（食品科学专业论文）硇洲马尾藻Snaozhouense+spnov多糖的提取、分离纯化及抑菌活性研究.pdf

c i a s s i f i e di n d e x ： t $ 2 0 1 1 s e c u r i t yc l a s s i f i c a t i o n ： u d c ： 6 6 4 8 9 s e c u r i t yp e r i o d ： d i s s e r t a t i o nf o rt h em a s t e r sd e g r e e s t u d i eso n e x t r a c t i o n ， p u r i f i c a t i o na n da n t i b a c t e r i a b i o a c t i v i t yo fp o l y s a c c h a r i d e s f r o m & n a o z h o u e n s e s p ，2 d p c a n d i d a t e ： s u p e r v i s o r ： s p e c i a l i t y ： r e s e a r c hf i e l d ： u ni v e r s it y ： - s u b m i s s i o nd a t e ： w a n gb o p r o f h u a n gh e a g r i c u l t u r e f o o dq u a l i t ya n ds e c u r i t y g u a n g d o n go c e a nu n i v e r s i t y a p r i l2 0 1 0 3洲7川川i60m 8 iiiil删y 广东海洋大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承 担。 作者签名：拼尊 2 0 。年6 月西日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权广东海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于l 、保密i 1 ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密d 。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 王鸽 刷磁饬和 1 汐刀鼽 。 2 0fd 年6 月f f 日 2 0 户年6 月lr 日 硇洲马尾藻( sn a o z h o u e n s es p n o v ) 多糖的提取、分离纯 化及抑茵活性研究 摘要 本研究以硇洲马尾藻( sn a o z h o u e n s es p n o v ) 为研究材料，主要分析了其基本 营养成分，研究了其多糖的提取、分离、纯化、化学组成与结构，并对分离纯化后的 多糖抑菌活性做了初步探讨。 对硇洲马尾藻的基本营养成分分析测定，结果显示：碳水化合物、蛋白质和狄分 是硇洲马尾藻的主要成分，占藻体干重的8 5 左右。其中不溶性膳食纤维占藻体干重 的1 0 8 8 ；蛋白质占1 3 9 5 ；必需氨基酸丰富，占氨基酸总量的4 1 ，必需氨基酸 与非必需氨基酸的比值为o 6 9 ；脂肪含量为2 4 ，不饱和脂肪酸含量高；矿质元素 含量丰富，尤其是铁和锌含量高。 对硇洲马尾藻多糖提取工艺进行了优化：在单因素试验基础上，选择提取温度， 提取时间，料液比为自变量，多糖得率为响应值，利用b o x b e n h n k e n 中心组合试验和 响应面分析法，研究各自变量交互作用及其对硇洲马尾藻多糖得率的影响，模拟得到 二次多项式回归方程的预测模型，最终确定硇洲马尾藻多糖提取最佳工艺。得出的最 佳提取工艺为：料液i ；l ：l ：2 1 ，提取温度9 0 7 ，提取时问5 1 h ；在此条件下，硇洲马 尾藻多糖得率达到6 3 9 。 热水浸提得到的粗多糖s n p ( s n a o z h o u e n s es p n o v p o l y s a c c h a r i d e s ) 经过 d e a e 5 2 纤维素离子交换柱层析后，得到5 个洗脱峰，收集其中最主要的两个峰， 分别命名为s n p 2 和s n p 3 ，再将s n p 2 和s n p 3 过s e p h a d e xg 1 0 0 葡聚糖凝胶柱层 析进一步纯化，得到s n p 2 2 和s n p 3 2 两个较纯的多糖组分。 