（应用化学专业论文）均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 首先合成了7 苯基1 氧杂- 4 ，l o - 二硫杂7 氮杂环十二烷( n s 2 0 ) ，1 0 - 苯基1 ，4 - 二 氧杂7 ，1 3 二硫杂1 0 氮杂环十五烷( n s 2 0 2 ) 和n ，n - 双( 2 一乙酰氧乙基) 苯胺( d e ) - - 个受 体。然后通过v i l s m e i e r 反应和w i n g - h o m e r 反应最终合成了6 个均二苯乙烯类型的双 光予荧光探针；d m n s 2 0 、d m n s 2 0 2 、d m d e 和d p n s 2 0 、d p n s 2 0 2 、d p d e ，其 中的d p 和d m 分别代表端位的n ，n 一二苯氨基和n j 二甲氨基。 培养了d m n s 2 0 的单晶，用x 射线衍射测试了其结构。发现均二苯乙烯荧光团的 两个双键都是以反式结构存在，并且分子中的苯环并非完全共平面，相邻苯环之间的夹 角分别为2 4 6 。和3 7 5o 。 测试了探针分子在乙腈溶液中的吸收和荧光光谱。6 个探针分子的最大单光子吸收 都在4 6 0n m 左右，荧光发射在6 0 0n m 附近。用7 5 0 - - 9 0 0n l n 范围的光激发，在6 0 0n 1 1 1 亦观测到荧光峰，形状与单光子激发荧光峰类似，只是强度较弱，说明探针分子在此范 围能同时吸收两个光予被激发。测试了不同金属离子对探针分子吸收和荧光光谱的影 响，发现一端是n , n - - - 氨基的3 个探针d m n s 2 0 ，d m n s 2 0 2 和d i v i d e 在加入过量 的a g + 、z n 2 + 或矿后，6 0 0 姗的荧光峰淬灭，而在4 2 0 胁处出现新的荧光峰，强度 是探针分子在6 0 0n m 处荧光强度的2 0 多倍。含有n j 灿二苯氨基的探针d p n s 2 0 ， d p n s 2 0 2 d p d e 加入金属离子或酸，4 2 0 蛐处无荧光发射。推测n ，n 二甲氨基参与了 与金属离子的作用，与金属离子的作用使得分子由原来的d * 舢卜d 结构变为 d 毋a 毋a 或是a 叫卜m c a 结构( d = d o n o r ，电子给体；a = a c c e p t o r , 电子受体) 。而具有 a 小a 吼a 结构的分子能在短波处发射强烈的荧光，d 呵a 哪a 结构的分子荧光发射红 移，强度降低。 对于d m d e ，加入一定量的a g + 和z n 2 + ，6 0 0 衄和4 2 0n m 处的荧光峰同时增强， 4 2 0n m 的荧光峰和4 6 0n m 的吸收峰存在叠合，认为发生了分子间荧光共振能量转移。 总之，合成了6 个以均二苯乙烯为荧光团的双光子荧光探针，测试了探针对金属离 子的响应。d m n s 2 0 ，d m n s 2 0 2 和d m d e 对a g + 和z n 2 + 具有选择性，在4 2 0n m 产生 新的增强的荧光峰。通过结构比较，对识别的过程作了推测。 关键词双光子荧光探针：金属离子：均二苯乙烯 均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究 s y n t h e s i sa n dp r o p e r t yi n v e s t i g a t i o no f d i s t y r y l b e n z e n eb a s e d t w o p h o t o ns e n s o r a b s tr a o t 7 - p h e n y l 1 _ o 姗_ 4 ，1 0 - d i t h i a - 7 - a z a - e y c l o d o d e c a n e 州s 2 0 ) ，1 0 - p h e n y l 一1 , 4 d i o x a - 7 ，1 3 - d i t h i a - 1 0 - a z a - c y c l o p e n t a d e c a n e ( n s 2 0 2 ) a n dn , n - b i s ( 2 a e e t y l o x y e t h y l ) a n i l i n ep e ) w e r e s y n t h e s i z e d a s r e c e p t o r s s i xd i s t y r y l b e n z e n e b a s e dt w o - p h o t o ns e l l s 0 r s d m n $ 2 0 d m n s 2 0 2 ，d m d ea n dd p n s 2 0 ，d p n s 2 0 2 ，d p d ew e r eo b t a i n e dt h r o u g hv i l s m e i e r r e a c t i o na n dw i t t i g - h o m e rr e a c t i o n o n ee n do ft h es e n s o ri sn , n - d i m e t h y l a