（细胞生物学专业论文）ghk和eptifibatide的合成研究.pdf

厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究 成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成 果，均在文中以明确方式表明。本人依法享有和承担由此论 文而产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：然 卅年月i e l 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦 门大学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸 质版和电子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允 许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关 数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密 的学位论文在解密后适用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密沁乃 ( 请在以上相应括号内打“4 ) 作者签名：搏 导师签名：1 鬈匆 日期：们年6 月，f 日 日期：沙司年6 月f j 日 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 摘要 蛋白质是生物体内最重要的物质之一，而氨基酸序列较短的多肽虽然在生物 体内含量很少，却能发挥巨大生理作用。由于生物提取材料来源困难，而基因技 术运用在小分子肽上表达量低等问题，使化学法合成多肽独具优势。本论文分别 采用液相法和固相法合成了具有药用价值的三肽g h k 及八肽e p t i f i b a t i d e ，研究 了多肽合成过程中缩合剂及纯化等问题。 g h k 是存在于人类血浆中的一种三肽，研究表明它能促进纤维原细胞，巨 噬细胞等多种细胞及组织的生长。采用液相合成法合成了三肽g h k ，对甘氨酸 的氨基、组氨酸的咪唑基、赖氨酸的侧链氨基进行保护，得到中间体b o c g l y 、 h i s ( t r t ) 和l y s ( b o c ) ：接肽反应以d m f 为反应溶剂，n - 羟基苯并三唑( h o b o ， n ，n 二环己基碳二酰亚胺( d c c ) 为复合缩合剂，三氟乙酸( t f a ) 切除保护基 团。各步反应经t l c 跟踪和旋光分析，最终产物进行色谱分析和质谱鉴定。实 验结果表明，在对温度、原料配比、反应时间的控制下，以h o b t d c c d m a 进 行接肽反应、用三氟乙酸( t f a ) 脱除叔丁氧羰基( b o c ) 是一种可行的方法。 实验中各步产率均在3 0 以上，e s i 质谱测得的m z 与理论值相符。活性测定结 果表明产物具有一定生物活性。 e p t i f i b a t i d e 是一种血小板糖蛋白g pi ib m a 受体拮抗剂，临床研究结果显示 其医用上的产业前景良好。采用固相合成法合成了八肽e p t i f i b a t i d e ，以 r i n k - a m r e s i n 树脂作为固相载体，f m o c 为保护策略：以t b 删o b 佃m a 作为 肽键缩合试剂进行接肽反应，用t f a e d t t i s h 2 0 定量地从树脂上切除；制备型高 效液相色谱分离纯化粗肽。同时对产品进行色谱分析和质谱鉴定。实验结果表明 f m o c 合成策略中各步的缩合率均在9 5 以上，分离纯化后的产物纯度达到 9 8 5 ，m o l d i - t o f 质谱测得的m z 与理论值相符。 关键词：g h k ：e p t i f i b a t i d e ；多肽合成 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 a b s t r a c t p e p t i d ei sat y p eo fb i o a c t i v es u b s t a n c et h a tp a r t i c i p a t e si nn o r m a lf u n c t i o n i n go f al i v i n go r g a n i s m i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft h ep e p t i d ef r o mn a t u r a ls o u r c e sh a s n o tb e e nv e r ys u c c e s s f u l ；t h eu s eo fr e c o m b i n a n td n a t e c h n i q u e sh a sap r o b l e mo f l o w e ry i e l d ；s o ，c h e m i c a ls y n t h e s i so fp e p t i d ei nt h el a b o r a t o r ya p