通过醋酸纤维薄膜电泳鉴定出s n p 2 2 和s n p 3 2 为两个组成比较均一的多糖组 分；红外光谱分析得出s n p 2 2 和s n p 3 2 均具有多糖相关基团的特征i 吸收峰；气相 色谱分析得出，s n p 2 2 主要是由甘露糖和葡萄糖组成，含少量木糖和半乳糖，其摩 尔比木糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖为0 2 5 ：1 3 7 ：l ：0 1 7 ；s n p 3 2 主要是由阿拉 伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，也含少量木糖和半乳糖，其摩尔比为阿拉伯糖：木糖： 甘露糖：葡萄糖：半乳糖为0 4 4 ：0 2 8 ：1 1 0 ：1 ：0 2 3 ；凝胶渗透色谱分析得出 s n p 2 2 的分子量为8 3 0 x1 0 4 d a ，s n p 3 2 的分子量为1 2 2 x1 0 5 d a 。 通过酶标仪法评定了s n p 2 2 和s n p 3 2 的体外抑菌活性，得出当浓度达到 1 2 5 m g m l 时，两种多糖组分均有较好的抑菌活性；通过扫描电镜观察初步推断 s n p 2 2 和s n p 3 2 的抑菌机理可能为抑制细菌的j 下常分裂增殖。 目前，国内外尚无有关硇洲马尾藻( sn a o z h o u e n s es p n o v ) 多糖的研究报道，本 试验为首次对其提取、分离纯化、化学组成、结构及生物活性进行了初步的研究。以 期为硇洲马尾藻的开发与利用提供基础的理论依据。 关键词：硇洲马尾藻，多糖，提取，分离纯化，抑菌 s t u d i e so ne x t r a c t l 0 n ，p u r i f i c a t i o na n d a n t i b a c t e r i ab i o a c t i v i t yo fp o l y s a c c h a r i d e s f r o m n a o z h o u e n s e s p n o v a b s t r a c t n a o z h o u e n s es p n o v w a ss t u d i e di no u rr e s e a r c h w eo p t i m i z e dt h ee x t r a c t i o no f p o l y s a c c h a r i d e s ，e x p l o r e t h ep r o c e s so fs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，i l l u s t r a t et h e c o m p o s i t i o na n ds t r u c t u r ea n dg i v eap r i m a r yd i s c u s sa b o u tt h e i ra n t i - b a c t e r i u ma c t i v i t y t h em a i nc h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fs n a o z h o u e n s es p n o v w e r ea n a l y z e d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tc a r b o h y d r a t e s ，c r u d ep r o t e i na n da s hw e r ei t sm a i nc o n s t i t u e n t ，w h i c hw a s8 5 o ft h ed r yw e i g h t t h ei n s o l u b l ed i e t a r yf i b e rr e a c h e d10 8 8 t h ec o n t e n to f p r o t e i n r e a c h e d13 9 5 ，a n de a ac o n t e n tw a s41 o ft h et o t a la a ，e a a n e a ar e a c h e do 6 9 c r u d ef a tc o n t e n tw a s2 4 t h ec o n t e n to fm i n e r a l sw e r er i c h ，e s p e c i a l l yf e ，z n o p t i m u mc o n d i t i o no fe x t r a c t i o n o f n a o z h o u e n s es p n o v p o l y s a c c h a r i d ei s o p t i m i z e db yr