（食品科学专业论文）高产ε聚赖氨酸白色链霉菌的原生质体诱变选育及发酵研究.pdf

摘要 高产聚赖氨酸白色链霉菌的原生质体诱变选育及发酵研 究 学科、专业：食品科学入学时间：2 0 0 7 0 9 0 1 硕士研究生姓名：程传荣答辩时间：2 0 0 9 1 2 0 9 指导教师：陈卫教授授予学位时间： 摘要 聚赖氨酸( p o l y l 1 y s i n e ，p l ) 是由微生物合成的一种氨基酸同型聚合物，由人体 必需氨基酸l 赖氨酸的氨基和另一l 赖氨酸的a 羧基形成的酰胺键连接而成。p l 具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、耐热芽孢杆菌和一些病毒都 有抑制作用，且具有水溶性好、热稳定性高等特点，是一种安全高效的天然生物防腐剂。 目前p l 被广泛用于食品防腐保鲜、可降解生物材料以及医学研究中。 为了建立一种快速方便的聚赖氨酸检测方法，本文基于聚赖氨酸与 d r a g e n d o r f f s 试剂的沉淀复合物可与硫脲产生显色反应，提出了一种利用分光光度计快 速检测聚赖氨酸的新方法。聚赖氨酸含量与反应复合物吸光度在p h 2 0 5 o ，反应 时间在4 5 m i n 以内，具有较高的线性相关性。分光光度计测定波长为4 3 5 n m 。浓度在0 1 5 0 9 l 范围内，聚赖氨酸工作曲线线性相关系数为r 2 = o 9 9 9 9 ，r s d = 3 6 3 ，检出限 为0 0 1 9 l 。该方法相比于i t z h a k i 法具有较高的准确性。最后以该方法为依据建立了一 种利用9 6 孔板高通量快速检测聚赖氨酸的方法。 对白色链霉菌u n 2 7 1 的原生质体进行了制备和再生。确定了白色链霉菌u n 2 7 1 原生质体制备和再生的最优条件，即在含甘氨酸2 的菌丝培养基中培养4 8 h ，收集菌丝 体经2 0 m g m l 的溶菌酶，在3 0 下酶解6 0 m i n ，可获得大量的原生质体。 以白色链霉菌u n 2 7 1 为出发菌株，进行了原生质体的d e s 诱变实验。首先研究了 不同剂量的d e s 对结果的影响，然后绘制了致死率曲线，确定了0 1 d e s ，诱变3 8 m i n 和0 1 5 d e s 诱变1 8 m i n 最适诱变剂量。挑取了5 1 4 株再生菌落，应用摇试管培养和高 通量快速测定方法初筛得到2 6 株高产菌，经过复筛最终得到了一株高产菌株d 3 3 2 ， 聚赖氨酸产量达到1 5 6 9 l ，比出发菌株提高了4 9 4 3 。经传代发酵试验，该突变株遗 传性状稳定。 采用2 3 l 自动发酵罐，研究了突变菌株d 3 3 2 和原始菌株的发酵特性，可以得出 突变株的菌体生长能力更高，聚赖氨酸合成能力更高。调控p h 4 0 ，有利于产物聚 赖氨酸的合成。突变株d 3 3 2 经2 3 l 自控发酵罐发酵，发酵过程中调控p h 4 0 ，发酵后 期补充葡萄糖和硫酸铵，补料分批发酵并调控p h ，采用不断补充碳源来延长发酵周期， 发酵体系中菌体浓度达到了3 1 5 8 9 l ，而聚赖氨酸的产量则达到8 0 6 9 l ，比原始菌株 自然发酵下提高了近5 倍。 最后初步研究了发酵液中聚赖氨酸的抑菌活性。 关键词：聚赖氨酸，白色链霉菌，生物防腐剂，原生质体诱变，发酵 a b s t r a c t p r o t o p l a s tm u t a t i o nb r e e d i n go fh i g h - p o l y l y s i n e - - p r o d u c i n gs t r e p t o m y c e sa l b u l u sa n d s t u d i e so n f e r m e n t a t i o n s u b j e c ta n ds p e c i a l i t y ：e n g i n e e r i n g ，f o o ds c i e n c e t i m eo f e n r o l l m e n t ：0 1 - 0 9 2 0 0 7 m a s t e rg r a d u a t es t u d e n t ：c h u a n r o n gc h e n g t i m eo fd e f e n s e ：0 0 - 12 - - 2 0 0 9 f a c u l t ya d v i s e r ：w e ic h e n ，p r o t i m eo f c o n f e r r i n gd e g r e e ： a b s t r a c t e - p o l y l l y s i n e ( e p l ) i sah o m o p o l y a m i n oa c i dc h a r a c t e r i z e db yt h ep e p t i d eb o n d b e t w e e nt h ea - c a r b o x y la n de - a m i n og r o u p so ft h ee s s e n t i a la m i n