p e a r st ob ea n e f f i c i e n tm e t h o d i nt h i st h e s i s ，t h et r i p e p t i d eg h kh a sb e e ns y n t h e s i z e db y l i q u i d p h a s em e t h o da n do c t p e p t i d ee p t i f i b a t i d eb ys o l i d - p h a s em e t h o d c o u p l i n g a g e n t sa n dp u r i f i c a t i o np r o b l e mh a v eb e e ns t u d i e di nt h ep r o c e s so fp e p t i d es y n t h e s i s g h ki sat r i p e p t i d ef o u n di nn o r m a lh u m a np l a s m a i tw a sf o u n dt oa c c e l e r a t e g r o w t hi nc u l t u r e dc e l l sa n dt i s s u e se g f i b r o b l a s t s ，m a c r o p h a g e s g h kh a sb e e n s y n t h e s i z e db yl i q u i d - p h a s em e t h o di n t h i st h e s i s t h ea m i n oo fg l y c i n e ，t h e i m i d a z o l eo fh i s t i d i n ea n dt h ee a m i n o o fl y s i n ew e r ep r o t e c t e d ，g a i n i n gt h e i n t e r m e d i a t e s ：b o c - g l y ，h i s ( t r t ) ，l y s ( b o c ) ；d m fi su s e da st h ec o u p l i n gs o l v e n t ； h o b ta n dd c ca st h ec o u p l i n ga g e n t s ；t f at or e m o v e dt h ep r o t e c t i n gg r o u p p r o d u c t sw e r ec o n f i r m e db yt l ca n dp o l a r i m e t r i ca n a l y s i s t h es y n t h e t i cp r o d u c t w a si d e n t i f i e do ne s i m sa n dh p l c t h ee x p e r i m e n t a ld a t ai n d i c a t e dt h a tu n d e rt h e c o n t r o lo ft e m p e r a t u r e ，m a t e r i a lr a t i oa n dr e a c t i o nt i m e ，u s i n gh o b t d c c d 正af o r c o u p l i n g ，t f af o rd e p r o t e c t i o no fb o cm i g h tb eag o o dw a yo fl i q u i d p h a s ep e p t i d e s y n t h e s i s t h er e s u l ts h o w st h a tt h ey i e l do fe a c hr e a c t i o ni so v e r5 5 t h em o l e c u l a r w e i g h to ft h ep r o d u c t i sc o r r e s p o n dt om o l e c u l a rw e i g h to ft h eg h k t h er e s u l t so f b i o a c t i v i t yi d e n t i f i c a t i o ni n d i c a t e dt h a tg h k h a sb i o a c t i v i t yo nc e r t a i nd e g r e e e p t i f i b a t i d e i st h er e c e p t o r a n t a g o n i s to fp l a t e l e tg l y c o p r o t e i ng p i ib i i i a ， c l i n i c a ls t u d ys h o w e dt h a ti th a st h ea d v a n t a g eo fp o t e n te f f e c t i nt h i st h e s i s ，a s t r a t e g y f o rt h es y n t h e s i so fe p t i