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鸡蛋清中三种蛋白质的连续化提取研究 摘要 研究鸡蛋清中三种主要蛋白质( 卵白蛋白、溶菌酶和卵铁传递蛋白) 连续化提取的新方法。建立了包括水稀释微滤、超滤、盐析以及离子交 换为主要分离步骤的技术路线，实现了鸡蛋清的综合利用。 鸡蛋清预处理工艺的优化。对影响微滤液中蛋白质含量及平均微滤速 度的五个因素：稀释倍数、p h 、n a c l 浓度、静置时间和硅藻土添加量进 行考察。最后确定最佳工艺条件为：鸡蛋清l o 倍水稀释、p h9 0 、n a c l 浓度为0 0 7 5 m o l l ，充分低速搅拌，4 c 下静置至少6 h ，添加硅藻土 5 9 1 0 0 m l ，微滤选用0 4 5 p r o 、。西5 0 m m 的混合纤维素酯微孔滤膜。经此操 作可显著降低鸡蛋清的粘度，加快微孔过滤速度，微滤平均速度为 2 m l m i n 。微滤液的澄清度较好，其中蛋白质含量为8 9 7 m g m l ，蛋白质回 收率为8 0 6 。 鸡蛋清微滤液的浓缩采用超滤法，卵白蛋白的初步分离采用盐析法。 选择截流分子量5k d 的超滤膜、单段间歇式超滤，对微滤液浓缩3 倍后， 其中蛋白质含量为2 1 8 6 m g m l ；再用不同饱和度的小i i 4 ) 2 s 0 4 进行盐析， 初步分离卵白蛋白，最后确定( n h 4 h s 0 4 饱和度为6 0 。卵白蛋白回收率 为7 9 8 ，电泳结果显示卵白蛋白为主要条带。 卵铁传递蛋白和溶菌酶的分离选用了两种阴离子树脂进行离子交换 色谱试验。( 1 ) d e a e s e p i a a r o s ef f _ 离子交换柱，以0 0 1m o l l 、p h 值为 8 0 的t r i s h c l 缓冲液平衡、上样、流洗得到溶菌酶，然后，用含0 0 4m o l l n a c i 的上述缓冲液洗去部分杂蛋白，再用含n a c l0 0 6 m o l l 的缓冲液洗 脱，得到了卵铁传递蛋白；经s d s p a g e 电泳检测，蛋白质的纯度较高； 活性检测，溶菌酶活力为：1 0 0 0u m g p r ，卵铁传递蛋白对大肠杆菌抑菌 率为：2 7 3 ；( 2 ) q s e p h a r o s ef f 离子交换柱，以o 0 1m o l l 、p h 值为 8 5 的 i r i s h c l 缓冲液平衡、上样、流洗得到溶菌酶，之后，先用含0 0 8 m o l ln a c l 的上述缓冲液洗去部分杂蛋白，再用含n a c l0 1 0m o l l 的缓 冲液洗脱，得到了卵铁传递蛋白；经s d s p a g e 电泳检测，蛋白质的纯 度较高；活性检测，溶菌酶活力为：1 0 7 7u m g p r ，卵铁传递蛋白对大肠 杆菌抑茵率为：3 1 8 。上述试验结果显示：选用d e a e s e p h a r o s e ：f f 及 q s e p h a r o s ef f 阴离子交换树脂均可实现对溶菌酶及卵铁传递蛋白的分 离提取。但q s e p h a r o s ef f 离子交换树脂在蛋白质回收率、蛋白质活性等 方面均优于d e a e s e p h a r o s ef f 离子交换树脂。 通过比较优化了以水稀释微滤、超滤、盐析以及离子交换为主要分 离步骤的工艺流程，实现了鸡蛋清中三种主要蛋白质的连续化提取，整个 分离过程没有使用有机溶剂，其它化学试剂使用很少，、方法简单、成本低。 同时建立了一套快速、简便的检测手段，即测定蛋白质含量的b r a d f o r d 法、判断蛋白质纯度的s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳法以及检测溶菌酶和卵 铁传递蛋白活性的舒加法、大肠杆菌抑菌试验，作为工艺监控指标。试验 所得的三种蛋白质均具有生物活性，特别是具有抗菌及免疫功能的卵铁传 递蛋白已成为近几年研究的热点，故该研究对开辟新的蛋白质资源具有重 要意义。 关键词：连续化提取，卵白蛋白，溶菌酶，卵铁传递蛋 r e s e a r c ho nc o n t i n u o u si s o l a t i o no f t h r e e l 蝌p r o t e l n sf r o me g bw h i t e an o v e lm e t h o dw a sd e v e l o p e dt h r o u g ht h er e s e a r c hd e s c r i b e di nt h i s t h e s i s f o rc o n t i n u o u si s o l a t i o no ft h r e em a i np r o t e i n sf r o me g gw h i t e c o n s i s t i l a go ft h em a j o rp r o c e d u r e sm e t l l o d so fw a t e rd i l u t i o n - m i c r o f i l t r a t i o n ， u l t r a f i l t r a t i o n ，s a l t i n g - o u ta n d a n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y n l eo p t i m a lp r o c e s s i n gc o n d i t i o nw a sa sf o l l o w e g gw h i t ew a sd i l u t e d 1 0t i m e sw i t