oa c i dl l y s i n e i ts h o w sa w i d er a n g eo fa n t i m i c r o b i a la c t i v i t ya g a i n s tm o s tg r a m - p o s i t i v ea n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ， f u n g ia n da l s os o m ev i r u s e s i na d d i t i o n ，- p li ss o l u b l ea n da t t r a c t i v eh e a ts t a b l e a tp r e s e n t ， - p lh a sb e e nu s e da sf o o dp r e s e r v a t i v em a i n l y , d e g r a d a b l eb i o l o g i c a lm a t e r i a la n dm e d i c a l r e s e a r c h i no r d e rt od e v e l o pan e wr a p i da n dc o n v e n i e n td e t e c t i o nm e t h o d ，b a s e do nt h ec o l o r r e a c t i o no ft h i o u r e aa n dp r e c i p i t e dc o m p l e xo fe - p o l y l y s i n ea n dd r a g e n d o r f f sr e a g e n t ，t h i s r e s e a r c hp u tf o r w a r dan e wr a p i dm e t h o du s i n gs p e c t r o p h o t o m e t e r t h e r ew a sal i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e ne - p o l y l y s i n ec o n t e n ta n do dv a l u ew h e nt h ef e r m e n t a t i o nb r o t hp hw a s a d j u s t e d2 0 - 5 0a n dt h er e a c t i o nt i m ew a sb e l o w4 5 m i n i t so dv a l u ew a sm e a s u r e da t 4 35 n m al i n e a rw o r kc u r v ew i t hr 2 = 0 9 9 9 9h a sb e e na c h i e v e di nt h el i n e a r i t yr a n g ef r o m0 t o1 5 0 l ，t h ed e t e r m i n a t i o nl i m i to ft h em e t h o dw a s0 01g l ，i t sr s do ff e r m e n t a t i o nb o r t h s a m p l ew a r er s d = 3 6 3 c o m p a r i s i o n 、析t hi t z h a k i sm e t h o dr e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h e m e t h o do ft h i sp a p e rw a sr a p i d ，r e l i a b l ea n da c c u r a t e f i n a l l y , b a s e do nt h i sm e t h o d ，w eh a v e e s t a b l i s h e dah i g h - t h r o u g h p u tm e t h o du s i n g9 6w e l lp l a t et od e t e r m i n ee - p o l y l y s i n ei n f e r m e n t a t i o nb r o t h t h ep r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o no fs t r e p t o m y c e sa l b u l u su n 2 - 71p r o t o p l a s tw a ss t u d i e d ， a n di t so p t i m u mc o n d i t i o nw a sd e t e r m i n e d s t r e p t o m y c e sa l b u l u su n 2 - 71w a sc u l t u r e di na m y c e l i u mm e d i u mc o n t a