（环境科学专业论文）锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究.pdf

中文摘要中文摘要 i 中文摘要中文摘要 白腐真菌对多种污染物具有广谱的降解作用，包括多环芳烃、氯酚、染料和 杀虫剂等。固态发酵相比传统的液态发酵产量更高、操作更简单、成本更低。本 实验选择稻壳作为基质进行固态发酵， 利用本实验室保存的白腐真菌裂褶菌 f17（schizophyllum sp. f17）产锰过氧化物酶（mnp） ，研究 mnp 酶促脱色染料 的条件，并利用固态发酵反应器建立连续的脱色体系，实验结果如下： 1、采用稻壳作为基质，利用裂褶菌 f17 固态发酵产锰过氧化物酶（mnp） 。 通过正交实验对发酵条件进行优化，并对 5 种不同结构类型的染料进行脱色。结 果显示，含水率、温度、mn2+、cu2+对裂褶菌 f17 产 mnp 有显著的影响；mnp 发酵的最优化条件为稻壳 27 g，黄豆粉 3 g，mnso4 0.4 mg/g，含水率 150%，接 种量 50%，培养温度 22，ph 自然，优化后酶活达到 16.39 u/g，比优化前的酶 活 9.20 u/g 提高了 78.2%。 优化后的发酵体系对染料刚果红、 茜素红、 poly r-478、 中性红和结晶紫的 24h 脱色率分别达到 92.6%、90.3%、93.1%、87.3%和 95.6%。 2、mnp 的酶促脱色过程是一个复杂的体系，体系中的 h2o2、mn2+、染料 和酶的浓度极大地影响脱色效率。通过响应面分析法（rsm）研究这四个因素影 响 mnp 对刚果红脱色的组合效应和交互作用；同时，利用传统的单因子分析法 研究这四个因素的单因子影响。通过单因子分析法，h2o2、mn2+、刚果红和 mnp 粗酶液的最优化值分别为 0.2 mm、0.5 mm、50 mg/l 和 0.8 ml，而在这个条件下 获得的最佳脱色率为 24.2%。响应面分析通过 box-behnken 设计进行，建立了一 个二次多项方程（r2 = 0.8565）用于定量描述四个因素的组合效应和交互作用。 方差分析 （anova） 表明 h2o2 和 mnp、 染料和 mnp 之间的交互作用是显著的； 通过响应面分析获得的最优化条件为 0.35 mm h2o2、 0.5 mm mn2+、 75 mg/l 刚果 红和 1.4 ml mnp 粗酶液，最大脱色率为 30.8%。 3、在固态发酵条件下，利用填充床式反应器建立了一个高效的、相对简单 的连续脱色染料刚果红的体系稻壳裂褶菌 f17。在这个体系中，存在两个脱色 机制，一个是裂褶菌 f17 对染料的脱色作用，另一个是稻壳对染料的吸附作用。 染料浓度和水力停留时间（hrt）对连续脱色影响很大，利用响应面分析法对这 两个因素进行定量分析和最优化。利用 22的全因子中心复合设计（ccd） ，实验 安徽大学硕士学位论文安徽大学硕士学位论文李旭东李旭东锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究 ii 建立三个二次回归方程，分别对应于总脱色率（r2 = 0.902） 、裂褶菌 f17 对染料 的脱色率（r2 = 0.866）和稻壳对染料的吸附率（r2 = 0.890） 。响应等高线图直观 地显示了染料浓度和 hrt 对脱色率的单独影响和累积作用， 以及最大的脱色率。 最大的总脱色率为 89.71%，最大的裂褶菌 f17 对染料的脱色率为 60.44%，而获 得这些脱色率的最佳条件分别为染料浓度 142.63 mg/l、hrt 41 h 和染料浓度 110.7 mg/l、hrt 29.4 h。本实验证明了利用白腐真菌在固态发酵反应器中连续脱 色合成染料的可行性。 关键词：关键词：裂褶菌 f17；锰过氧化物酶（mnp） ；稻壳；固态发酵；脱色；刚果 红；响应面分析；填充床式反应器 英英文摘要文摘要 iii abstract white-rot fungi possess the ability to degrade a wide variety of pollutants, including polycyclic aromatic hydrocarbon, chlorinated phenols, synthetic dyes and pesticides. solid-state fermentation has many advantages over conventional liquid culture, such as higher productivity, simpler operation and lower cost. this study carried out solid-state fermentation selecting rice hull as the medium, and utilized a local white-rot fungus-schizophyllum sp. f17 to produce manganese peroxidase (mnp); then the decolorization mechanism was investigated, and a continuous decolorization system was developed in bioreactor under solid-state fermentation. 