（食品科学专业论文）丁酸梭状芽孢杆菌Z10发酵工艺优化.pdf

摘要 摘要 微生态制剂在替代抗生素、防治畜禽疾病和改善环境等方面的积极作用已经得到了 公认。目前广泛应用的非芽孢类活菌制剂普遍存在保存期短、活性不稳定等缺点，给实 际应用带来很多困难，这个问题在动物用微生态制剂上尤为明显。 丁酸梭状芽孢杆菌z 1 0 ( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u mz 1 0 ，丁酸菌z 1 0 ) 是由本实验室 从健康人体粪便中分离得到的，并已对其生长特性和安全性进行了研究。本论文主要以 提高丁酸菌z 1 0 的菌体浓度和芽孢形成率为目的，针对丁酸菌z 1 0 培养中的培养基、 接种条件、p h 和培养温度等影响因素分别对种子培养工艺、发酵工艺进行了优化，并 进一步研究了丁酸菌z 1 0 芽孢的形成条件。 采用液体静置培养法研究了丁酸菌z 1 0 的种子培养工艺，最终确定了种子培养基 和培养条件。在此条件下培养丁酸菌z 一1 0 并测定丁酸菌z 1 0 的生长曲线。以此为基础， 进一步优化了丁酸菌z 1 0 的发酵工艺，最终确定了发酵培养基和发酵条件：接种方式 采用8 0 热处理1 0 m i n ，接种p h 为7 0 ，接种量5 ，培养温度为3 8 ；本论文还针对 芽孢形成率不稳定的问题对芽孢形成条件进行了研究，采取在培养一定阶段调节p h 的 方法，使芽孢形成率的稳定性保持在较高水平。按照上述发酵工艺进行发酵，菌体浓度 可达1 3 1 0 y c f u m l ，芽孢形成率达到6 l 。 关键词：丁酸梭状芽孢杆菌，发酵工艺优化，菌体浓度，芽孢，芽孢形成率 a b s t r a c t a b s t r a c t t h ep o s i t i v ee f f e c t so fm i c r o b i a le c o l o g i c a la g e n t so nr e p l a c i n ga n t i b i o t i c s ，p r e v e n t i n g a g a i n s tb a c t e r i ai n f e c t i o na n di m p r o v i n ge n v i r o n m e n th a v eb e e nw i d e l ya c c e p t e d t h el i v e b a c t e r i ap r e p a r a t i o nw i d e l yu s e dt o d a ye x i s t sm a n yd i s a d v a n t a g e s ，s u c ha ss h o r tr e t e n t i o n p e r i o da n du n s t a b l ea c t i v i t y , b r i n g i n gm a n yd i f f i c u l t i e s i np r a c t i c a la p p l i c a t i o n m o r e o v e r , t h e s eq u e s t i o n sa r em o r eo b v i o u si nt h em i c r o b i a le c o l o g i c a la g e n t so fa n i m a l c l o s t r i d i u mb u t y r i c u mz 10w a si s o l a t e df r o mf e c e so fh e a l t hv o l u n t e e r sb yo u rl a b a n d t h eg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c sa n ds a f e t yo fc l o s t r i d i u mb u t y r i c u mz - 10w e r es t u d i e d i nt h i s p a p e r , t h ee f f e c t so fc u l t u r em e d i u m ，i n o c u l a t i o nc o n d i t i o n s ，p ha n dc u l t u r et e m p e r a t u r eo n t h ec u l t u r ea n df e r m e n m t i o nt e c h n o l o g yo fs e e dw e r es t u d i e di no r d e rt oi n c r e a s et h ec e l l c o n c e t r a t i o na n ds p o r u l a t i o nr a t eo fc l o s t r i d i u mb u t y r i c u mz - 10 t h ec u l t u r a lc o n d i t i o n so fc l o s t r i d i u mb u t y r i c u mz - 10w e r