i n i n g2 g l y c i n ef o r4 8 h ，t h e nt h em y c e l i aw e r ep r o c e s s e d 谢t l l 2 m g m ll y s o z y m ea t3 0 f o r6 0m i n u t e s ，t h ep r o t o p l a s t sw e r eo b t a i n e d t h ep r o t o p l a s to fs t r e p t o m y c e sa l b u l u su n 2 71w a st r e a t e db yd e sm u t a t i o n f i r s t l y , t h ed i f f e r e n td o s eo fd e sw e r es t u d i e da n dt h ed e a t hr a t ec u r v eo fd e sw a so b t a i n e d t h e o p t i m u md o s ew e r et h a t ：0 1 d e sw i t h3 8m i n u t e sa n d0 15 d e sw i t l l18m i n u t e s 2 6 1 1 i g h y i e l d i n gs t r a i n sw e r es e l e c t e df r o m5 14r e g e n e r a t i o nc o l o n i e sa f t e rs c r e e n i n g t h e n t h r o u g hr e s c r e e n i n g ，am u t a n t ，s t r e p t o m y c e sa l b u l u sd 3 - 3 2 ，w a so b t a i n e d ，w h o s e 一p lo u t p u t r e a c h e d1 5 5 9 li n c r e a s e db y4 9 4 3 c o m p a r e d 、枥t 1 1t h es t a r t i n gs t r a i n a f t e rc o n t i n u o u s c u l t u r eg e n e r a t i o nb yg e n e r a t i o n ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em u t a n th a dag o o dg e n e t i c s t a b i l i t y t h ef e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h em u t a n td 3 - 3 2a n dt h es t a r t i n gs t r a i nu n 2 - 7 1 w e r es t u d i e di n2 3 la u t o m a t i cf e r m e n t a t i o nj a t t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h em u t a n ts t r a i nh a d h i g h e ra b i l i t yo fc e l lg r o w t ha n de - p ls y n t h e s i s t h er e s e a r c h e ss h o w e dt h a tp hp l a y e d l i a b s t r a c t i m p o r t a n tr o l e si nt h ef e r m e n t a t i o na n dc o n t r o l l i n gp h 4 0w a sb e n e f i c i a lt ot h ea c c u m u l a t i o n o fa - p l u n d e rt h ec o n d i t i o no fc o n t r o l l i n gp h 4 0 ，g l u c o s ef e e d i n g ，t h eb i o m a s sw a s31 5 8 9 l ， a n d 一p lp r o d u c t i v i t yw a sa sh i 曲a s8 0 6 g l ，w h i c hw a s5 - f o l dh i g h e rt h a nt h a ts t a r t i n gs t r a i n i nt h en a t u r ec o n d i t i o n f i n a l l y , ap r e l i m i n a r ys t u d yo fs - p la n t i m i c r o b i a la c t i v i t yh a sb e e nd o n e k e y w o r d s ：s - p o l y l y s i n e ，s t r e p t o m y c e sa l b u l u s , b i o l o g i c a lp r e s e r v a t i v e ，p r o t o p l a s t m u t a t i o n ，f e r m e n t a t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 挂垡童 e t 期： 塑墨兰：! ! 