hd i s t i l i e dw a t e r , a d j u s t e dt o p h 9 0 ，n a c l c o n c e n t r a t i o n 0 0 7 5 m o i l d e p o s i t e df o ra tl e a s t6h o u r sa t4 a n dt h e nf i l t e r e dt h r o u g h c e l l u l o s ea c e t a t em e m b r a n ea d d i n g5 v o ( p d l 0 0 m 1 ) d i a t o m a c e o u se a r t h t h e v i s c o s i t yo fe g gw h i t ew a sm a r k e d l yl o w e r e d 髓er e s u l t ss h o w e d f i l t r a t ew i t h p r o t e i nc o n t e n to f8 9 7 m g m la n dp r o t e i nr e c o v e r yo f8 0 6 w a sp e l l u c i d n l e m i c r o f i l t r a t i n gv e l o c i t ya v e r a g e da t2 m l m i n u i t r a f i l t r a t i o na n ds a l t i n g - o u tw a su s e ds e p a r a t e l yt oc o n c e n t r a t ef i l t r a t e a n di s o l a t eo v a l b u m i n f i l t r a t ew a sc o n c e n t r a t e d3t i m e sb yu s i n gam i l l p o r e s y s t e mw i t h5 k dm o l e c u l a rw e i g h tc u ：c - o f f ( m w c o ) m e m b r a n e s ot h e p r o t e i nc o n t e n tw a su pt o2 1 8 6 m g m 1 a f t e rt h e6 0 s a t u r a t e da m m o n i u m s u l f a t e ( 4 5 s a s ) p r e c i p i t a t i o n ，o v a l b u m i no f p r o t e i nr e c o v e r yo f 8 0 6 w a s o b t a i n e d i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw a su s e d t oi s o l a t e l y s o z y m e a n d o v o t r a n s f e r r i n t h ec o l u m no fd e a e s e p h a r o s ef f w a se q u i l i b r a t e dw i t h o 0 1m o l l ，p n8 0t r i s h c lb u 缳玎( t i m ) ，t ow h i c ht h ef i l t r a t ew a sl o a d e do n a f t e rw a s h i n gt h ec o l u m nw i t ht h ea b o v et h b 1 y s o z y m ew a so b t a i n e d t h e i m p u r i t yw a se l u t e dw i t ha b o v et h bc o n t a i n i n g0 0 4m o i ln a c l a n d o v o t r a n s f e r r i nw i t h0 0 6 m o i ln a c l l y s o z y m ea n do v o t r a n s f e r r i no b t a i n e d b yi o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yo fd e a e s e p h a r o s ef fw e r ep u r ec h e c k e d b ys d s p a g ea n a l y s i s t h ea c t i v i t y o f l y s o z y m e w a s1 0 0 0u m g p r a n t i b a c t e r i a l p r o b a b i l i t y o fo v o t r a n s f e r r i nw a s 2 7 3 i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h yo fq - s e p h a r o s e f ec a n l et ot h es a m ec o n c l u s i o n t h e d i f f e r e n c e sa r et h a tt h ec o l u m nw s se q u i l i b r a t e d 、v i 廿lo 0 1m o i l p h8 5 t r i s h c ib u f f e r ( t h b ) a n dt h ei m p u r i t ya n do v o