m i n o ( d o r n , n - d i p h e n y l a m i n o p ) r e s p e c t i v e l y n 圮c r y s m ls t r u c t u r eo fd m n s 2 0w a sa n a l y z e db ys i n g l ec r y s t a lx - r a yd i f f r a c t i o n t h e r e s u l ts h o w st h a tb o t ho ft h et w oc - cd o u b l eb o n da r ee x i s t 舔at r a n sc o n f i g u r a t i o n n 圮 d i h e d r a la n g l eb e t w e e nb e n z e n er i n gw a s2 4 6 。a n d3 7 5 0r e s p e c t i v e l y n 蛇a b s o r p t i o na n de m i s s i o ns p e c t r aw e r ea n a l y z e di na c e t o n i t r i l es o l v e n t 皿e m a x i m u ma b s o r p t i o no ft h es i xs e i l s o r si sa r o u n d4 6 0n n l ，a n dt h ee m i s s i o na r o u n d6 0 0n m w i t hat w o - p h o t o ne x c i t a t i o nb e t w e e n7 5 0n n la n d 9 0 01 1 1 1 1 。f l u o r e s c e n c ew a sa l s of o u n da t 6 0 0n mw i t haw e a k e ri n t e n s i t y t l l i sc a l lb eap o w e r f u lp r o o fo ft h et w o - p h o t o na b s o r p t i o n p r o p e r t yo f t h es e n s o r s f l u o r e s c e n c es p e c t r ar e s p o n d so fa l ls i xs e n s o r su p o nt h ea d d i t i o no f v a r i o u sm e t a li o n sw e r e i n v e s t i g a t e d n 增a d d i t i o no f a g + ，z + o rh t od m n s 2 0 ，d m n s 2 0 2a n dd 】v i d ei n d u c e da n e we m i s s i o np e a ka t4 2 0n n l ，t h ei n t e n s i t yi s2 0t i m e ss t r o n g e rt h a nt h e6 0 0n me m i s s i o no f p u r es e n s o r , t h eo r i g i n a l6 0 0 咖e m i s s i o np c a kb e c o m ew e a k e ro rd i s a p p e a r s n oe m i s s i o n p e a l 【w a sf o u n df o rs e n s o rd p n s 2 0 ，d p n s 2 0 2a n dd p d eu p o nt h ea d d i t i o no f a g + ，z o r 矿田1 en , n - d i m e t h y l a m i n og r o u pa n dt h er e c e p t o ri ss u p p o s e dt oi n t c r a c tw i t ht h em e t a l i o n so rp r o t o n n 圮i n t e r a c t i o nm a k e sb o t hn i t r o g e na t o m si nt w oe n d se l e c t r o nw i t h d r a w i n g g r o u p s t h e nt h em o l e c u l a rs t r u c t u r ea r ec h a n g e df r o md - x - a 呱- dt od - n - a - n - a 0 ra 呱a 吼ai nd i f f e r e n tm e t a li o nc o n c e n t r a t i o n m o l e c u l e sw i t ha ，卜a 丹as t r u c t u r es h o w s t r o n ge m i s s i o na t4 2 0n m g e n e r a l l y , s i xd i s t