f i b a t i d ew a sp r e s e n t e d e p t i f i b a t i d eh a sb e e n s y n t h e s i z e db ys o l i d p h a s em e t h o du s i n gt h eb a s e - l a b i l ef m o cg r o u pf o rp r o t e c t i n g t h ea - a m i n oa c i d t h ep e p t i d ew a sa s s e m b l e do nr i n k a m r e s i n t b t u h o b t d i e a i su s e da st h ea c t i v a t i o ns y s t e m ；a n dt f a e d t t i s h 2 0a st h ec l e a v a g ec o n d i t i o n t h es y n t h e t i cp r o d u c tw a sp u r i f i e db yp r e p a r e dr e v e r s e d p h a s eh i g hp e r f o r m a n c e 2 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 l i q u i dc h r o m a t o g r a p h ya n di d e n t i f i e do nm a l d i t o f - m sa n dh p l c t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l ts h o w st h a tt h er a t i oo ft h ec o u p l i n gs y n t h e s i so fe a c ha m i n oa c i d i so v e r9 5 t h ef i n a lp u r i t yo fo u rp r o d u c tw a sf o u n dm o r et h a n9 8 5 t h e m o l e c u l a rw e i g h to ft h ep r o d u c ti sc o r r e s p o n dt om o l e c u l a r w e i g h to ft h ee p t i f i b a t i d e k e yw o r d s ：g h k ；e p t i f i b a t i d e ；s y n t h e s i so fp e p t i d e 3 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 l 前言 1 1 多肽合成的研究意义 多肽是两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物。两个氨基酸由一个肽 键连接而成的化合物称为二肽，若一个肽由三个氨基酸组成，则称为三肽等等。 分子量在1 8 0 - 1 0 0 0d a l t o n 之间的称为小肽、寡肽、低聚肽，也称为小分子活性 肽；分子量在1 0 0 0 - - - 5 0 0 0d a l t o n 之间的称为大肽。多肽除了由蛋白质水解产生 外，也有许多天然存在的肽。已发现的天然存在的多肽大多具有生物活性，它们 含量少，结构多样，功能各异。如动物及人体内的一些激素：催产素，胰增血糖 素，激肽，促肾上腺皮质激素；从脑组织中分离出来的脑啡肽，微生物中的抗菌 素短杆菌肽等，都属于肽类。 多肽涉及生物体内多种细胞功能的生物活性，是机体完成各种复杂的生理活 动必不可少的参与者。所有细胞都能合成多肽物质，其功能活动也受多肽的调节。 这些多肽物质虽然含量极少，却与生物的生长发育、行为、免疫、疾病、学习、 记忆和衰老有着极为密切的关系。它涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域， 其重要性在于调节体内各个系统器官和细胞，在生命过程中起着极为重要的作 用。也可被广泛应用于医疗嗍、卫生、保健、食品口1 、美容h 1 等方面。 多肽的产业前景如此良好，而且所有细胞都能合成多肽物质，它们在生物体 内的是合成仅仅需要几分钟或者几秒钟的时间，但是由于含量极微，提取材料来 源困难，而且提取和纯化步骤非常烦琐，而运用基因技术通过d n a 重组表达多 肽又因为多肽的分子量较小而存在表达量低等问题，随着多肽化学合成这一领域 的飞速发展，合成高纯度的具有生物活性的多肽已经可以做到。这样就使得化学 法合成多肽占有独特优势。 多肽的合成同样也具有理论上的意义，合成的多肽是最有说服力的结构证 据，有力地支持了“蛋白质的高级结构决定于它的一级结构。尽管运用了最先 进的技术，多肽序列常常因为氨基酸的翻译错误而使其一级结构的分析出现差 错，如：人类生长因子，分析天然提取的材料所取得的序列最终被全合成的肽段 的结构证据所推翻瞄1 。因此可以说，在许多情况下，多肽最终的结构证据往往是 从合成产物中获得。此外，多肽的构象分析对于设计有一定构象的多肽类似物有 一定的指导意义。 