e s p o n s es u r f a c et e s t o nt h eb a s i s o fs i n g l e - f a c t o rt e s t ，t h em a t h e m a t i c a l r e g r e s s i o n m o d e li se s t a b l i s h e da b o u tt h ed e p e n d e n tv a r i a b l e ( e x t r a c t i o ny i e l do fs n a o z h o u e n s es p n o v p o l y s a c c h a r i d e ) a n di n d e p e n d e n tv a r i a b l e s ( e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e ， e x t r a c t i o nt i m ea n dr a t i oo fm a t e r i a lt ow a t e r ) u s i n gb o x b e n h n k e nc e n t e rc o m p o s i t e d e s i g na n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n sa sf o l l o w s ： e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e9 0 7 ，e x t r a c t i o nt i m e5 1h ，m a t e r i a lt ow a t e rr a t i o1 ：21 u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s t h ey i e l do fs n a o z h o u e n s es p n o v p o l y s a c c a r i d ei s6 3 9 s n p ( xn a o z h o u e n s es p n o v p o l y s a c c h a r i d e s ) a f t e rt h r o u g hd e a e 5 2c e l l u l o s e i o n e x c h a n g ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , o b t a i n e d5p e a k s ，c o l l e c tt h et w om o s ti m p o r t a n t p e a k s ，n a m e ds n p 2a n ds n p 3 ；s n p 2a n ds n p 3t h e np u r i f i e db ys e p h a d e xg - 1 0 0d e x t r a n g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , o b t a i n e dt w om o r ep u r ep o l y s a c c h a r i d en a m e ds n p 2 2a n d s n p 3 2 t h r o u g hc e l l u l o s ea c e t a t em e m b r a n ee l e c t r o p h o r e s i si d e n t i f i e dt h a ts n p 2 - 2a n d s n p 3 - 2w e r et w or e l a t i v e l yp u r ep o l y s a c c h a r i d e ；t h r o u g ht h ei n f r a r e ds p e c t r u ma n a l y s i s f o u n dt h a ts n p 2 - 2a n ds n p 3 2h a v et h ep o l y s a c c h a r i d ec h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a k s ； t h r o u g hg a sc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s ，s n p 2 2i sm a i n l yc o m p r i s e do fx y l o s e ，m a n n o s e ， g l u c o s ea