1. schizophyllum sp. f17 can use rice hulls to produce mnp by solid-state fermentation. some parameters were optimized through orthogonal tests and five dyes with different structure were decolorized by applying mnp. the results showed that moisture ratio, temperature, mn2+ and cu2+ all significantly influenced mnp production. the optimal conditions were respectively rice hull 27 g, bean powder 3 g, mnso4 0.4 mg/g, moisture ratio150%, inoculation amount 50%, culture temperature 22oc and ph nature. under these conditions, the mnp activity was increased by 78.2% from 9.20 u/g to 16.39 u/g and after 24 h of fermentation, the decolorization rates of congo red, alizarin red, poly r-478, neutral red and crystal violet reached 92.6%, 90.3%, 93.1%, 87.3% and 95.6%, respectively. 2. the enzymatic decolorization process of manganese peroxidase (mnp) is a complex system, which is greatly affected by the concentrations of h2o2, mn2+, dye and enzyme. through response surface methodology (rsm), the effects of these four factors on decolorization of congo red by mnp of schizophyllum sp. f17 were studied, and the combined interactions between the factors were investigated, meanwhile conventional one-factor-at-a-time analysis was carried out. through the one-factor-at-a-time analysis the optimized h2o2, mn2+, congo red and mnp extract was 0.2 mm, 0.5 mm, 50 mg/l and 0.8 ml, respectively, and the maximum decolorization attained under such conditions was 24.2%. response surface analysis was conducted through box-behnken design and a second order polynomial model 安徽大学硕士学位论文安徽大学硕士学位论文李旭东李旭东锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究 iv (r2 = 0.8565) was generated to describe the combined effect and the interactions quantificationally. anova analysis indicated that the interactions between h2o2 and mnp, between dye and mnp were significant; the optimum condition through rsm was found to be 0.35 mm h2o2, 0.5 mm mn2+, 75 mg/l congo red and 1.4 ml mnp extract, for maximum decolorization of 30.8%. 3. this work developed an efficient and relatively simple continuous decolorization system rice hull-schizophyllum sp. f17 under solid-state condition in a packed-bed bioreactor, for decolorizing congo red. in the decolorization system, two decolorization mechanisms exist, one is decolorization by schizophyllum sp. f17, the other is biosorption by rice hull. the decolorization was greatly affected by dye concentration and hydraulic retention time (hrt), which were quantificationally analyzed and optimized through response surface methodology (rsm). a 22 full factorial central composite design (ccd) was performed, and three second order polynomial models were generated to describe the effects of dye concentration and hrt on total decolorization (r2 = 0.902), decolorization by schizophyllum sp. f17 (r2 = 0.866) and biosorption by rice hull (r2 = 0.890). response surface contour plots were constructed to show the individual and cumulative effects of dye concentration and hrt, and the optimum values. a maximum total decolorization 89.71% and maximum decolorization by schizophyllum sp. f17 60.44% was achieved at dye concentration 142.63 mg/l, hrt 41 h, and dye concentration 110.7 mg/ll, hrt 29.4 h, respectively. meanwhile, the role of manganese peroxidase (mnp) in the decolorizaion process was investigated. this study proved the feasibility of continuous mode for decolorizing synthetic dyes by white-rot fungi in solid-state fermentation bioreactors. keywords: schizophyllum sp. f17; manganese peroxidase; rice hull; decolorization; congo red; response surface methodology; packed-bed bioreactor 目录目录 i 目录目录 第一章第一章 锰过氧化物酶固态发酵应用于染料脱色的研究概况锰过氧化物酶固态发酵应用于染料脱色的研究概况 . 1 1.1 mnp 在染料脱色中的应用在染料脱色中的应用 . 1 1.2 白腐真菌及白腐真菌及 mnp 的固态发酵研的固态发酵研究究 . 4 1.3 白腐真菌和白腐真菌和 mnp 固态发酵对染料脱色的研究固态发酵对染料脱色的研究 . 8 第二章第二章 锰过氧化物酶固态发酵条件的优化及其对染料脱色能力的研究锰过氧化物酶固态发酵条件的优化及其对染料脱色能力的研究 . 11 2.1 前言前言 . 11 2.2 材料与方法材料与方法 . 11 2.2.1 菌种 . 11 2.2.2 培养基 . 11 2.2.3 固态发酵 . 12 2.2.4 粗酶液制备 . 12 2.2.5 培养物干重测定 . 12 2.2.6 酶活测定 . 12 2.2.7 固态发酵条件的优化 . 12 2.2.8 固态发酵对染料的脱色作用 . 14 2.2.9 数据处理 . 14 2.3 2.3 结果结果. 14 2.3.1 含水率对裂褶菌 f17 产 mnp 的影响 . 14 2.3.2 培养条件和活性添加成分对裂褶菌 f17 产 mnp 的影响 . 15 2.3.3 金属离子对裂褶菌 f17 产 mnp 的影响 . 16 2.3.4 固态发酵对染料的脱色作用 . 18 2.4 讨论讨论 . 19 2.4.1 因素分析 . 19 2.4.2 发酵条件 . 19 2.4.3 固态发酵对染料的脱色 . 20 2.4.4 实际应用前景 . 20 2.5 结论结论 . 20 第三章第三章 利用响应面设计分析锰过氧化物酶催化脱色刚果红的研究利用响应面设计分析锰过氧化物酶催化脱色刚果红的研究 . 21 3.1 前言前言 . 21 3.2 材料和方法材料和方法 . 22 3.2.1 培养条件 . 22 3.2.2 粗酶液的制备 . 22 3.2.3 酶活的测定 . 22 3.2.4 单因子法分析 . 22 3.2.5 响应面分析 . 23 3.3 结果和讨论结果和讨论 . 25 3.3.1 单因子法分析 . 25 3.3.2 响应面分析 . 27 3.4 结论结论 . 31 第四章第四章 利用固态发酵反应器对刚果红进行连续脱色利用固态发酵反应器对刚果红进行连续脱色 . 32 4.1 前言前言 . 32 安徽大学硕士学位论文安徽大学硕士学位论文李旭东李旭东锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究 ii 4.2 方法方法 . 33 4.2.1 填充床式反应器的设计 . 33 4.2.2 在填充床式反应器中进行固态发酵 . 33 4.2.3 酶活的测定 . 34 4.2.4 连续脱色实验 . 34 4.2.5 染料浓度和 hrt 对脱色影响的响应面分析 . 35 4.2.6 脱色过程中脱色率、mnp 酶活和 ph 的变化 . 37 4.3 结果结果 . 37 4.4 讨论讨论 . 42 第五章第五章 创新点与展望创新点与展望 . 45 5.1 特色与创新点特色与创新点 . 45 5.2 展望展望 . 45 参考文献参考文献 . 46 致致 谢谢 . 57 攻读学位期间发表的学术论文目录攻读学位期间发表的学术论文目录 . 58 第一章第一章 锰过氧化物酶锰过氧化物酶固态发酵应用于染料脱色的研究概况固态发酵应用于染料脱色的研究概况 1 第一章第一章 锰过氧化物酶固态发酵锰过氧化物酶固态发酵应用于应用于染料脱色的染料脱色的研究概况研究概况 白腐真菌能将木质素彻底矿化为 co2和水， 这个能力将白腐真菌与其它大多 数微生物区别开1。白腐真菌的木质素降解能力主要是由于它能分泌多种胞外木 质素酶，包括木质素过氧化物酶（lip） 、锰过氧化物酶（mnp） 、不依赖锰的过 氧化物酶（mip）和漆酶（lac）等2；这些酶具有底物非专一性，这种特性使白 腐真菌不仅能降解木质素，而且能降解多种异生物质，包括多环芳烃、氯酚、染 料和杀虫剂等3, 4。