eo p t i m i z e dt h r o u g ha d o p t i n g t h em e t h o do fl i q u i ds t a t i cc u l t u r e c u l t u r ec l o s t r i d i u mb u t y r i c u mz - 10u n d e rt h ec o n d i t i o n s a n dd r a w nt h eg r o w t hc u r v eo fi t o nt h i sb a s i s ，s t u d i e dt h ef e r m e n t i o np r o c e s so fc l o s t r i d i u m b u t y r i c u mz - 10 ：i n o c u l a t ep hi s7 0 ，i n o c u l a t eq u a n t i t yi s5 ，c u l t u r et e m p e r a t u r ei sa t38 。c ； i no r d e rt oi m p r o v et h es t a b i l i t yo fs p o r u l a t i o nr a t e ，c o n t r o lt h ep hd u r i n gt h ef e r m e n t a t i o n p r o c e s si ns p e c i a ls t a g e u n d e ra b o v ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，t h ec e i l sp o p u l a t i o ng o tt o 1 3 x 1 0 9c f u m la n dt h es p o r u l a i t o nr a t eg o tt o6 1 k e y w o r d s ：c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ，f e r m e n t a t i o np r o c e s so p t i m i z a t i o n ，c e l lc o n c e n t r a t i o n ， s p o r e ，s o r u l a t i o nr a t e i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日 期： 1 前言 1 前言 1 1 正常菌群 1 1 1 正常茵群的概念 正常微生物群既是具体的，又是相对的概念。其定义是指生活在健康动物各部位， 并随宿主长期进化过程形成的，在宿主一定时期，定殖在宿主细胞膜或皮肤上的微生物 群。一般在生理情况下，主要表现为有益于宿主的微生物群落，但在病理情况下，也可 能表现为有害宿主的微生物群落，我们把这些有益于宿主的，而且是对于宿主必需的微 生物群落统称为正常微生物群【1 1 。 正常微生物群又分为原籍菌( a u t o c h t h o n y ) 、外籍菌( a l l o c h t h o n y ) 及共生菌群 ( s y m b i o t i cf l o r a ) 。原籍菌又称为固有菌( i n d i g e n o u sf l o r a ) ，外籍菌又称为过路菌( t r a n s i e n t f l o r a ) 。微生物主要分布于人的体表和与外界相通的腔道中。 原籍菌( a u t o c h t h o n y ) ，一般指在成年人或成年动物体内，一定时期在特定部位定殖， 并在成年人或成年动物的微生物群落中保持一定的种群水平，和定殖区域的黏膜上皮细 胞有着极为密切联系，在正常情况下主要表现对宿主健康有益，具有一定免疫、营养及 生物拮抗作用的专性厌氧菌。f u l l e r 2 1 对原籍菌的定义是：在宿主一定时期特定的解剖部 位占位密度最高，低免疫原性的厌氧菌。 共生菌( s y m b i o t i co r g a n i s m s ) ，r o s e b e r y 首先提出了共生菌( s y m b i o t i co r g a n i s m s ) 的 概念，凡与原籍菌有共生关系的生理性细菌称为共生菌，它与其它外籍菌有共生拮抗关 系。共生菌已适应宿主，一般来说无传染性，如芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 。 过路菌( t r a n s i e n tf l o r a ) ，f u l l e r l 2 对过路菌的定义是：在宿主一定时期和解剖部位占 位密度低的，并具有相当免疫原性的需氧或兼性厌氧菌。 人体正常菌群的构建可以通过多种途径，主要方式有：( 1 ) 产道，胎儿在经过母体 产道时产道内的某些微生物可借机侵入胎儿体内参与正常菌群的形成，但该途径不适用 于经剖宫产分娩的胎儿；( 2 ) 胎儿出生后与外界环境中的微生物接触，某些微生物可以 侵入到婴儿体内参与正常菌群的形成，这是人体内正常菌群形成的主要途径；( 3 ) 通过 母乳喂养，母乳中含有一定量的微生物，它们通过母乳进入婴儿体内，参与正常菌群的 形成【3 1 。 