n dg a l a c t o s ei nt h em o l a rr a t i oo f0 2 5 ：1 3 7 ：1 ：o 17 s n p 3 - 2i sm a i n l yc o m p r i s e d o f a r a b i n o s e ，x y l o s e ，m a n n o s e ，g l u c o s e a n d g a l a c t o s e i nt h em o l a rr a t i oo f 0 4 4 ：0 2 8 ：1 10 ：1 ：0 2 3 ；t h r o u g hg e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s t h em o l e c u l a r i w e i g h to fs n p 2 - 2 i s8 3 0 l0 4 d a t h em o l e c u l a rw e i g h to fs n p 3 - 2i s1 2 2 10 5 d a t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fs n p 2 - 2a n ds n p 3 2w e r ee v a l u a t e db ym i c r o p l a t e w e f o u n dt h a tw h e nt h ec o n c e n t r a t i o nr e a c h e d1 2 5 m g m l ，t h et w op o l y s a c c h a r i d eh a dg o o d a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ；t h r o u g hp r e l i m i n a r ys c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ei n f e r r e dt h a tt h e a n t i - b a c t e r i a lm e c h a n i s mo fs n p 2 - 2a n ds n p 3 - 2m a yi n h i b i tt h en o r m a lp r o l i f e r a t i o no f t h eb a c t e r i a t h e r ei sn or e p o r ta b o u tp o l y s a c c h a f i d e so fs n a o z h o u e n s es p n o v i n s i d ea n do u t s i d e ， o u rr e s e a r c hh a sg i v e naf i r s tr e p o r ta b o u tt h ep u r i f i c a t i o nm e t h o d s ，c h e m i c a lc o m p o s i t i o n a n ds t r u c t u r ea n dp r i m a r yb i o a c t i v i t yo fi t a n dw eh o p ei tc a n p r o v i d et h et h e o r yb a s i sf o r t h ed e v e l o p m e n ta n du s eo fs n a o z h o u e n s es p n o v k e yw o r d s ：sn a o z h o u e n s es p n o v ，p o l y s a c c h a r i d e ，e x t r a c t ，p u r i f i c a t i o n ，a n t i b a c t e r i u m i v 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 1 绪论1 1 1 研究背景1 1 2 国内外研究现状分析2 1 2 1 海藻多糖的生物活性2 1 2 2 海藻多糖的应用5 1 2 3 海藻多糖的构效与活性关系研究5 1 2 4 海藻多糖的提取，分离和纯化6 1 2 5 海藻多糖的结构分析7 1 3 本试验主要研究内容8 2 硇洲马尾藻基本营养成分分析9 2 1 材料与方法9 2 1 1 材料。9 2 1 2 主要仪器9 2 1 3 主要试剂9 2 1 4 分析方法9 2 2 结果与分析1 0 2 2 1 硇洲马尾藻的基本组成成分。