（食品科学专业论文）乳糖酶产生菌筛选、优化培养及在低乳糖奶中的应用.pdf

ab s t r 朗 t ab s t r act ith a sbe皿 。 s t l m a t ed that o v e r 7 0 % o f、 ， o t l d ， 5石 。 h ， 卜 1 加 口 招 s u ffer丘o m e l the r l a c t o ，双 以 l di gesti on orin t o l erance. t 五 e e 正 以 m ep 一 d-gaia c t o si de 叨acto h y dr o l as e ( p 一 g al a ct o si d as e ， e. c . 3. 2 . 1 . 23， tri vi al lyl a c tase ) b y dr o l y z e s l a c t o ， ， the 而压即 g ar ， 加 t o t w o moieties_ g l u co sean d咧朗 to se t 七 e deve fo pme ntof】 a c t o 努勿d r o l yz ed p r o d 谧 t s p r e s e n ts o neof此 poss ible 即 p rd 朗 he s tod i 画 面 shth e l a c t o sem al di ge stion p r o b l e m . b y u s i n gx ， g al姗 and o 刊 甲 gte 成 the p 一 gal朗 t o si d 剐 粥朗 t l vi tyq uality and q uan t l tywered e t ec t e d re specti祖y ， ino r d e r tos c re e n the 面c r o o r g 面s mfr o msoil 助d 而攻认 七 i ch pr odu ce s l ar g e q uant l tyofp 一 g al ac tosi d as e . t 七 。 r e二 栩e 刘 沙 刃 ne 5 勺 妞 众 .t h a t ap p e ar e d b 脉 co le uron the a g arp l 毗 叫别 泣 运 g x-咧. 冉 刀 d th e reare fi ve s tr al nsp r odu 以 刃hi gh q uality 汕d larg eq uan t i tyofp 一 g al ac t o s i d as e . a 刀 d the 卜 g ai a c t o si d a s e a c ti vity ofyeast y6 is the best ofthese6 v e sti a in s . t 】 l e fe rme n 以i on 司n 江 已 m e 山 山 旧of】 留。 is e . p ro d u c in gye ast 灿甲e m 风 沙 es 勿 心 才 行waso p t 加远dby o n h o go耐 des i gn ands in g l e 一 几 以 。 r e x pe ri m 改 lts . t b e 卯6 m 目c u l to 肥m e d i um for fe rme “ ta t 1 0 n ofl a c ta se . p m d u c i ng y e ast 幻勺 即 e ro myc e s 勿 “ 臼 was s h o wn asfo u o 研 旧 (%， w 凹 : l a 引 力 seg ， 砂 u c o s e o. 5 ， yeast e x 加 ac t o. 7 ， 吟 0.15 ， k h z p 认1 . 5 ， mgs 认0.1， n 压 c 12 0. ol， ph 6. 