1 1 2 正常茵群与宿主的关系 h o o p e r 等人【4 】在研究肠道微生物和宿主之间的关系方面有重大的突破。他们用激光 捕捉显微解剖技术( 1 a s e r - c a p t u r em i c r o d i s s e c t i o n ) 、适时定量反转录酶一聚合酶链反应技 术( r e a l t i m eq u a n t i t a t i v er e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 和高浓度寡核苷 酸微阵列技术( d n am i c r o a r r a y s ) 对多形拟杆菌( b a c t e r o i d e st h e t a i o t a o m i c r o n ) 定殖的 无菌小鼠做了系统的研究，结果显示共生细菌调节多个涉及几种重要的小肠功能的基因 江南大学硕士学位论文 表达，包括营养吸收、黏膜屏障防护、药物代谢、血管生成和出生后小肠发育成熟等， 阐明了许多宿主与寄生微生物共生体之间的相互关系。 分析结果表明，多形拟杆菌可改善宿主营养物质的加工和吸收；完整的黏膜屏障对 限制微生物的入侵非常重要，屏障系统一旦破坏就会引起免疫应答，造成疾病。多形拟 杆菌的定殖不产生可见的炎症反应，但是使b 细胞的汇集伴随多聚体免疫球蛋白受体、 编码黏膜层组分( m u c l i n ) 和三叶肽( t r e f o i lp e p t i d e ) 潜在受体的c r p d u c t i n 基因和衰 变加速因子的基因表达量提高了，这3 个基因共同加强表达有助于防止细菌通过黏膜屏 障并防止由小肠分泌中的补体成分活化而造成的黏膜损伤；细菌接种后最显著的响应是 富脯氨酸的小蛋白2 a 的m r n a 表达量显著提高了，这些结果表明，细菌定殖能诱发小 肠上皮屏障的形成；环境和饮食成分及药物通常在小肠内被氧化或者偶联而失去毒性， 接种细菌能将谷胱甘肽耦合亲电子基团的谷胱甘肽硫转移酶基因表达量降低约2 倍。 另外，负责从上皮细胞中运出谷胱甘肽复合物的多药抗性蛋白，表达量降低约4 倍，参 与氧化药物代谢的脒基四氢异喹胍羟化酶c y p 2 d 2 ，其基因表达量也下降3 倍，这些结 果显示，接入细菌能影响宿主代谢药物和内源毒素的能力。乳糖酶水解乳中的乳糖，腺 苷脱氨酶和多胺是出生后小肠成熟的效应物，多形拟杆菌定殖后，乳糖酶基因表达量降 低，而腺苷脱氨酶和鸟氨酸脱羧酶( o d c ) 抗酶基因表达量升高，说明共生细菌可能在 出生后小肠发育成熟过程中起指导作用；血管生成素一3 原来首先在n i h3 t 3 成纤维细胞 中被发现，它在组织中的细胞起源并不清楚，l c m q r t - p c r 揭示其m r n a 大都局限于 回肠腺管上皮细胞，接种细菌导致其在腺管表达量升高，分泌的血管生成因子定位于回 肠腺管上皮细胞，使之可能作为宿主对微生物接种响应的效应物之一。以上研究结果说 明，正常微生物对宿主的营养吸收、黏膜免疫、益生素代谢、出生后肠道成熟等方面都 有重要影响 4 - 6 。 1 1 3 正常茵群的生理功能 正常微生物群是宿主一个新发现的生理功能系统，它是经典生理功能系统的补充， 和经典生理功能如呼吸、循环、消化吸收、内分泌、血液、生殖泌尿、神经、能量代谢 和体温、感觉等一道构成人体的十大生理功能【7 ，8 】。 正常微生物群与其宿主的营养具有极为密切的关系。正常微生物群通过对碳水化合 物、蛋白质和脂类的分解，参与宿主对营养的消化和分解；正常微生物群也可以通过产 生宿主所必需的维生素和消化酶，参与宿主对营养的吸收作用【9 】。 正常微生物群对其宿主的第二个重要作用是免疫性，普通动物免疫系统的形态学和 功能都与无菌动物不同，这些来源于正常微生物群的作用，无菌动物对各种肠内菌的抵 抗力较普通动物明显降低，就是很好的证明 1 0 , 1 1 】。 正常微生物群还可通过产生生物屏障、化学屏障、与外细菌争夺营养等生物拮抗作 用，来抵抗外来细菌的入侵，保护宿主【1 翻。 2 1 前言 1 1 4 微生态平衡扣失调 微生态平衡是生态平衡的重要组成部分，是微观层次的生态平衡。我国微生态学家 康白教授总结了前人有关论述，提出了微生态平衡的概念：“微生态平衡是在长期历史 进化过程中形成的正常微生物群与其宿主在不同发育阶段的动态的生理性组合。这个组 合是指在共同宏观环境条件影响下，正常微生物群各级生态组织结构与其宿主( 人类、 动物与植物) 体内、体表的相应的生态空间结构正常的相互作用的生理性统一体。这个 统一体的内部结构和存在状态就是微生态平衡 【8 j 。微生态失调的概念在康白教授主编 的微生态学中定义为：“正常微生物之间及正常微生物群与其宿主之间的微生态平 衡，在外界环境影响下，由生理性组合转变为病理性组合的状态 【7 ，8 】。 微生态平衡是由内外多种因素维系着的，这些因素包括环境、宿主和微生物。宿主 对微生态平衡的影响因素有：宿主的种类、年龄、性别、发育状况、生理功能、习性、 营养及休克、精神紧张、应激反应、感染、疾病、衰老、癌症、创伤、外科手术等等。 