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签+名： 整篮童 导师签名： 日 期： l 前言 1 前言 1 1 生物防腐剂 长期以来，在食品工业中习惯于使用化学合成品作为食品防腐剂，如苯甲酸、山梨 酸及其盐类、对羟基苯甲酸酯类等，基于大多数化学食品防腐剂在体内残留、有一定的 毒性和特殊气味等原因，我国对于食品防腐剂的安全问题越来越重视，能用于食品防腐 剂的化学防腐剂越来越受到限制，这对食品生产、运输、储存已经产生了很大的阻碍， 迫切需要研究和开发出高效、无毒的天然食品防腐剂。随着生物技术的不断发展，利用 植物、动物或微生物的代谢产物等为原料，经提取、酶法转化或者发酵等技术生产的天 然生物型食品防腐剂逐渐受到人们的重视，也是今后我国防腐剂市场的主要方向。 不少微生物在其代谢过程中都能产生抑菌物质，但作为食品防腐剂，必须符合：生 物杀菌素本身对人体完全无害；在消化道内降解为食物的正常成分；对食品进行热处理 进而降解为无害成分：不影响消化道菌群；不影响药用抗菌素的使用【l 】。 微生物源食品防腐剂研究比较多的有乳酸链球菌素( n i s i n ) 、那他霉素( n a t a m y c i n ) 、 聚赖氨酸( p o l y l y s i n e ，p l ) 等。 1 1 1 乳酸链球菌素( n i s i n ) 乳酸链球菌素是从乳酸链球菌( s t r e p t o c o c c u s l a c t i s ) 的发酵产物中提取的一种多肽 类化合物。它是由3 4 个氨基酸残基和5 个硫醚桥形成的分子内环肽，白色粉末，分子 式为c 1 4 3 h 2 2 8 n 4 2 0 3 7 s 7 ，其活性体为二聚体或四聚体，相对分子量为7 0 0 0d a 和1 4 0 0 0d a 。 乳酸链球菌素不溶于非极性溶剂，在水中的溶解度随p h 值的下降而增大，其稳定性与 环境p h 值相关，在酸性介质中最稳定。乳酸链球菌素对革兰氏阳性菌，特别是对产生 孢子的细菌有很强的抑制作用。但是在目前条件下，n i s i n 对革兰氏阴性菌、酵母、霉 菌及病毒一般无效。 乳链菌肽可以广泛抑制多种革兰氏阳性菌，其作用的起始靶位点在敏感菌的细胞膜 上，通过分散质子动力形成不连续的孔道，从而去除细胞膜的基本能量来源。乳链菌肽 在膜上形成孔道，使小分子外渗，使敏感菌细胞需能反应休止而死亡。相对来说，乳酸 链球菌肽抑制细胞壁的生物合成是一个比较慢的过程。因此，认为孔道形成是乳酸链球 菌最初的作用方式1 2 j 。 乳链菌肽的半数致死量( l d 5 0 ) 值约为7 9 k g ( 体重) ，与普通食盐相近。1 9 6 9 年， f a o w h o 联合食品添加剂专家委员会确认乳链菌肽可作为食品防腐剂。到目前为止， 乳链菌肽已被欧美及东南亚等5 0 个国家和地区广泛应用于乳制品、罐头食品、高蛋白 食品和酒等的防腐和保鲜。我国于1 9 9 2 1 0 0 1 实施的，g b 2 7 6 0 8 6 规定，乳链菌肽在罐 装食品、植物蛋白食品中的最大使用量为0 2 9 k g ，在乳制品、肉制品中的最大使用量为 o 5 9 k g ，一般参考用量为0 1 - - 0 2 9 k g 。 江南大学硕士学位论文 1 1 2 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 又名游霉素、匹马菌素、匹马利星。是由s t r e p t o m y c e sn a t a l e n s i s 和s t r e p t o m y c e s c h a t a n o o g e n s 捃等链霉菌发酵经生物技术精炼而成的新型生物防腐剂。纳他霉素是一种 多烯烃大环内酯类抗真菌剂，分子式c 3 3 h 4 7 n 0 1 3 ，分子量为6 6 5 7 3d a 。 n a t a m y c i n 是一种乳白色粉末，熔点2 8 0 c ( 分解) 。不溶于水，微溶于甲醇，溶于稀 盐酸、稀碱液、冰乙酸及二甲基甲酰胺，p h 值低于3 或高于9 时，其溶解度可有所提 高。对空气中的氧、紫外线极为敏感，所以在使用或存放时应注意避光与密封。该抗菌 素是一种很强的抗真菌试剂，它能够专性的抑制酵母菌和霉菌，阻止丝状真菌中黄曲霉 毒素的形成【3 1 。与其它抗菌成分相比，纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，可以广泛 应用于由真菌引起的疾病。除此之外，由于纳他霉素的溶解度低，可用其对食品表面进 行处理以增加食品的保质期，却不影响食品的风味和口感。 