（食品科学专业论文）荞麦蛋白酶抑制剂cDNA片段克隆、序列分析及表达载体的构建.pdf

荞麦蛋白酶抑制剂c d n a 片段克隆、序列分析 及表达载体的构建 摘要 蛋白酶抑制剂( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r , p i ) 以多种形式普遍存在于动、植物以及微生物 中，它参与生物体内蛋白酶活性的调节，信号受体( s i g n a l i n gr e c e p t o r ) 的相互作用，以 及逆境情况( 如外界损伤) 下的应答等生理过程。除某些微生物可以产生抑制宿主蛋白水 解酶活性的非蛋白类小分子外，生物的内源性蛋白酶抑制剂一般均为对蛋白水解酶有抑 制活性的一类分子量较小的多肽或蛋白质。蛋白酶抑制剂在植物中分布甚广，在植物的 贮藏器官，特别是种子和球茎中含量较高，在许多农作物如小麦、大麦、玉米、豆类、 番茄和马铃薯中，其含量常常达总蛋白的1 1 0 ，植物叶片受机械损伤或化学处理， 也会积累大量p i 。到目前为止已发现四大类蛋白酶抑制剂，丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基 蛋白酶抑制剂( 半胱氨酸蛋白酶抑n n ) 、金属蛋白酶抑制剂和天冬氨酸蛋白酶抑制剂。 在植物类蛋白酶抑制剂中研究得最普遍的是丝氨酸蛋白酶抑制剂，这些抑制剂已成为研 究与蛋白质代谢相关医药及生物学的强有力的工具，尤其是由于它们在与诸如胰腺炎、 肺气肿、癌症等疾病相关蛋白酶控制方面的治疗潜力，因而引起了医药界的广泛兴趣， 生物化学家还用之作为模式系统来探索酶与底物的作用机理，同时也作为新型的抗虫基 因工程元件展开了深入研究，并取得了一定的进展。植物种子是人类及牲畜的重要食物 来源，蛋白酶抑制剂的存在，使其在营养学方面的研究同样引人入胜。迄今为止，人们 已从大豆、豇豆、马铃薯、番茄、水稻等植物中提取出蛋白酶抑制剂，并测定了其中大 部分植物来源的蛋白酶抑制荆基因序列。 荞麦是我国一种传统的药食两用的小宗粮食作物，具有较高的营养价值和药用价 值，养麦的一个显著特征就是其蛋白质具有很高的生物活性。荞麦蛋白是荞麦中主要的 生物活性成分，具有很高的营养价值，但早期人们也注意到人体对荞麦食品的消化吸收 并不是很好，营养学家认为这是由于养麦中存在一些抗营养因子( a n t i n u t r i t i o n a lf a c t o r s ) 所致，蛋白酶抑制剂就是其中之一。关于荞麦中蛋白酶抑制剂基因水平的报道较少，除 山西大学王转花等人对山西寿阳甜养蛋白酶抑制剂基因序列有过报道外，国内未有关于 荞麦蛋白酶抑制剂基因的其他报道。目前关于本实验室由乌克兰引种荞麦一吉乌一号甜 荞蛋白酶抑制剂基因序列尚无报道。 本研究通过检索n c b i 数据库，对己报道的植物蛋白酶抑制剂氨基酸序列保守区进 行分析，利用p r i m e rv e r s i o n5 0 设计简并引物，同时提取养麦第一对子叶总r n a ，采用 r t - p c r 及r a c e 法，首次克隆得到吉乌一号甜荞蛋白酶抑制剂羧基端e d n a 序列，命 i 名为b p i - 2 ( g e n b a n k 登录号为e f 5 0 7 8 5 7 ) ，利用d n a m a n 软件对获得的b p i - 2 基因3 端e d n a 序列进行分析，结果表明该片段长度为3 0 7 b p ，其中包括一个1 7 1 b p 的开放阅 读框( o r f ) ，编码5 7 个氨基酸，同时包含一个1 3 6 b p 的3 端非转译区( 3 u t r ) 。将 b p i - 2 基因所推导的氨基酸序列在n c b i 服务器上用b l a s t 搜索软件进行同源性基因检 索，结果在g e l l b a n k + e m b l + d d b j + p d b 数据库中显示1 0 0 条有同源性的序列，这些序 列均为蛋白酶抑制剂序列，其中同源性较高的依次是苋属( a m a r a n t h u s h y p o c h o n d r i a c u s ) 、南瓜属( c u c u r b i t a ) 、拟南芥( a r a b i d o p s 捃t h a l i a n a ) 、亚麻属( l i n u m ) 、 大戟属( e u p h o r b i a c e a e ) 等，相应氨基酸序列的同源性在分别为5 0 6 3 之间。据 此，可推断克隆的基因片段即为吉乌一号荞麦蛋白酶抑制剂的e d n a 片段。该序列与张 政等人报道的山西寿阳甜荞蛋白酶抑制剂基因同源性为6 4 ，由此表明该基因可能为荞 麦属蛋白酶抑制剂家族的一个新成员。应用d n a m a n 软件对荞麦蛋白酶抑制剂的氨基 酸序列及从g e n b a n k 中获取的其他植物蛋自酶抑制剂序列进行系统进化分析，发现养麦 与苋属植物最先聚类合并，在进化上显示靠得最近，接着与百日草类群聚合，然后再与 苦瓜属、接骨木属、柑橘属、茄属植物聚合，符合按照形态学进行判定的系统进化关系。 在此基础上，对基因序列所编码多肽链一级和二级结构进行了分析，最后构建了该基因 序列羧基端原核表达载体。 