4 g i - i k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 1 2 多肽合成历史 对于蛋白质的研究可以追溯到1 9 世纪，但直到1 9 0 1 年，化学家e m i lf i s c h e r 采用了酸水解二酮哌臻的方法，将蛋白质拆成单个氨基酸，再把两个和两个以上 的氨基酸连接在一起，形成一个个小分子，分别称为二肽，三肽等【6 1 。到1 9 0 7 年，他合成了非天然的无生物活性的含有1 8 个氨基酸的肽链【7 1 ，称之为多肽。 这是多肽化学的一个开端，预示着这一领域将会有惊人的发展。1 9 3 2 年，德国 化学家m a xb e r g r n a n 和l e o n i d a sz c r v a s 发明了用氨基酸合成人工多肽的技术， 使合成的多肽更接近于天然多肽和蛋白质。1 9 3 4 年，美国化学家v i n c e n td u v i g n e a n d 等人合成出了一种天然多肽_ 朋。肽，1 9 5 3 年，他又合成出第一个天然多 肽激素冷有二硫键的催产素【8 】并因此获得1 9 5 5 年的诺贝尔化学奖。这一阶段 是多肽合成的基础时期，有大量的活性多肽被合成出来，为之后的发展积累了大 量的方法和经验。同时也迎来了用合成方法研究活性多肽的结构与功能的关系的 新领域。1 9 6 5 年，中国科学家合成了有5 3 个氨基酸残基组成的牛胰岛烈9 】。1 9 7 9 年，失岛治明等人又合成出了1 2 4 个氨基酸残基组成的牛胰核糖核酸酶。这一时 期的多肽化学的发展取得了非常重要的成果，无论在缩合剂、保护基团、还是反 应条件、纯化条件等方面都取得了新的突破。近二三十年以来，越来越多的具有 重要生物功能的活性多肽被发现和被合成，如1 9 8 3 年b o l d 等人首次从心脏中发 现的心房肽【1 0 l 以及多肽生长因子【1 1 】等等，使得活性多肽的合成成为一个非常活 跃的领域。 1 9 6 3 年，m e r r i f i e l d 首创了固相合成法，在甲氧基树脂上采用每次缩合一个 残基的方法合成了四肽l e u - a l a g l y v a l l l 2 】。m e r r i f i e l d 建立的经典的b o c 固相法 【1 3 】得到广泛应用，一些生物大分子，如生长因子等，被成功的合成出来。m e r r i f i e l d 由此获得1 9 8 4 年诺贝尔化学奖。1 9 7 8 年，c h a n g ，m e i e n l o f e r 和a t h e r t o n 等人采 用f m o c 作为保护基，发展出f m o c 固相法1 1 3 l ，相比b o c 固相法来说反应条件更 温和，步骤也更简便。由此得到了越来越多的应用。目前，国内外用f m o e 法成 功合成的活性多肽也越来越多，如g h k l l 4 1 ，胸腺素肽q1 1 1 5 l ，血管紧张素i1 1 6 l 等。 片段缩合法是后来人们根据固相和液相各自的不足之处发展起来的固液相 结合的一种方法，其基本做法是在固相载体上每次缩合的不是一个氨基酸，而是 5 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 一个含有几个氨基酸的肽段，被缩合的片段肽的保护方式与载体上的肽保护方式 一样，并在有机溶剂中具有可溶性。最早采用片段缩合法的是o m c n ng 等人1 1 7 1 ， 先用液相法合成出全保护的四肽酸，再与二肽树脂缩合，得到9 0 的纯的六肽； y a j i m ah 等人1 1 8 l 合成了含5 8 个残基的胰蛋白酶抑制剂；我国化学家用此方法合 成胰高血糖素，得到2 5 的纯品【1 9 】。 在多肽的纯化分离方面，除了传统的层析、盐析、有机溶剂沉淀等之外，高 效液相色谱( h p l c ) 也成为分离纯化多肽的一个非常有效的手段 2 0 l 。其优于传 统方法的地方在于：分离的速度快，大大缩短了纯化的时间；分离的效果好，终 产物可达到9 0 以上的纯度；使用范围广，多肽根据其等电点、分子量、疏水 性的不同，都可以选用不同方案用h p l c 进行分离【2 1 】；此外，h p l c 还具有回收 率高和纯化量大等优点，无论从质量、数量还是效率上说，都是传统方法所不可 比拟的。 1 3 多肽的合成方法 1 3 1 多肽的液相合成 多肽合成的历史已有近百年，随着各种方法的出现和应用，多肽合成一直活 跃在相关领域。多肽合成的目标是将氨基酸组分按照天然多肽的氨基酸排列顺序 和组装方式连接起来；形成多肽时，一个氨基酸的a 氨基和另一个氨基酸的a 羧基缩合失去一分子水而形成酰胺键，也称肽键【。 n o o h 十 r 图1 1 肽键形成简图 f i g 1 1s i m p l i f i e ds c h e m eo fp e p t i d eb o n df o r m a t i o n o 在两个氨基酸的肽键形成过程中，每一个氨基酸分子中既存在氨基也存在羧 基，而组成多肽分子的氨基酸要按一定顺序参与肽键形成，因此，为了避免氨基 酸的氨基和羧基发生交联反应和连接顺序的错乱，必须用保护基团将氨基和羧基 6 三j 薹i g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 有目的保护起来，使其按照预计的方式连接；肽键形成时，相对应的氨基和羧基 缩合可以采用多种方式进行，例如：活泼酯法，混合酸酐法，对称酸酐法，叠氮 物法，n 羧基内酸酐法及酶促合成法i 冽；肽键形成后，氨基酸连接完成，脱除 部分保护基团，开始下一个肽键的形成。