环境对微生态平衡的影响因素有：气候、食物、药物、抗生素治疗、化学因素、失重、 外来刺激、缺氧、放疗、化疗、辐射等等。微生物对微生态平衡的影响因素有：外来微 生物的种类和数量。上述种种直接或间接的因素都有可能影响微生态平衡，导致隐性或 显性的机体的、组织的、细胞的变化，生理感觉不适甚至患病【1 3 以5 1 。 1 1 5 正常茵群的某些危害性 通常情况下正常菌群对于人体无害，但在某些条件下如菌群失调、异位寄生等，正 常菌群中的某些微生物也是可以致病的【3 1 。 菌群失调是指在应用抗感染药物的过程中，由于体内对药物敏感的细菌被杀灭，而 一些对抗感染药物具有耐药性的细菌趁机大量繁殖，引起严重的感染，又称为二重感染。 常见的疾病包括假膜性肠炎败血症和儿童急性难治性肺炎等，通常病情严重愈合较差， 需要作紧急处理。目前，预防菌群失调的方法主要是合理使用抗菌药物，避免滥用或长 期使用；此外，在使用抗菌药物的同时以及发生菌群失调后，可适量服用乳酸杆菌制剂 ( 乳酸或乳酸菌素片) 、维生素c 及乳糖、蜂蜜、麦芽糖等以利于大肠埃希氏菌生长；口 服叶酸、复合维生素b 、谷氨酸及维生素b 1 2 以利于肠球菌生长；亦可用健康成人粪滤 液保留灌肠，以引入正常菌群。 在某些条件下，正常菌群中的微生物可以离开其正常的寄生部位寄生于体内的其他 部位，引起疾病，称为异位寄生。l e e 等人证实，乳酸菌异位寄生于腹腔时可引起乳酸 菌性腹膜炎 1 6 - 1 8 l 。 1 2 微生态学理论和微生态制剂 1 2 1 微生态学理论 19 7 7 年，德国v o e k e r r u s c h 博士率先提出“微生态学”( m i c r o e c o l o g y ) 概念并在德 国建立起世界上第一个微生态学研究所，从事对双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌等活菌制 剂( 生理性细菌) 作生态调整疗法的研究与应用【19 1 。尔后，微生态学作为一门新兴的生 江南大学硕士学位论文 命科学分支迅速的发展起来。何清明等将微生态学定义为“研究j 下常微生物与其宿主内 环境相互依赖和相互制约的细胞水平和分子水平的生态科学”【l 引，它是微生态制剂的 理论基础。微生态学是生态学由宏观向微观深入研究发展而形成的。宏观生态学研究的 对象是大气、土壤、水、动植物等，而微生态学研究的是正常微生物。正常微生物在健 康体内和体表有数百种之多，数量比动物体本身的细胞还要多。正常微生物与动物细胞 紧密接触，交换着物质、能量和各种生命信息，对动物体产生营养、免疫、生长刺激、 生物拮抗等功能，形成动物机体生命活动的必需成分 2 0 2 1 j 。 随着微生态学理论研究的不断深入，微生态制剂( m i c r o b i a l e c o l o g i c a la g e n t ， m i c r o e c d o g i c a lm o d u l a t o r ) 也随之迅速地发展起来。微生态制剂与其它药物不同，从理 论上讲，它优于抗生素，克服了应用抗生素所造成的菌群失调、耐药菌株的增加以及药 物的毒副反应。实践证明，微生态制剂的优越性表现为健康人群可使用它来增强体质， 提高健康水平，达到防病治病目的，其作用机理有下列几个方面【1 2 , 2 2 】： 1 优势种群理论微生态学认为，人体、动植物体表及体内寄居着大量的正常微生 物群。宿主、正常微生物群和外环境构成一个微生态系统。在正常条件下，这个系统处 于动态平衡状态。这一方面对宿主有利，能辅助宿主进行某些生理过程；另一方面对寄 居的微生物有利，使之保持一定的微生物群落组合，维持其生长与繁殖。在微生态系统 内微群落水平中，少数优势群对整个群落起着决定作用，而在微种群内部优势个体对整 个群落起着控制作用。一旦因种种原因而失去优势种群，则微群落就会解体。若失去优 势个体，则优势种群更替，并改变微生态平衡。例如，由于抗生素、放射治疗、手术和 过敏性疾患等因素引起正常菌群变化，微生态平衡遭到破坏，即微生态和菌群的平衡失 调，引起一系列临床症状。如双重感染和免疫力降低等。利用宿主体内的正常微生物优 势菌群成员的益生菌，制成的微生态制剂，可以调节失调的菌群，使宿主体内恢复正常 的微生态平衡，达到防病治病的目的 2 3 】。 2 生物拮抗理论生物拮抗理论又称生物屏障理论。肠道内正常菌群直接参与机体 生物防御的屏障结构，包括化学屏障和生物屏障，生物屏障是指肠内主要菌群的代谢产 物例如乙酸、乳酸、丙酸、过氧化氢及细菌素等活性物质，可阻止或杀灭病原微生物在 体内的定殖。生物屏障是指定殖于黏膜或皮肤上皮细胞之间的正常菌群所形成的生物膜 样结构，通过定殖保护作用影响过路菌或外来致病菌的定殖、占位、生长和繁殖。微生 态制剂中的益生菌就是这类正常菌群中的成员，可参与生物屏障结构，发挥生物拮抗作 用f 8 , 1 2 】。 3 生物夺氧理论根据正常微生物群的自然定殖规律，人或动物出生时是无菌的， 出生后不久就被一系列微生物细菌定殖了。定殖的顺序先是需氧菌，后是兼性厌氧菌， 随后的是厌氧菌。厌氧菌之所以不能先定殖，是因为自然生境内有过多的氧。在需氧或 兼性厌氧菌生长一段时期后，由于氧被大量消耗，从而提供了厌氧菌生长条件，厌氧菌 才能生长。厌氧菌虽然不能先定殖，但是整个微生态系统中其数量上占据首位，并保持 着一定的生态平衡。