y r y l b e n z e n e b a s e dt w o - p h o t o ns e n s o r sw e r es y n t h e s i z e d m i r r e c o g n i t i o nt om e t a li o n sw e r ei n v e s t i g a t e d d m n s 2 0 d n d 4 s 2 0 2a n dd m d es h o w s e l e c t i v ef l u o r e s c e n c er e s p o n d st oa g + a n dz + an e w s t r o n ge m i s s i o np e a kw a so b s e r v e da t 4 2 0m o t h e rr e c o g n i t i o np r i n c i p l e sw e r es p e c u l a t e d k e yw o r d s ：t w o - p h o t o ns e n s o r ；m e t a li o n ；d i s t y r y l b e n z e n e 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 作者签名型蠡垦日期丝醛鱼瑚 大连理工大学硕士研究生学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位论文版权使用 规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论 文。 储躲逍邈 导师签名：蔓幽 趁丑年上月卫日 6 1 大连理工大学硕士研究生学位论文 引言 分子识别是广泛存在的自然现象，特别是在生命过程中，分子识别起着极其重要的 作用。但分子识别作为分子之间发生的事件，人需要借助一定的技术手段才能感知伴随 分子事件发生所产生的物理信号。分子荧光作为传感信号具有以下优点：可达到单分子检 测的高灵敏性、可开关、可实现人与分子的通讯，对亚微粒具有可视的亚纳米空间分辨 并且是亚毫秒时间分辨的。另外人们已经积累了许多关于分子结构、超分子结构以及环 境因素对分子荧光影响的知识并在一定程度上揭示了其内在的规律。所以人们设计、合 成了大量能够将分子识别事件通过分子的荧光信号有效表达的复杂荧光分子，这些分子 也就是所谓的荧光分子探针。荧光分子探针能将这种分子结合信息转换成易检测的荧光 信号，而且可在单分子水平上实现原位、实时检测。因此，在化学走向超分子科学并与 生命科学、材料科学等学科高度交叉的今天荧光分子探针得到各研究领域的广泛关注是 非常自然的。可用荧光分子探针识别的客体从最简单的质子到手性分子、蛋白、寡聚核 苷酸序列等千差万别。 目前，对多数荧光探针来说，采用单光子激发时，最大吸收和荧光发射多小于6 0 0n m 。 而对生物样品而言，其样品基体和一些杂质在此区域也会有吸收或荧光，再加上光散 射的影响往往会产生较为严重的背景干扰，短波激发对生物样品的损伤较大。针对上述 情况，近几年出现了一系列关于双光子荧光探针的报道。所谓双光子荧光探针是指探针 分子的荧光团具有较大双光子吸收，能同时吸收两个光子到达激发态，发射与单光子激 发同样的荧光。 双光予材料应用于生命科学领域具有独特的优越性，首先双光子激发过程使用的波 长在生物光学窗口( 6 0 0 - , 9 0 0n m ) 的范围内，避开了生命体系所不能承受的紫外可见 光损伤；其次由于生物组织对这一光波段的线性吸收与r a y l e i g l l 散射均比较小，背景光 干扰小，便于观测，并且光损伤、光漂白、光毒性都较小。双光子诱导的电子跃迁几率 与入射光强度的平方1 2 成正比，使得发色团的激发具有高度的空间选择性。均二苯乙烯 是一类研究较多的双光子吸收材料，具有大的双光子吸收截面。 以均二苯乙烯为荧光团的双光子荧光探针是近几年研究较多的一类，通过在其一端 或两端引入识别基团来实现对客体的识别，主要是金属离子，如m 9 2 + ，z n 2 + 和c a 2 + 等。 已报道的此类探针的普遍问题是选择性不好，且对作用的机理研究不多。因此，合成具 有选择性的双光子荧光探针对理论研究和应用都有重要意义。 均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究 1 文献综述 1 1 概述 化学、生物学和材料科学中至关重要的识别事件往往发生在一个为人们所不熟知的 微观世界里。但这些识别事件的信号可以通过建立具有特殊目的的分子器件以光的形式 表达出来。所以，人们设计、合成了大量能够将分子识别事件通过分子的荧光信号来有 效表达的复杂荧光分子，这些分子也就是所谓的荧光分子探针。荧光分子探针 ( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e ) ，荧光分子开关( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs w i t c h ) 和荧光分子传 感器( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rs e n s o r ) 是在荧光分子识别( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ) 中 经常使用的概念【l 】。