1 0 2 2 2 硇洲马尾藻的氨基酸构成及营养评价i o 2 2 3 硇洲马尾藻脂肪酸组成1 1 2 2 4 矿物质1 2 2 3 小结1 3 3 硇洲马尾藻多糖提取工艺优化1 4 3 1 材料与方法1 4 3 1 1 材料与试剂1 4 3 1 2 仪器与设备1 4 3 1 3 方法1 s 3 2 结果与分析1 5 3 2 1 葡萄糖标准曲线的绘制1 s 3 2 2 单因素试验结果1 6 3 2 3 响应面试验安排及试验结果1 8 3 3 小结2 1 4 硇洲马尾藻多糖的分离纯化2 2 4 1 材料和方法2 2 4 1 1 材料2 2 4 1 2 主要仪器2 2 4 1 3 主要试剂2 3 4 1 4 方法2 3 4 2 结果与分析2 4 4 2 1 粗多糖s n p 的初步分离纯化2 4 4 2 2s n p l 和s n p 2 的s e p h a d e xg - 1 0 0 葡聚糖凝胶柱层析纯化2 5 4 2 3s n p 及组分s n p 2 2 和s n p 3 2 的碳水化合物含量及硫酸基含量测定2 6 4 3 小结2 7 5 硇洲马尾藻多糖结构解析2 8 5 1 材料与方法2 8 5 1 1 材料2 8 5 1 2 主要仪器2 8 5 1 3 主要试剂2 8 5 1 4 方法2 8 5 2 结果与分析3 0 5 2 1s n p 2 - 2 和s n p 3 - 2 的纯度分析3 0 5 2 2s n p 2 - 2 和s n p 3 - 2 的红外光谱分析3 1 5 2 3s n p 2 - 2 和s n p 3 - 2 的单糖组成3 3 5 2 4s n p 2 - 2 和s n p 3 - 2 的分子量测定3 s 5 3 小结3 6 6 硇洲马尾藻多糖体外抗菌活性的初步研究3 8 6 1 材料与方法3 8 6 1 1 材料3 8 6 1 2 主要仪器。3 8 6 1 3 主要试剂3 9 6 1 4 方法3 9 6 2 结果与分析4 0 6 2 1 受试菌的生长曲线及m i c 4 0 6 2 2s n p 2 - 2 和s n p 3 - 2 的抑菌机制初步探讨4 3 6 3 小结4 4 7 总结论4 5 一总结论4 5 二本文的欠缺之处及展望4 6 参考文献4 7 致谢5 3 作者简介5 4 导师简介5 4 广东海洋大学硕士学位论文 1 绪论 1 1 研究背景 海藻( a l g a e 或s e a w e e d s ) 是海洋生物资源的重要组成部分，主要分为四大类蓝 藻、绿藻、红藻和褐藻，另外还包括硅藻、甲藻、会藻等微藻。估计全世界海洋中生 长有15 0 0 0 余种海藻。它不仅在维护地球生态平衡方面起着非常重要的作用，而且 j 下成为人类的食物资源。集营养与药理活性于一身的藻类保健食品也越来越为人们所 重视。 我国藻类资源丰富，藻类产量居世界自i 列。以硇洲岛为例，研究发现硇洲岛共有 藻类5 6 属8 7 种，资源十分丰富。”。据统计，2 0 0 5 年我国藻类总产量1 5 4 7 8 万t 。在我国北 方大型经济藻类主要有海带、裙带菜、石花菜、角叉菜、鹿角菜、石莼和羊栖菜等； 在南方主要有江蓠、紫菜、麒麟菜、羊栖菜和马尾藻等。 湛江三面临海，有岛屿3 0 个，海岸线长达1 5 5 6 公罩，占广东省海岸线的4 6 ， 人均拥有海岸线与海洋大国同本相当，海洋资源十分丰富。湛江地区自古有食用天然 海藻的传统习惯，以前每逢端午节儿章服用海人草、鹧鸪菜等海藻以驱蛔虫，食用海 萝( 俗称“赤菜”) 、石花菜等以凉肠退火，食用马尾藻( 如硇洲马尾藻，俗称“黑菜”) 以清火和解喉毒、此外，江蓠( 俗称“蚝菜”、“海菜”) 也是人们喜爱的海洋食品。湛 江的海岸线和广阔浅海滩涂资源，为发展海洋藻类提供了得天独厚的自然条件，天然 海藻资源极为丰富。据调查，硇洲岛的底栖海藻就有3 l 科5 6 属8 7 种，其中大型经 济海藻4 2 种。 国外一些发达的海洋国家，如同本、美国等，已相继建立了现代的海藻高值化 深d h - r 综合利用产业。目前，在美、同等国的大商店罩，各种各样的以海藻多糖为原 料丌发的医药、保健食品及精细化工产品可谓是琳琅满目，品种繁多并深受消费者的 欢迎。与美、f 1 等国相比，我国的海藻加工业还相当落后。湛江是海洋大市，海藻资 源十分丰富，丌展近海海藻养殖、丌发和利用，既可解决农民收入，又可增强我市经 济增长后劲，可谓一举两得。 硇洲马尾藻( sn a o z h o u e n s es p n o v ) ，由我校名誉教授曾呈奎院士于上世纪8 0 年代发现并命名1 。根据叶、托混生的特征，硇洲马尾藻属于马尾藻亚属s a r g a s s u mj a g 叶托混生组z y g o c a r p i c a e 。主要特征：( 1 ) 藻叶较厚，边缘全缘。基部藻叶长披 针形、线形，叶脉不贯顶；上部藻叶线形或丝状，没有叶脉。