n a t a m y c i n 抗菌机理在于它能与细胞膜上的甾醇化合物反应，由此引发细胞膜结构 改变而破裂，导致细胞内容物的渗漏，使细胞死亡1 4 。 纳他霉素是用于食品表面处理的防腐剂，用于防止酵母和霉菌在食品表面生长。在 焙烤食品中，使用纳他霉素对生面团进行表面处理，有明显效果。此外在干酪、香肠、 饮料、果酱等生产中，添加一定量的纳他霉素，可以防止发霉。我国也已经批准n a t a m y c i n 为食品防腐费t j ( g b 2 7 6 0 1 9 9 6 ) 并规定其在食物中最大残留量为1 0m g k g 。 1 1 3 - 聚赖氨酸( e - p o l y l y s i n e ，一p l ) 19 7 7 年，日本学者s s h i m a 和h s a k a i 从放线菌培养过滤液中提取出一种含有2 5 3 0 个赖氨酸残基的同型单体聚合物【5 】，此聚合物就是聚赖氨酸。聚赖氨酸是最具优良 性能和巨大商业价值的生物防腐剂之一。聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨 酸是人体必需的8 种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。 聚赖氨酸具有很广的抗菌谱，它对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、真菌的生长繁 殖都有显著的抑制作用，而且对耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。同时，聚 赖氨酸热稳定性好( 1 2 0 。c ，2 0 m i n ) ，水溶性也好，又具有抑菌p h 范围广( 5 8 ) 的特 点【6 】。2 0 0 3 年聚赖氨酸被f d a 批准为安全防腐剂。聚赖氨酸由于其抗菌性和安全性 已广泛应用到食品工业的各个领域中，如用于面包点心、奶制品、肉制品、冷藏食品和 袋装食品等。 1 2 聚赖氨酸( p l ) 研究进展 1 2 1 - 聚赖氨酸的理化性质 聚赖氨酸是一种由微生物发酵产生的氨基酸同型聚合物，它由l 赖氨酸的洳氨基 与另一l 赖氨酸的羧基形成的酰胺键连接而成【7 1 ，结构式如图所示，微生物产生的 聚赖氨酸通常由2 5 3 5 个赖氨酸单体组成，相对分子量3 5 0 0 - - 4 5 0 0d a 引。 s 聚赖氨酸是淡黄色粉末、吸湿性强，略有苦味；极易溶于水、盐酸，不溶于乙醇、 乙醚等有机溶剂，有好的热稳定性，在8 0 加热6 0 m i n 及在1 2 0 加热2 0 m i n ，均保持 2 1 前言 抑菌能力。比旋光度【a 】2 5 d 为+ 5 7 1 0 ( c = 1 ，h 2 0 ) ， 】2 5 d 为+ 3 9 9 0 ( c _ 1 ，6 m o l l h c i ) ， 熔点为2 5 0 ( 2 。红外光谱分析表明：在1 6 8 0 - - 1 6 4 0 c m 1 和1 5 8 0 - 1 5 2 0 c m 1 有强吸收峰5 1 。 h + n h - c h 2 - c h 2 - c h = - c h 2 - 芝：c 。十：h 8 1 x g m l 时，即对g 十、g 。细菌有抑制作用，且抑菌能力强于a 聚赖氨酸9 1 。 表1 - 1 一聚赖氨酸抗茵谱【9 】 t a b 1 1t h ea n t i b a c t e r i a lo fe p l m i c 为最小增值抑菌浓度；，i 宰为培养2 4 h 后检测的结果 分子量在3 6 0 0 4 3 0 0d a 之间的聚赖氨酸抑菌效果最好，当分子量低于1 3 0 0d a 时，聚赖氨酸失去抑菌活性。i g e o r n a r a s 等人【lo 】发现在食品提取物中聚赖氨酸 对大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌等抑菌效果较培养基上好，米饭和蔬菜中的抑菌效果 较在高蛋白食品中效果好，高蛋白食品中趋向于高浓度的聚赖氨酸。刘慧等】l l 】的研究 表明，聚赖氨酸对其它天然防腐剂( 如n i s i n ，n a t a m y c i n ) 不能抑制的革兰氏阴性菌 如大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好。但对酵母菌、霉菌的抑菌浓度要高，为1 2 8 - 2 5 6 m g l 。此外，它对一些耐热性芽孢杆菌和病毒也有抑制作用。 1 2 3 菌种分离及选育 2 0 世纪7 0 年代末，s h i m a 掣5 j 首次从白色链霉菌( s t e p t o m y c e sa l b u l u s ) 的发酵液 中发现聚赖氨酸。藤井正弘掣1 2 】发现诺尔斯氏链霉菌( s t e p t o m y c e sn o u r s e i ) 也可产生 3 江南大学硕士学位论文 聚赖氨酸。s z 6 k 缸a 等【1 3 】发现一种丝状的麦角真菌( c l a v i c e p sp u r p u r e a ) 能够积累一种 类似聚赖氨酸、含有大量赖氨酸的化合物麦角胺( c l a v i c e p a m i n e s ) ，其化学结构 与a l b u l u s 的产物不同。 