荧光分子探针是其中内涵最广的一个概念，一般凡是在一定体系内， 当某一种物质或体系的某一物理性质发生变化时该分子的荧光信号能发生相应的改变 的分子就可称为某一物质或某一物理性质的荧光分子探针；荧光分子开关是指在识别过 程中分子荧光信号有明显强弱变化的荧光分子探针；荧光分子传感器是指在识别过程中 分子荧光信号能够速、可逆响应的荧光分子探针。所谓分子识别是指分子之间( 主体与 客体或称之为受体与底物) 靠非共价键力的选择性结合并产生某种特定功能的过程。单 纯的结合不是识别，识别是有目标的结合，它是通过一系列结构确定的分子间相互作用 而组成的模式识别过程。 荧光分子探针在临床医学，分析化学，生物化学分析，医学和环境学等领域均有重 要作用，因此，设计合成荧光探针具有重要意义。很多化学，生物化学的底物可以用荧 光探针来检测，像阳离子( i + ，m 9 2 + , c 矿：z n 2 + , c u 2 + ，c ( 1 2 + 等) ，阴离子( 氯离子，柠 檬酸根，羧酸酯，磷酸酯，a t p 等) ，气体( 0 2 ，n o ，c 0 2 ，等) 荧光分子探针还能用在 生物化学中，用来识别氨基酸，辅酶，核酸等复杂的客体 2 1 。 荧光探针主要包括荧光团和受体两部分，可以直接相连，也可以通过间隔基相连 3 1 。 e 园屯 q - 一 图1 ，1 荧光团和受体的不同连接方式 f i g 1 1 d i f f e r e n tw a y st oc o n n e c taf l u o r o p h o r ea n dar e c e p t o r 2 大连理工大学硕士研究生学位论文 荧光信号的变化主要体现在位置，强度和荧光寿命上。一般荧光探针对于客体的识 别主要是通过对荧光位置和强度的检测实现的。荧光位置变化的描述可以用蓝移或红 移。蓝移是指最大吸受或荧光发射向短波方向移动。红移：最大吸受或荧光发射向长波 方向移动。而吸收和荧光发射位置的差别用斯托克斯位移表示。荧光光谱较相应的吸收 光谱红移，这被称为斯托克斯位移( s t o k e ss h i f t ) 。荧光光谱发生向短波方向的位移被 称为反斯托克位移( a n t i s t o k e ss h i f t ) 。斯托克斯位移的大小能反应出激发态与基态偶 极距的大小关系。激发态偶极距大于基态偶极距时，斯托克斯位移随着溶剂的增大而增 大。描述荧光强度的一个重要物理量是荧光量子产率，是指荧光物质吸光后所发射的荧 光的光子数与所吸收的激发光的光子数之比值。它的数值在通常情况下总是小于l ，数 值越大则化合物的荧光越强。荧光量子产率一般采用参比法测定。即在相同激发条件下， 分别测定待测荧光试样和已知量子产率的参比荧光标准物质两种稀溶液的积分荧光强 度( 即校正荧光光谱所包括的面积) 以及对一相同激发波长的入射光( 紫外可见光) 的吸光度，再将这些值分别代入特定公式【4 】进行计算，就可获得待测荧光试样的量子产 率。 嘶2 鬻黼矧t ， 、 ( f 脚( a u ) ( ) n 。2 ) ”7 q y ：荧光量子产率f a ：荧光光谱积分面积a ：激发波长处的吸光度 k 。：激发波长n ：溶液折光率u 和s 分别代表未知样品和已知样品 化合物的结构与荧光 ( 1 ) 跃迁类型：矿一丌的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生； ( 2 ) 共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 ( 3 ) 刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如 荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。 n c 9 洲h 、移洲 r 、q 、一 丫、o 。 扩。扩。 酚酞 荧光素 电子给体( 本文中用d 表示， 1 0 d o n o r ) ：如羟基、烷氧基、氨基和取代氨基等。电子 给体能增大分子的摩尔消光系数，使光谱变宽，无精细结构。电子受体( 本文用a 表示， b h c c e p t o r ) ：如羰基、硝基等嘲。 均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究 1 2 荧光探针的识别原理 1 2 1 光诱导电子转移p e t ( p h o t o n i n d u e e d e l e c t r o n t r a n s f e r ) u u 肭 糟黼 。龋矗飘一鞠瑚辨蝣f 薯r 睁盥鬻1 棚棚嘲，- 蕾一嗍 u 岫 i 誓链o 射鞫r 擀 图1 2p e t 探针识别金属离子的原理示意图嘲 f i g 1 2p r i n c i p l eo f c a t i o nr e c o g n i t i o no f f l u o r e s c e n tp e ts e l l s o r 在各种各样的阳离子荧光分子探针的设计中，p e t 机理被应用的最多。