综上所述，我们利用r t - p c r 和3 r a c e 技术首次从吉乌一号甜荞第一对子叶中克 隆获得荞麦蛋白酶抑制剂基因并对其基因特性、表达模式进行生物信息学分析，同时构 建了该基因序列羧基端原核表达载体，为今后进一步研究养麦功能性蛋白的分子机制及 高效原核、真核表达载体的构建奠定了基础。 关键词：荞麦蛋白酶抑制剂， 3 - r a c e ， 基因克隆，表达载体 g e n ec l o n i n g 、s e q u e n c ea n a l y s i sa n de x p r e s s i o nv e c t o r c o n s t r u c t i o no n p r o t e i n a s ei n h i b i t o re d n af r a g m e n t so fb u c k w h e a t a b s t r a c t p r o t e i n i n h i b i t o r ( p 1 ) e x i s ti nv a r i o u ss o r t sa n dv a i l e t i e sc r e a t u r e i tt a k ep a i ti nt h ea c t i v i t yo f p r o t e i n a s e , i n t e t r e a c t i o no fs i g n a l i n gr e c e p t o rs u dt h er e s p o n d e ro fa d v e r s i t y m o s to fp r o t e i n a s ei n h i b i t o r a r ei nf o r mo fp o l y p e p t i d eo rp r o t e i n ，w h i c hh a v et h ea b i l i t yt oi n h i b i t o rt h ea c t i v i t yo fp r o t e i n a s e p ie x i s t i np l a n t sw i d e s p r e a d l y , e s p e c i a l l yi nt h es t o r a g eo r g a ns u c ha ss e e da n de o r r o i nm a n yf i e l dc r o p ss u c ha s w h e a t ，b a r l e y , m a i z e ，t o m a t o ，p o t a t o ，i t sc o n l e n tu s u a f l yr e a c ht o1 - 1 0 o ft o t a lp r o t e i n i ft h eb l a d eo f p l a n tw a si n j u r e do rs t i m u l a t eb yc h e m i c a lm a t e r i a l p 1w i l lb ea c c u m u l a t e di nb u i k t h e r ea r ef o u rm a i n t y p ep 1w e r e f o u n du pt on f f w , t h e ya r e s e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o rf a m i l y , s u l f h y d r y lp r o t e a s ei n h i b i t o r f a m i l y ( c y s t e i n ep r o t e a s ei n h i b i t o rf a m i l y ) ，m e t a l l o p r o t e a s ei n h i b i t o rf a m i l ya n da c i d i t yp r o t e a s ei n h i b i t o r f a m i l y t h ep i e x i s ti np l a n t sa r em a i n l ys e r i n ep r o t e a s ei n h i b i t o rf a m i l y t h i st y p eo fp ii sah i g l l p e d o r m a n c ei m p l e m e n to nt h er e s e a r c ha b o u tp r o t e i nm e t a b o l i s mr e l a t i o n t om e d i c i n ea n db i o l o g y , e s p e c i a l l yi t s l a t e n tt h e r a p y c a p a c i t yo nc o n t r o ld i s e a s es u c h p a n c r e a t i t i s e m p h y s e m aa n dc a n c e r b i o c h e m i s tu s ei ta sm o d e ls y s t e mt os e a r c hf o rt h em e c h a n i s mo fa c t i o nb e t x 、e e ne