这种能力为建立针对降解异生化合物的生物技术方法打开了 新的前景，而且在科研上引起了越来越多的对利用白腐真菌的关注5。 锰过氧化物酶（mnp）被认为是降解木质素的关键酶6，并且许多研究表明 mnp 能氧化多种底物，包括酚类化合物、高分子量氯化木素、尼龙和染料等， 因而 mnp 在诸如制桨和造纸等工业和污染物降解上有很大的应用潜力7。 1.1 mnp 在染料脱色中的应用在染料脱色中的应用 在工业废水中，对纺织和印染废水的处理是最大的挑战之一8。染料是一种 人工合成的大分子芳香烃化合物，所有的芳香族化合物都可吸收电磁能量，但只 有吸收的光波在 350700 nm 处才可以显示颜色9。近年来，全球每年生产的染 料大约有 1105种，产量为 7105 吨，其中 80%是偶氮染料10。中国是染料生 产大国，其每年生产的染料达 1.5105 吨11。估计有 1015 %的染料在生产和 使用过程中被释放到环境中，造成了严重的环境污染问题12-14。 许多用于纺织工业的染料都被设计成具有在水环境、光照和许多化学物质条 件下稳定而不褪色的特性，包括能抵抗多种氧化剂和微生物的进攻。大量的染料 进入水域后造成水体的色度升高， 由于染料对太阳光的吸收， 影响入射光线的量， 导致水体透光率降低，抑制水体中光合作用的自然过程，并进而影响到各级消费 者的生长， 使整个水生生态系统的多样性下降15； 而且许多染料被确认具有致癌 毒性，或者由致癌的物质如苯或其它芳香化合物制备而成，在微生物的代谢作用 下，染料会重新分解成为苯或芳香化合物16。因此，染料废水在排入环境之前， 必须进行处理， 而且， 与许多其他有机工业废水相比， 染料废水的处理难度更大、 安徽大学硕士学位论文安徽大学硕士学位论文李旭东李旭东锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究 2 技术更复杂、工艺流程更长。 常规的染料废水的处理工艺大多数建立在物理或和化学方法的基础上，包 括吸附、浓缩、化学转化和焚化等，但这些处理方法存在不少缺点，如成本高、 效率低、 有可能产生高毒性的副产物和不能应用于多种染料的脱色等17, 18。 因此， 生物降解法受到了很大的关注， 微生物脱色的方法也被认为是低成本和较少引起 环境干扰的方法。 到目前为止，最能有效破坏合成染料的微生物就是白腐真菌，许多研究都证 实了白腐真菌和它们分泌的木质素酶能降解多种结构类型的染料（表1-1）19。 锰过氧化物酶（mnp）是白腐真菌木质素酶系中比较突出的一种酶，在染料降解 和脱色过程中起着重要作用，从表1-1可以看到，几乎所有能降解染料的白腐真 菌菌种都分泌mnp； 且boer20实验表明， 在以mnp为主要木质素酶的脱色体系中， lentinula edodes对染料刚果红、rbbr、poly r-478、台盼蓝、乙基紫和甲基绿的 脱色率达到92.0%98.0%；kariminiaae-hamedaani16研究报道，白腐真菌菌株 l-25及其mnp对多种偶氮、蒽醌类染料的脱色率达到84.9%99.6%；harazono 21 实验证实，在phanerochaete sordida对活性艳蓝、活性艳橙、活性艳红、活性深 绿4种染料混合液的脱色中，mnp起主要作用，脱色率达到90.0%。 表 1-1 可降解染料的白腐真菌及其木质素降解酶系 table 1-1 white-rot fungi, able to decolorize synthetic (textile) dyes and its lignin-modifying enzymes 菌种 降解酶系 a 染料 b bjerkandera adusta bjerkandera sp. ceriporia metamorphosa daedalea flavida daedaleopsis confragosa dichomitus squalens geotrichum |lip|mnp |mnp nd lac|mnp reactive orange 96n = n, reactive violet 5n=n, reactive black 5n =n, reactive blue 15pc, reactive blue 38pc; remazol brilliant blue rpaq, poly r-478paq; reactive violet 5 n = n, reactive black 5 n = n, reactive blue 38pc by mnp. orange iin =n, reactive blue 38pc, poly r-478paq. remazol brilliant blue r paq, poly r-478 paq . brilliant greentpm, cresol redtpm, congo redn =n. remazol brilliant blue r paq, poly r-478 paq. brilliant greentpm, cresol redtpm, crystal violettpm, congo redn =n, orange iin =n. reactive blue 5 paq. 