此类探针分 子包括荧光团、受体和间隔基。根据氧化还原电位的大小，选择合适的受体和荧光团， 使得受体的一个电子可以转移到荧光团。在这种情况下，荧光团不能发射荧光。一旦与 识别的底物结合，受体的氧化还原电位将被改变，不能发生从受体到荧光团的p e t 过程， 荧光团就可以发射荧光。这是一种底物诱导的荧光增强现象。荧光增强比“o n o f f ”值 为2 时，就有应用价值，而达到l o ，在暗场中就有明显的视觉效果。p e t 探针通常只有 荧光强度的变化，不会出现荧光波长的移动。 p e t 1p e t - 2 p e t l r l 是最早也是结构最简单的p e t 荧光探针。加入k ? ，荧光量子产率从o 0 0 3 增加到o 1 4 。而p e t 2 1 * 1 中的受体部分是一个含硫的杂冠醚，对铜离子具有很强的络 合。但是，p e t 过程是从荧光团到金属离子，存在一个c u 2 + ，c t l + 的氧化还原，导致荧光 淬灭。 4 十一 大连理工大学硕士研究生学位论文 1 2 2 分子内电荷转移i c t ( i n t r a m o l e c u l a rc h a r g et r a n s f e r ) 这一原理也被称作光诱导电荷转移p c t ( p h o t o n i n d u c e dc h a r g et r a n s f e r ) 。典型的i c t 荧光探针是由荧光团与识别基团直接相连构成，在荧光团的两端分别连有供电子基团和 吸电子基团，属于识别基团的一部分，形成推拉电子体系。从供电子基到吸电子基存在 电荷转移，荧光团被光激发后，电子重新分配，激发态具有大的偶极距。受体与客体结 合时，会对荧光团的推拉电子作用产生影响，或是减弱了分子内的电荷转移，或是强化 了分子内的电荷转移，表现为荧光的蓝移或红移。一般情况下，i c t 荧光探针对荧光强 度的影响不像p e t 荧光探针那样显著。 i c l 乙l 删嗍啪 嘲抑翻料l 慨9 劳踹 i c l 乙2 捌朔喇明- 耐，糖弗p l r p 图1 3 客体对不同结构i c t 探针前线轨道的影响忉 f i g 1 3 f r o n t i e ro r b i tc h a n g eo f d i f f e r e n ti c tp r o b ew i t ht h ei n t e r a c t i o no f a n a l y t e 睁盎 化合物i c t 1 9 为典型的i c t 荧光探针，氮杂冠醚既是受体，同时也是推拉电子体 系的电子供给体。当冠醚与碱土金属离子如c a 2 + 络合时，由于金属离子的拉电子效应， 降低了冠醚氮原子的供电子能力，因此发生荧光蓝移，且荧光增强。多数i c t 探针在结 合客体后，光谱都有明显移动，但荧光强度变化不明显。但i c t 2 【咖是一个例外，与l i + 络合后荧光增强9 0 倍，与m 9 2 + 络合后荧光增强2 2 5 0 倍。 均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究 1 2 3 激基缔合物( e x c i m e r ) 一些分子中存在两个相同的荧光团如萘、蒽、芘等，其中一个荧光团被激发到激发 态，会和另一个处于基态的荧光团形成分子内激基缔合物。这样除可以观察到单体的荧 光发射，还可以在长波方向观察到有一个无精细结构的宽峰，即激基缔合物的发射峰。 由于形成这种激基缔合物需要激发态分子与基态分子达到碰撞距离约3 5 a ，所以荧光团 之间的距离是形成激基缔合物的关键。葸、萘等荧光团由于具有较长的激发单线态寿命， 易形成激基缔合物，常常被用于此类探针中【1 1 1 。 化合物e x c i m e r - 1 t e l 具有双芘荧光发色团，氮杂冠醚络合k + 或b a 2 + 后，抑制了从氮原 子到芘的光诱导电子转移，使荧光发射增强，同时单体激基缔合物的荧光强度比发生变 化。化合物e x c i m e r 2 t 1 3 l 是两个萘荧光团通过聚醚链连接的荧光化合物，碱土金属离子 c a 2 + ，b a 2 + 可以与乙氧链上的多个氧原子以及酯键上的氧原子络合，造成链的收缩，使 两个蔡环得以靠近，促进激基缔合物的形成，使萘单体发射荧光强度减弱。 咄州舟 e x c i m e r - ie x c i m e r - 2 1 2 4 荧光共振能量转移f r e t ( f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r ) 当能量给体荧光团d 与能量受体荧光团a 相隔的距离远大于d a 的碰撞直径时，只要 d 与a 的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，或者说d 的发射光谱与a 的吸收光 谱能有效重叠，就可能发生从d 至i j a 的非辐射能量转移，又称为长距离能量转移( 甚至相 距远达7 0 1 0 0a ) t 1 4 1 。实际上d - a 发生能量转移两者除了光谱重叠外，还必须以适当的方 式排列。 