利用无毒、无害、非致病性微生物( 如蜡样芽孢杆菌等) 暂时在肠 4 1 前言 道内定殖，使局部环境中氧分子浓度降低，氧化还原电位下降，造成适合正常肠道优势 菌生长的微环境，促进厌氧菌大量繁殖生长，最终达到微生态平甜8 , 1 2 , 2 4 】。 4 三流循环学说三流循环其主要内容是能量流、物质流及基因流的循环。 能量流即能源运转，正常微生物群的内部与其宿主保持着能源交换和运转的关系。 现在已提出一个生态能源学的分支，它们研究人类、动植物与正常微生物之间，正常微 生物与正常微生物之间所存在的能源交换关系。近年已从电子显微镜的观察中发现，人 和动物肠上皮细胞的微绒毛( m i c r o v i l l u s ) 与正常细菌细胞壁上的菌毛( p i l i ) 极为贴近， 并发现有物质交换的现象【1 引。 物质流即物质交换，正常生理菌群的能源与物质均依赖于宿主，不存在宏观生态学 中的生产者、消费者和分解者的区别，但都存在着降解( c a t a b o l i s m ) 与合成( a n a b o l i s m ) 的代谢。降解与合成是微生物代谢中的必然途径，这与宿主细胞的功能是一致的。正常 生理微生物菌群与宿主细胞通过降解和合成代谢进行物质交换。裂解的细胞与细胞外酶 可为微生物利用，而微生物产生的酶、维生素、刺激素以及微生物降解的细胞成分也可 为宿主细胞利用，如此反复进行着物质交换。 基因流即基因交换在正常微生物之间有着广泛的基因( o pb n a ) 交换，例如耐药因 子( r 因子) 、产毒因子等都可在正常微生物之间通过物质的传递进行交换。微生态制剂 可以作为非特异性免疫调节因子，促进机体吞噬细胞的吞噬能力和促进b 淋巴细胞产生 抗体的能力。这不仅可以抑制腐败茵和致病菌的生长，还可降解肠道的有毒物质( 如氨、 酚、内毒素等) ，保证微生态系统中的能量流、物质流和基因流的正常运转。 微生态制剂是在微生态学理论的指导下，调整微生态失调( m i e r o d y s b i o s i s ) 、保持微 生态平衡( m i c r o e u b i o s i s ) 、提高宿主( 人、动植物) 健康水平或增进健康状态( w e l l b e i n g ) 的生理性活菌制品( 微生物) 及其代谢产物以及促进这些生理菌群生长繁殖的物质制品。 微生态制剂又称为微生态调节剂( m i c r a e c o l o g i c a lm o d u l a t o r ) 、益生素( p r o b i o t i c ) 等。 目前微生态制剂主要是具有一定生理作用的活菌制剂，是正常动物菌群的生理性细菌， 经过严格选育和驯化，由生物工程和微生态工程制备，能通过动物体胃酸、胆液、胰液、 肠液等屏障而存活，最后在消化道定殖并繁殖，对动物机体产生某种生理生态作用。目 前国际上己将其分成3 个类型，即益生菌( p r o b i o t i c s ) 、益生元( p r e b i o t i c s ) 和合生素 ( s y n b i o t i c s ) 2 5 , 2 6 1 。 1 2 2 微生态制剂的发展概况 随着微生态学理论研究的不断深入，微生态制剂( 或称微生态调节剂m i c r o e c l o g i a l m o d u l a t o ) 也随之迅速地发展起来。自1 9 2 9 年英国的f l e m i n g 发现抗生素，并于1 9 4 5 年实现工业化生产以来，人类在病原体导致的疾病治疗方面取得了革命性的进步，给人 类生产和生活带来了巨大变化【2 7 】。但随着人类不断地、无限制地扩大抗生素的使用范围 和使用剂量，而未考虑到其对微生态平衡的负面影响，其弊端也逐渐显露出来，主要表 现为耐药性的产生、毒性反应、扰乱正常菌群、过敏反应以及药物残留、污染环境等， 对人类健康造成严重威胁。面对这种情况，人们一方面要求禁止滥用抗菌药物，西欧、 日本、美国等国家己经相继颁布一系列法律，从立法上限制抗生素使用，另一方面要求 5 江南大学硕士学位论文 发展新的生态科学理论并研制抗生素的替代品【2 8 1 。微生态学及微生态制剂就是在这一背 景下应运而生和发展壮大的新兴理论和制品。 虽然早在本世纪初( 1 9 7 0 年) 梅切尼科夫( e l i em e t c h n i k o f f ) 就在欧洲提倡饮用酸 牛奶可健康长寿，微生态制剂亦从此而风行于世界各地，但微生态制剂真正用于防治疾 病却是近2 0 年的事。 日本是世界上研制开发和利用微生态制剂较早的国家之一，其产品主要是双歧杆菌 活菌制剂。7 0 年代初，已将双歧杆菌活菌制剂用于临床治疗腹泻，至8 0 年代中期已有 2 6 种产品，9 0 年代已达到饱和状态。据报道，至今在日本生产这类制剂年产值达2 0 0 亿日元以上的企业已有1 0 余家。其品种分3 大类，即双歧杆菌食品( 包括双歧酸奶， 双歧杆菌乳制品、双歧杆菌面包及饼干类) ，双歧杆菌保健食品( 含双歧因子) ，是一种 以双歧杆菌促生因子为中心的特定保健食品( 包括强化寡糖类食品及双歧杆菌、乳杆菌 培养物的提取物等) 和双歧杆菌药品( 包括单菌制剂和联菌制剂) ，其剂型有粉剂、颗料 剂、针剂、胶囊剂和微胶囊剂等多种。 