（食品科学专业论文）茶多酚对植物巯基蛋白活性的影响研究.pdf

摘要 中文摘要 本文研究了茶多酚( t p ) 对应用广泛的两种毓基蛋白酶( 菠萝蛋白酶及木瓜蛋白 酶) 的稳定化作用，以及对豆类中普遍存在的两种胰蛋白酶抑制因子( k s t i 、b b i ) 的 钝化作用，并进一步探讨了其作用机理。其主要内容如下： 研究了茶多酚与菠萝蛋白酶及木瓜蛋白酶作用的最佳条件。其中与菠萝蛋白酶作用 的最适条件为：茶多酚浓度0 8 ，温度3 0 。c ，p h 5 ，作用时间3 0 m i n ，缓冲体系为 0 0 3 m 0 1 l 。1 的柠檬酸一磷酸二氢钠，在此条件下，酶活回收率8 1 9 7 ，蛋白回收率 7 9 5 6 ；作用木瓜蛋白酶的最适条件为茶多酚浓度0 7 ，温度o 4 ，p h 4 7 5 ，作用 时间4 5 m i n ，缓冲体系为o 1 m 0 1 l 1 的柠檬酸一磷酸二氢钠，此时，酶活回收率9 1 2 4 ， 蛋白回收率9 2 4 5 。 比较了茶多酚作用前后菠萝蛋白酶及木瓜蛋白酶的催化性质及稳定性。最适温度及 p h 没有明显变化：菠萝蛋白酶最适温度为5 5 。c ，p h 为6 ；木瓜蛋白酶最适温度为6 5 ， p h 由7 变为7 5 。热稳定性及贮：藏稳定性在茶多酚作用后均有所提高：8 0 。c 水浴保持 2 h 后，菠萝蛋白酶的酶活残存率较游离酶由2 0 提高到5 7 3 4 ；木瓜蛋白酶则由4 8 0 7 提高到7 6 4 7 ；常温( 2 5o c ) 贮减条件下，菠萝蛋白酶的半衰期由8 天增加到2 0 天，木 瓜蛋白酶由5 天延长到3 5 天；而低温( 0 4 ) 贮藏3 0 天后，菠萝蛋白酶的酶活残存率 由1 5 1 提高到7 7 8 9 ，木瓜蛋白酶由4 9 8 4 提高到8 4 8 6 。茶多酚作用后k m 值有 所增大，其中菠萝蛋白酶的k m 值由0 6m g ml - l 变为1 4m g m l ，木瓜蛋白酶的k m 值由3 0 7m g m l 。1 变为5 7 1m g m l 一，表明这两种蛋白酶经茶多酚作用后对酪蛋白底物 的亲和力降低。结果表明，经茶多酚作用的菠萝蛋白酶以及木瓜蛋白酶其特性没有发生 明显变化，但热稳定性及贮藏稳定性得到了显著提高。 研究了茶多酚对鲜豆浆中胰蛋白酶抑制因子的饨化作用。当t p ：豆浆( g ：g ) 的比例 为l ：2 时，钝化效果最好，胰蛋白酶抑制因子钝化牢为5 2 3 。 比较了茶多酚及j l 矛t 常用化学物质对k s t i 及b b i 的钝化影响。其中，对k s t i 的 钝化效果为g s h ( 还原性谷胱甘肽) t p ( 茶多酚) n a 2 s 0 3 ( 哑硫酸钠) l y s ( 赖氨 酸) n a 2 s 2 0 3 ( 硫代硫酸钠) ，而对b b i 为n a 2 s 0 3 t p n a 2 s 2 0 3 l y s g s h 。 研究了茶多酚钝化k s t i 及b b i 的最佳条件。其中，钝化k s t i 的最佳条件为 t p k s t i 为2 5 ( m g ：m g ) ，作用温度4 5 ，p h 4 5 ，作用时间1 5 h ，此时，k s t i 的最大 抑制字达8 3 1 5 ：钝化b b i 的最佳条件为t p b b i 为2 0 ( m g ：m g ) ，作用温度4 0 ，p h 4 5 ， 作用时间1 h ，此时，b b i 的最大抑制率达7 6 5 8 。 研究了茶多酚作用前后巯基蛋白( 菠萝蛋白酶、木瓜蛋广1 酶、k s t i 、b b i ) 的抗氧 化性、巯肇状态、紫外图普及荧光光谱的变化。作用后的菠萝蛋白酶及木瓜蛋白酶抗o h 和抗0 2 一能力较作用前均增强；巯基含量随贮藏时i 、f i j 变化而降低的趋势较作用前慢， 江南大学硕上学位论文 k s t i 及b b i 的巯基含量较作用前少；紫外图谱及荧光光谱扫描结果表明毓基蛋白作用 前后共价键结构没有破坏，但荧光发射峰发生少量蓝移，可能是因为蛋白中色氨酸所处 的微环境极性减小。 关键词：菠萝蛋白酶木瓜蛋白酶 k u n i t z 型胰蛋白酶抑制剂( k s t i ) b o w m a n b i r k 型 胰蛋白酶抑$ 1 齐t j ( b b i ) 茶多酚作用 摘要 a b s t r ac t t h e o b j e c t i v eo ft h i sr e s e a r c hi st os t u d yt h es t a b i l i z a t i o no ft e ap o l y p h e n o l s ( t p ) o nt w o s u l f h y d r y lp r o t e a s e s ( b r o m e l a i na n dp a p a i n ) o fc o m p r e h e n s i v ea p p l i c a t i o na n di n a c t i v a t i o no f t w ot r y p s i ni n h i b i t o r s ( k s t ia n db b i ) ，w h i c he x i s ti nm o s