f r e t - l f r e t - 1 1 2 1 中，两个香豆素分子通过醚链连接，香豆素基团间距离较远，能量共振 转移效率低，当用短波激发时，只能观测到d 香豆素荧光，加入p b 2 + 时，p b 2 + 与开链聚 醚形成络合物，拉近d - a 距离，f r e t 效率得以提高，激发d 时，得到较强的a 的荧 光发射。 6 威 大连理工大学硕士研究生学位论文 1 3 荧光团 在探针分子的设计中，荧光团的选择也至关重要。要能比较容易的与受体部分连接， 荧光发射的位置强度，及其溶解性能，稳定性都必须能满足实际需要。 用于探针分子的荧光团多为芳香族化合物，如稠环芳烃的蒽，芘等，它们具有强而 稳定的荧光。它们作为结构最简单的荧光团，经常用于基础理论的研究。另外，它们易 产生基激缔合物荧光，这也是其它荧光团所不能代替的。 以荧光素为主要代表的占吨类荧光团也经常被应用到荧光探针的设计中来。随着 p h 值的变化，表现为不同的结构i z j 。 卅曙hy ”。 曙洲可叫u 暖h 0 0 。 负一价型 负二价型 吡咯甲川类荧光团( b o d i p y ) 的荧光量子产率高，随着取代基变化其荧光波长可 调范围大，不易受环境p h 值影响。受体既可以连接在的位置，也可以连在r l 或r 3 的位置。1 ，8 - 萘酰亚胺是一类优秀的荧光发射团，特别是4 位有强供电基团( 如氨基) 的衍生物，都能发出很强的荧光，且s t o c k s 位移大。这类荧光团有很好的平面性，是 优良的d n a 嵌入剂u ”。 b o d i p y j 取戒c 0 8r ：骚r u 取斛一r v 蛐b 7 1 8 - n a p h t h a t i m i d e 均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究 罗丹明染料由于分子呈刚性平面，有较高的荧光量子产率，故荧光较强。罗丹明一b 是常用的测试荧光物质量子产率的标准物之一，已成为商品化染料，但s t o k e s 位移较小， 吸收区域的低能量部分与发射区的高能量部分重叠，导致染料的激发辐射损失。常见的 还有罗丹明6 g 、罗丹明1 0 1 等 1 6 1 。 1 4 受体部分 荧光探针的受体负责与底物的选择性结合，常用的受体主要有以下几种： 一、冠醚包括：氧杂冠醚、氮杂冠醚、硫杂冠醚。此外，开链聚醚虽然不具有大 环效应，由于络合能力弱，具有较好的选择性。 二、环糊精是继冠醚之后的第二代受体。是由葡萄糖通过1 ，4 一糖苷键相连形成的 一类筒状化合物，其内腔疏水，而外部亲水。 三、杯芳烃由苯酚单元通过亚甲基经2 ，6 位相连而成的一类具有独特空穴结构的 环状低聚醚，兼具杯芳烃和冠醚之长，及能识别离子型客体，也能包结中性分子。 关于受体的报道【1 7 ，1 8 l 已有很多，这里就不再详述。 1 5 有机双光子材料 1 5 1 双光子吸收过程 双光子吸收是一种非线性光学现象，在强光激发下，介质通过一个虚拟中间态同时 吸收两个光子，从基态跃迁到两倍光子能量的激发态的过程【1 9 1 。这种双光子吸收过程的 强弱，取决于原子或分子体系相应的跃迁几率或截面、光场与体系跃迁的共振或非共振 特性以及光场的强度。 s 2 s l 锡e x c i t e d s t ； 气q 一 ( ) 3 1 v i r t u es t a t e 2 1 s i n g l e - p h o t o n t w o - p h o t o n g r o u ds t a t e 图1 4 单、双光子吸收和发射机理示意图嘲 f i g 1 4 s c h e m a t i co f o n ea n dt w o - p h o t o ne x c i t a t i o np r o c e s s 8 大连理工大学硕士研究生学位论文 双光子吸收截面是表示双光子吸收强弱的物理量，其单位为：锄s p h o t o n l 。常 用测试方法包括非线性透过率法，上转换荧光法，瞬态吸收法和四波混频法。采用上转 换荧光法计算双光子吸收截面的公式为嗍； 固rc rmf | 仃5 2 仃7 面西i i 公式( 2 ) g 胁f ，“ 其中，下标r 代表参比，s 代表样品，n 是折射率，f 是双光子积分强度，o 是双关 子荧光量子产率，由于双光子量子产率很难测定，通常假定单、双光子荧光量子产率相 同。由于使用普通荧光仪测试的双光子荧光和t i ：s a p p h i r e 锁模激光器所测的数据差别 可能较大，所以本论文没有测试双光子吸收截面。 1 5 2 常见有机双光子材料的结构 双光子吸收过程以其特有的三维处理能力和极高的空间分辨本领而在生物、物理、 化学、医学和微电子技术等广泛领域显示出变革性的应用潜力。近几年来高效率的双光 子吸收材料得到很大的发展。由于高效双光子吸收材料在双光子荧光成像和显微技术、 3 d 信息存储，光化学治疗、微加工、上转换材料等方面的应用，引起了科学家们的巨 大兴趣，基于双光子吸收过程的分子设计、组装及性能研究成了光电子领域的热门课题。 目前，双光子材料主要有以下几种类型： ( 1 ) 二苯乙烯类和均二苯乙烯类双光子吸收材料 美国纽约州立大学b u f f u l o 分校的p r a s a d 2 1 1 教授领导的小组的设计思路是基于双光 子吸收截面和三级非线性极化率的关系上，最初设计了以下两种基本结构的双光子吸收 材料。