n z y m ea n ds u b s t r a t e ， m e a n w h i l e ，i tu3 sr e s e a r c h e da sar e s i s tp e s tg e n ee n g i n e e r i n ge l e m e n ta n dh a v em a k eap r o g r e s s t h es e e d 0 fp l a n ti st h ef o o dr e s o u r c eo fm a n k i n da n dl i v e s t o c k s t h ee x i s t e n c eo fp im a k et h er e s e a r c ho ni t s f u n c t i o n a lt od i e t e t i c sf a s c i n a t i n gt o o a tp r e s e n t ，p ii ns o y a b e a nc o w p e ap o t a t ot o m a t oa n dr i c eh a v eb e e n e x t r a c t e da n dg e tm o s to fg e n es e q u e n c eo fp if r o mp l a n t t h e r ea r ef e wr e p o r to ng e n es e q u e n c eo fp i f r o mb u c k w h e a te x c e p ts h a n x iu n i v e m i t yw a n gz h u a n h u ao n c er e p o r t e dt h eg e n es e q u e n c eo fp jf r o m s h o u y a n gb u c k w h e a t i nd o m e s t i ct h e r ea r en or e p o r ta b o u tp ig e n es e q u e n c ef o ru k r a i n eb u c k w h e a t b yr e t r i e v a l i n gn c b id a t a b a s ea n da n a l y z i n gt h ec o n s e r v e da m i n oa c i ds e q u e n c eo fp ih a v eb e e n r e p o r t e df r o mp l a n t ，w ed e s i g nac o u p l eo fd e g e n e r a t ep r i m e rb yp r i m e rv e r s i o n5 0 ，a tt h es a m et i m e ，w e e x t r a c t e df i r s tc o t y l e d o no fb u c k w h e a tt o t a lr n a b ym e t h o do fr t - p c ra n dr a c e ，a n dg e tt h ec l e n n i n a lc d n as e q u e n c eo fp if r o mu k r a i n eb u c k w h e a tf i r s tt i m e w en a m e di tb p i - 2a n dr e g i s t e rt h i s s e q u e n c ei no e n b a n k ( t b ea c c e s s i o nn u m b e ri se f 5 0 7 8 5 7 ) a n a l y s i n gt h es e q u e n c eb yd n a m a ns o f t w a r e w ef o u n dt h a tt h i sf r a g e m e n ti s3 0 7 b pl o n g ，i tc o n t a i na1 7 1 b pl o n go p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) ，t h i so r f e n c o d e5 7a m i n oa c i d s ，a n dc o n t a i na1 3 6 b pl o n g3 u n t r a n s l a t i o n a lr e g i o n f 3 u t r ) w er e t r i e v et h ea m i n o a c i ds e q u e n o gb yb l a s ts o f t w a r ei nn c b is e l w e rt oc o m p a r et h eh o m o l o g ya n df o u n dt h a ti n g e n b a n k + e m b l + d d b l + p d bt h e r ea r e1 0 0s e q u e n c eh a v et h eh o m o l o g yw i t ht h i ss e q u e n c e t h