tl e g u m e s t h em a i nr e s e a r c h c o n c l u s i o n sw e r ea sf o l l o w s ： t h ee f f e c t so ft pc o n c e n t r a t i o n ，t e m p e r a t u r e ，p h ，a c t i o nt i m e ，b u f f e rt y p ea n d c o n c e n t r a t i o no nb r o m e l a i na n dp a p a i nr e c o v e r yw e r ed i s c u s s e dw h e nt h e yw e r ec o m p l e x i n g w i t ht p t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em a x i m u mr e c o v e r yo fb r o m e l a i na c t i v i t yw a s81 9 7 a n dt h ep r o t e i nr e c o v e r yw a s7 9 5 6 u n d e rt h ec o n d i t i o n so f0 0 3 m 0 1 l 1c i t r i ca c i d - n a 2 h p 0 4b u f f e r ，0 8 t pc o n c e n t r a t i o na t3 0 a n dp h5f o r3 0m i n ；w h e no 7 t pw a s a d d e dt op a p a i nd i s s o l v e di no 1m 0 1 l c i t r i ca c i d n a 2 h p 0 4b u f f e ra to 4 a n dp h4 7 5f o r 4 5m i n ，t h em a x i m u mp a p a i nr e c o v e r yw a s91 2 4 a n dp r o t e i nr e c o v e r yw a s9 2 4 5 ， r e s p e c t i v e l y t h ec a t a l y z i n gp r o p e r t i e sa n ds t a b i l i z a t i o no fb r o m e l a i na n dp a p a i nb e f o r ea n da f t e r c o m p l e x i n gw i t ht pw e r ec o m p a r e d c o m p l e x i n gw i t ht pd i d n tc h a n g et h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo fb r o m e l a i n ( 5 5 。c ) a n dp a p a i n ( 6 5 。c ) ；i tw a ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mp ho ft h e f r e ea n dt h ec o m p l e x e db r o m e l a i nd i d n tc h a n g e ( 7 0 ) ，b u tp a p a i nc h a n g e df r o m7t o7 5 c o m p a r i n gw i t hf r e eb r o m e l a i na n dp a p a i n ，t h et h e r m a ls t a b i l i t i e so ft h ec o m p l e x e dw e r e g r e a t l yi m p r o v e d ：a f t e rw a r m i n gi n8 0 cf o r2 h ，r e s i d u er a t i oo fb r o m e l a i na c t i v i t yw a s i m p r o v e df r o m2 0 t o5 7 3 4 ，w h e r e a sp a p a i na c t i v i t yf r o m4 8 0 7 t o7 6 4 7 ；w h e ns t o r e d u n d e rn o r m a lt e m p e r a t u r e ( 2 5 。c ) ，t h eh a l f - t i m e ( t i m et ol o s eh a l fo ft h ea c t i v i t y ) o fb r o m e l a i n w a si n c r e a s e df r o m8 dt o2 0 d ，p a p a i nw a si n c r e a s e df r o m5 dt om o r et h a n35 d ；w h e ns t o r e d u n d e rl o wt e m p e r a t u r e ( 0 - 4 。