如图1 1 5 所示： 晰。 今 ) 勺 电子供体极化丌电子桥 电子供体 q 电子供体极化丌电子桥 电子受体 图1 5 两类具有强双光子吸收的分子结构 f i g 1 5 m o l e c u l a r - s t r u c t m em o t i f sf o rb i g h l ya c t i v et w o - p h o t o na b s o r b i n gc h r o m o p h o r e s 9 均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究 这一类共轭分子的双光子吸收截面的大小和分子四极矩的变化有直接的关系，在受 激光激发后，如果四极矩发生较大的变化，则具有相对较大的双光子吸收截面。 m a r d e r 等【2 2 】新合成一系列具有d a - 7 【- a - d 、d - a - d a - d 和d d a - d - d 结构的化合 物，这类化合物易溶于二氯甲烷等有机溶剂，其中化合物c 的双光子吸收截面最大达到 5 3 0 0g m ，有广泛的应用前景。 a ：r i = c n ，r 2 = h b ：r i = c n ，r 2 = 0 6 1 2 h 2 5c ：r i = o c h 3 ，r 2 = c n ( 2 ) 多枝状结构的双光子吸收材料 在具有多枝状结构的分子中，由于支链间电子偶合和电子共振作用，能显著提高双 光子吸收截面1 2 3 1 。k o r e a 大学c h o 教授研究小组口4 】合成了一类星状结构的双光子分子， 荧光量子产率达到了o 6 7 ，双光子吸收截面为5 0 3 0g m 。 n f e n g 等人合成了含有咪唑一噻唑杂环的y 型分子，由于噻唑环没有任何氢原予与咪 唑环共轭造成扭曲，因而两个杂环保持较好的共平面性，分子表现出很强的双光子吸收， 吸收截面为2 1 0 0g m 。 i h 八。愉 ( 3 ) 对称八极分子结构的双光子吸收材料 2 0 世纪9 0 年代，z y s s 等 2 5 1 在研究具有d 3 h 分子对称性的平面型三硝基三氨基苯的结 构及其二阶非线性效应的过程中引入了非偶极非中心对称的八极分子( 0 c t u p o l 岫的概念， 指出八极分子的晶体中没有偶极偶极作用导致的中心对称化趋势，倾向于聚集成非中 心对称的晶体结构，出现宏观二阶非线性效应的几率增大。此后，关于八极分子的双光子 1 0 大连理工大学硕士研究生学位论文 ( 3 ) f e n g 等人合成了含有咪唑噻唑杂环的y 型分子，由于噻唑环没有任何氢原子与咪 唑环共轭造成扭曲，因而两个杂环保持较好的共平面性，分子表现出很强的双光子吸收。 吸收截面为2 1 0 0g m 。 h o 慨 ( 4 ) 对称八极分子结构的双光子吸收材料 2 0 世纪9 0 年代，z y s s 等t 2 5 】在研究具有d 3 分子对称性的平面型三硝基三氨基苯的结 构及其二阶非线性效应的过程中引入了非偶极非中心对称的八极分子( o c t u p o l a r ) 的概念， 指出八极分子的晶体中没有偶极偶极作用导致的中心对称化趋势，倾向于聚集成非中 心对称的晶体结构，出现宏观二阶非线性效应的几率增大。此后，关于八极分子的双光子 吸收的研究日益增多。k o r e a 大学的c h o 教授【2 6 】的研究小组合成了具有平面d 3 h 对称性的 六取代六元芳环八极分子，其双光子吸收截面达到5 3 9 5g m 。 1 6 双光子荧光探针 1 8 1 双光子荧光探针的优势 双光子荧光探针也称双光子荧光传感器( t w o - p h o t o nf l u o r e s c e n c es e l l s o r ) ，关于什 么是双光子荧光探针并没有明确的定义。一般来说，双光子荧光探针是指荧光团具有较 大的双光子吸收截面的荧光探针，能很好满足用双光子显微术测试的要求。传统的单光 子荧光探针也可以用双光子成像技术进行分析，但是由于双光子吸收截面太小，存在很 多局限。双光子荧光探针与单光子荧光探针相比，具有如下优点1 2 7 j ： 均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究 1 双光子荧光显微与成像术一般采用在生物组织中穿透能力较强的红外激光作为激发 光源，可以解决生物组织中深层物质的层析成像和生物细胞的光致毒问题。 2 由于双光子荧光波长远离激发光波长，因此双光子荧光显微与成像术可以实现暗场成 像。 3 在双光子荧光显微与成像术中，光漂白区域小。 4 双光子跃迁具有很强的选择激发性，有利于对生物组织中一些物质进行成像研究。 5 双光予荧光显微与成像术具有更高的横向分辨率和纵向分辨率。 另外，由于材料的双光子吸收强烈地与激发光强的平方相关，在紧聚焦的条件下， 双光子吸收仅局域于物镜焦点处空间体积约为人3 的小范围内，人们甚至可以不使用共焦 小孔，就能得到高清晰的三维图像，使共焦显微镜的设计大为简化，易于操作。 