6 沪币 :st b e 叩t 五 n 功 mfe rme n tatl on co nditi ons on p r edu c ing l 朗 ta se were as follo ws: cu】 h 叮 eti m ew a s1 8 2眠 i n o culationq u an t ity was 2. 5 %少乃 0 ， the vol umeoffe n 刀 e n ta ti on c ul tu rem e d i 切 叮 was 3 0 m u 2 50m l . 八 刀 d the ave r a g e p redu c t 1 v i tyof1 a c ta sew a s 1 .93o o n p guni ts 声r 面l l i l i te t 七 e p r o p erties ofthe e 正 守 m o ofl 即 ta sei so l at edfr o mk7叨 即 e ro峨 样 esla c t isw a 名 咖d i edusi n g s in g l e 6 比 t o r e x pe拄 m e nts. t b e o p t 汕alp hvalue即d t e m pe r al 劝 限ofthe l a c 七 始 e werefo und tobein th e rangeof6. 4 户芍 石明 d at 4 。 礴 5 汀 。 卿tlv e ly.t b e 卯t 汕目山 阴刀 司s t a b l l i tye 司 比 b i ted att e m pe . 山 jr e of4 仆 礴 5 明d inp h住 口 g e of 6. 小8.4. the e nz y m e was si 加反胡 t 卜 a c t iv at ed勿m e 回fo ns。 f m nz 十 ， m 扩 + 耐 n a+ ， but in hi b ited 勿the m e 回fo nsof知补 and c u 补 . 肠 喻 ai ueofthe l 朗 ta se姗 me asure dat3 .34 8 n u n o 】 几 阳d1 6 . 8 7 3 n u n o l 几 wb e n0 n 甲 g andl a c t o se as s ubs 七 at 亡 ab s tr a c t re s pec t i v ely . 从 飞 阳 m i 玫w a s trea t e d 幼thl a c ta sei sol at e d 五 勺 m刃叨 即 e r o 用 沙 c e s lac t 臼at4 0 for s bours ， 俪山dosag e of1 0 %， 比e degree ofhydro lvsi s for l 朗t o secan r e a c h 7 0 %. k 叮 wo r ds:p 一 g al actd sidas e; s tr 幻 nsc reening;fe n n e n t at i on; e 牙 m ep io 详 成 y ; b y dro ly sis 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是本人在导 师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知， 除了 文中 特别加以标 注和致谢的 地方外， 论文中不包含 其 他 人已 经 发 表 或 撰 写 过 的 研 究 成 果 ， 也 不 包 含 为 获 得 业塾处扎或 其 他教 育 机构的学位或证书而使用过的 材料。 