e s e1 0 0 s e q u e n c ea r e a l l s e q u e n c eo fp 1 a m o n gt h i s t h ea m a r a n t h u sh y p o c h o n d r i a c u sh a v et h em a x i m u m h o m o l o g y , t h e nt h ec u c u r b i t a ，a r a b i d o l i st h a l i a n a ，l i n u m ，e u p h o r b i a c e a e ，e r e 1 r h ec o r r e s p o n da m i n oa c i d s e q u e n c eh o m o l o g yi s5 0 一6 3 ，o nt h e s eg r o u n d sw ec a l lc o n c l u d et h a tt h i sf r a g e m e n ti sc d n ao fp i f r o mb u c k w h e a lt h i ss e q u e n c ec o m p a r et ot h es e q u e n c eo fp if r o ms h a n x is h o u y a n gb u c k w h e a to n c eb e r e p o r t e db y7 _ h a n gz h e n ga n do t h e n ，t h eh o m o l o g yi s6 4 ，f r o mt h i sw ec a nc o n c l u d et h a tt h i sg e n ei s a n e wm e m b e ro fp if r o mf a g o p y m m t h ep h y l e t i ce v o l u t i o na n a l y z i n go ft h i sp is e q u e n c ea n dp is e q u e n c e f r o mo t h e rp l a n t sb yd n a m a ns o f t w a r e ，w ef o u n dt h a tb u c k w h e a ta n da m a r a n t h u sh y p o c h o n d d a c o sm e r g e f u s f l y , t h e nm e r g ew i t hm o m o r d i c a , s a m b u e u s ，s o l a n u m ，e t e m e e t i n gw i t ht h ep h y l e t i ce v o l u t i o nr e l a t i o n a s s e s sb ym o r p h o l o g y b a s e do nt h e s ew ea n a l y s e dt h ep r i m a r ys t r u c t u r ea n ds e c o n d a r ys t r u c t u r eo ft h e p o l y p e p t i d ec h a i ne n c o d e db yt h i ss e q u e n c ea n dc o n s t r u c tt h ep r o c a r y o ne x p r e s s i o nv e c o ro ft h i sg e n ec t e r m i n a ls e q u e n c e i naw o r d 。w ee x t r a c t e df i r s tc o t y l e d o no fb u c k w h e a tt o t a lr n a ，b ym e t h o do fr t - p c ra n d3 r a c e ， g e tt h ect e r m i n a lc d n as e q u e n c eo fp if r o mu k r a i n eb u c k w h e a t ，a n dd os o m eb i o i n f o r m a t i c sa n a l y s eo i l t h i sc d n as e q u e n c eo f p if r o mb u c k w h e a t , s u c ha sg e n ec h a r a c t e r i s t i c s e x p r e s s i o nm o d e a l lo f t h i sw i l lb e h e l pf o r t h ef o r w a r dr e s e a r c ho nf u n c t i o n a lp r o t e i na n dh i 曲p e r f o r m a n c eo fp r o c a r y o ne x p r e s s i o no r e u k a r y o ne x p r e s s i o n k e yw o r d s ：b u c k w h e a t ，p r o t e i n a s ei n h i b i t o r ，3 一r a c e ，g e n ec l o n i n g ，e x p r e s s i o nv e c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一。