c ) f o r3 0d a y s ，r e s i d u er a t i oo fb r o m e l a i na c t i v i t yw a sc h a n g e d f r o m15 1 t o7 7 8 9 ，p a p a i nf r o m4 9 8 4 t o8 4 8 6 i na d d i t i o n ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h ek mv a lu e sf o rt h ec o m p l e x e dw a sh i g h e rt h a nt h ef l e e ：b r o m e l a i nf r o m0 6 m g m l 叫t o 1 4 m g m l p a p a i nf r o m3 0 7m g m l 以t o5 7 1m g m l 一，w h i c hi n d i c a t e dt h a tc o m p l e x i n g w i t ht pl o w e r st h ea f f i n i t yo ft h ee n z y m ef o rt h ec a s e i ns u b s t r a t e t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ec o m p l e x e dh a de n h a n c e dt h e i ru t i l i z a t i o nb yi m p r o v i n gt h e i rs t a b i l i t i e so b v i o u s l y , b u tn o t c h a n g e dr e a c t i o nc h a r a c t e r i s t i co fb r o m e l a i na n dp a p a i n t h ei n a c t i v a t i o no ft po nt r y p s i ni n h i b i t o r so fs o y b e a nm i l kw a ss t u d i e d o p t i m u m i n a c t i v a t i o nr a t i ow a s5 2 3 w h e nt h er a t eo ft pt os o y b e a nm i l kw a s1 ：2 t h ei n a c t i v a t i o ne f f e c t so fs e v e r a lc h e m i c a lc o m p o u n d so nk s t ia n db b lw e r e c o m p a r e d i tw a ss h o w e dt h a t t ok s t i ：g s h t p n a 2 s 0 3 l y s n a 2 s 2 0 3 ，a n dt ob b i ： n a 2 s 0 3 t p n a 2 s 2 0 3 l y s g s h t h e r e s u l t si n d i c a t e dt pw a sap r o s p e c t i v eb i o l o g y 江南大学硕士学位论文 i n a c t i v a t o r o p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sf o rt p t oi n a c t i v ek s t ia n db b lw e r ea l s os t u d i e d o p t i m a l i n a c t i v a t i o nr a t i ow a s8 3 15 u n d e rt h ec o n d i t i o n s ：t h eq u a n t i t yr a t i oo ft pt ok s t i ( r a g ：m g ) w a s2 5a tp h4 5a n dt e m p e r a t u r e4 5 。cf o r1 5 h ；m a x i m u mi n a c t i v a t i o nr a t i oo fb b lw a s 7 6 5 8 w h e nt h eq u a n t i t yr a t i oo f t pt ob b ii s2 0a tp h4 5a n dt e m p e r a t u r e4 0 。