与我一同工作的同 志对本研究所做的 任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学 位 论 文 作 者 签 名 手 写 ) 枷闷 函签 字 日 期 : 黔 司 年 月 居日 学位论文版权使用授权书 本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解选通叫左史 有关 保留 、 使 用 学 位 论 文的 规定 ， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅 和借阅。 本人授权南昌大李可以将学 位论文的全部或部分内容 编入有关数据库 进行检索，可以 采用影印、 缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学 位 论 文 作 者 签 名 手 写 : 取 围丽 签 字 日 期 : 办习 年 ; 月2日 导 师 签 名 、手 写 ):) .蜻 洲 签 字 跳 门年石 ” 犷 日 学 位论文作者毕业后去向: 工作单位: 通讯地址: 电话: 邮编: 第 1 章 引言 第1 章 引言 国内外研究状况 乳糖酶的特性 乳糖酶(l a c 七 is e ) ， 按国 际酶学委员会的 命名法， 称为p ee d es 半乳糖 昔半乳糖 水解 酶 ( p 一 d 一 咧acto si de咧留to h y d ro l as e ， e. c3. 2 . 1 . 23) ， 简称日 一 半乳 糖昔酶。 乳糖酶是一 种无毒 无副 作用的 生物酶制剂， 它是 一种白 色粉末， 无味 道， 无嗅， 溶 解 后 是 一 种浅 棕 色 液 体 11 . 已 由f da( 美国 食 品 与 药 品 管 理 局) 和j a c pa ( 食 品 添加剂联 合专家委员 会) 评审 机构确认为安全物质， 中国卫生部己 于1 9 98年 10月将其 列入食品 添加剂使用卫生标准gb 2 7 60 中 阅 。 乳糖酶是一类催化 p 一 半乳糖昔化合物中 p 一 卜半乳糖昔键发生水解断裂 的 酶，具 有催化乳糖水解和转糖昔两种功能。乳 糖酶的 活性位点上有两个官 能 团: 疏基 和咪哇基， 其中 疏基可作为广义 碱使半乳 搪昔的 氧原子质子化， 眯哇 基可作为 亲核试剂攻击半乳糖分子的第一 个碳原 子上的 亲核中 心，当半乳 糖昔 的受体 是水时，发生的是水解反应，可以 将乳糖 水解 成 q - 卜葡萄糖和 p 一 卜 半乳 糖 ( 见图1 . 1 ) ;当 受体是糖或醇时， 发生的是转搪 昔反 应。如果受 体是半 乳糖， 则可生 成低聚半乳 糖 ( g o s) 切 ， 机理如图1 . 2 所示。 日t 口 口 口 一一. . -心卜 g iu co s e _ 、 ， ，oh 厂 过 卉 下 0叼山沪产女一 . 公 奋. 只 臼 h l a c t o s e 加a 卜 云 户 次 ， ( 刁) ，g i c j l 巧a 百 a ct0 s e 图1 . 1乳搪经乳 糖酶作用转化为葡萄糖和半乳 撼 第 1 章 引言 澎!诚， 心帕 闪 目 孑 : 一 澎一 / 、j【 一 公、5 月 图1 . 2乳糖酶合成低聚半乳糖的机理 乳糖酶的 这两种功能也就决定了 它在下面1 . 1 . 2 和1 . 1 . 3 中的应用。 2关于乳箱不耐受 乳糖是哺乳动物乳汁中 一种特有的碳 水化合物， 人乳中 含量最多。 乳糖在 人类正常的生命活动中起着重要作用， 特别是婴幼儿的主要能量来源。乳 糖需 经 位于 小 肠 粘 膜 上 皮 细 胞 刷 状缘 的 p 一 半 乳 糖 昔 酶 水解 为 半 乳 糖 和葡 萄 糖 两 种单 糖后才能被机体吸收利用。 机体乳糖酶缺乏可分为3 类: 先天性乳糖酶缺乏， 指出 生时 乳糖酶活 性即 低下或缺乏，这是一种罕见的常染色 体隐 性遗传性疾病; 继发性乳糖酶缺乏， 指由于各种原因致小肠上皮损伤而导致的暂时性乳糖酶活性低下，常见病因如 感染性腹泻、营养不良 等。 乳糖酶活性多 于机体原发疾病康复后自 行恢复正常; 原发性乳糖酶缺乏( 又称成人型乳糖酶缺乏 ) ，是最常见的一种乳糖酶缺乏。 