1 6 2 双光子荧光探针的发展概况 1 9 9 6 年，c h r i sx u 等在其发表的文章【2 3 】中对c a l c i u mo r a n g e ，c a l c i u mg r e e n 1 a n d c a l c i u mc r i m s o n 等几种染料双光子吸收截面在加入c a 2 + 前后的变化作了描述。发现，加 c a 2 + ，几个染料的双光予吸收截面从小于3 0g m 增大至u 5 0 - 1 0 0g m 。还发现，双光子 激发荧光与双光子吸收截面成正比，单、双光子激发下，金属离子络合前后的荧光增强 比相同。 具有大的双关子吸收截面的双光子探针是近几年才出现的，识别的客体包括金属离 子、阴离子和质子。首先介绍其中最重要的一类，以均二苯乙烯为荧光团，用来识别金 属离子的双光子荧光探针。2 0 0 4 年，s t e p h a n i ej k p o n d 在j a c s 上发表的文章1 2 9 报道 了一类具有d - a 弘a d 结构的均二苯乙烯类双光子荧光探针t p s e n s o r - 1 和t p s e n s o r - 2 ，分 别在均二苯乙烯的一端或两端连有氮杂1 5 冠5 作为络合金属的受体。加入m ，+ 后， 7 3 0 - 8 6 0n m 范围内分子的双光予吸收截面下降5 0 多倍。其结构如下： t p s e n s o r - 1t p s e n s o r - 2 意大利的c a m i l l af e r r a n t e 等相继报道了两个以1 ，4 ，7 ，1 2 - 4 氮杂环十二烷为识别基团 的，均二苯乙烯双光予荧光探针t p s e n s o r - 3 和t p s e n s o r - 4 t 3 0 3 1 1 。t p s e n s o r - 3 在没有金属 离子存在时，为推拉电子的d 毋a 结构加a z n 2 + 后，受体部分的供电子能力减弱，变 为对称性较好的a 呵- a 结构。 大连理工大学硕士研究生学位论文 t p s e n s o r - 3 t p s e n s o “ 韩国的b o n gr a ec h o 小组设计合成了一系列的双光子荧光探针，主要是针对金属 离子的识别。在2 0 0 4 到2 0 0 6 年间分别报道了t p s e n s o r - 5 p 刁，t p s e n s o r - 6 口3 1 和 t p s e n s o r - 7 3 叼三个以均二苯乙烯为荧光团的双光子荧光探针。 t p s e n s o r - 7 t p s e n s o r - 5 和t p s e n s o r - 6 在甲苯中的双光子吸收截面都为3 2 0c m , 在乙腈中要小 很多这种溶剂效应的原因目前还不清楚。但是，双光子激发的荧光强度能满足测试的 需要。c a 2 + 对t p s e n s o r - 5 的荧光淬灭作用最显著，但是m 矿，b a 2 + ，n a + 有干扰，加之 生物组织中m f + ，n a + 的含量较大，所以，探针t p s e n s o r - 5 的选择性与实际应用还有很 大距离。t p s e n s o r - 6 在加入z n 2 + 后，荧光淬灭。 均二苯乙烯类双光子荧光探针的合成及性能研究 与t p s e n s o r - 5 和t p s e n s o r - 6 相比，t p s e n s o r - 7 的不同在于l o 铂p b 2 + 的加入阻断了 两个双光子荧光团之间的荧光共振能量转移，从而荧光大大增强。这种“关一开”( o f f o n ) 类型的探针对于实现对底物的分析更为有效。因为引起荧光淬灭的因素很多，并 且荧光淬灭也不利于在生物体中的成像分析。 t p s e n s o r - i t p s e n s o r - 6 虽然都具有较大的双光子吸收截面，加入某些金属离子能 影响其吸收和荧光，但是它们的缺点也显而易见，对金属离子的选择性不好。s t e p h a n i e j k p o n d 和b o n g r a e c h o 在其文章中只是介绍了m 9 2 + ，c a 2 + ，z n 2 + 等离子对t p s e n s o r 的单、双光子激发荧光光谱的影响，给出了设计此类双光子荧光探针的潜在可行性，选 择性要求还不能满足实际应用，另外就是不具备水溶性，不能用于生物体的成像。 t p s e n s o r - 8 n矿(hooch2 c ) 2 n 7 。 t p s e n s o r - 9 为了解决上述问题，得到更实用的双光子荧光探针，b o n gr a ec h o 在2 0 0 7 年报道 了t p s e n s o r - 8 1 和t p s e n s o r - 9 1 3 6 】两个具有水溶性的双光子荧光探针。t p s e n s o r - 7 的最大 双光子吸收截面为2 9 0g m ，加入m 矿+ 后，则变为3 8 2g m ，位置从8 2 0n m 红移到8 8 0 r i m t p s e n s o r - 8 在络合了m 矛+ 后，双光子吸收截面为1 2 5 g m ，t p s e n s o r - 7 和t p s e n s o r - 8 的成功之处在于选择了简单的水溶性荧光团，络合金属离子后荧光增强。