直到整个目的产物连接完成。 因此，每一个肽键的形成包括以下三个步骤【5 】= 第一，制备保护氨基酸。将要连接起来的两种氨基酸的氨基或者羧基分别保 护起来，形成n 保护氨基酸和c - 保护氨基酸。保护氨基酸应该不存在两性离子 结构；反应过程中不能发生消旋；保护氨基酸应该具有一定的稳定性和溶解性。 第二，肽键的形成。n 保护氨基酸首先通过活化羧基转变成活泼的中间体， 然后与c 保护氨基酸的氨基通过失去一分子水形成酰胺键。这一步要求缩合产 率高，反应速度快，副产物易于分离除去。 第三，脱除保护基团。形成一个肽键后，为了继续接连氨基酸，往往需要选 择性的脱去保护基团，如：脱去二肽化合物的羧基保护基团，以便与下一个g 保护氨基酸连接形成肽键。全序列连接完成后，则需要脱去全部的保护基团，最 终得到目的产物。保护基团的脱除应该不影响肽键的稳定和肽链的结构；中间产 物的保护基团的脱除应该不影响其他保护基团的稳定。 由于部分氨基酸的结构中带有侧链功能基团，如：羟基，巯基，酚基，b 和丫羧基，氨基，胍基，咪唑基，b 和丫羧基酰胺基，吲哚基，等等，这给 合成加大了难度，因为这些侧链功能基团会在接肽的过程中参与反应，形成副产 物。如：半胱氨酸的巯基非常容易被氧化；丝氨酸和苏氨酸的羟基易被酰化；色 氨酸的吲哚基在酸性条件下会被氧化生成氧化吲哚；天冬氨酸肽在酸性或者碱性 条件下都极易环化生成二丁酰亚胺衍生物，再水解则发生q b 移位生成b 肽倒。 因此，对这些侧链功能基团的选择性保护也是十分必要的。 1 3 1 1a 氨基的保护 保护氨基实质上是封闭氮原子上的共用电子对，以降低氨基的亲核能力，一 种方法是将氨基酰化，氮原子上的孤电子对与羰基共扼，其亲核性降低；另一种 方法是用较大的基团遮蔽氮原子上的电子对。 用于a 氨基保护的保护基团的数目已多达一百多种，按其结构可分为烷氧羰 酰型，酰基型和烷基型等等。由于烷氧羰酰型的共扼效应和空间位阻都对降低氨 7 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 基的亲核性有利，而且其保护的氨基酸在接肽时不宜发生消旋，因此使用最为广 泛。比较常见的烷氧羰酰型保护基团有苄氧羰基( z ) ，可用h 2 p d ，n a - n h 3 ， h f 等方法脱去【2 3 】；叔丁氧羰基( b o c ) ，可用t f a d c m ，h c l h o a c 脱去【2 4 】； 9 芴甲氧羰基( f m o c ) ，可用哌啶d m f 等方法脱去【冽等； 1 3 1 2a 羧基的保护 在多肽合成中，不需要参与接肽反应的羧基都需要保护起来。目前研究使用 过的a 羧基保护基团根据脱除保护的条件可分三种类型。最常见的是a 羧基的 成酯反应，如甲酯( o m e ) ，乙酯( o e t ) 等，可用碱皂化脱去；第二类是可以 用酸脱除的，如叔丁酯( o t b u ) ，对甲氧苄酯，邻苯二甲酰亚胺甲酯【2 6 1 等；第三 类是可用其他方法脱除的，如苄酯( o b z l ) ，能用催化氢解的方法脱除f 2 7 l1 2 8 1 。 1 3 1 3 侧链功能基团的保护 在多肽合成的过程中，对于氨基酸侧链上能反应的基团，在必要时应该加以 保护。根据已经使用过的情况来看，半胱氨酸的巯基和赖氨酸的e 氨基是必须 要保护的，谷氨酸丫羧基和天冬氨酸的b 羧基作为羧基组分时必须保护，作为氨 基组分是可选择不保护，其他氨基酸的基团可保护也可不保护，视合成路线来决 定。 一般情况下，保护基团的选择应考虑到在肽链合成过程中不需要选择性的脱 除，而在肽链合成完成后才被除去，因此应该选用在脱除其他临时保护基团是不 会被除去的保护基团。 精氨酸含有侧链胍基，可以采用质子保护，但为了减少其碱性，增加有机溶 剂中的溶解性，一般也将其用保护基团保护起来。最常用的保护基团是硝基 ( - n 0 2 ) 、及z 、 l o s 、a d o c 、p b f 、p m c l 2 9 】等。a r g ( a d o c ) 2 曾被成功的用来合 成胰高血糖剥2 2 1 。 赖氨酸的氨基原则上也可用保护a 氨基的保护基团，其最早使用的是对 甲苯磺酰基( t o s ) ，如l v s ( t o s ) 曾成功的用于催产素，加压素，胰岛素等多肽、 蛋白的合成 3 0 - 3 3 1 。用z 或者b o c 来保护氨基时，应注意与其他保护基团脱除 保护的条件是否匹配。 组氨酸是所有氨基酸中最容易发生消旋的氨基酸，其原因可能是组氨酸的咪 唑基p 氮原子参与的结果，因此，在大多数情况下，咪唑基也需要保护起来。常 8 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 用的保护基团有苄基( b z l ) 、z 、b o c 、a l l y l 川、三苯甲基( t r t ) 3 5 1 、苯羰甲基 ( p n c ) 等，h i s ( b o c ) 曾被用来合成生长激烈刈。 谷氨酸和天冬氨酸的侧链羧基保护存在着a 羧基和小b 羧基的选择性保护。 在作为羧基末端氨基酸时，可采用同样的基团保护，而在其他情况下则要选择不 同保护基团。