cf o rl h i no r d e rt os u m m a r i z et h ea c t i o nm e c h a n i s m s ，t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t i e s ，s u l f h y d r y l c o n t e n t s u va n df l u o r e s c e n c es p e c t r u mo ft h e s es e v e r a ls u l f h y d r y lp r o t e i n sb e f o r ea n da f t e r c o m p l e x i n gw i t ht pw e r ed e t e r m i n e d t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yt op y r o g a l l o la n df e t o no f p a p a i na n db r o m e l a i nw e r eg r e a t l yi m p r o v e da f t e rc o m p l e x i n g ，r e d u c i n gt r e n do fs u l f h y d r y l c o n t e n tw i t hs t o r i n gt i m eo fb r o m e l a i na n dp a p a i nw a ss l o w e rt h a nt h a to ff r e ee n z y m e ，a n d t h es u lf h y d r y lg r o u pc o n t e n to fk s t ia n db b ic o m p l e xw e r ef e w e rt h a no fn o n - c o m p l e x i n g k s t ia n db b i u va n df l u o r e s c e n c es p e c t r u ms h o w e dt h a tc o v a l e n tb o n d ss t r u c t u r eo ft h e s e s u l f h y d r y lp r o t e i nh a d n tb e e nd e s t r o y e da f t e rc o m p l e x i n gw i t ht p b u tp o l a r i t yo ft r pi n m i c r o e n v i r o n m e n td e c r e a s e d k e y w o r d s ：b r o m e l a i np a p a i n k s t ib b it e a p o l y p h e n o l sc o m p l e x i n g 独刨性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南大学或 其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 垂旦趁诠 日期：c 哆年7 月& 6 曰 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定：江 南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 至垒孟硷 导师签名： 日期：c 7 年呼月劲日 f 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 1 1 1 酶制剂的应用研究现状 根据国际生物化学联合委员会对酶制剂的分类，可将酶分为氧化还原酶类、转移酶 类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类i lj 。目前已经广泛用于食品、饲料、造 纸、酿造、石油化工、纺织、印染、医药等2 0 多个领域。 1 1 1 1 国内外酶制剂的发展概况 近年来，随着生物技术的深入研究，圈际上在酶工程研究和产业化方面发展非常迅 速，从1 9 9 5 年的1 2 5 亿美元增加到1 9 9 9 年的1 9 2 亿美元，2 0 0 2 年市场规模达到2 5 亿美元1 2 j 。而我国的酶制荆工业经过近4 0 年的努力，也形成了一定的生产规模。据行 业不完全统计，2 0 0 0 年，我国酶制剂产量达2 5 万t ，为1 9 9 2 年的2 4 倍，其中，蛋白 酶4 4 9 万t 1 3 1 。2 0 0 1 年，酶制剂总产量超过3 2 万t ，产值6 亿多元。与此同时，行业集 团化经营也得到了发展，企业规模扩大，品种增多，从而推动了发酵工业和相关行业的 发展。酶制剂服务于固民经济的相关行业。 1 1 1 2 国内外的差距表现 虽然我同酶制剂工业通过了各项国家科技攻关，通过内部联合和引进先进技术取得 了长足发展，但与国外先进水平村j 比，仍有较大差距。主要表现在以下3 个方面： 1 ) 酶制剂品种少，结构不合理。国外酶制剂按用途进行分离提纯，酶制剂杂质少， 纯度高，还制成不同品级的酶和不同系列的专用酶。而我围酶制剂大多是粗酶，产品单 一无系列，生产菌株也单一，这些都影响着它的推广应用i 训。 2 ) 技术含量不高，生产效益低、生产量低、质量差。我国是酶制剂使用大国，但 酶制剂的销售额只占全l i j = 界的4 ，且产品的技术含量比较低。国外已普遍使用的工程 菌在困内还很少见，相应的法规也不健全。 3 ) 研发能力差，新产品开发慢。