同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文巾作了明确的说明并 表示了谢意。 学位论文作耆签名：督志、罪 签字只期： 扣7 年6 月i 8 同 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，卸：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 学位论文作者签名：智志、罩 签字日期：函叮年6 月弼日 导师签 签字日期：扣7 年月豫日 吉林农业大学硕士学位论文荞麦蛋白莳伸制剂c d n a 片段克隆序列分析及表达薮体的构建 第一章前言 蛋白酶抑；制齐l j ( p r o t e i n a s ei n h i b i t o r , p d 以多种形式_ 业遍存在于动、植物以及微生物中， 它参与生物体内蛋白酶活性的调节，信号受体( s i g n a l i n gr e c e p t o r ) 的相互作用以及逆 境情况( 如外界损伤) 下的应答等尘理过程。除某些微， 物可以产生抑制宿主蛋白水解酶 活t ，e 的非蛋白类小分子外，生物的内源性蛋白酶抑制荆。一般均为对蛋白水解酶有抑制活 性的一类分子量较小的多肽或蛋白质【”。蛋白酶抑制刺侄植物中分布甚广，在许多农作 物如小麦、大麦、玉米、豆类、番茄和马铃薯中均有存在，多见于种子和块茎内。在植 物贮藏器官中，其含量通常高达总蛋白的1 0 ，昆虫消化道内存在着数种蛋白酶，在食 物的消化过程中起重要作用，。昆虫摄食蛋白酶抑制利后，导致昆虫消化功能失凋，生 长发育受阻，并且易受环境中其它不利因素的影响，最终导致昆虫发育不正常甚至多e 亡。 植物叶片受到机械损伤或经化学物质处理，也会积累人量蛋白酶抑制剂。因此，蛋白酶 抑制剂在植物对害虫和病原体的侵染防御系统中具有 。分重要的作用h 。蛋白酶抑制剂 能j 蛋白酶的活性部位和变拗部位结合，抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的 酶闲此它具有防止体内1 i 必嘤的蛋白降解，调节蛋r l 代谢及调节各种蛋白酶的牛理活 忖：的功能。在一系列的，j 三珲病卿过程中也起着关键性的调控作用，众多研究表明种或 多种蛋白酶及蛋白酶抑制剂可能在细胞凋亡发生、发腱过程中起关键性作用。研究者们 已认识到蛋白酶和蛋白酶抑制卉i 可能为临床治疗某些疾病，延缓或加速细胞凋亡过平u 提 供新的途径，例如可以应用一赡蛋白酶抑制剂旨在延缓如缺血一缺氧所诱发的神经几、心 肌肾脏上皮细胞的细胞凋亡进俐“。 1 1蛋白酶抑制剂的类型 自然界中的p 1 种类繁多，数目庞大，而且每年都有相当数量的新抑制剂被报道，迄 今为止，自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂，根据作用于酶的活性基团不同及其氨基酸 序列的同源性，可分为以下四大判4 5 】： 1 1 1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛仔在于豆科植物的储存器官特别是种子中，其含量常常高 达总蛋白的1 0 。近几十年来，已从许多豆科植物材料中纯化出多种丝氨酸蛋白酶抑制 剂，并进行了生理生化及分子牛物学等方面的研究。丝氩酸蛋白酶抑制剂在其作用机理、 吉林农业大学硕士学位论文荞麦蛋白酶抻制荆c d n a 片段兑隆年列分析及表达载体的构硅 氨基酸序列及x 光晶体衍射图谱方都研究得比较清楚。这类抑制刺数量很多，根据它 们之间的序列l 司源性分子中二硫桥与作用位点之侧的拓扑学关系又可将丝氨酸蛋白酶 类抑制剂至少分为1 0 个属。其中主要有牛胰蛋白酶抑制剂k u n i t z 属，是目前研究的最“ 泛的蛋白质家族之一f 6 - 7 】。 1 1 2 巯基蛋白酶抑制剂 巯基蛋l ：i 酶抑制i j ( t h i 0 1p r o t c i n a s ei n h i b i t o r s ，简称1 1 p i ) 又称、# 胱氨酸类蛋白酶抑制 i t j ( c p i ) ，是近f 一几年来研究较多的种天然蛋白酶抑制剂。它广泛分布于动物、植物和 微生物中p j 。早在1 9 7 6 年发现血浆中存在c p i 之前，人们便注意剑了哺乳动物的许多组 织中存在c p ! ，c p i 是一调节蛋白，对不适宜的蛋白质水解有保护作用。动物体细胞内的 溶酶体，其一 t 的巯基酶参与蛋白质代谢，组织生长和分化、抗原产生等过程。许多病理 过程如发炎、肌肉营养不良、自身免疫疾病、肿瘤等都与巯基酶仃关，该酶活性主要受 其抑制剂的拧制p j 。 1 1 _ 3 金属蛋白酶抑制剂 会属蛋| ，i 晦是一类依赖于金属离子的蛋白水解酶类，能够降解细胞外基质和基底 膜，参与许彩7 卜理和病理过程f 如肿瘤细胞的侵袭和转移，自身免疫性疾病等1 。研究发 现，基质会棱蛋白酶的分泌和活性受多水平和多层次因素的调节，如基因转录水平、酶 原激活和特蚌的抑制剂等。