在自 然条件下乳汁为 乳糖的唯一来源，哺乳动物幼仔断奶后很少有可能再大量 摄人乳糖，因 此大多 数哺乳动物肠道内的 乳糖酶自 断奶前开始逐渐减少，直至 成年期完全消失，其原因一 般认为与世代形成的 饮食习惯所造成的乳糖酶基因 突变而不可逆关闭 有关。大多数哺乳动物成年后乳糖酶活性降低，不能再消化 乳糖。当 机体缺乏乳 糖酶时，乳中的乳糖不能 在小肠内 被及时消化吸收，而直 第 1 章 引言 接进入结 肠，被肠道细菌分解产生乳酸、甲 酸等短 链脂肪酸 和氢气、二 氧化碳 及甲 烷， 所产生的 低分子物质的 渗透压作用使肠道中 水分 增加，引 起腹 胀、 肠 鸣、肠绞痛、腹泻等一系列 症状，称为 乳糖不耐受( l a c t o s e 加 切 l e 仙i c 七 ) ;当 乳糖 酶缺乏只引起乳糖吸收障碍而无临床症状时，称为乳糖吸收不良( l a c t o s e 山 目 ab s o 印 ti o n)。 世 界 上 除了 高 加 索 人 种以 外 ， 绝 大 多 数 人 口 都 存 在 着 不 同 程度 的乳糖酶缺乏。 而且有明显的 种族差异， 其中 亚洲人和非 洲人的 发生率达75% 1 0 0 %。 我国汉 族成人乳糖酶缺乏的 发生率高达75% 一95. 7 % ，3 13岁 儿童乳 糖酶 缺乏发生率为 87%， 儿童乳 糖酶 下降的年龄 在7 8 岁冈 。 乳搪不耐受( 吸收不良 ) 在很大程度上限制了 人们对乳及乳制品的摄人， 会 产生一系列不良 影响。乳 糖不耐受的长期危害在儿童易表现为钙吸收不良 、腹 泻、软骨病、 体重 低下及生长发育迟缓，在老年人尤其是老年妇女易表现为骨 质疏松等症状。另 外， 对无症状的 乳搪吸收不良 者来说， 虽然不会刻意避免饮 用牛 奶， 但由于本 身乳糖酶缺乏也会使牛 奶中的 营养成分得不到充 分吸收。 药物治疗乳糖不耐受费 用高且存在许多副 作用， 膳食调节就成为当前解决 乳糖不耐受( 吸收不良 ) 问 题的关键。最简单的办法是避免一切含乳搪的食品， 但这 势必会影响钙的 摄人。国 外目 前普遍 采用的 方法是直接 补充缺少的乳糖酶， 进食 含乳糖食品 之前以片剂 形式口 服微生 物源的乳糖酶能增强乳 糖不耐受 对乳 糖的 消化。另外， 在乳及乳制品中加入商品 化的乳糖酶或用 超滤法处理乳品， 能 够去除乳中 绝大部分乳糖。酸乳等发 酵乳中的 活菌含p 一 半乳糖昔酶，在发酵 过程中被 这种酶利 用的乳糖达50%， 大大地促进乳糖 在肠内的 吸收， 饮用酸乳 可以明 显减轻腹泻、 肠胃 胀气等乳糖不 耐受症状。 3关干低聚半乳精 低聚半乳糖是以乳糖为 原料， 在微生物 所产p 一 半 乳糖普酶作 用下， 在乳糖 的半乳糖一侧结合上1 4 个 分子的半 乳糖的混合糖囚 。 . 在自 然界中， 动物的乳汁 中含有微量的 低聚 半乳糖， 母乳中的含量稍多，因此用母乳喂养的婴儿肠内 细 菌中双歧杆菌占 优势。 低聚半乳糖具有 难消化性，对 双歧杆 菌具有明显的增殖 效果。此类糖甜味 纯正， 热值较低，甜 度为蔗搪的20% 40%， 有较强的 保湿 性。在 声为中性条件 下有较高的热稳定性，1 00 下加热lh 和1 20下加热3 0 耐 n 低聚半乳糖无任何 分解。 低聚半乳糖广 泛应用在食品领域， 如乳制品、面包、 第 1 章 引言 饮料、果酱等。它添加于食品，不仅使食品增加了保健功能，而且一定程度上 改普了食品的风味、质地和色泽 。 不同微生物生产的p 一 半乳糖昔酶，其水解反应和转移反应活性不同，由乳 酸克 鲁维 酵母( 刃明e r 口 川 酬 韶iac动 、 脆壁酵母( 长 户 明 左 钻 ) 及黑曲 霉 生 产的酶水 解力强而转移酶活性低，适合于乳糖之水解;而保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌 ( 女印 .th e 附印 h il us ) 、 青 霉、 米曲 霉及 环 状芽 抱杆 菌伍c ircu la ns ) 生 产的 酶转移 反应活性强而水解力弱，故适用于低聚半乳搪的 合成。 