我囤目前用于酶工程领域的研发经费非常少，把 企业和国家投入的经费加在一起，还不及国外一家企业投入经费的1 。因此新酶种和 新剂型的研制丌发急待提高。 1 1 2 食品用蛋白酶的来源及特点 食品工业上酶制剂的来源主要有微生物、动物和植物组织。目f j 使用量最大、使用 范阐最广的酶制剂人多为微乍物来源的酶制剂。但就蛋白酶而言，植物来源的酶制荆在 种类及销售量上都占有较大的份额，植物蛋白酶较微生物酶制剂相比，具有以下四个方 面的优势：酶源的筛选。筛选和发现一个高酶产率的菌种与筛选一个具有高含量酶的 植物资源相比，其工作量要大很多。目前用于提取蛋白酶的植物资源相当丰富，如木瓜、 江南大学硕上学位论文 菠萝、无花果、猕猴桃、剑麻等【5 j 。毒理学试验。用于食品工业的酶源菌种，必需经 过大量的毒理和临床试验来证明菌的安全无毒性后，才可投入使用，这项工作往往既耗 时也耗资。而根据f a o 和w h o 的规定，凡从植物和动物中可食用部分生产的食品用 酶制剂，可作为食品对待，无需进行毒理试验【6 】。提取工艺。植物蛋白酶的提取，不 象微生物蛋白酶生产时所必须的一系列设备如发酵罐等，同时也不需要消耗粮食，不存 在发酵时杂菌的污染等。废物利用。植物蛋白酶的生产原料，大多是利用生产过程中 的下脚料及副产品如木瓜汁、菠萝皮、剑麻皮汁等，既不影响生产过程中主要产品的生 产，同时也有利于治理环境污染，变废为宝。因此，开发植物蛋白酶资源，具有极其重 要的意义和发展前景。 1 1 3 木瓜蛋白酶( p a p a i n ) 1 1 3 1 木瓜蛋白酶的特性 木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类巯基蛋白酶，广泛存在于番木瓜( c a r i c ap a p a y a ) 的 根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富【7 l 。它是一种蛋白水解酶，此 外还具有酰胺键和酯键的特性1 8 】。其分子量为2 7 0 0 0 ，含有2 1 2 个氨基酸残型9 l 。至少 有3 个氨基酸残基位于酶的活性中心部位，它们分别为c y s 2 5 、h i s l 5 和a s p l 5 8 1 m 】。 木瓜蛋白酶作用的底物包括各种蛋白质如明胶、酪蛋白、谷蛋白、弹性蛋白、球蛋 白和肌纤维蛋白。该酶足1 0 0 的纯天然产：物，适应现代社会生活追求自然化的趋势。 1 1 3 2 木瓜蛋白酶的应用 r 前，木瓜蛋白酶已被广泛应j h 于诸多行业。在工业彳：、j k 中，用于明胶制造、蚕茧 脱胶、皮革脱毛等1 1 1j ；在h 化工业巾，用于生产含酶化妆品和含嗨牙膏；在医疗行业 中，用于驱肠虫剂、治疗消化不良、各种炎症以及水肿等疾病1 1 2 1 ；在食品行业中，主 要用于肉类嫩化、啤酒澄清、包d 料添加剂乘1 鱼类加工等。现将其在食品行业中的应用介 绍如下： l 豆类食品。大豆蛋白营养价值较高，其中必需氨基酸含量在植物蛋白中较为合理， 并有良好的胶凝、乳化、起泡能力，同时大旺产品的开发对解决人类营养问题有着极其 重要的意义。但大豆蛋白在使用过程中存在着等电点沉淀，粘度随浓度增高而迅速升高 等不利因素。研究发现：采用小瓜蛋广1 酶改性适度降解大豆蛋白，使其等电点发生变化 而其应用范同也随之变广了，这也足木瓜蛋门酶目前最有前景的应用之处。 另外，在豆腐制作工艺中，木瓜蛋广1 酶在豆腐凝胶形成过程中于特定的水解条件下 使得蛋白质适当展丌，分子内部的s h 、ss 疏水氨基酸暴露，然后通过蚩白质分予的 相互作用使蛋白质聚集成凝胶，取代了传统的加热法。 2 肉类食品。由于木瓜蛋白酶足半胱氨酰基蛋e l 酶，能降解胶原纤维和结缔组织蛋 白质，将肌动球蛋白和胶原蛋白降解为小分了的多肤甚至氨基酸，令肌肉肌丝和筋腰丝 断裂，使肉类变得嫩滑，并简化蛋白质结构，使人体食刚后易于消化吸收。目前市售嫩 肉粉的主成分足木瓜蛋白酶。它己成为凼内外家庭及餐馆常用的烹调用品之一。此外， 2 第一章绪论 木瓜蛋白酶在腊肉生产以及制取动物水解蛋白液中也得到了广泛应用i l 引。 3 啤酒工业。由于啤酒是不稳定的胶体溶液，其中的非生物混浊主要由多酚和蛋白 质形成，其中蛋白质和多肽占4 5 - - 7 5 ，多酚占2 0 - - - 3 0 。为延缓啤酒浑浊的形成， 最有效的方法足添加非生物稳定剂。木瓜蛋白酶的加入会使洒体高分子氮明显降低，中 小分子氮含鼍有所增加。随着酶添加量的增加，总酸会有所升高，泡持力下降。因此采 用蛋白酶作为啤酒稳定剂，在糖化过程中加木瓜蛋白酶，能解决因麦芽溶解不好或辅料 量大时麦汁q 氨基氮不足的问题，在后发酵或清洒中加入木瓜蛋白酶能防止啤酒混浊 沉淀，提高非生物稳定性i l 引。 4 饼干生产。利用木瓜蛋白酶的酶解性质，将面团蛋白降解为小分子肽或氨基酶， 降低了面团的拉伸阻力，使面团变软，容易成型。 5 鱼类加工业。木瓜蛋白酶可用于提取鱼渣或海洋生物中鱼类蛋白浓缩物，主要盛 行于法国。该国用这种方法得到的鱼类蛋白浓缩物比用其他方法得到的浓缩物可溶性 好，蛋白质含量也高1 ”j 。 1 1 4 菠萝蛋白酶( b r o m e l a i n ) 1 1 4 1 菠萝蛋白酶的特性 早在18 9 1 年，m a r c a n o 首次发现菠萝汁中含有蛋白酶。