金属蛋白酶抑制剂作为调节细胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , e c m ) 代谢的多功能蛋白质，能与金属蛋白酶以一定的比例形成复合物，抑制金 属蛋白酶的活性，是金属蛋白酶的特异抑制剂l l “q 。 1 1 4 天冬氨酸蛋白酶抑制剂 目前，斟内外有关天冬氨酸蛋白酶抑制剂基因的研究较少，天冬氨酸蛋白酶活性的 最适p h 值为3 - - 5 ，因此也称酸性蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶抑制剂不仅可抑制天冬氨酸蛋 白酶，还可抑制胰蛋白酶。天冬氨酸类蛋白酶抑制剂抗虫作用的有关研究还未见报道， 由于丝氨酸类及半胱氨酸类蛋白酶抑制剂转基因植物的抗虫作用已经得到了证实，因而 推测天冬氨酸蛋白酶抑制剂也应具有抗虫作用。鞘翅目与半翅目昆虫肠道内的酸性环境 ( p h 3 5 ) 为天冬氨酸蛋白酶抑制剂提供了一个良好的作用环境，丝氨酸类蛋白酶抑制剂 的最适p h 值为9 1 1 ，所以天冬氨酸类蛋白酶抑制剂对这两类昆虫可能发挥较好的抗虫 作用【1 3 】。 吉林农业大学硕士学位论文 荞麦蛋白荫抑制刺c d n a 片段克隆序列竹f f f 及表达戴体的掏逵 1 2 蛋白酶抑制剂的结构与理化性质 1 2 1 蛋白酶抑制剂的结构特征 目前已报道的p i 大小多为8 0 k d 左右，氨基酸数目为5 l 9 9 个。蛋向酶抑制剂有很 多个家族，它们尽管具有相同的生物活性，但分子的空间折叠方式却有很大差别甚至完 全不同，在已发现的各类p i 中，丝氨酸类蛋白酶抑制剂种类最多，分布也最广，因此对 这类抑制剂作用机胖和生理功能的研究较为深入。这类抑制剂不仅对于植物生理活动的 调节和病虫害的抵御有重要作用，而且与人体肿瘤细胞的发生、转移和浸润过程密切相 关，这对于肿瘤细胞凋亡和癌症治疗有重要意义，在抗癌药物的设计上具有良好的应用 前景。k u n i t z 型丝氨酸蛋白酶抑制剂是其中最重要的，也是研究最广泛的蛋白酶抑制剂 之一，该类蛋白酶抑制剂三维结构高度保守：山个明显的疏水核心、：i 对高度保守的 二硫键桥、三链1 3 折叠和一个n 端3 l o 螺旋及一个c 端q - 螺旋组成，3 对：硫键对分子空 间结构的稳定起着“二常重要的作用“叫。 1 2 2 蛋白酶抑制剂的理化性质 p i 多具有较好的热稳定性有的组分在9 8 f 处理2 小时仍可保持9 0 的抑制活 性。p i 一般在酸性条件下比较稳定，当p h 值离f8 0 时抑制活性逐渐卜降，同时对热 处理的敏感性提高【16 。 1 3 蛋白酶抑制剂的作用机理 蛋白酶抑制剂的作用机理与其分子结构密切相关。从蛋白质的一级结构角度来看， 抑制剂的活性位点和分子内的二硫键对抑制活性有重要作用，蛋白酶抑制剂与其靶酶两 者之间的作用方式大致有3 种l l - l a j ： ( 1 ) 互补型即抑制剂象底物一样占据靶酶的识别位点与结合部位，并与酶的活性基团形 成氢键而封闭靶酶的活性中心，如胰蛋白酶抑制剂。 ( 2 ) 相伴型抑制剂分子不占据靶酶的识别位点，而是与酶分子并列“相伴”，并在与酶 的活性基团形成氢键的同时封锁酶与底物的结合部位，凝血酶抑制剂f 水蛭素h i r u d i n ) e p 属于这种形式。 ( 3 ) 覆盖型抑制剂以类似线性分子的形式覆盖到靶酶活性中心附近的区域上，从而阻止 酶的活性中心与底物接触，木瓜蛋白酶抑制剂就是此类的典型代表。 蛋白酶抑制剂通过抑制蛋白酶的活性，调控蛋白酶参与的生理生化活动，从而起到抗病 吉林农业大学硕士学位论文荠麦蛋白晦抑制利c d n a 片段克睦序列分析及最退戴俸的构建 虫害、抗炎抗病毒及抑制肿增细胞增生的作用。 1 4 蛋白酶抑制剂的生物功能 1 4 1 蛋白酶抑制剂的抗病作用 r o b y 等观察到西瓜感染菜豆炭疽菌( c o l l e t o tr i c h u nl i n d em u t h i a n w ) 后，叶片内的蛋 i ，1 酶抑制剂含量便会上升。这砦研究表明植物蛋白酶抑制剂与植物的抗病有一定的关 系。另外的一些研究发现蛋f 1 酶是病原微生物侵染与扩展过程中所依赖的重矍酶类。 补：植物中，也存在能专一抑制微生物来源蛋白酶的蛋白酶抑制剂。因此，研究认为，病 原微生物在侵染与扩展过程中，要依赖胞外蛋白酶降解寄主组织，才能获得病原苗生长 和增殖所需的氨基酸，而植物则可能通过分泌蛋白酶抑制剂阻止病原菌蛋白酶对寄主组 彭 的降解，使病原菌营养不足，生长和增殖受限，侵染与扩展受阻，从而达到抗痫的目 刚吼 1 4 2 蛋白酶抑制剂的抗虫作用 蛋白酶抑制剂具有很“的杀虫谱，当蛋白酶抑制剂被昆虫摄食并在体内聚枞时它 j i 昆虫消化道内的蛋白酶作川形成酶一抑制剂复合物( e 1 ) ，将会显著抑制肠道内蚩内水 解酶的活性，影响食物中蚩 | j 质的i f 常消化和许多酶原的激活，并能刺激消化酶的过量 合成和分泌，引起某些必须氨基酸( 如甲硫氨酸) 的缺乏，干扰昆虫的j 下常代谢，最终 导致昆虫发育不正常甚至死亡1 2 0 】。 1 4 3 蛋白酶抑制剂的抗炎抗感染作用 胰蛋白酶被不适当的激活- 叮引起腺体自身消化，诱发炎症水肿，而活化后的胰蛋白 酶又可激活许多其他的消化酶，从而导致胰腺的过度损伤，甚至局部坏死。