( 2 ) 雌雄异株；生殖托 圆柱形，光滑；没有锯齿；单个或有时分叉。( 3 ) 叶托混生，生殖托上常常长出小叶 或气囊。( 4 ) 主枝、分枝和小枝上都有黑色腺点。 硇洲马尾藻( s n a o z h o u e n s es p n o v ) 多糖的提取、分离纯化及抑菌活性研究 啉jr 。8 竹i 6 ，7 惫匝 图1 硇洲马尾藻 f i g ls n a o z h o u e n s es p n o v 但到目前为止，对硇洲马尾藻相关的研究还罕有报道，因此本课题决定对其进行 研究。 1 2 国内外研究现状分析 海藻中含有多种活性成分，如多糖，甾醇，多酚等，其中最主要的是多糖，占海 藻干重的5 0 以上。近几十年来，随着对新免疫物质及新药物资源的开发与研究，人 们发现糖类在生物体中的作用不仅是作为能量资源或结构材料，更重要地参与了生命 现象中细胞的各种活动。多糖在自然界高等植物、藻类、细菌及动物体内均有存在， 分布极广。作为一类高价多聚物，由于其特殊的流变学特性，使得其在食品、纺织、 化妆品和医药领域具有较好的应用性。生物大分子表面的糖链能够控制细胞的分裂与 分化，调节细胞的生长与衰老。多糖在生物学上的重要意义决定了它在医药领域有广 阔的前景。多糖的生物活性主要表现在抗凝血、抗血栓、抗病毒、抗病毒、免疫调节、 降血脂、降血糖、抗肿瘤等作用。对多糖的构效关系的研究表明多糖的活性与以下的 因素有关，即：多糖的化学组成和糖苷键构型，多糖的取代基团特别是硫酸基的存在 及含量，多糖的空间结构，多糖的分子量大小等，这些因素都与多糖的活性有着密切 的关系。 1 2 1 海藻多糖的生物活性 1 2 1 1 抗病毒 自1 9 5 8 年g i r b e r 等发现g e l i d u mc a n i l a g e n i u m 提取出的多糖和卡拉胶具有抗流感b 和抗腮腺炎病毒后，科学家逐渐发现海藻多糖对多种病毒有抗性畸1 。 海藻多糖钙配合物( c a s p ) 能够抑制少数有包膜病毒的复制，这些病毒包括单纯 2 广东海洋大学硕士学位论文 疱疹病毒i 型、人巨细胞病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、流行性感冒病毒和 h i v i 。太平洋裂膜藻中的硫酸多糖是h i v 病毒逆转录酶的特异性抑制剂，其浓度 为2 0 0 0 l u m l 时，对病毒逆转录酶活性的抑制率高达9 2 ，而对宿主细胞d n a 和r n a 的合成无影响。这一物质不仅可抑铝i j h i v 逆转录酶，而且对其它病毒的逆转录酶也有 抑制作用1 。 研究表明海藻多糖的抗病毒作用与s o ：一含量成正相关。当海藻多糖的分子增大、 硫酸基团含量增多时，其抗病毒活性也增强。 1 2 1 2 抗氧化 海藻硫酸多糖( s p s ) 具有清除活性氧的作用，是有效的自由基清除剂，低浓度的s p s 对多形核白细胞( p m n ) 呼吸爆发产生的活性0 2 的作用是直接清除；而高浓度的s p s 除 直接清除p w n 呼吸爆发产生的0 2 外，尚能部分抑制p w n 活性，阻止0 2 。的生成。 褐藻多糖( b s p ) 在体外具有较强的清除f e n t o n 反应和光照h 2 0 2 产生的o h 署t l 黄嘌 呤黄嘌呤氧化酶和光照核黄素产生的0 2 。的作用，是一种很好的抗氧化剂 钝顶螺旋藻多糖能显著增强机体抗氧化及抗自由基损伤的能力，极大螺旋藻多糖 具有显著的清除o h 的活性盯1 。 1 2 1 3 抗肿瘤 海藻多糖抑制肿瘤的效果，一般认为不是直接作用于肿瘤细胞，而是作为生物免疫 反应调节剂通过增强机体的免疫功能而i 日j 接抑制或杀死肿瘤细胞，如能促进淋巴囚子 激活杀伤细胞( l a k ) 、自然杀伤细胞( n k ) 活性，诱导巨噬细胞产生肿瘤坏死因子等1 。 海带多糖l a s 是从海带l a m i n a r i n j a p o n i c aa r e s c h 中提取的一种由l 岩藻糖、d 半 乳糖等糖基组成的硫酸多糖类化合物，对小鼠肉瘤s 1 8 0 的抑制率可达8 6 5 砷1 。 从亨氏马尾藻中提取的硫酸多糖对小鼠艾氏腹水瘤、腹水型肉瘤s 1 8 0 表现出明显 的抑瘤效果，抑瘤率分别达3 3 0 7 和3 0 7 7 0 1 。 项华等利用小鼠对海藻多糖的抗突变功能进行了研究，结果表明海藻多糖对环磷 酰胺诱发的微核率和精子畸形率有着显著的抑制作用。 1 2 1 4 抗辐射 螺旋藻多糖能显著减轻小鼠骨髓细胞辐射遗传损伤，大大降低辐射引起的突变频 率。张成武等给小鼠腹腔注射1 2 5 m g k g 钝顶螺旋藻多糖，其抗辐射能力大大提高，在受 到致死剂量6 0 c o 吖射线照射后的存活率比对照组提高3 3 ，并表明螺旋藻多糖能促进 照射后小鼠造血功能的恢复。