从2 0 世纪9 0 年代末至今，筛选聚赖氨酸高产菌株一直是研究的热点。2 0 0 2 年， 日本学者n i s h i k a w a 等【1 4 】通过在培养基中加入一种酸性染料p o l yr 4 7 8 ，5 - 聚赖氨酸产 生菌的菌落周围会有明显的颜色浓缩圈，从而筛选出产生聚赖氨酸的菌株。n i s h i k a w a 采用此方法，对日本各地土壤样品进行了大规模的筛选，发现大多数聚赖氨酸产生菌 集中在链霉菌科( s t r e p t o m y c e t a c e a e ) 的几个不同的属和麦角真菌( e r g o t f u n g o 这两类 微生物上，且不同菌株的产物其赖氨酸单体数也有所不同( 舻1 0 3 6 ，1 0 - 2 4 ，8 9 ) 。 并且发现这些菌株大部分属于链霉菌。但由于p o l yr 4 7 8 现已停产，菌株筛选又变得 较困难。中国学者朱宏阳等【15 1 、陈雄等【1 6 1 、张超等【17 1 、采用碱性染料亚甲基蓝，先后 分离到了产聚赖氨酸的菌株，但由于亚甲基蓝对微生物毒性较高，而且出菌率较低， 分离到的菌株均为放线菌，菌种单一，聚赖氨酸产量也较低【l 引。因此探索筛选培养基 指示剂，或研究建立高通量、高分辨、高灵敏聚赖氨酸产生菌筛选模型是目前聚赖 氨酸研究的难点之一。 利用理化因子对链霉菌进行诱变，从各种基因突变中筛选有利突变的诱变育种是传 统的育种方法，也是最常用、最有效的。传统的方法是对出发菌株采用常规的物理化学 诱变方法，中国学者余明洁、杨玉纠2 0 l 、张海涛2 1 1 、张超【2 2 】等使用紫外诱变聚 赖氨酸产生菌株，并获得了不错的高产效果。贾士儒【2 3 】、陈玮玮【2 4 】等使用化学诱变剂硫 酸二乙酯对链霉菌孢子诱变，聚赖氨酸产量得到较大的提高。s s h i m a 等人报道， 聚赖氨酸的合成可能途经赖氨酸代谢支路，最后经聚合酶作用生成【2 5 1 。终产物赖氨酸的 反馈抑制，因此选用赖氨酸的结构类似物s ( 2 氨乙基) l 。半胱氨酸( a e c ) 作为抗性筛 选标记可以消除赖氨酸的反馈抑制，从而获得高产菌。1 9 8 8 年平木纯和森田裕以白色链 霉菌3 4 6 菌株为出发菌，经过n 一甲基- n 硝基n 硝基胍( n t g ) 作用后，以a e c 为筛 选标记，得到编号为1 1 0 1 1 a 1 号的突变菌株，其摇瓶产量达到2 1 1 m g m l ，是野生菌株 的1 0 倍【2 6 1 。1 9 9 7 年，岩田敏治，平木纯等人以1 1 0 1 1 a 1 为出发菌株，经过n t g 、紫 外线照射、5 溴尿嘧啶等试剂处理后，以1 0 m g m l 的a e c 作为抗性标记，筛选得到编 号为b 2 1 0 2 1 的a e c 高浓度抗性菌株【2 7 1 。目前，对白色链霉菌原生质体诱变选育的文献 报道不多，2 0 0 8 年于雪骊等对白色链霉菌的原生质体进行了制备和再生，h e n e 激光照 射诱变后，聚赖氨酸产量有一个较大提高。 随着对聚赖氨酸合成机理研究的深入和合成酶基因的定位、克隆和表达，科研人 员将采用基因工程手段，构建基因工程菌应用于聚赖氨酸的生产。h i r o s h it a k a g i 等人 报道，在聚赖氨酸产生菌白色链霉菌i f 0 1 4 1 4 7 中发现了一种高分子量( 3 7 k b ) 隐蔽性质 粒p n 0 3 3 。目前认为质粒p n 0 3 3 只在产生聚赖氨酸的白色链霉菌中发现，因此，此 质粒可能是编码聚赖氨酸合成或抗性基因。h i r o s h it a k a g i 等人还发现d 内酰胺酶基因 可用作是白色链霉菌i f 0 1 4 1 4 7 克隆载体的标记基 1 2 8 , 2 9 。 4 l 前言 1 2 4 - 聚赖氨酸发酵生产 采用s h i m a 等分离的白色链霉菌变种【3 0 】，聚赖氨酸发酵产量为o 5g l 。聚赖氨 酸产生菌株的摇瓶批式发酵产量较低，均在0 2 1 0g l 。岩田敏治等【27 j 以b 2 1 0 2 1 菌株 为研究对象，在3l 发酵罐中采用氨水调控p h ，补加葡萄糖和硫酸铵，发酵培养7 2h 时，聚赖氨酸产率为1 6 2g l ，而发酵培养1 6 8h 时产率为3 1g l ，产率有了较大幅度 的提高。h i r a k i 等【2 6 】以野生白色链霉菌s a l b u l u s3 4 6 为出发菌株，经诱变获得1 1 0 1 1 a 1 号菌株在3l 发酵罐中，1 2 0h 产率2 0g l 。k a h a r 等【3 2 娜】报道p h 与葡萄糖对聚赖氨 酸发酵产量有很大的影响。发酵分两个阶段，p h 高于5 o 有利于菌体生长，而p h 低于 4 0 对产聚赖氨酸是关键。通过发酵控制，聚赖氨酸的产量由起初的0 5 9 l 增长到 4 8 3 l 。此外，由于白色链霉菌在发酵过程中形成菌丝球，高搅拌转速易将菌丝球剪 切成丝状，使胞内物质渗入到发酵液中，影响聚赖氨酸的提取。k a h a r 等采用气升式 发酵罐，在动力消耗为0 3k w m 。