曾用过的保护基团主要有苯羰甲基( p n c ) 、叔丁基( b u t ) 、环戊基、 对硝基苄基等f 3 刀。 半胱氨酸的侧链巯基非常活泼，极易被氧化生成副产物，因此对于巯基的保 护也是必要的。目前开发出来的巯基保护基团也不少，主要有苄基( b z l ) 、三苯 甲基( t r t ) 、对甲氧苄基( m o b ) 、叔丁基( b u t ) 、吡啶甲基( p y r n ) 等掣3 8 】【3 9 1 。 丝氨酸和苏氨酸的羟基在接肽过程中有被酰化的危险，因此常用苄基( b z l ) 、 叔丁基( b u ) 4 0 i 、t r t 、t o s 等来保护其羟基。酪氨酸的酚基常用酰基和烷基来 保护。色氨酸的吲哚基也容易在合成中发生环化，最早用来保护吲哚基的是甲酰 基( f o r ) ，常用的还有二氯苄氧羰基( d c z ) 、z 等。 1 3 1 4 肽键的生成 多肽大多数是由a 氨基酸的氨基和羧基形成酰胺键形成的，合成中普遍使用 的方法是将羧基活化，然后与另一个氨基酸的氨基发生缩合。羧基的活化一般是 在羧基上连接一个吸电子的基团，使羰基的碳原子带有较强的正电性，有利于氨 基进行亲核反应，质子转移到氨基的氮原子上，活化基团解离，形成酰胺键。 r 1 x h 2 n r 2 r - - - - - - - - - - - - - 图1 2 形成酰胺键的通式 f i g 1 2g e n e r a l i z e dc h e m i c a lf o r m a t i o no fa na m i n ob o n d n h r 2 o 形成肽键的方法有叠氮法，混合酸酐法，活泼酯法，对称酸酐法，n 羧基内 酸酐法及酶促合成法。 叠氮法是1 9 0 2 年由c u r t i u s 建立起来的一种合成方法，是多肽合成中非常 古老的一种方法【4 l j 。它的最大优点是在各种合成方法中，它是最少的引起消旋化 的，因此现在也还会被应用到合成中。叠氮法的酰化反应比较温和，有些侧链功 9 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 能基团不用保护起来，但是由于在反应过程中叠氮物非常容易发生重排反应，生 成异氰酸酯及其衍生物，较难与合成产物分离除去。 混合酸酐法是上世纪5 0 年代发展起来的，其方法简单，反应速度快【4 1 1 。最 广泛采用的是氯甲酸异丁酯最为制备酸酐的试剂，它具有很好的接肽效率【4 2 】【4 3 1 。 但混合酸酐本身有分解和岐化反应、对氨基组分反应生成烷氧甲酰胺类副产物等 问题的存在。因此反应的主要问题是试剂的种类、氨基组分的结构等。 1 9 5 5 年，b o d a n s z k y 发展了保护氨基酸对硝基苯酯，对硝基苯基的吸电子能 力很强，同氨基组分反应的活性很好，它成功的用于合成催产素i 州，从而确定了 活化酯法在多肽合成中的重要地位。之后发展的多种活化酯，如芳基酯、n 一羟基 化合物形成的酯等，很多都能分离纯化出来得到稳定的晶体，利于保存；而且接 肽时氨基组分的末端羧基也可以不用保护，这给多肽合成的路线设计提供了很多 方便。活化酯法也曾成功的运用于环肽的合成，如短杆菌肽s 、酪杆菌肽及其类 似物的合成也都取得不错的效果【4 5 4 7 】。 n 一羧基内酸酐( n c a ) 法在胰核糖核酸酶s 蛋白的合成【删中取得过一定的成 效。它是由n 一羧基内酸酐与氨基组分反应，得到n 一羧基衍生物，调节p h 值脱羧 得到氨基游离的肽。这个方法的优点是反应速度快，得到的产物不用分离可直接 进行下一步接肽；但是致命的缺点是生成多种副产物不利于分离，这也在很大程 度上限制了这一方法的使用。近年来，随着u n c a 4 9 】的发现和应用，这一方法又 重新引起了人们的注意。 多肽合成的许多缩合试剂中，应用最早、最广泛的是二环己基碳二亚胺 ( d c c ) 。它是1 9 5 5 年由s h e c h a n 和h e s s 首先应用于多肽合成的【删。后来还发展 了一些水溶性的碳二亚胺，如二异丙基碳二亚胺( d i c ) 1 5 1 】、e d c l 5 2 l 【5 3 j 等。d c c 反应中的主要问题是反应低温的控制和减少副产物的生成。d c c 同氨基酸的羧基 生成活泼中间体。一酰基脲，然后与氨基发生反应。但是，单独使用d c c 往往会 伴随一些副反应，o - 酰基脲的重排反应会生成更多的酰基脲副产物，还会导致氨 基酸的消旋。1 9 6 6 年，w i i n s c h 和d r e s s 发现在d c c 反应体系中加入n 一羟基琥 珀酰亚胺( h o s u ) t 5 4 可使产率大大提高，而且消旋化和酰基脲副产物的形成完 全被抑制，但h o s u 本身和d c c 可以发生反应生成副产物。之后，人们进一步尝 试了一些n 一羟基衍生物来替代h o s u ，比较有效的有h o b t l 5 5 1 ，h o a t1 5 6 】等等，它 1 0 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 们均能降低消旋化，提高产率。复合试剂的采用有效的解决了d c c 反应遇到的问 题。 酶促合成法是指利用蛋白水解酶的逆转反应或转肽反应来进行肽健的合成， 这种方法不仅用于一些小肽如脑啡肽、增血压素等的合成中，而且成功的运用到 了胰岛素、胰蛋白酶抑制剂、细胞色素c 等大的蛋白的全合成或者半合成中。 