同时活化后 的胰蛋白酶作为炎性介质，释入腹腔进入体循环，破坏宿主防御机制，致血管痉挛循环 障碍，引起远端器官功能障碍诱发如肺气肿、胰腺坏死、休克等。动物脏器中提取的 抑肚酶是一特异性蛋白酶抑制莉。对人的胰蛋白酶、糜蛋白酶，胃蛋白酶、溶血酶原激 活荆、溶血酶、激肽释放酶、弹性蛋白酶等有很强的抑制活性，临床用于治疗胰腺炎， 肺气肿，脑水肿，脑、肺、肠缺血再灌注损伤，心脏、子宫等术后出血，烧烫伤外用及 肿瘤的辅助性治疗卜”“j 。 4 吉林农业大学硕士学位论文砗麦蛋白酶押制刺c d n a 片段克隆，年列分析及表达载体的构建 1 4 4 蛋白酶抑制剂对癌细胞的抑制作用 肿瘤细胞的浸润和转移是肿瘤患肯死亡的主要原因。目前认为肿瘤侵袭是一个复杂 的动力学多步骤过程，它包括恶性肿缩细胞从其原发位脱离、穿过细胞外基质和基底膜、 进入淋巴血铃等过程，其中，细胞外基质和基底膜的降解是必需的步骤。细胞外基质 主要组分中，睃原、层粘连蛋白和纤粘连蛋白的降解需要专一的蛋白酶的作用。k o b a y a s h i 制备了小鼠l e w i s n * 癌模型，用t j t i ( j 5 j 胰蛋白酶抑制剂) 进行抗肿瘤治疗，结果发现，u t i 对原位癌的作不明显，但可以有效抑制肿瘤细胞的转移1 。j i “j ， 1 5 蛋白酶抑制剂的应用现状 1 5 1 农业领域 害虫的防治是农业生产中的重要f 务。现阶段，人们普遍采用化学试剂来杀灭害虫， 不仅使很多霄已经产生了耐药性，晌且严重污染了环境。而传统的常规育种又受到周 期长和基冈资溯缺乏的限制，不能很十j 地应用于生产。因此，基i n 程技术的发展为培 育抗虫作物d ：1 提供了新手段忡j 。蛋【酶抑制剂在农业中应用的l 耍方面是在抗虫基因 工程中的应nj 它能与昆虫消化道中的特异蛋白消化酶相互作刚形成酶一抑制剂复合 物( e 1 ) l j f l 断或减弱消化酶的蛋白水解作用。昕以，一旦昆虫摄食生r j 酶抑制剂就会影响 对外来蛋白的消化，同时，蛋白酶抑制剂和消化酶形成e l 复合物，能刺激消化酶的过量 分泌，通过神经系统的反馈，使昆虫产生厌食反应，由于蛋白酶抑制剂抑制了昆虫的进 食及消化过程，不可避免地将导致昆虫缺乏代谢中必需的氨基酸，最终造成昆虫的非正 常发育或死亡此外，蛋白酶抑制剂可通过消化道进入昆虫的血淋巴系统，从而严重干 扰昆虫的蜕皮过程和免疫应答。进一步的p i 的抗虫机理要涉及到昆虫肠道内蛋白酶的合 成、分泌和调控机制弘“。此外，植物蛋白酶抑制剂与植物的抗病有一定的关系。研究发 现，蛋白酶是病原微生物侵染与扩展过程中昕依赖的重要酶类，在植物中，也存在能专 一抑制微生物柬源蛋白酶的蛋白酶抑制剂，因此，研究者认为，病原微生物在侵染与扩 展过程中，要依赖胞外蛋白酶降解寄主组织，j 能获得病原菌生长和增殖所需的氨基酸， 而植物则可能通过分泌蛋白酶抑制剂阻止病原菌蛋白酶对寄主组织的降解，使病原菌营 养不足，生长平u 增殖受限，侵染与扩展受阻，从而达到抗病的目的。 自h i l d e r 等1 9 8 7 年首次将豇豆蛋白酶抑制剂基因( c r r l ，c o w p e at r y p s i ni n h i b i t o r ) 导 入烟草以来，蛋白酶抑制剂在植物抗病虫害基因工程中的应用已有近2 0 年。目前，已有 多种蛋白酶抑：刚剂基因或c d n a 被克隆并进行了序列测定。并得到。批转蛋白酶抑制剂 基因工程植 ；k 这些转蛋白酶抑制剂蛙因植株表现出良好的抗病抚虫效果，具有广阔的 吉林农业大学硕士学位论文荞麦蛋白酶抑制剂e d n a 片段克隆序列寸析及表达裁体印构建 应用前景。 1 5 2 医药领域 目前蛋白酶抑制剂在医药方面的应用归纳起来主要有3 个方面，抗炎抗感染、抗病 毒感染、抗肿瘤1 2 。蛋白酶抑制剂在临床治疗l 有许多重要应用，如在治疗胰腺炎和多 功能衰竭、抗休克、减少心脏外科手术中失血、防治脑水肿和脑缺血、预防早产、预防 单侧肺缺血再灌汴引起的损伤等方面都有相关的研究报道i 刈。其中，最令人瞩目的是在 h i v 和肿瘤治疗中的应用。y e 等从蚕豆( v i c i af a b a ) 中分离得到一种分f 量大约为7 5k d 的胰蛋白酶一胰凝乳蛋白酶抑制剂，证实该抑制剂对m y c o s ph a e r e l l aa r a c h i d i c o l a ， f u s a r i u mo x y s p o r u m 和b o t r y t i sc i n e r e a 具有抗真菌活性。和其他抗真菌蛋白样，该抑 制剂也抑$ i j h i v - 1 逆转录酶的活性，可以增强鼠脾细胞的有丝分裂能力。这是首次关于 豆类蛋白酶抑制剂抗真菌活性的报道p ”。研究发现，大豆b b t i 型蛋e 1 酶抑制剂具有明 显的抗癌作用，它不同于其它一些抗癌药物，能以不可逆方式影响致癌过程且在低含量 时也能发挥其抗痹作用。在已经发生癌症的模型中大豆b b t i 型蛋白酶抑制剂体内外均可 长期表现出抑癌f 1 用，大豆b b t i 型蛋白酶抑制刺可抑制或阻止诱导结肠癌的发生，其抑 制肿瘤的效果主要来自于抑制胰凝乳蛋白酶的；一性i j 叫。蛋白酶抑制剂虽然对癌细胞没有 直接的杀伤效果，但它在离体条件下可阻止i ：常细胞向恶性转化、甚币在癌症晚期亦如 此。