华大学硕士学位论文 国植物蛋白酶资源长期以来主要依靠于木瓜、菠萝等少数热带水果资源的现 状，并为其在食品领域的应用提供理论依据，有利于生姜资源的充分综合利用， 具有重大而深远的理论意义与现实意义。 1 3 2 生姜蛋白酶的提取方法 目前，蛋白酶的提取方法比较多，提取蛋白酶的方法都可用于生姜蛋白酶 的提取。有机溶剂沉淀法、超滤浓缩法、盐析法、吸附法和冻干法一般为粗分 离方法，主要用于蛋白酶的浓缩和富集。聚丙烯酞胺凝胶、葡聚糖凝胶、d e a e 一 纤维素、d e a e 一琼脂糖、电泳层析等各种分离方法为精细分离方法，用于提纯 高纯度的蛋白酶。喷雾干燥法和冷冻干燥法比较适合于大规模的提取蛋白酶。 人们已经试验出硫酸铵、单宁、聚丙烯酞胺凝胶、葡聚糖凝胶、d e a e 一纤维素、 电泳层析等分离技术对生姜蛋白酶进行了分离纯化。但这些提取方法成本高、 产量低、操作繁琐、不适于工业化大规模生产生姜蛋白酶，正是由于缺少工业 化的提取方法，才严重阻碍了生姜蛋白酶在实际生产中的应用。因此，研究适 用生姜蛋白酶的提取分离方法也就成了一个急待解决的问题。 国外很早就有关于生姜蛋白酶的提取和作用理论研究，研究主要集中于蛋 白酶的分离纯化及酶学性质研究上，使生姜蛋白酶的理化特性越来越为人们共 知。目前，关于适合工业应用的提取方法及实际应用研究较少。开展适合工业 应用的生姜蛋白酶提取方法研究和生姜蛋白酶的应用研究将会为食品工业增 添新的酶源，拓宽食用植物蛋白酶的应用领域。生姜蛋白酶作为一种新的天然 植物蛋白酶资源丰富，具有很高的应用价值，市场前景非常广阔。 1 3 2 1 盐析法 向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响：在盐的浓度较低时蛋 白质的溶解度增加，产生盐溶现象，表现蛋白溶解度增加。在盐浓度较高时产生 盐析现象，表现蛋白溶解度降低、析出。盐析法是一种实验室常用的蛋白浓缩 方法，此法操作简单，中性盐对易变性的蛋白质有一定的保护作用，同时盐析能 除去较多的杂质，有纯化作用，但固一液难以分离，且离心分离只能把各种下沉 物或不溶物与溶液分开而无法把分子、性质、构造相近的蛋白质、核酸和糖类 西华大学硕士学位论文 等大分子细分，故盐析法分辨率较低。在实际工作中，常用的盐析剂是硫酸铵， 因为它盐析能力强，在水中溶解度大，浓度高时也不会使蛋白质生物活性降低。 赵帜平等啼鲫应用了硫酸铵沉淀法对生姜蛋白酶进行了提取和分析。 1 3 2 2 有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀法一直是大规模浓缩蛋白质常用的方法，有机溶剂沉淀法己 广泛应用于生产蛋白质制剂。有机溶剂沉淀法不仅用于浓缩蛋白，还用于蛋白 的提纯，但是纯化效果较差、分辨率较低。有机溶剂的加入量不同，混合溶液 的介电常数即不同，酶的分级提纯就是利用了介电常数的改变来实现的，故要 实现酶的提纯有机溶剂的量需要严格控制。生物制品在有机溶剂的环境下很容 易失活，这就要求在操作过程中要严格控制有机溶剂的加入量，控制有机溶剂 加入以后整个体系的温度。有机溶剂沉淀法一般选择的有机溶剂的量为蛋白溶 液的2 5 倍为宜，体系温度一般控制在5 c 以内，有的酶类稳定性比较高，可 根据实际的情况掌握，以操作过程不影响酶的活性为标准。 在使用有机溶剂时要遵循一定的原则。必须能完全与水互溶，不与蛋白质 发生反应，要有较好的沉淀效应，溶剂蒸汽无毒，且不易燃烧。丙酮和乙醇符 合上述要求，因此是使用最广泛的两种溶剂。唐晓珍等呻1 就采用了有机溶剂沉 淀法提取生姜蛋白酶。目前，未见单独使用有机溶剂沉淀法分离提纯生姜蛋白 酶的报道，一般是以有机溶剂沉淀法进行粗提，再使用其他方法纯化。 1 3 2 3 超滤法 超滤浓缩法是进行蛋白质浓缩的重要方法。在酶的分离过程中为了要除去 酶溶液中的盐分、有机溶剂等小分子物质等通常要用到超滤将各种小分子化合 物去掉。超滤是利用微孔膜将各种小分子化合物去掉，这种膜的微孔从大到小 有各种规格，可以摒除分子量为5 0 0 - - 1 0 0 0 乃至3 0 0 0 0 0 的化合物。现在经常 用到的超滤膜组件式的设备是利用蠕动泵对溶液施加压力使小分子的化合物 透过超滤膜，导出组件外部，而大分子的酶则继续在管路里循环直到达到一定 的浓缩度，以上操作只能得到酶的浓缩液，得不到易保存的酶粗提物，经过浓 缩以后还要再经过一步冷冻干燥得到粗酶制品。超滤法不仅有浓缩蛋白质的作 西华大学硕士学位论文 用，而且有除盐、分级、纯化的作用，但分辨率较低。不过较其它的浓缩方法 来说，具有方便、迅速、温和的优点。唐晓珍等m 门用超滤法浓缩得到生姜蛋白 酶，确定了最佳工艺条件。但未见使用超滤技术分级提纯生姜蛋白酶的报道。 1 4 乳蛋白和凝乳机理 1 4 1 乳蛋白的概述砸2 3 乳蛋白质可以分为酪蛋白和乳清蛋白，它是人们膳食中的重要营养成分之 一，已被深入研究