自1 9 3 7 年b e r g m a n 通过木瓜蛋白酶第一次得到酶促合成的肽段【5 7 】以后，人们又 相继发现了糜蛋白酶、胃蛋白酶的转肽作用。酶促合成的优点在于它有很高的反 应专一性，反应时不需要对保护基团加以保护，或者只需要对少数的基团加以保 护，大大减少了合成的步骤。但是也正是由于其反应的专一性，酶促反应只能针 对特定的氨基酸之间的合成，合成产率和反应条件都各有不同；其次，酶促反应 也会带来一些副反应，如：转肽反应，受体羧基端酯的水解；肽链其他位置酶解 断链等等。 1 3 2 多肽的固相合成 固相法合成多肽的一般方式是按照从c n 的顺序，首先将c 端第一个氨基 酸的q 一氨基临时保护起来，通过其羧基连接到固相载体的功能基团上，脱除q 一 氨基上的临时保护基团，使q 一氨基露出，然后与下一个预先活化的n 一保护氨基 酸的羧基端缩合。固相载体与反应溶剂及过量的反应物，副产物通过过滤分离开 来。当一步缩合完全后，再转入下一个循环，按肽链的顺序将各个氨基酸依次进 行缩合。作为多肽组合构件的氨基酸在接肽缩合前必须对侧链活性基团进行保 护，多肽序列连接完全后再脱除所有的侧链保护基团，切除载体，最终得到目标 肽。 f m o c 固相法合成多肽使用的是f m o c ( 9 芴亚甲氧羰) 基团2 5 1 ，f m o c 在碱 性环境中不稳定。在合成多肽的过程中，氨基酸的q 一氨基用f m o c 基团临时保 护起来，每一步缩合完全后用2 0 哌啶d m f 溶液即可脱除f m o c 基团。与之对 应的，氨基酸的侧链选用对碱稳定而对酸敏感的叔丁氧基等基团保护起来，肽链 连接完毕后用t f a 即可脱除。树脂功能基团的选择也以酸敏感性为主，在t f a 的作用下一并切除【5 羽。 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 f m o c 图1 39 芴亚甲氧羰基团的结构式 f i g 1 3t h e s t r u c t u r eo f9 - f l u o r e n y l m e t h o x y c a r b o n y lg r o u p f m o c 固相合成从c 端第一个氨基酸与载体的连接开始，它是指氨基酸的羧 基与载体功能基之间的反应，载体树脂根据功能基团的不同一般可分为苄酯型树 脂，如w a n g 树脂f 5 9 l 、p a m 树脂【删；苄胺型树脂，如：p a l 树脂【6 l 】、b i - - t a 树 剧6 2 j ；及其他型，如三苯甲基( t n ) 树脂等。 保护氨基酸的制备在固相合成中非常关键，f m o c 保护氨基酸除了将f m o c 基团引入氨基酸的q 一氨基进行保护以外，还需要引入侧链保护基团。理想的 f m o c 保护氨基在碱性环境下脱除f m o c 基团，在酸性环境下脱除侧链保护基团。 常见的氨基酸保护基团有：a s p 和g l u 侧链羧基常用o t b u 保护，可用9 0 1 r i a h 2 0 脱去；h i s 的咪唑基常用t r t 或m t t 保护，用5 t f a d c m 可脱去；a r g 的胍基常用p b f 保护，用9 5 t f a h 2 0 脱去；c y s 的巯基用t n 保护，用t f a 脱 去；l y s 的氨基用b o c 保护，用t f a 脱去【6 3 1 。 缩合反应是接肽过程中最为重要的反应，每一步的缩合是否完全直接影响最 终产物的形成。这就要求缩合试剂大大过量于固相上的组分，一般为3 5 倍；但 是由此也加大了发生副反应的风险。因此，选用合适的缩合试剂成为了接肽效率 的关键，氨基酸之间的酰胺键主要以活泼酯法和对称酸酐法为主。最早使用的碳 二亚胺型缩合剂，如：d c c 、d i c 、e d c 会导致一些副反应的发生，如g i n 和 a l n 的侧链脱水，一些氨基酸的消旋化；而碳二亚胺型和n 羟基化合物h o s u 、 h o b t 等的混合使用有效的避免了消旋，防止了副反应的发生；随着多肽化学的 发展，一些新型的缩合试剂也不断出现，它们应用到固相肽合成中也大大提高了 1 2 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 接肽效率，如苯并三唑筠盐型：h b t u 、t b t u 、p y b o p 等：吡啶并三唑箱盐型： h a t u 、p y a o p 等。这些新型的缩合试剂彻底摆脱了以前缩合反应的模式，无论 从接肽速度方面还是避免副反应发生方面都有了极大的进步【叫1 6 5 1 。 裂解反应是固相上的最后一步反应，一般情况下，1 9 左右的树脂可用1 0m l 左右的裂解混合液，震荡反应，反应结束后滤除树脂，滤液经沉淀得到多肽。 为了监测每一步缩合反应是否完全，可用印三酮试剂进行检测。印三酮试剂 可与4 哪2 基团发生高灵敏度的反应，当树脂样品与印三酮试剂加热反应呈浅黄 色，表明已经没有游离氨基的存在，缩合已经完全，可进行下一步的反应；当树 脂样品与印三酮试剂反应呈浅蓝色，则表明树脂上还有小m 2 基团没有被酰化， 需要用上一个保护氨基酸进行二次缩合，以保证固相上的反应完全，直到印三酮 检验呈阴性才可转入下一个接肽循环【删。 