3 下，一聚赖氨酸产率为3 0 9 l ，而在搅拌罐中获得相 同产量的聚赖氨酸则需要消耗8k w m 刁，由此表明，采用气升式发酵罐生产聚赖氨 酸可以更有效地降低生产成本l 驯。 目前在国内关于生物合成聚赖氨酸的研究刚刚起步，姜俊云等采用5l 自控式发 酵罐研究了发酵过程中搅拌转速和p h 对菌体形态以及聚赖氨酸产量的影响，发现搅 拌转速3 5 0r m i n 和控制p h 时可获得最大的聚赖氨酸产量2 9 5g l ，菌体量9 3 3g l 1 3 4 。朱宏阳等从土壤中分离到1 株产聚赖氨酸菌株p l 6 3 ，其发酵产量为0 4 1 l 【 】。 目前一聚赖氨酸发酵工艺为液体深层发酵，虽然单批次发酵可以达到较高产量，但重复 性较差。其根本问题在于溶氧较低，达到高产需要较高的溶氧，合适的转速，但这两者 本身是一对矛盾，只能应用多尺度发酵原理与过程控制思想，优化聚赖氨酸发酵参数， 提高发酵水平。 1 2 5 聚赖氨酸的应用 ( 1 ) 聚赖氨酸在食品行业的应用 聚赖氨酸在食品行业的应用具有很多的优良特性【3 5 j ：水溶性好，易溶于水及乙醇， 容易添加到食品中；耐热性佳，能承受一般食品加工中的热处理，1 2 0 加热l o 分钟仍 有抗菌活性；抑菌范围广，在酸性与微酸性环境中，对革兰氏阳性及阴性细菌、酵母菌、 霉菌、耐热性芽孢杆菌、病毒、大肠杆菌都有很好的抑菌效果。聚赖氨酸作用细菌、 霉菌等微生物的生物膜后，可直接而迅速地破坏细胞膜，使膜破裂而诱导微生物自溶至 细胞死亡。 聚赖氨酸的高水溶性、热稳定性及广谱抗菌性，使其在食品中应用非常广泛并极 具潜力。日本应用聚赖氨酸于盒饭、奶制品、面包、糕点、酱类、果酒类、肉制品、 海产品、禽类、乳蛋冰淇淋、奶油泡头、掼奶油、低温软罐头、冷藏食品等等，应用效 果显著【3 6 1 。聚赖氨酸用作食品添加剂是以含5 0 聚赖氨酸的糊精粉末为原料，添加 其它制剂而成的，主要有以下几种商品剂型：酒精制剂、醋酸制剂、有机酸制剂、甘油 酯制剂、甘氨酸制剂等。徐红华等【37 】通过饱和试验设计研究聚赖氨酸和甘氨酸对牛奶 江南大学硕十学位论文 保鲜作用。结果表明，单独使用聚赖氨酸和甘氨酸，其抑菌能力明显低于二者混合使 用效果。其中以添加0 4 2 9 l 的聚赖氨酸和2 甘氨酸时抑菌效果最佳。日本学者腾井 正弘在米饭中添加o 4 0 6 聚赖氨酸醋酸制剂研究对米饭防腐作用。结果显示， 3 0 培养4 8h 后，添加聚赖氨酸防腐剂样品中细菌总数为6 c f u g ，而空白样中细菌 总数为3 6 0c f u g ，表明聚赖氨酸醋酸制剂有明显抑菌作用【3 引。据有关方面报道，用 大蒜为主要原料与聚赖氨酸混合制成食品防腐剂，使用时加入食品中或喷淋到食品表 面，均具有显著抗菌防腐作用，能杀死或抑制食品内部或表面致病微生物。 ( 2 ) 医药行业。聚赖氨酸在医药方面主要应用于药物的缓释和靶向载体。聚赖 氨酸与海藻酸盐复合体可制成缓释胶囊的包被膜。n u s s i n o v i t c h l 等将分子量25 0 0 - - - - 2 0 5 0 0 0d a 的蛋白质包被于聚赖氨酸海藻酸盐膜内，测定了蛋白质的释放曲线，并与 海藻酸盐膜对比，结果证明添加聚赖氨酸实现了膜的缓释功能1 4 9 j 。由于聚赖氨酸富 含阳离子，与带有阴离子的物质有很强的静电作用且很容易通过生物膜，可以降低药物 的阻力并提高药物的转运效率，由此可将聚赖氨酸用作某些药物的载体，这已在医疗 和制药方面得到广泛的应用1 4 引。 ( 3 ) 高吸水性树脂材料。生物聚合得到的水溶性聚赖氨酸通过简单的辐射交联 可得到高吸水性聚赖氨酸。日本物质工学技术研究所用y 射线使聚赖氨酸交联，得 到吸水倍数约2 0 0 倍且可生物降解的s a p 4 酬。 ( 4 ) 其他领域。聚赖氨酸是电融合技术中的有效促融剂。g r 6 b n e ru 等人【47 j 的研 究发现平均分子量为3 9 7 0 - - 1 3 2 3 0 0d a 的纳摩尔级浓度的聚赖氨酸能促进大麦原生质体 的电融合率，与葡聚糖相比，是其融合率的2 倍。龚海鹏等【4 8 】发现在具有优良生物相容 性的生物可降解材料壳聚糖表面，涂布多聚赖氨酸后可以大幅度提高材料与神经细胞 的亲和性，能非常有效地促进神经细胞的生长，具有良好的神经修复功能。刘德伍等采 用多聚赖氨酸为基质的无血清培养基培养人表皮细胞，结果表明它能显著提高表皮细 胞的贴壁、集落和膜片形成的速率，同时对培养表皮细胞的生长无不利影响【4 圳。随着科 学的进一步发展，聚赖氨酸富含阳离子的这一特性一定能被广泛认识，并不断开发各 种应用技术，因此有着非常好的前景。 1 3 本课题的研究意义及主要研究内容 由于聚赖氨酸是一种高效、无毒、广谱的新型生物防腐剂，市场需求可观，因此 应用前景十分看好，但国内还只是出于研究阶段，未能规模化生产，并且由于其价格昂 贵在国内未能广泛应用，因此为了降低成本，推动国内食品防腐剂行业的发展，值得深 入研究并需加快其研究步伐。 目前聚赖氨酸生产技术只是被国内外极为少数的公司和科研院所拥有，并且生产 菌株来源单一，限制了行业的发展。我们应引进新技术、新方法对聚赖氨酸的生产技 术进行攻关，并开发拥有自主知识产权的聚赖氨酸生产菌株及技术，并满足我们此类 产品的需求及增加其在国际市场的竞争力。 