不同来源的酶其转移生 成物的聚合度也不同，乳酸克鲁维酵母、大肠杆菌及黑曲 霉等的酶产品中以 二 糖类为主;而环芽抱杆菌、 米曲 霉的 酶， 其转移反 应产品中以 三糖的比 例较高。 在环芽 抱杆菌乳糖酶催化乳糖分子间转移反应生成的低聚乳糖中主要是p( 1 一 4) 键组成的三糖和四糖，此外， 还有日( 1 一 2)键或p( 1 一 3)键构成的二糖。 将斯达酵母或罗伦隐 球酵母在含乳糖的 培养基中 培养时， 在胞内p 一 半乳糖 昔酶的转移作用下可生成50%p( 1 一 4)键的半乳糖基乳糖，而几乎无四糖以上的 低聚搪生成，因葡萄糖被菌体所利用，故产品中副产物很少。 市 售 商品 低 聚 半乳 糖的 组 成 成分 见 表1 . 1 和 表1 。 2 “ 。 表1 . 1低聚半乳塘0 119 0 . a t e 55的组成成分 糖的种类主要结构比例 ( %) 181241725123 单塘 乳塘 转移二糖 转移三糖 转移四搪 五塘以上 葡萄糖 ( g l u ) 半乳塘 ( g 日 ) o al ( 1 礴冷l u g al(l 一 冷lu ，o al ( 1 一 冷l u g 目 汉 1 刁 姆a l ( 1 礴 羚l u g al 仪1 闷 扣ai 仪1 礴 冷al 傲1 礴 冷lu 注: 上表为用环芽抱杆苗的日 一 半乳锗昔醉生产的制品。 表1 . 2低聚半乳糖c a p 0 l l g o 日 一 7 0 的组成成分 糖的种类主要结构 gi u ，6目 比例 ( %) 单糖 二糖类 三搪类 其他低聚塘 g 幻 伐1 4 冷hi 等 g al 仪1 礴 冷al ( 1 礴 冷lu 注: 上表为用罗伦隐球醉母发醉法制成。 第1 章 引言 低聚半 乳 糖也 可 用超级 嗜热微生 物的 酶 来合成， 丁 h “ e s e h an s son门 用导 入半 乳糖昔酶基因的古细菌硫化叶菌翻扣to b 毋勘扣匆 尸 记 盯 ( l acs)和脚了 口 。 “ 。 户 川 口 浑 公( cel b)， 在高 浓度 底物、 温 度 95 条 件下 进 行反 应， 转 移三 糖、 四 糖的 得率分别可达37%与40%， 远比 使用嗜热菌或中 温菌如米曲霉的 得率高。 曲 霉半乳糖昔酶可用固体培养或液体深层培养法生产，固体培养以 数皮为 培养基， 30 培养3d后用水抽提， 将抽提液脱色， 减压浓缩到1 /5， 在低温10 以 下再加异丙醇或酒精沉淀酶， 然后冷冻千燥。 液体培养可用数皮、甜菜渣和 乳搪作碳源， 玉米浆、豆饼粉、膝、按盐和尿素为氮源， 添加适量磷酸盐、 钙 盐及镁盐等制成培养基。果胶因含半乳糖醛酸，故对半乳糖昔酶生成有诱导作 用。 以 米曲霉p 一 半乳糖昔酶转化乳糖生产低聚半乳糖为例， 工艺流程如下。 p 一 半乳搪昔酶的活力测定通常是以 邻硝基酚一 p es 半乳搪昔( o n 陀) 为底 物， 在声值为 4 . 5 ， 5 0 反 应后， 用比色法测定游离的 邻硝基酚含量来衡量的， 以释出l p mol /min邻硝基酚所需酶量为一个单位. 但此法只反映出 酶的水解能 力，要测定其转移反应需用h p lc法. 畜 . 1 。 4乳糖酶的来源及其制备 乳糖酶广泛存在于扁桃、 桃、杏和苹果等植物和大肠杆菌、 乳杆菌、 酵母 菌 和霉菌 等微生 物中，以 及幼小 哺乳 动物的小肠中 哪 .由 于微 生物易培 养、 繁 殖快、 产酶多， 所以 微生物发酵法生产乳糖酶具有易控制、周期短、产量高、 造价低等优势， 便于工业化大规模生产。