第一章第一章 锰过氧化物酶锰过氧化物酶固态发酵应用于染料脱色的研究概况固态发酵应用于染料脱色的研究概况 3 candidum irpex lacteus lentinus tigrinus mycoacia nothofagi phanerochaete chrysosporium phanerochaete sordida phellinus gilvus phellinus pseudopunctatus phlebia brevispora phlebia (merulius) tremellosa phlebia fascicularia phlebia floridensis phlebia radiate piptoporus betulinus lac|lip|mnp lac|mnp |lip|mnp (lac)|lip|mnp lac|mnp |mnp lac|lip|mnp lac|mnp methyl redn =n, congo redn =n, naphtol blue blackn =n, remazol brilliant blue r paq, bromophenol bluetpm, copper (ii) phthalocyanine tetrasulfonic acid tetrasodium saltmc, poly r-478 paq. orange iin =n, reactive blue 38pc, poly r-478 paq. remazol brilliant blue r paq, poly r-478 paq. remazol turquoise bluepc; azo dyes, azure blue, cresol redtpm, crystal violettpm, bromophenol bluetpm ;acid green 27paq, copper phtalocyanine tetrasulphonic acid tetrasodium saltmc, indigo carmine, neutral redhc, acid red 106n = n, mordant yellow 10n =n,brilliant yellown = n, chrysopheninen =n, chlorazol yellown = n, cibacron brilliant yellow 3g-p (reactive yellow 2)n = n;hc, cibacron brilliant red 3ba (reactive red 4)n = n;hc, orange iin =n, crystal violettpm, brilliant greentpm;remazol brilliant blue rpaq ;indigo. amaranthn =n, new coccinen =n, orange gn =n, tartrazinen =n; reactofix orangen =n, reactofix golden yellown =n,reactofix blue he2rn =n, navilene blackn =n, sulphur greenn =n, sulphur redn =n, navione bluen =n, vat brownn =n ; red 2bab; congo redn =n ; reactive orange 96n =n, reactive violet 5n =n,reactive black 5n =n, reactive blue 15pc, reactive blue 38pc; everzol turquoise blue gpc, everzol yellow 4gl, everzol red raq, orange k-gl, everdirect supra yellow pc; orange iin =n, reactive blue 38pc, poly r-478paq. orange iin =n, reactive blue 38pc, poly r-478paq. indigo. remazol brilliant blue rpaq, poly r-478 paq. brilliant greentpm, cresol redtpm, crystal violettpm. cibacron red, remazol navy blue, remazol red, cibacron orange, remazol golden yellow, remazol blue, remazol turquoise blue, remazol black b,mixture. brilliant greentpm, cresol redtpm, crystal violettpm, congo redn =n, orange iin =n. brilliant greentpm, cresol redtpm, crystal violettpm, congo redn =n, orange iin =n. orange iin =n, reactive blue 38pc, poly r-478paq; crystal violettpm, congo redn =n, orange iin =n. acid green 27paq, copper phtalocyanine tetrasulphonic acid tetrasodium saltmc, indigo carmine, acid red 106n =n, brilliant yellown =n, chrysopheninen =n, chlorazol yellown = n, cibacron brilliant yellow 3g-p (reactive yellow 2)n = n;hc, cibacron brilliant red 3b a (reactive red 4)n = n;hc, orange iin =n, crystal 安徽大学硕士学位论文安徽大学硕士学位论文李旭东李旭东锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究锰过氧化物酶的固态发酵及其对染料脱色作用的研究 4 pleurotus eryngii pleurotus ostreatus pleurotus sajor-caju polyporus ciliatus polyporus sanguineus pycnoporus sanguineus stereum h