李德远等分别以1 0 ，1 5 0 ，3 0 0 m g k g 齐u 量腹腔注射岩藻糖 胶，可使受4 5 g y 6 0 c o 丫射线照射的小鼠白细胞分别增加1 9 1 ，4 7 6 ，6 1 3 ，使淋巴细 胞分别增加2 4 2 ，5 8 3 ，6 6 9 。刘志辉等研究海藻多糖对辐射损伤小鼠免疫功能的 影响证实，海藻多糖对辐射所致的免疫功能损伤有明显的保护作用1 。 1 2 1 5 免疫调节 海藻多糖能刺激各种免疫活性细胞( 如巨噬细胞、t 淋巴细胞、b 淋巴细胞等) 的 3 硇洲马尾藻( s n a o z h o u e n s es p n o v ) 多糖的提取、分离纯化及抑菌活性研究 i i i i i = 分化、成熟、繁殖，使机体的免疫系统得到恢复和加强2 l 。 螺旋藻多糖能明显地促进小鼠脾细胞对丝裂原刀豆素a 的增殖反应，提高小鼠 机体的免疫功能。极大螺旋藻胞外多糖可提高小鼠n k 的活力，促进白细胞介素产生及 增强淋巴细胞和混合淋巴细胞的转化功能。螺旋藻多糖还能提高小鼠腹腔巨噬细胞的 吞噬率和吞噬指数。提高外周血中t 淋巴细胞的百分数和血清溶血素的含量。显示出螺 旋藻多糖不仅能提高动物非特异性的细胞免疫功能，还能促进机体特异性的免疫功能 【i ：i 】 1 2 1 6 抗凝血活性 肝素是一种具有良好抗凝血活性的多糖，在过去的几十年中未分级的肝素一直被 作为抗凝血药物使用。肝素可以通过结合并激活抗凝血酶一一种苛刻的蛋白酶。激活 的抗凝血酶将导致对凝血酶和x a 的快速的抑制，关闭纤维蛋白凝结的产生。肝素的 年产量大概在1 5 0 ，0 0 0 磅，这些可以生产1 0 亿支剂量。尽管我们仍不清楚低分子量的 肝素的作用机理，但在对肝素分级后发现其比未进行分级的肝素具有更好的药理学特 点及更少的并发症。 非肝素类多糖也具有抗凝血特性，h a n 等从海洋丝状( k e i s s l e r i e l l a s p ) 中提取得 到的硫酸多糖衍生物具有明显的抗凝血效剁h j ，其作用机理是通过绑定纤维蛋白原来 阻止凝血酶作用于纤维蛋白原。王春铃和张全斌从海带中提取的褐藻多糖硫酸酯在实 验中发现凝血活性，对内源性和外源性凝血途径均具有良好的抑制作用，在连续给药 时能够降低血浆纤维蛋白原的含量，并能够明显抑制静脉血栓的形成副。在抗凝血活 性与多糖的结构关系方面，p e r e i r a 等发现多糖主链上单糖的组成及硫酸化方式是影响 多糖抗凝血活性的重要因素制。 1 2 1 7 抑菌作用 海藻在海洋环境中生存会不断受到外界生物的侵袭，因此在长期的进化过程中 可能产生对各种微生物有抗菌活性的化合物。目前，已经在鸭毛藻、孔石莼、酸藻和 松节藻中分离得到具有抑制大肠杆菌活性较强的提取物，在鸭毛藻、酸藻、海黍子和 松节藻小黏膜藻中分离到抗盒黄色葡萄球菌活性较强的提取物。海藻中所含抗菌活性 物质的活性有显著的季节性变化，一般在藻体生长发育旺盛季节罩，其活性物质含量 最高。l e e 等利用海藻中的褐藻酸钠制备褐藻酸银，其抗菌活性通过测定6 0 0 n m 时液体 培养液的光吸收值确定，实验菌为会黄色葡萄球菌和大肠杆菌，发现在p h 值为7 时生 长旺盛，但当该盐的加入大于0 6 时生长被抑制 。俞丽君等采用人白细胞弹性蛋白 酶( h l e ) 体外筛选技术对3 9 种海藻样品的甲醇提取物进行抗炎活性筛选，发现鸭毛 藻、海头红、江蓠、细枝软骨藻和粗枝软骨藻的抑制活性最强( 2 5 1 , t g m l 时抑制率为 9 5 7 ) 。 1 2 1 8 其它生物活性 海藻多糖除了上述作用外，还有许多其它的生物活性，如降血糖作用，降血脂作 4 广东海洋大学硕士学位论文 用，生物信息载体等。 1 2 2 海藻多糖的应用 1 2 2 1 微胶囊材料 微胶囊技术已广泛应用医学及生物技术领域。例如：利用褐藻酸钠的分子链上有 大量的羧基，可以通过正、负电荷吸引形成聚电解质。目前，褐藻酸钠微胶囊可能的 应用背景是作为药物控释载体、细胞培养微反应器、基因运载工具和人工器官以及分 离介质等。已有学者报道报道，将胶囊化的朗格汉斯胰岛素用褐藻酸盐和二甲基亚砜 保护后，移植入患有糖尿病的大鼠中。 1 2 2 2 海藻多糖衍生物作为细胞物质的寒冷保护介质 作为非渗透性寒冷保护剂，当与己知某一穿透性寒冷保护剂混合时，为寒冷条件下 保护活体细胞提供了有效手段。海藻多糖衍生物，如琼脂糖和褐藻酸盐可被作为非渗 透性寒冷保护剂。这些多糖在遇冷时，形成胶体基质，防止了冰晶形成，并在融化时，提高 细胞的生存能力引。 1 2 2 3 组织工程支架材料 ： 例如褐藻胶具有高粘度和机械强度，经过处理后可植入组织细胞的载体和模板。 分子修饰后的褐藻胶可用于组织再生特别是骨再生过程中在仿生学上可用作人造肝 脏肝细胞的生长介质，为肝细胞的长、分化和体外肝脏的重建创造生理坏境。 ： 1 2 2 4 海洋药物 由于海藻多糖有多种生理活性，因此可以根据构效关系研究的结果，以生物活性 物质为分子模型，通过化学结构改造，有效提高其生理活性，丌发出真证高效低毒的临 床应用药物啪1 。 1 2 3 海藻多糖的构效与活性关系研究 糖类具有丰富的生物活性，其结构和功能是目前多糖研究的热点。构效关系的研 究能为活性多糖的目的性筛选及进行分子修饰提供理论指导。初步认为多糖的活性与 分子量、溶解度、分支度、一级结构和高级结构有关。 1 2 3 1 硫酸根含量与活性的关系 商业用非硫酸琼脂糖则无抗病毒活性，而硫酸酯化级分的多糖具有显著的抗病毒 活性。如无硫酸根的b 1 ，3 连接带有p 1 ，6 侧链的香菇多糖，无直接抑, t i i j h i v 复制的活 性，硫酸化后可抑铝i h i v l 产生的细胞病变比。 1 2 3 2 多糖分子量与活性关系 体外研究表明，硫酸葡聚糖分子量为1 0 0 0 时表现出抗h i v 活性，且活性随着分子量 的增加而增加，分子量1 0 0 0 0 时达到最大，1 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 之间保持最大活性。化学降 5 确洲马尾藻( s n a o z h o u e n s es p n o v ) 多糖的提取、分离纯化及抑菌活性研究 解肝素和硫酸多糖，得到的两种低分子量化合物的抗h i v i 的活性大大高于初始提取 物2 引。 1 2 3 3 空间构象与活性的关系 多糖的活性与其初级和高级结构特别是三维空间构象密切相关，特别是高级结 构，对其生理活性影响更大乜3 1 。有证据表明，具p 螺旋型立体结构的多糖其抗病毒活性 较高。多糖生理活性还与溶解度、粘度等物理化学性质有关。 1 2 3 4 海藻多糖的分子修饰研究 多糖分子修饰是通过化学、物理学及生物学等手段对化合物分子进行结构改造， 以获得众多结构类型衍生物的方法。分子修饰可通过改变多糖的空| 日j 结构、分子量及 取代基种类。数目和位置而对多糖的生物活性产生影响。选择合适的方法对多糖进行 分子修饰，获得不同的衍生物，可以降低多糖的毒副作用，并提高其生物活性。常用的多 糖分子修饰方法如下。 ( 1 ) 硫酸化 多糖硫酸酯化的方法很多，如氯磺酸吡啶法、三氧化硫吡啶法、浓硫酸法、三 氧化硫二甲基甲酰胺法等，比较常用的是氯磺酸吡啶法心引。 ( 2 ) 分子量降低及分级 常用化学降解、酶降解和超生波降解等方法。 ( 3 ) 脱硫酸基 常用酸、碱和有机溶剂脱硫酸基法等方法瞳引。 ( 4 ) 其他分子修饰的方法 除了上述几种比较常用的有可能提高多糖生物活性的分子修饰方法外，包括羧甲 基化、烷基化、脱乙酰化、氨化、碘化、磷酸酯化等多种方法。 1 2 4 海藻多糖的提取，分离和纯化 在海藻多糖提取过程中，海藻的采集时间、采集地点、生长环境的气候等因素都 可能影响多糖的种类和产量。 海藻粗多糖的分离纯化是海藻多糖研究的重要步骤，分离纯化过程中要注意海藻 粗多糖的得率和纯度，尽量保证粗多糖在提取过程中不会被破坏。 1 2 4 1 提取 从海洋藻类植物提取多糖的过程主要包括：破碎、浸提、沉淀等。而破碎及浸提 是影响多糖回收率、产品质量及提取多糖经济性的主要环节1 。 海藻的破碎常用的方法有三种：破碎分离法、微波法和酶解法，其中以机械破碎 法最常用。 从浸提液中分离提取海藻多糖目前大多采用乙醇沉淀法，其主要作用原理是通过 降低水溶液的介电常数使多糖脱水从而产生沉淀来分离多糖，几乎适用于所有水溶性 6 广东海洋大学硕士学位论文 多糖引。 1 2 4 2 分离纯化 1 2 4 2 1 多糖的分级纯化 初步纯化的多糖，要获得较单一的多糖组分，需再对粗多糖进行分级，即将粗多 糖分离为单一多糖。而实际上分离和纯化是很难明显区别开的，因为有的分离过程己 经在纯化了，反过来在纯化过程中进一步得到分离。 对多糖进行分级分离的方法有多种，常用以下方法：有机溶剂分部沉淀法；离子 交换柱层析法；凝胶柱层析法；盐析法：；金属络合物法；季铵盐沉淀法。川等。 此外，粗多糖的纯化方法还有电泳法、超速离心法、亲和层析分级法、超滤分级 法等。”1 。 1 2 4 2 2 多糖的纯度鉴定 多糖的纯度标准不能用通常化合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其 微观也是不均一的。它的纯度只代表相似链长的平均配布。通常所晚的多糖纯品实质 是一定分子量范围的均一组分。谨1 。 目前，国内外常用的鉴定多糖纯度的方法有：电泳法，比旋度法，超离心法和凝 胶色谱法等。其中凝胶渗透色谱法( g p c ) ，具有快速、高分辨和重现性好的优点，因 此最为常用。州。 1 2 5 海藻多糖的结构分