随后w i l l s t a t t e r ，b e r g m a n n 和m a r t i n 相继指出：菠萝蛋白酶广泛分布于菠萝的果、茎、柄和叶片中。从来源上可 分为果菠萝蛋白酶及茎菠萝蛋白酶。从菠萝果实中提取的蛋白酶，称为果菠萝蛋白酶 ( f r u i tb r o m e l a i n ，e c 3 4 2 2 5 ) f 怕1 ；从菠萝茎中提取的蛋白酶，称为茎菠萝蛋白酶( s t e m b r o m e l a i n ，e c 3 4 2 2 4 ) 1 1 7 l 。这两种不同来源的酶性质问具有较大的差异。结构特性研 究表明，果菠萝蛋白酶为酸性酶，等电点为p h 4 6 ，分子量为3 0 0 0 0 ，茎菠萝蛋白酶的 等电点为p h 9 5 ，分子量为3 6 0 0 0 ，并确定为一种糖蛋白1 1 6 j 。商品菠萝蛋白酶均来源子 茎中。 菠萝蛋白酶为典型的巯基蛋白酶，能分解蛋白质、肽、酯和酰胺，水解蛋白的活性 较木瓜蛋白酶高1 0 倍以上。但其对热不稳定，如果储存条件和处理方法小当，生理活 性会减弱。 1 1 4 2 菠萝蛋白酶的应用 菠萝蛋白酶用途甚广，在实验室可用作工具酶；在食品行业中，与木瓜蛋白酶样， 可用- 酿造、肉类) j h i ! 博1 、豆乳的凝固1 19 1 、面粉的改性1 2 0 】等，用菠萝蛋白酶生产等电 点可溶性的人豆蛋白水解液被认为是菠萝蛋白酶在食品工业上最自应用前景的课题 1 2 1 1 ，在工、i kj 二，用于皮革脱毛、蚕茧脱胶、明胶制造，门用品生产( 化妆品、牙膏添 加剂、加酶洗衣粉等) 等方面，而近年来在医药上更是有相当诱人的发展前景。 最早在1 9 5 7 年，就已发现菠萝蛋白酶可作为一种治疗性成分，随后国内外许多专 家学者对其约j j 功能做了深入的研究与探讨，其临床应用的潜力正不断被挖掘。下面将 菠萝蚩门酶住医约中已得到应用的药用功能做简要概述： 江南人学硕士学位论文 1 免疫刺激作用。曾有专利认为菠萝蛋白酶的某一组分可用于治疗免疫系统受抑制 的病症或作为疫苗佐剂1 2 2 1 。b r a k e b u s h 等报道菠萝蛋白酶具有免疫刺激作用，并指出血 液中丙种球蛋白缺乏症病人的吞噬细胞表现出对这种刺激特别敏感1 2 3 1 。e n g w e r d a 等 ( 2 0 0 1 ) 在体内外的研究结果表明，通过对辅助细胞的刺激作用和对t 细胞的直接抑制 反应，菠萝蛋白酶可以增强和抑制t 细胞的免疫反应【2 引。 2 防治心血管疾病。菠萝蛋白酶作为蛋白水解酶对心血管疾病的防治是有益的。它 能抑制血小板聚集引起的心肼! 病发作和中风，缓解心绞痛症状，缓和动脉收缩，加速纤 维蛋白原的分解。实验证明1 2 引，菠萝蛋白酶在体外减少人体血小板聚集，减少向j 、板 在牛内皮细胞的吸附和大鼠体内血栓的形成。 3 消炎作用。菠萝蛋白酶在各种组织中能有效地治疗炎症和水肿( 包括m 栓静脉炎、 骨骼肌损伤、血肿、口腔炎、糖尿病人溃疡及运动损伤) ，能在体外激活鼠巨噬细胞( r o u t i n e r n l0 p h g e s ) 和自然杀伤( n k ) 细胞1 26 1 。据报道，含有菠萝蛋白酶的混合物( 含菠萝蛋白酶、 胰蛋广1 酶、芸香苷) 在疗效和安全性方面更优于类固醇的消炎药【2 丌。 4 增进药物i l 及收，减少抗生素用量。将菠萝蛋白酶与各种抗生素( 如四环素、阿英 两林等) 联用，能提高其疗效。此外，菠萝蛋白酶能促进营养物质的吸收。庞然( 2 0 0 4 ) 侄 研究巾发现，使用抗生素；, i - , 0 h 菠萝蛋自酶肠溶片治疗慢性前列腺炎疗效明显优于单独使 用抗生素。 5 抑制毒素分泌作川。试验结果证明菠萝蛋白酶能降低毒素结合活性并能抑带0 热4 i 稳定毒素( l 1 ) 、霍乱毒素( c t ) 及热稳定毒素( s t ) 的分泌效应1 2 引。 1 1 5 木瓜蛋白酶及菠萝蛋白酶的稳定研究概况 酶足一种f 卜物催化荆，其催化效率非常高，催化作用专一，但作为一种蛋门质，凡 是能使蛋门质变。件的因素，都- 叮能使酶失去活性，如物理因素( 温度、压力、光、磁场) ， 化学因素( 氰化、还原、溶剂、金属离子、离子强度、p h ) 和生物学因素( 酶修饰和 酶降解) 。木瓜蛋r _ 1 酶及菠萝蚩白酶在加工过程中活力都会降低，木瓜蛋门酶常温下储 存1 5 d 后，其活力只剩卜原始酶活力的一半1 2 圳，菠萝蛋白酶在常温下的半衰期只自- 十 多个小时，5 5 时仅为5 3 m i n ，两者的易失活特性极大地影响了其生产和应用。因此， 通过一定的方法稳定化菠萝及木瓜蛋白酶具有极其重要的理论和实践意义。这也足奉论 文的重要性所在。 日前国内外学者对丁菠萝及小瓜蛋白酶的稳定主要采用添加剂法和固定化法。 1 1 5 i 使用添加剂法 1 菠萝蛋白酶。常川的添加剂有维牛素c 、l 一半胱氨酸、e d t a 2 n a ，：二氧化硫 等。h e i n i c k e 报道用苯甲酸钠做稳定剂，添加量为0 1 7 6 ，与时照样棚比，一个月 后，酶活力保留；篆提高1 4 1 3 0 j 。采用添加焦业硫酸钠的方法也可减少加工和贮存过程 巾的氧化反应，对照样相比，15 避光保存2 个月，酶活力保持不变i3 l j 。