其他许多国家，例如德国、美国、法国、意大利、荷兰、英国、俄罗斯和韩国等亦 都有不同类型的微生态制剂产品投放市场，而且数量和品种亦在不断扩大，有的产品近 年来己进入我国市场。 我国最早使用微生态制剂乳酶生( 表飞鸣) 来治疗肠道疾患。8 0 年代初大连医科大 学康白教授首先研制成功促菌生( 蜡杆芽孢杆菌) 以来，各种活菌微生态制剂相继研制 成功并陆续投放市场，这些微生态制剂一问世，便受到了人们的普遍关注和欢迎，并以 惊人的速度、良好的效果被更多人群所接受。其主要原因是该制剂能纠正微生态失调， 调节人体微生态平衡，起到有病辅治、未病防病、无病保健的主要作用 2 2 , 2 9 j 。近年来， 随着使用抗生素的弊端日益凸现，我国对动物微生态学基础理论和应用的研究也取得了 可喜的成就，一批动物微生态制剂脱颖而出，获得了较大的社会效益和经济效益【2 引。 1 2 3 微生态制剂的作用 1 调整微生态失调人体和动物肠道内的正常微生物群是在长期进化过程中形成 的，是动物机体的一部分，它保持相对平衡的稳定状态，对动物的生长发育和抵御疾病 具有十分重要的意义。但在某些因素影响下，肠道微生物生态系统会被破坏，引起肠道 菌群失调，使动物产生疾病症状。应用微生态制剂可以补充和恢复优势菌群的数量、种 类和比例，防止细菌移位，恢复微生态平衡，维持肠道健康【3 0 j 。 2 抑制有害菌生长促进有益菌生长正常菌群直接参与机体生物防御的屏障结构， 并且与外源细菌争夺营养物质、占取生存空间，这些生物拮抗作用有效阻碍病原菌在肠 道黏膜上定殖，维护肠道健康。而微生态制剂可以补充肠道优势菌群的数量，促进有益 菌生长。有些微生态制剂还可以合成短链脂肪酸、过氧化氢、细菌素、抗生素等抗菌物 质，抑制有害菌的生长，起到拮抗作用。 3 刺激机体免疫机制无菌动物由于缺乏肠道微生物，肠道内派依尔节( p e y e r s p a t c h e s ) 数目比正常动物少，免疫球蛋白a 型( i g a ) b 细胞的数量仅是正常动物的十分 之一；免除无菌状态，动物的免疫系统可恢复正常发育，这两个现象都说明肠道微生物 6 1 前言 对宿主的免疫系统发育具有重要作用【3 。g r o e n l u n d 等【3 2 i 研究o 6 个月的健康新生儿时， 发现肠道内脆弱类杆菌和双歧杆菌定殖的时间越早，外周血中i g a 定向细胞的含量可以 越早的被检测到；随着肠内脆弱类杆菌和双歧杆菌数目增加，外周血中i g a 定向细胞的 数量也逐渐增加，由此可见，肠内固有菌可以促进肠黏膜内免疫器官的发育成熟。口服 添加的益生菌暂时定殖于肠道后，可模仿固有菌的免疫促进作用，而且其中的一些菌株 长期定殖后，还可通过产生免疫信号影响外周或肠道局部免疫系统的功能 3 2 , 3 3 j 。 微生态制剂还能激发细胞应答，增强宿主免疫力【3 4 1 。微生态制剂可作为非特异免疫 调节因子，通过细菌本身或细胞壁表面结构成分刺激宿主免疫细胞，使其激活，产生促 分裂因子，提高自然杀伤细胞和巨噬细胞活性。此外，微生态制剂还可以发挥特异性免 疫功能，促进宿主b 细胞产生抗体。为了抵抗肠道内细菌及毒素对黏膜细胞的黏附和穿 透，哺乳动物都有健全的肠道相关淋巴组织，在肠黏膜下层有许多潘氏结和免疫细胞， 其中的浆细胞能够分泌i ga 至黏膜表面，i ga 的作用主要表现为两个方面：一是粘液中 的i ga 与免疫原性物质相互作用，避免其黏附至肠黏膜细胞上；二是凝集细菌或鞭毛， 使其失去黏附能力。而芽孢杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌可使动物肠道黏膜底层细胞增加， 出现淋巴细胞、组织细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润，细胞吞噬功能增强，机体免疫特别 是局部免疫功能提高，分泌型i ga 的分泌增加，从而抵御感染【3 副。 4 促进机体营养吸收及生长很多微生态制剂能在动物肠道内产生各种消化酶，提 高营养物质的利用率。例如芽孢杆菌具有极强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，并在厌 氧条件下发酵糖类，通过e m p 和h m p 两条途径产生一系列有机酸，这些有机酸不仅 能有效抑制有害菌的繁殖，也为乳酸杆菌等的生长创造了有利的条件；多数细菌能合成 多种维生素以及各种必需氨基酸；乳酸杆菌类产生的有机酸和过氧化氢能增加反刍动物 消化道内挥发性脂肪酸的含量，并防止有毒代谢产物( 如氨和胺) 对肠道的不良刺激， 减少肠道疾病的发生率；鸡肠道中的肠球菌可使鸡更好地利用食物中的维生素【l 引。 5 延缓衰老微生态制剂有利于补充老年人体内双歧杆菌和乳杆菌等优势菌群的缺 失，坚固肠道生物屏障结构，参与肠道菌膜的重建，从而起到重要的占位保护作用和排 它性的生物拮抗作用；能分泌多种有机酸、细菌素和抗菌物质，构建化学屏障、使异常 增殖的腐败菌减少，并大大地减少了机体对有毒产物( 组胺、酷氨、腐胺、硫化氢、吲 哚、亚硝盐和酚类等) 的产生与吸收，有利于脏器功能的正常发挥及衰老进程的延缓。 微生态制剂作为免疫赋活剂或非特异性免疫调节因子，可激活或促进机体的细胞和体液 免疫功能，这就有利于机体免受致病微生物的侵袭和损害。