黑曲 霉、 米曲 霉和乳酸克鲁维酵母生 产的乳糖酶获得美国政府的准许， 作为生产食品酶制剂的菌种气 很 多 微 生 物 都 具 有 合 成 乳 糖 酶 的 能 力 间 。 能 合 成 乳 糖 酶 的 细 菌 有 : 大 肠 杆 菌、乳酸链球菌、产气肠细菌、嗜热链球菌、球菌、嗜热厌气细菌、嗜执脂肪 第1 章 引言 芽抱杆菌、嗜碱芽抱杆菌、巨大芽泡杆菌、环状芽抱杆菌、浸麻芽抱杆菌、保 加利亚乳酸杆菌、 瑞士乳杆菌等;酵母菌有:脆壁酵母、乳接合酵母、 乳酸酵 母、热带假丝酵母、产阮假丝酵母;霉菌有:黑曲霉、米曲霉、碳色曲霉、泡 盛酒曲 霉、 臭曲 霉、 微小 毛霉、 粗糙链抱霉、 球抱白 僵菌、 嗜热 厌氧菌、 黄青 霉， 壳 球抱属、 小菌核 属、 木霉属、 多色青霉等; 放线 菌有: 天兰链 霉菌、 链 霉菌。 很多学者研究了 微生物发酵法制备乳糖酶。 1 . 1 . 4 . 1细菌发酵制备乳糖酶 用大肠杆菌( 及动 e r ichiaco li)合成乳糖酶的研究较多。 lixiaoll等110用酵 母抽提物富集培养基培养大肠杆菌重组体生产乳糖酶，这种培养基可使菌体生 长量和产酶量提高。 在限 制酵母抽提物的条件下， 补充各种氨基酸、维生素、 矿物质、嗓吟、喀睫、胰蛋白 陈、酪蛋白，或明胶蛋白等，可刺激产生最高生 物量， 而个别菌在加入酵母抽提物的培养基中， 菌体生长量及产酶量没有增加。 在研究大肠杆菌atcc1 5 2 24 胞内 p 一 半乳糖昔酶生成的动力学时li1，以 分批补 料培养方法控制限制生长底物的补料速率。 获得一个限制生长底物浓度由i o ks 缓慢地渐降的可控培养过程。 研究结果反映出了大肠杆菌a t c c 1 5 2 24胞内参与 代谢的 p 一 半乳糖昔酶的 “ 可阻遏组成酶”的特征，胞外限制生长底物浓度的 增加导致底物在胞内代谢速率的改变，使菌体合成代谢速率增加，导致胞内代 谢库内 p 一 半乳糖昔酶合成物质浓度增加， 这种物质的 增加可能在酶合成水平 上阻 遏该酶的生成; 而当 环境中限 制生长底物浓度降低时，细胞将加速参与分 解代谢的 日 一 半乳糖昔酶的合成，以加强底物的利用，满足细胞生命活动的基 本需要。 几 r u n 1 b h o w m 让 等 tln 人 研 究了 戊 糖 片 球 菌护 e 成 口 。 ccus pe刀 to ， a c e 动和酸乳 片球菌沪 成 。 coccusacidii q c t i c i)，这两种球菌产生的乳糖酶为胞内酶。 尸 夕 己 n to a c e us产 乳糖 酶由 乳 搪、 蜜 二 糖、 乳 糖 酸 和 纤维 二 糖 所 诱 导， 而 不能由 葡萄糖、 蔗搪、 麦芽糖、 甘油、 纤维二糖、 果糖及甘露搪所诱导。 p. ac止 di la c t ici 可由乳搪、半乳糖、蜜二糖、乳糖酸所诱导产生乳糖酶，而葡萄糖、蔗搪、甘 油、 纤维二糖、果糖及甘露糖不能 诱导该菌合成乳糖酶、两种菌在有乳糖和半 乳糖存在时，在其生长期间向 培养基中加入葡萄糖，则会部分抑制其乳糖酶的 生物合成。 1 . 1 . 4 . 2酵母菌发酵制备乳糖酶 第 1 章 引言 乳酸克鲁维 酵 母( 刀叨 月 己 阳 恻 eslactis ) 是工 业生产乳 糖酶常 用菌。 瞬时 培 养 可提高 其产乳 糖酶 活 力 131 . 每个循环需要9 0 一 1 80分 钟， 运转14个循环 后， 输 入的培养基中乳糖浓度为 2 9 /l 或 4 9 /l，瞬时培养的产酶活力为 383 4 . 81u /m9 ，而稳态 连续培养的培养基中乳糖浓度为 3 9 /l， 产酶活力为 1 . 71 2 . zu加9 。 在含有2 % 乳糖的玉米培养基中培养乳酸克鲁维酵母淤- 1 1 ， 培养24 小时，产乳搪酶z o 0u加l 。 脆壁克鲁 维 酵 母( 刃 明 阳 袱 沙 “ 户 铭汀 括 ) 能 产生 较多乳糖酶， 且被 认为 是安 全菌株，因而， 该 菌被广泛用作乳糖酶的工业生产菌株。