性 印三酮检测 链保护基团 h 2 n a a a 3 叫吧一a a l o h 图1 4 固相多肽合成的过程 f i g 1 4p r o c e s so fs o l i d - p h a s ep e p t i d es y n t h e s i s 1 3 阴性 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 1 4g h k 及e p t i f i b a t i d e 的研究现状 1 4 1g h k 的研究现状 甘氨酰组氨酰赖氨酸( g h k ) 是1 9 7 3 年i 扫p i c k a r t 等人f 6 7 】首先人血浆中分离得 到的一种三肽，它和二价铜离子有很强的亲和力，能自发的与其形成络合物 g h k - c u “。最初实验发现，g h k 能增加大鼠正常肝细胞的存活率，能促使肝癌 细胞的生长，刺激这些细胞d n a 和r n a 的合成，因此被称为肝细胞生长因子1 6 8 j 。 接下来的几年中，人们陆续发现g h 姘口g h k c u 2 + 能促进多种细胞和组织的生长、 分裂和分化，如：神经细胞和神经胶质细胞；巨噬细胞、纤维原细胞、淋巴细胞、 肾小球细胞等等，g h k o c u 2 + 还可以在纤维原细胞培养液中促进或抑制金属蛋白 酶的合成【6 9 - 7 1 j 。近年来有人报道g h k 存在于人的i 型胶原a 2 ( o 链中，说明可能参 与伤口愈合和组织修复的过程。有实验表明g h k 铜络合物的确可以加速大鼠、 小鼠、猪和马等表面伤口的愈合。 1 9 7 9 年，p i c k a r t 等人尝试从生物材料中提取g h k , 发现从人的血浆中提取和 纯化三肽g h k 的过程中往往会造成生物活性的损失，而且常伴随着铜离子和铁 离子的螯合，这些金属离子对从血浆中分离g h k 的多个步骤都会产生干扰l 诩。 这就使得化学合成三肽g h k 具有独特的优势。 1 9 9 7 年，l i a k o p o u l o u 等人用f m o c 固相法从c 末端合成了g h k ，以 f m o c l y s ( m t o o h 、f m o c h i s ( m t t ) 一o h 、f m o c - g l y o h 为原料，以d c c i h o b t 为缩合试剂，经h p l c 纯化得到纯的三肽g h k 。其中h k z 肽的产率为6 7 ，g h k 三肽的产率仅4 8 ；实验还对其在体外微生物抗性及对d n a ，r n a ，蛋白合成 的影响做了研究，结果表明g h k 在一定浓度下能抑制大肠杆菌的生长，迸一步 的实验发现g h k 骺 时抑制大肠杆菌d n a i f f l 蛋白质的合成【7 3 1 。 2 0 0 1 年，y u j u nz h e n g 等人也通过f m o c 固相法，以f m o c - l y s ( m t t ) - o h 、 f m o c - h i s ( t r t ) o h 、f m o c g l y o h 为原料，以d m a p 、d i c 、h o b t 为缩合试剂， 1 0 t f a 裂解制得三肽g h k 。并研究了其与铜离子等各种金属离子的特异性结 合情况i 矧。c o n a t o 等人也研究了铜离子，镍离子与其结合的结构特征【7 5 1 。 目前所见国外合成g h k 的报道不多，多属专利；国内陈钧辉等人在1 9 9 4 年 研究了g h k 及g h k c u 2 + 促使创面愈合的作用【7 6 1 ，1 9 9 7 年报道用液相法成功合 成g h k 及g h k c u “，并研究了其对于表皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞等人 1 4 g h k 和e p i t i f i b a t i d e 的合成研究 源细胞d n a 合成的影响【7 7 1 。在合成路线上，选择了先合成苄氧甲酰甘氨酰组氨 酸( z g l y h i s - o h ) ，然后与一氨基和羧基保护好的赖氨酸( l y s ) 用d c c 法缩合再 经催化加氢脱去保护基得三肽g h k , g h k 与等摩尔数的醋酸铜反应制得 g h k - c u “。 2 0 0 3 年，彭小三等人采用z 基团保护g l y 的氨基和l y s 的氨基，用对甲 苯磺基保护l y s 的羧基，所有保护基团用氢气和钯黑一并脱去，合成出三肽g h k ； h p l c 分离纯化；并对其酶促降解做了相关研列7 8 1 。 1 4 2e p t i f i b a t i d e 的研究现状 e p t i f i b a t i d e 是由七个氨基酸或氨基酸衍生物组成的环形肽，活性基团为赖氨 酸甘氨酸门冬氨酸，与血小板糖蛋白i i b i l i a 受体具有较高亲和力，是一种新 型的血小板糖蛋白g p i i b i l i a 受体拮抗剂。e p t i f i b a t i d e 是由美国c o r t h e r a p e u t i c s 公司研制，s o b e r i n gp l o u g h 公司生产上市，1 9 9 8 年7 月美国首次上市的，其商 品名为h l t r i f i b