还有学者最近实验证明：丝氨酸胰蛋白酶抑制剂可以用于急慢性胰腺炎的治疗中。 还有一种潜在的和肯选择性的b e t a 1 a c t a m 类胰蚩白酶抑制剂b m s 2 6 2 0 8 4 被治疗学家将 其作为一种潜在的药物运用到哮喘的治疗中i j j i 。肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂( t a t i ) 是一 种对组织的退化有抑制作用的6 k d a 的蛋白酶抑制剂，在不同类型的癌组织有不同的水 平，结论证实，在肿瘤组织中高水平表达t a t i 对早期胃癌患者的治疗是非常有利的p j ， 尿胰蛋白酶抑制剂，是一种丝氢酸蛋白酶抑制剂，其对细菌内毒素导致的急性肺损伤至 少有部分的抑制作用l ”j 。 1 5 3 食品领域 在水产品生产中，主要存在问题就是鱼肉制品和甲壳类产品在贮藏稳定性方面的问 题，一些海洋资源比如鱿鱼，其蛋白质形成凝睃的能力弱，限制了其作为肉糜原料的用 途，在该过程中蛋白酶起到了关键作用，一些特殊的蛋自酶抑制剂可以与鱼肉中的蛋白 酶争夺活性位点或者非特异性地捕获蛋白酶，二二扰蛋白酶的作用，从而起到提高鱼肉糜 的贮藏性的功能【3 刚。 6 吉林农业大学硕士学位论文葬麦蛋白萄押制音1 | c d n a 片段克隆序列分析硬表迅薮俸的柯建 1 6 蛋白酶抑制剂的分子生物学研究进展 随着对蛋白酶抑制剂研究的不断深入，许多蛋e l 酶抑制剂的基因已被克隆测序，人 1 f 】丌始通过各种基因工程技术手段生产、改造、设计、合成蛋白酶抑制剂，目酣，关于 械物蛋白酶抑制剂主要集中十抗虫基因工程的研究f ：，将蛋白酶抑制剂基因转移到不同 的植物体内，以提高其抗病虫害的能力。自从h i l d e r 等( 1 9 8 7 ) 率先将豇豆中的胰蛋白酶抑 制剂基因转入烟草( n i c o t i a n ar u s t o ，获得了对鳞翅日烟芽夜蛾( h e l i o t h i sv i r e s c e n s ) 、斜 纹贪夜蛾( s p o d o p t e r al i t u r a ) 和直翅目蝗虫( k u s t a 册i g r a t o r i a ) 的抗性以来。植物蛋白酶 抑制剂抗虫基因工程已经取得了很大进展，现己获得了一些转基因植物。 1 6 1 蛋白酶抑制剂基因表达的研究 目的可用于蛋白酶抑制剂基因工程表达的体系 i 要有大肠杆菌表达系统、酵母菌表 达系统、昆虫细胞杆状病毒表达系统和植物表达系统p “”j 。 ( 1 ) 大肠杆菌表达系统大肠卡f 菌是目前应用最广泛的基因工程表达工具，大肠f r 菌具 箭操作简便、繁殖迅速及成本低廉等特点，因而大肠卡t 菌表达系统是目前最常刖的外源 货门表达系统，为研究蛋白质的结构与功能及应用提供了极大的便利。外源琏l q 作大肠 十l 菌中表达水平的高低取决n 午多因素，包括宿二1 i 荫的性质、启动子的强弱、表达基 本身的结构及表达产物的理化性质等。目前已有们：多关于植物类蛋白酶抑制剂n ：大肠 f i 菌中的表达的报道。 ( 2 ) 酵母表达系统主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表达系 统。其中甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统，也是目前 应用最广泛的酵母表达系统，主要有h p o l y m o r p h a 、c a n d i d ab o d i n i i 、p i c h i ap a s t o r i s 三 种，其中p i c h i a p a s t o r i s 作为基因表达系统既具有生长快，易于培养，遗传操作简单，表 达量高，成本低等原核生物的特点，又具有真核生物对表达的蛋自质进行糖基化、磷酸 化等翻译后加工、修饰及合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，使用最 多、最广泛，被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。王晓龙等将中性粒细 胞蛋白酶抑制剂e l a f i n 在毕赤酵母g s l l 5 菌株中表达，发酵分离并检测到活性；李克勤等 人用p i c h i ap a s t o r i s 酵母系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑制剂i ( t i m p 一1 ) ，获得了分 泌型并币确折叠的重组蛋白，培养上清中重组蛋白的含量高达4 0 i n g ，l 。免疫印迹法和反 相酶谱法证实重组蛋白具有与天然蛋白同样的生物学活性。 ( 3 ) 昆虫杆状稿毒表达系统昆虫杆状病毒表达系统是目前国内外十分推崇的真核表 达系统。利用杆状病毒结构基因中多角体蛋白的强启动子构建的表达载体，可使很多真 骸目的基因得到有效甚至高水平的表达。它具有真核表达系统的翻译后加工功能，如二 7 吉林农业大学硕士学位论文茸麦蛋白酶抑制莉c d n a 片段舞弩、序列分析及表遮载体的构建 硫键的形成、糖基化及磷酸化等，使碹组蛋白在结构和功能上史接近天然蛋白，其最高 表达量可丛昆虫细胞蛋白总量的5 0 ，可表达非常大的外源性肇冈，具有在同一个感染 昆虫细胞内同时表达多个外