郭炎杰等洲人筛选出 产酶较高的脆壁酵母: 介: 、 艺 。 。 和y 。，其中， 介: 可在对数生长期的末期获得 最大产酶。葡萄糖对 乳糖酶的生物合成有明 显的阻 遏作用。 培养基中的乳搪， 既作为微生物生长代谢的碳源和能源， 同时又是酶的诱导物。 4 %的乳糖最有利 于乳搪酶的合成， 8 10%的乳糖虽对细胞生长没有明显影响， 但对提高产酶似 乎起着不良 作用。 对马克斯克 鲁 维酵母( 刃切 四 己 阳 梢 沙 esus ) 产乳糖酶的研究结 果表明， 该菌利用乳糖的能力很强，发酵过程中，酶产量与传氧速率( orr)有直接关系。 传氧速率低时，产酶与传氧系数 凡有关。在所试验的 凡范国内，酶总产量无 显著差别，因为菌体量减少的同时酶活性增强，凡越大，酶活性越低，菌体量 越 大 rlc 。 1 . 1 . 4 . 3霉菌发酵制备乳糖酶 b all cy等 ll 用 生 物 反 应 器 液 体 深 层 培 养 米曲 霉伽 胡 心 心 沂 公口 尽 加 ) 生 产 乳 糖酶， 筛选出n个菌株， 培养基以 乳搪和数皮为基础。 研究结果表明， 用鼓皮 培养基培养所有的 试验菌株，都可达到最高产酶活性. 用乳糖培养基， 在生物 反应器中 采用分批补料方式培养比 简单的分批培养产酶效果好，但比 用数皮培 养基产酶效果差. 有机氮源对米曲 霉产乳糖酶作用很大。 米曲 霉的产酶 所需培 养 时间比 黑曲 霉认 . n iger ) 的 产 酶 所需 培 养时 间 要长 ， 可向 培 养基中 加 入 表面 活 性剂，以缩短产酶所需培养时间。 对黑曲 霉cwl 8 8 2 71菌在四 种不同 碳源上生长情况进行的调查结果表明， 在果胶上生长最快( p = 9 . 63x l r h 一 今，在半乳搪上生长最慢( p二 3 . 86x l 了 丫 ) . 不同 碳源 对该 菌乳 糖酶诱导合成 影响 不同，果 胶的 诱 导 作 用 最强， 比 活力可达7 . s x l r单 位/ 干菌体重( mg) ， 比 对照高约10倍. 对果胶中 可能起诱导作用的物质的解析结果发现，半乳糖醛酸比半乳糖醛酸二聚体诱导 第 1 章 引言 作用更强。 在固 体或液体培养基上通气培养多色青霉k u 一 于1 32，可合成乳糖酶，培养 基从麦鼓、米糠、脱脂大豆、棉籽粉等天然物质为基础，相应地添加必须的碳 源 ( 淀粉、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖等) 、氮源( 碳酸按、硝酸钠、蛋白陈、麦 芽汁、酵母膏等) 及无机盐类( 磷酸盐、镁盐、钙盐等) 。在10一40( 最适20 3 5 ，c ) 、 p h z . 5 9 ( 最适ph3 . 5 7 . 5 ) 的条件下好气培养1 8 天( 一般为2 6 天) ， 乳糖酶活性达最高值，固体培养和液体培养产酶分别为:1 000u/ 9 麦数和 1 5 0 u / 毗。与曲 霉菌属、木霉菌属、小菌核菌属等菌株的产酶活性相比，属于强 活性菌， 其产酶活性为其它菌产酶活性的10一30倍。不仅如此，多色青霉所产 乳糖酶的稳定性也很高，其酶制剂不需任何稳定化处理，也能长时间储藏。 球饱白 僵菌伍 口 “ v 月 口 吞 出 的 加) 是一种丝状真菌， 在含有阿拉伯搪、 果糖、 半乳糖、果胶、葡萄糖、谷氨酸盐、乳糖、甘露搪、麦芽糖、蔗糖或木糖的培 养基上生长时，可合成和分泌乳糖酶。产酶受碳源的影响，在 0 . 1 %蔗糖培养 基上产酶最多，与在单纯葡萄糖的培养基上培养菌体产酶相比 较，在葡萄搪和 含n 化合物的混合培养基上培养菌体产酶将减少3 倍。酶的 合成从菌丝生长开 始，一直延续到生长后期。 在富含乳糖的培养基上培养嗜热厌氧菌(tdt 无 口 加左 邸 ) ， 可产生胞外耐热乳 糖酶，产酶适宜温度69，适宜ph s . 