微生态制剂中的微生态制剂 还具有激活机体细胞内超氧化歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的作 用，促使抗氧化物产生，减少自由基的损伤和延缓老化作用。因此，微生态制剂对老年 人保健作用就在于通过对机体内微生物菌群调整，激发机体本身的效应( 如微生态系、 免疫系和代谢系的活动) ，来达到调节自身，延缓衰老进程的目的【2 列。 6 抗过敏及其他某些过敏反应的发生是由于肠黏膜屏障功能的崩溃，致使大量抗 原侵袭所造成的。已有研究报道，微生态制剂具有调节某些过敏反应的功效，它是通过 改善肠黏膜的屏障功能来实现的。有关特异治疗和食品过敏反应的研究表明：通过恢复肠 7 江南大学硕士学位论文 黏膜的透过性，调节区域免疫反应及应用能改变食品抗原的微生物，免疫反应能被引导 恢复至j 下常【3 6 1 。 ， 微生态制剂对人体的健康促进作用还包括：促进泌尿系统健康、调节体内胆固醇水 平、减弱放射性同位素的作用、降低致癌化合物在肠道中的含量水平、防治泌尿系统及 肠道系统感染、抑制幽门螺杆菌引起的感染、降低与酒精中毒性肝疾病相关的内毒素的 作用等等【3 7 。9 1 。胆固醇与胆汁酸的代谢与成人患动脉硬化症有密切关系，成人体内大约 存在1 4 0g 胆固醇，每天要有1 被代谢；欧美人大约每天产生6 0 0g 以上，而亚洲人产 生2 0 0 3 0 0g 胆汁酸，胆汁酸代谢产生胆固醇，在消化管内形成含有胆固醇的脂质和乳 靡粒，促进脂肪的吸收，而异常的胆汁酸代谢可能成为大肠癌的促进剂。现在已知双歧 杆菌、嗜酸乳酸杆菌、粪肠球菌及屎肠球菌是有益的，在消化管内能消化胆固醇，并能 降低血胆固醇的浓度，其作用机制可能与这些菌对h m g c o a 还原酶的抑制作用有关。 1 3 丁酸梭状芽孢杆菌 1 3 1 丁酸梭状芽孢杆菌的发现 丁酸梭状芽孢杆菌( c l o s t r i d i u mb u 缈i c u m ) 即丁酸菌，又名酪酸菌。19 3 3 年日本千 叶医学院卫生系的宫入近治( m i y a i r i ) 博士报道了从粪便中分离得到丁酸梭状芽孢杆 菌，因此又名宫入菌【4 0 1 。根据p r a z m o w s k i 在1 8 8 0 年发表的文献，早在1 8 7 7 年就已经 有对酪酸梭状芽孢杆菌的记录和描述。在过去的研究工作中，不同的研究者曾经先后用 了十几种不同的名称记录和描述这个菌种。1 9 8 0 年，将其正式命名为酪酸梭状芽孢杆菌 ( c l o s t r i d i u mb u t y r i c u m ) 4 。主要存在于奶酪、天然酸奶、人与动物的肠道与粪便、某些 树叶、土壤等自然环境中，也是工业生产丁酸的主要菌种，在酿酒业中一般被当作有害 菌看待，一般在1 0 2 0 的健康人群中能分离至l j 42 1 。由于丁酸菌具有特殊的微生态学 特性，日趋受到医学、兽医学、饲料工业的广泛关注。 1 3 2 丁酸茵的特征 丁酸菌是一种直或弯曲的革兰氏阳性厌氧内生芽孢杆菌，后期培养物可变为革兰氏 阴性杆刮4 3 1 。菌落灰白色，呈煎蛋样，中间隆起，菌体体宽0 5 1 7 岬，长2 4 7 6l x m ， 菌体中常有圆形或卵圆形芽孢，无孢子外壁和附属丝，形成芽孢后一端膨大呈鼓锤状， 或中部膨大呈梭状或纺锤状使菌体偏末端部膨大呈梭状，单个或成对，短链，偶见长丝 状菌体，周生鞭毛，具有运动性【4 3 , 4 4 。 丁酸菌不水解酪蛋白和明胶，但能使牛奶变酸、凝固、产气；不分解蛋白质，不产 生胺、氨、吲哚、硫化氢等物质；丁酸菌体内存在着脱氢酶、氢化酶、糖苷酶、内酰胺 酶等酶系，能分解高聚糖( 如淀粉、纤维素) ；寡聚糖( 如低聚半乳糖、木聚糖) ；麦芽 糖、甘油、葡萄糖、果糖乳糖、木糖、核糖、阿拉伯糖、甘露糖等；丁酸菌不能利用卫 矛醇和山梨醇；发酵产物主要有丁酸、乙酸、甲酸、丁醇、乙醇、氢气、二氧化碳、1 ， 3 丙二醇；d n a 的g + c 含量为2 2 8 克分子1 4 5 , 4 6 1 ；另外从人粪便中分离的丁酸菌株一 拜氏梭菌杂交菌株还含有转粘质酶( t r a n s l i m i n a s e ) ，其能降解肠道内的果胶酸为中间产 1 前言 物寡聚半乳糖( o a ) 和4 ，5 不饱和半乳糖醛酸( d a ) ，o a 最终分解成挥发性的短链脂肪 酸一乙酸、少量丁酸和甲酸，d a 则完全分解为乙酸和甲酸。 1 3 3 丁酸茵的生理作用 1 对肠道菌群的作用丁酸菌制剂同双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪链球菌等其它微生 态制剂一样，可用以治疗肠道感染和肠功能异常，是调节人和动物肠道微生态平衡的有 益菌，其最显著的生物学特性是能与肠道内有益菌共生并促进有益菌的增殖和发育，特 别是它能产生促双歧杆菌发育的因子【4 7 1 。株晓慧等【4 8 】将丁酸菌分别与双杆菌、乳酸菌、 粪杆菌进行体外混合培养，结果发现双歧杆菌、乳酸菌、粪杆菌活菌含量分别比对照组 增加2 4 、4 2 5 7 、6 7 6 。赵熙等【4 9 j 通过动物实验和人体受试实验，对丁酸菌活菌制 剂一泰平片对肠道菌群的影响进行了研究，结果发现受试对象肠道内双歧杆菌数量增 加，与对照相比差异极显著，乳酸菌数量增加，差异显著。