本实验室余明洁对实验室原有菌株白色链霉菌s a 发酵产物做了初步鉴定，通过复 6 1 前言 合诱变得到白色链霉菌u n 2 7 1 ，使聚赖氨酸产量有了较大提高。在此基础上，本课 题着重从原生质体诱变选育高产菌株及发酵合成聚赖氨酸条件的优化等方面进行研 究，具体内容如下： ( 1 ) 建立高通量的筛选检测方法。 ( 2 ) 以白色链霉菌u n 2 7 1 为出发菌株，进行原生质体的制备和再生。 ( 3 ) 然后对白色链霉菌u n 2 7 1 原生质体进行了d e s 诱变实验，应用摇试管培养 和高通量快速测定方法筛选，定向选育遗传性能稳定的高产菌株。 ( 4 ) 进一步考察在小型发酵罐中生产聚赖氨酸。 ( 5 ) 对发酵产物聚赖氨酸的抑菌活性做了初步研究。 7 2 材料与方法 2 1 材料 2 1 1 菌种 2 材料与方法 白色链霉菌( s t r e p t o m y c e sa l b u l u s ) u n 2 7 1 ，本实验选育保藏菌株，具有聚赖氨 酸生产能力。枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 、大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、乳酸克鲁维酵 母菌( k l u y v e r r o m y c e sl a c t i s ) ，本实验保藏菌株。 2 1 2 试剂 甘氨酸、溶菌酶购自上海s a n g o n 公司；酵母提取物、蛋白胨为英国o x i d 公司产品； 硫酸二乙酯( d e s ) 购自s i g m a 公司；- 聚赖氨酸对照品购自日本窒素公司；甲基橙、 五水硝酸铋、3 ，5 二硝基水杨酸、碘化钾、n - - ( 羟甲基) 甲基2 氨基乙磺酸( t e s ) 、硫 酸铵、硫代硫酸钠、硫脲、n a 2 s 、蔗糖均为分析纯购自上海国药集团化学试剂有限公司； 其余试剂均为进口或国产分析纯。 2 1 3 培养基 贝纳特斜面培养基：葡萄糖l o g 、牛肉浸膏1 9 、蛋白胨2 9 、酵母提取物lg 、琼脂 1 8 9 ，加水定容至1 l ，p h7 2 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n t 3 2 1 。 高氏一号培养基：可溶性淀粉2 0 9 、n a c l5 9 、k n 0 3l g 、f e s 0 4 7 h 2 0o o l g 、k 2 h p 0 4 0 5 9 、m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 、琼脂2 0 9 、加水定容至l l ，调p h 7 2 7 4 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n i s 6 。 平板培养基葡萄糖：5 0 9 、( n h 4 h s o , 1 0 9 、k 2 h p 0 4o 8 9 、k h 2 p 0 41 3 6 9 、m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 9 、z n s 0 4 7 h 2 0o 0 4 9 、f e s 0 4 7 h 2 00 0 3 9 、酵母提取物5 9 、琼脂18 9 ，加水定容至 l l ，p h6 8 ，1 2 l 灭菌2 0 m i n 3 羽。 发酵培养基( 种子培养基) ：葡萄糖5 0 9 、( n h 4 ) 2 s 0 41 0 9 、k 2 h p 0 4o 8 9 、k h 2 p 0 41 3 6 9 、 m g s 0 4 7 h 2 0o 5 9 、z n s 0 4 7 h 2 00 0 4 9 、f e s 0 4 7 h 2 00 0 3 9 、酵母提取物5 9 ，加水定容至 l l ，p h6 8 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 3 2 1 。 菌丝培养基：可溶性淀粉4 0 9 、硫酸铵8 9 、酵母提取物6 4 6 9 、k e h p 0 40 8 9 、k h 2 p 0 4 1 3 6 9 、m g s 0 4 。7 h 2 0o 7 5 9 、z n s 0 4 。7 h 2 00 0 6 9 、f e s 0 4 7 h 2 00 0 4 5 9 、加水定容至1 l ， p h6 8 ，1 2 1 灭菌2 0 m i n 5 1 j 。 高渗再生培养基：k h 2 p 0 4o 2 5g l ，蔗糖1 0 3g l ，m g c l 2 6 h 2 01 0 1 2g l ，葡萄糖 1 0 l ，蛋白胨0 1 l ，酵母膏5 0g l ，微量元素溶液2 0 m l ，t e s1 0m l ，琼脂粉2 0 l ， 配好后分装，5 0 0 m l 锥形瓶中装液2 5 0 m l ，灭菌后顺序加入单独灭菌的k h 2 p 0 4 ( 0 5 ) 2 5m l 、c a c l 2 2 h 2 0 ( 2 t