0 ，底物为洲民( 邻硝基苯一 p se 卜毗喃半 乳糖昔) . 当 乳糖浓度大于2 0 9 /l时， 酶产率会降低。 在渗透压较大的 干酪乳清 上培养， 酶的 生 成远滞后于 菌体 生长。 与中 温菌相比 ， 酶产率 较 低tln. 出 芽 短 梗霉妞 ure口 西 “ ” 动“ 功 p 赵 i l u la ns ) 合成乳糖酶的 适宜条 件是: 45， ph 6 . 8 。 乳搪能诱导合成较多的乳糖酶， 其它搪只能诱导合成少量乳糖酶。 培养基 中 加入mn卜 和c a ， 可提高 产酶量 和活力。 所产乳糖酶 在ph5-10 、 b d ， 最佳组合为a 尹 二 c j 氏 ， 即乳糖8 %， 葡萄糖0 . 5 %， 酵母膏0 . 7 %，蛋白陈1 . 4 %。 用最佳 组合培养基成 分作为发酵培养基相同条件培养k 白 c t isl sh，能 够得 到 最高产酶 量1 . 9 70 0n邢 u / 毗，比 正交试验中的8 号产酶量高出32. 39%。 3 . 2 ， 1 . 2发酵培养基氮源 试验 用不同 浓度尿素代替 蛋白 陈的氮源试验，试验结果见图3 . 1 。 1.41.210.50.60.40.2 八曰日污020只鹅谧 0 一- - - - - - - - - - 一 - - - - - - - - - - - - - - - - . 0 一050 10 一 1 50 ，2 尿素浓度 ( %) 0 .乃0 . 303 5 图3 . 1尿素含量对产酶的影响 从图 3 . 1 可以 看出 ， 用 0 . 巧%( w / v ) 的 尿素代替蛋白 陈产酶量可以 达到1 . 2 14 o n p gu / m l ， 虽然比 1 . 4 %的 蛋白 陈对照样产酶量 (l. 4 8 40n此 u / 吐) 低， 但考 虑到成本因 素， 可以 用 0 . 15% 的尿素来代替蛋白 膝作为 氮源。 3 . 2 . 1 . 3金属离子对发 酵产酶的影响 在上述试验的基础 上， 发酵培 养基中 分别添加以 下不同 浓度的无机盐 n aci 、 khz p o. 、 m g s 0 、 c acl : 、 m n c i : 、z n s o. 、f e s o. 、 c u s o.( 分别含金属离子附 ， k+ ， m 了， c 犷， 施卜 ， 2 了 ， fe ， 及cu卜 ) ，以 不添加无机盐的培养基为对照， 28 培养 1 8 h 后测定其产酶量，结果见表3 . 4. 第3 章乳 酸克 鲁维酵母菌株 培养产酶发酵条件的 研究 表3 . 4金属离子对产酶的影响 金属离子浓度 ( w 加%)酶活力(on 甲 gu 加工 ) 空白00 . 7 5 4 n a+0 0 10 .2 1 2 k+0 0 10 .7 7 9 11 .0() 5 1 . 51 6 90 m 扩 于0 . 0 11 5 73 0 . 12 .8 99 c az+0 . 0 12 .3 40 0.12.9 64 m n z 十0 . 0 11 .3 3 9 0 . 10 .41 6 z n 2+0 .0 10 .5 8 3 f e 卜0 .0 10 . 2 (x) c uz+0 0 10 . 0()l 由表 3 . 4 可知， 碱金属 k+ 和 碱土金 属m 了、 caz 十 及少量的 枷卜 对发酵产酶有促进 作用;而重金属离子c u 卜 对产酶有强烈的抑制作用。由于c a 卜 在培养基中易形成 沉淀，影响到细胞的收集和酶活的测定，故优化发酵培养基中未加入c az+。 3 . 2 . 1 . 4培养基起始p h 值对发酵产酶的 影响 用1 !no1/ l 的 hcl 和na川溶液调 节培养基的 起始ph值， 发酵培养1 8h后测其产 酶量，结果见图3 . 2 。 0.50.7“0.5以0.30.20.10 口日、口odno只鹅谧 7 一 27 一 4 6.8ph 图3 . 2起始ph值对