近来也有 研究采用茶多酚作为菠萝蛋白酶的稳定剂，黄惠华、高孑l 荣报导，菠萝蛋白酶与茶多酚 结合后酶的稳定性明显提高，常温下的半衰期由游离酶的5 天延长罕2 7 大1 3 羽，l i a n gh 4 第一章绪论 报导，茶多酚与菠萝蛋白酶的结合能使菠萝蛋白酶在6 0 下贮存的半衰期提高倍1 3 3 1 。 2 木瓜蛋白酶。国内外采用添加化学物稳定木瓜蛋白酶研究得不多，主要采用柠檬 酸及钠盐、t b h q 等抗氧化剂使酶活性中心保持还原状态，从而有效保护酶活性。 1 1 5 2 固定化法 固定化法是将酶多点共价连结到支持物的表面，或将酶包埋在支持物紧密的孔中， 使酶构象坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡。l e e ，d o n g h o o n 等报导用脂 质膜微胶囊包埋保护菠萝蛋白酶，能有效地提高菠萝酶的稳定性【3 4 1 。据黄惠华、高孔 荣报导，以聚乙二醇为分散剂和稳定剂f 3 引，用守生7 氐价铁盐的方法制成具有磁性响应 性的微球，用1 3 3 浓度的该磁性微球吸附分离菠萝蛋白酶，回收率达6 1 9 6 ，酶活 性为3 8 万单位克，固定化磁性菠萝蛋白酶的热稳定性有显著的提高，常温下的保存 半衰期为2 8 天左右。 几十年来，国内外研究人员对于木瓜蛋白酶的固定化也进行了很多研究，使用最多 的是交联法、载体吸附法、载体偶联或是将其中两种方法结合起来。采用甘蔗渣纤维素 【3 6 】，尼龙f 3 7 】，壳聚糖f 3 8 】，家蚕丝素f 3 9 l ，水滑石等对木瓜蛋白酶进行固定化，有效提 高了酶的稳定性，并增高了酶的使用效率，降低了生产成本。 采用添加化学试剂的方法虽然使卜述两类巯基蛋白酶的稳定性得到一定的保护，但 由于毒性和残留的关系，在食品行、i k 中的应用受到限制；固定化法虽足现代生物工程技 术中较为活跃的研究领域之一，但对于菠萝蛋门酶及木瓜蛋白酶的固定化目前仍处于实 验室的摸索阶段。因此，选择合适无毒的方法来稳定热稳定性差、但应用广泛的菠萝及 木瓜蛋白酶迫在眉睫。 1 1 6 豆类胰蛋白酶抑制因子的研究现状 1 1 6 1 大豆胰蛋白酶抑制因子( s t i ) 早在2 0 世纪4 0 年代，人们就已发现豆类植物中含有蛋白酶抑制剂，特别是种子中 含量较高，生大豆中含量高达2 0 m g g 。其巾，s t i 是大豆中的主要抗营养因子，为一 种多肽类或蛋白质。 大豆中胰蛋白酶抑制荆约有7 1 0 种1 4 ，但到f 前为止，只有两种得到了较详细 的研究，即k u n i t z 型胰蛋白酶抑制剂( k s t l ) 和b o w m a n b i r k 型胰蛋白酶抑制剂( b b i ) ， 在生大豆中其含量分别为1 4 和0 6 ，后来在其他豆类植物中也陆续发现了这两种抑 制因子。 k u n i t z 抑制剂( 简称k s i 1 ) ，于1 9 4 5 年由k u n i t z 首次分离和结品出，为易变的非 螺旋蛋白，分子量为2 1 3 8 4 ，由1 8 1 个氨基酸残基组成，包含2 个二硫键( r s s r ) 结 构，其活性中心是a r 9 6 3 1 1 e 6 4 。k s t i 与胰蛋门酶的结合是等量进行的，即1 分子 k s t i 能抑制1 分子胰蛋自酶1 4 引，它具有特殊的热稳定性和化学稳定性。 b o w m a n b i r k 抑制剂( 简称b b i ) ，在1 9 4 4 年由b o w m a n 作为丙酮不溶因子从大 豆中分离出米，并由b i r k 于1 9 6 1 年成功纯化并定义。它是简译的多肽链，山7 1 个氨 5 江南大学硕 j 学位论文 基酸残基组成，分子量为7 8 6 1 ，含有7 个二硫键结构。有2 个活性中心，一个是l y s l 6 s e r l 7 的胰蛋白酶结合点，另一个是一l e u 4 4 。s e r 4 5 的胰凝乳蛋白酶结合点。b b i 与胰 蛋白酶的结合是倍量结合的，即1 分子b b i 能钝化2 分予胰蛋白酶。 胰蛋白酶抑制因子的存在，抑制了肠内胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性，妨碍了食 物蛋白的消化、吸收和利用并引起胰腺肿大，导致生长延缓或停滞，不利于豆类食品与 豆类饲料的开发。因此，s t i 的钝化对提高豆类食品及饲料的营养价值和食用安全性具 有重要意义。 1 1 6 2s t i 的钝化研究现状 s t i 结构中活性部位的氨基酸是其具有抑制活性的必要条件，所以其中的二硫键受 到破坏时能使其失活。近十年来国内外对s t i 失活方法与技术的研究都获得了明显的进 展。 l 热钝化法。s t i 热钝化法是最早发现、研究，也是目的最常用的钝化方法。其原 理是通过加热，破坏豆类中对热不稳定的抗营养因了。r o u h a n a 等( 1 9 9 6 ) 1 4 3 j 发现豆奶中 k s t i 和b b i 在温度低于1 3 7 时先后钝化。马得莹等( 2 0 0 0 ) m 4j 对人豆进行湿热处理， 认为在1 2 0 ( 0 1 m p a ) 条件下加热1 0 m i n ，大豆中的抗营养凶子失活。