另外，丁酸菌菌落可增加肠 内酪酸、醋酸等短链脂肪酸生成量，可促进排便，抑制肠道内葡萄球菌、念珠菌、克雷 伯氏菌、变形杆菌、弯曲杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门氏菌、霍 乱沙门菌、霍乱弧菌等有害和腐败菌的生长繁殖【5 们，陆俭等【5 l 】实验发现丁酸菌对霍乱弧 菌具有拮抗作用。丁酸菌通过促进有益菌和抑制有害菌双重作用纠正肠道菌群失调，改 善肠道内微生态环境，减少肠道疾病的产生，临床实验证明本菌剂对腹泻、肠应激综合 征、腹部症状的有效率可达8 0 以上，对便秘、便稀、胃肠炎的疗效也有6 0 0 o - - - 7 5 ， 是一种良好的整肠微生态药物 4 3 , 5 2 , 5 3 j 。 2 促进生长功能丁酸菌体内存在着蛋白酶i 和蛋白酶i i 及脂肪酶，其能促进动物 对脂肪和蛋白质的消化吸收。丁酸菌还具有氨基酸载体的作用，能转运所有的氨基酸， 但不分解，所有这些都有利于促进动物生长。用蛋白酶、脂肪酶、糖化酶、乳酸菌、丁 酸菌为有效成分制成特效鱼用饲料添加剂，以o 5 和2 的比例添加到饲料中，饲喂8 周后，饲料效率比无添加剂组高8 0 和7 0 ，增重率高1 2 0 和1 1 5 ，并且摄食早，体 表黏液分泌多，体色新鲜，肉质有适量脂肪，味感改善，疾病率和死亡率下降，粪臭减 少且呈类状固体易清除【4 5 1 。李恕等【5 4 】将丁酸菌制剂用于水产类，结果鱼及特种水产类日 增重率提高大约1 5 - 4 0 ，杂食性鱼类可提高2 2 以上。用3 株乳酸菌、2 株芽孢菌、 2 株酵母菌、1 株光合菌、1 株丁酸菌，以麸皮为主要原料，多菌混合厌氧固态发酵生产 出新型微生物饲料添加剂。后经过养殖实验表明：2 添加量组比对照组提高日增重8 ， 提高饲料利用率1 0 ，降低粪便n h 3 的含量6 1 1 5 川。 3 生物催化剂丁酸菌制剂是一种生物催化剂，能有效的降解饲料中的抗营养因子， 消除其抗营养作用，有效地催化饲料中养分的分解，从而提高饲料利用率，提高饲料的 营养价值。丁酸菌同其它需氧芽孢杆菌一样在消化道内复活发育的过程中产生活性很强 的胞外酶一蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖苷酶等多种酶类，同时还产生降解植物饲料中 非淀粉多糖的酶果胶酶、纤维素酶、葡聚糖酶，这些活性酶直接作用于动物消化道的 “酶池”，降解饲料中相应的营养成分，提高饲料中营养成分的消化率，从而提高蛋白 质和能量的利用率，降低料肉比；间接作用是这些活性酶刺激机体本身酶的活性，从而 提高动物的生产性能，因而丁酸菌微生态制剂又被称之为抗营养因子克星【4 9 l 。 9 江南大学硕士学位论文 4 免疫调节功能丁酸菌能激活免疫系统，促进免疫功能，维持机体的健康状况。 给鸡饲喂含丁酸菌菌体的饲料后，测其血清中n d h i 抗体效价的变化，结果显示：摄 食一周后n d h i 的效价迅速上升。傅思武【56 j 用酪酸菌婴儿双歧杆菌二联活菌制剂对小 鼠进行实验，结果3 0d 后测定发现小鼠抗体生成细胞数增加，说明该制剂具有一定的免 疫调节功能。用2 7 1 0 3c f u 和2 7 1 0 4c f u 弧菌感染1 0g 重虹鳟鱼，同时饲喂丁酸菌和 白蛋白的实验发现：丁酸菌处理的鱼。肾、肝脏、血液中弧菌数目均少于对照。2 7 x 1 0 3c f u ( 菌落形成单位) 的弧菌感染，1 0g 重虹鳟鱼饲喂酪酸菌和白蛋白的死亡率分别为1 0 和 7 8 ；而2 7 1 0 4c f u 的弧菌组，死亡率则分别为7 3 和9 3 。丁酸菌处理的肾噬菌细胞 的活力也较高，表明了饲喂丁酸菌提高了虹鳟鱼对弧菌感染的免疫力【5 。 5 提供营养元素丁酸菌在发酵过程中能产生葡萄糖、麦芽糖等6 种糖，及维生素 e 。这些物质直接为动物提供营养元素，维生素e 能强化血管，增强抗病性，激活细胞， 对机体非常重要。以丁酸菌为主要成分制成v e 吸收促进剂对乳用仔牛进行实验，结果 发现血清中v e 含量呈上升趋势，与对照组差异显著。用幼鸡实验也得出相似的结果【4 5 j 。 1 3 4 丁酸茵的芽孢 芽孢是一种特殊的细胞形态，是某些细菌在其生长发育后期，由于生长环境中的某 些因素发生变化，在细胞内形成的一个圆形和椭圆形、厚壁、含水量低的休眠构造【5 3 1 。 芽孢对环境中各种有害因子，具有很强的抗性，尤其是对热的抗性非常突出。芽孢结构 远比营养体细胞结构复杂得多，因为芽孢有多层结构。遗传因素和环境因子( 碳氮源和 无机盐含量及比例、温度、p h 、氧和无机离子) 对芽孢形成具有重要的影响狰引。 芽孢含有一种特有的化学物质吡啶二羧酸( d p a ) ，它主要存在于芽孢的核心中。芽 孢中含有钙离子，大部分也同核结合。有充分理由可认定，钙同吡啶二羧酸结合成吡啶 二羧酸钙是使芽孢具有高抗热性的重要原斟”j 。 芽孢形成从遗传角度讲，是一个受基因调控的极其复杂的过程。包括形态结构、化 学组成和生理功能等多方面的变化。每个生化变化都受特定的基因和类似操纵子的一组 基因所决定和调节。已发现枯草芽孢杆菌至少有5 0 个基因与芽孢形成