但热处理常常导 致其中必需氨基酸( 尤其是赖氨酸) 的损失和物料理化性质的改变，从而影响饲料的营 养价值。 2 超声波钝化法。s t i 的超声波钝化足近几年发展起来的新技术。其原理是利用超 声波在液体中产生空化气泡，气泡在崩溃时所形成的极短暂的强压力脉冲及高温作用， 对溶液中的细小颗粒产生声化效果，导致那螳具有生理活性的蛋白质的钝化，如酶的钝 化包括胰蛋白酶抑制因子的钝化1 4 引。杨汝德等( 1 9 9 8 ) 1 4 6 1 采用低频超卢波对生豆奶中的 s t i 和纯化的s t i 进行5 m i n ，8 0 的处理，发现其对尘豆奶巾天然存在的s t i 钝化效 果比纯化后的s t i 好，活力残留率分别为2 9 3 和3 8 8 。f i i 超声波r 前的水平只能达 到7 0 左右，所处理的豆类达不到最佳的营养价值。 3 化学失活法。化学方法主要足对k s t i 和b b l 分子结构中的( r s s r ) 采用毓基还 原剂进行修饰、封闭、酶解，从而达到破坏其活性的 二l 的。s e s s a ( 1 9 9 1 ) 1 4 7 1 用3 0 m m o l 的n a s 2 0 56 5 。c 处理1 h ，可使9 5 的k s t i 和9 8 b b i 失活。加入o 3 m 的n a 2 s 0 3 于 乍豆粕中，7 5 处理1 h ，可以完伞钝化火眨蛋白中的胰赁白膀抑制冈子，且n a 2 s 0 3 的残留量较 氐( m e n d a l f ，1 9 8 6 ) ；加入1 0 m m 维生素c 和o 8 m m c u s 0 4 ，2 7 处理l h ， 可使4 0 以上的k s t i 钝化，用6 5 时则有9 0 钝化，而b b i 则有7 0 的钝化( s e s s a ，1 9 9 0 ) 1 4 引。但该种方法往往存在着试剂残留问题。 4 酶解失活法。其原理是s t i 作为底物而被蛋白酶水解，从m “史其活性巾心结构改 变而失玄活性。早在1 9 6 8 年，b o w m a n - - b i r k 便提出k s t i 能被胃蛋白酶钝化。酶解时， k s 7 f i 被酶解为更简单的多肽。吴非( 2 0 0 2 ) 1 49 l 采用中性蛋广l 酶、碱性蚩白酶、酸性蛋白 酶及木瓜蛋白酶钝化s t i ，发现四种酶都能不| r d 程度地钝化s t i 的活性，其中碱性蛋白 6 第一章绪论 酶效果最好，使得s t i 的活性降为原来的5 8 0 9 。但关于b b i 的酶解钝化却鲜见报道。 酶解方法由于蛋白酶来源不稳定以及易失活，并且其成本问题也使得其应用受到限制。 另外，近年来也有采用发酵失活法( 姚远红，等，2 0 0 5 ) 1 5 0 1 、膨化法( 席鹏彬， 等，2 0 0 0 ) 【5 1 】、高压脉冲( 李迎秋，2 0 0 6 ) 1 5 2 】对s t i 进行抑制。但目前依然处于实验 室研究阶段，因此，s t i 的失活方法还有待于深入的研究与改进，若能应用天然的食品 添加剂( 例如茶多酚) 与大豆中胰蛋白酶抑制剂和其它抗营养因子钝化结合，消除化学 物质残留，将成为s t i 钝化的飞跃。 1 1 7 茶多酚的应用研究现状 茶多酚又名茶单宁、茶鞣质，是茶叶中所含有的一类多羟基酚类化合物的总称，简 称t p 。其主要成分为儿茶素类( 黄烷醇类) 、黄酮、黄酬醇类、花青素类、酚酸、缩酚 酸类及聚合酚类等。其中儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，约占茶多酚总量的 6 5 8 0 1 5 3 j ，主要包括表儿茶素( l - - e c ) ，( 一) 表没食子儿茶素( l - - e g c ) ，( 一) 表儿 茶素没食子酸f l 旨( l - - e c g ) ，( 一) 表没食子儿茶素没食子酸i 酯( l - - e g c g ) 。目前，国内外 学者对茶多酚的大量研究表明：在医疗保健方面，茶多酚具有增强机体抵抗力、抗氧化、 防癌、抗肿瘤、抗辐射、抑菌、抗病毒、降血糖和血脂、预防心血管疾病、抗衰老等多 种功能；在日用化工行业中，可作为防晒添加荆与花露水添加剂；食品方面，作为一种 卫生部批准的天然抗氧化食品添加剂，广泛j 衄用于油脂、肉制品、饼干、饮料等。其在 食品行业中的主要用途如下： 1 1 7 i 用作抗氧化剂 茶多酚的抗氧化作用在于儿茶素分子结构中酚羟基特有共氢体的活性，能与脂肪酸 在自动氧化过程中产生的自由基结合，中断脂肪酸氧化的链锁反应，抑制氢过氧化物的 形成，达到抗氧保鲜的f 1 的1 5 引。 添加于油脂中，能阻i 卜和延缓小饱和脂肪酸的自动氧化分解，使油脂的贮藏期延长； 添加于肉制品中，与其表面的蛋白质形成一层不透气的硬膜，起到防止肉制品酸败，抑 制细菌形成，防止腐败变质的效果；加入焙烤制品及乳制品中，可保持其原有风味，防 蛤变和酸败，延长保鲜期；添加剑油炸食品中，可延缓油脂的氧化酸败，提高食品的货 架寿命；在饮料中，叮以防止其中各种营养成分的损失。 1 1 7 2 用作保鲜剂 茶多酚具有较强的抗菌和抑菌性能。掂因内外有关文献报道，茶多酚对于自然界 中1 9 类群的近卣种细菌均有优异的抗菌活性，显