t r a n s f e r r i nw a se l u t e dw i m v h8 5t h bc o n t a i n i n g0 0 8m o l ln a c la n d0 1 0m o l ln a c lr e s p e c t i v e l y t h ea c t i v i t yo fl y s o z y m ea n da n t i b a c t e r i a lp r o b a b i l i 够o fo v o t r a n s f e r r i n ，w h i c h w e r e10 7 7u m g p ra n d31 8 w e r eh i g h e r k e yw o r d s ：c o n t i n u o u si s o l a t i o n , o v a l b u m i n ，l y s o z y m e ，o v o t r a n s f e r r i n 鸡蛋清中三种蛋白质的连续化提取研究 1 文献综述 鸡蛋作为方便、营养价值较高的食品，曾被营养学家誉为人体营养的宝库，在人们 的膳食结构中占较大的比例。它不仅为人类提供了丰富的营养，而且还有很高的食疗价 值，通过鸡蛋的食疗作用，还可预防和治疗各种疾病，实现强身健体、延年益寿的保健 功能。 作为一种生命的完整体现，鸡蛋中含有发育成一个新生命所必需的所有元素，其中 某些特殊生理活性物质的组成及生理功能远远超出了目前的研究。然而到目前为止，对 鸡蛋的研究和利用基本上以蛋的初加工为主，包括生产各类冰蛋及干蛋粉制品等一次性 加工产品和松花蛋、蛋黄酱、醋蛋及鸡蛋豆腐等二次加工产品，蛋资源始终没有得到充 分的开发和利用i l 】。 随着对鸡蛋生理生化活性研究的不断深入，对鸡蛋的利用逐渐超越简单的初加工阶 段，趋向于开发具有较高附加值生理活性物质的鸡蛋【2 、， 。在1 9 9 8 年4 月举办的第二届 国际蛋品营养和禽蛋新技术专题研讨会上，很多研究者提出增加鸡蛋中溶菌酶、抗生物 素蛋白、卵黄高磷蛋白及其它有利于人体健康的化学成分 4 qz 。日本已从蛋黄中进行商 业化分离提取s i a l i ca c i d e ( 唾液酸) 和s i a l o l i g o s a c c h a r i d e s ( 唾液酸低聚猪弘 ( j u n e j a , 1 9 9 8 ) ，后者是人奶的重要组分，是抗病原菌、病毒和毒素的第一道防线舂在 体内和体外都能抑制轮状病毒( 感染婴儿胃肠道的主要病毒) 。也有很多研究者把鹅蛋 作为特殊营养成分或特殊化学成分和药物成分的载体，按照这种思路，生产的鸡蛋称设 计蛋( d e s i g n e re g g s ) 。比如一些富含微量元素、维生素、d h a 、心3 脂肪酸m l 、亚麻酸 等的功能性鸡蛋。目前英国罗斯林研究院( 曾经创造了世晃上第一只克隆羊“多利”) 正 同美国“维拉根”生物技术公司合作设计一种含有抗皮肤癌成分的功能蛋1 1 3 。此外，更具 有诱人前景的是对鸡蛋清的生理生化研究表明0 4 - t 。i ，其中含有许多附加价值较高的生理 生化活性蛋白质，主要有：卵白蛋i 刍( o v a l b u m i n ) 、卵铁传递蛋f l ( o v o t r a n s f e r r i n ) 、卵类 黏蛋白( o v o m u c o i d ) m “”、溶菌酶( l y s o z y m e ) 、抗生物素蛋i 刍( a v i d i n ) ( m 2 6 等，而具有生理 生化活性的蛋白质在维持人类健康方面具有重要作用，可被广泛应用于医疗、食品、生 物工程等领域，但对其质量和纯度都有较高的要求。因此，对这些生物活性蛋白质的充 分开发和利用是使鸡蛋发挥其最大价值的途径。 总之，如何充分利用鸡蛋资源，开发其新的生理功能物质，无论对禽蛋行业或是对 生命科学本身的发展，都具有非常重大的意义。 1 1 鸡蛋的组成概述 鸡蛋由蛋黄、蛋清、蛋壳三大部分组成，其中水分约为7 0 4 、蛋白质1 2 8 、脂 i 陕西科技大学硕士学位论文 肪1 1 5 、碳水化合物0 6 7 、灰分1 0 。 1 1 1 蛋清的结构 蛋清是一种典型的胶体物质，约占蛋总重的6 0 。其颜色呈微黄色。蛋清由内向外 分为四层。其结构是：第一层外层稀薄蛋白，贴附在蛋白膜上，占蛋白总体积的2 3 2 ； 第二层中层浓厚蛋白，占蛋白总体积的5 7 3 ；第三层内层稀薄蛋白，占蛋白总体积的 1 6 8 ；第四层系带膜状层，占蛋白总体积的2 7 。可见，蛋白按其形态分为两种，即 稀薄蛋白与浓厚蛋白。 蛋白中含量最多的浓厚蛋白与蛋的质量、贮藏、蛋品加工关系最为密切。浓厚蛋白 含量约占全部蛋白的5 0 - - 6 0 ，它是一种纤维状结构，主要由粘蛋白和类粘蛋白组成， 并含有特有成分溶菌酶，它能溶解细菌，具有杀菌作用。此酶的含量、活性与浓厚蛋白 的含量成正比。刚生下来的鲜蛋，浓厚蛋白含量高，溶菌酶含量多，活性也强，蛋的质 量好，耐贮藏。而随着外界温度的升高，存放时间的延长，蛋白会发生一系列变化，首 先是浓厚蛋白被蛋白中的蛋白酶迅速分解变为稀薄蛋白，而其中的溶菌酶也随之被破 坏，失去杀菌能力，使蛋的耐贮性大为降低。因此，越是陈旧的蛋，浓厚蛋白含量越低， 稀薄蛋白含量越高，越容易感染细菌，造成腐坏蛋。可见浓厚蛋白含量的多少是衡量蛋 的质量新鲜与否韵重要标志。 1 1 2 蛋清的化学成分 鸡蛋中的蛋清是一种以水作为分散介质，以蛋白质作为分散相的胶体物质鲫。鸡蛋 清的化学成分如表l 。1 。 表1 - 1 鸡蛋清的化学成分 t a b l e l - ic h e m i cc o m p o s i t i o no f e g gw h i t e a 蛋清中的水分 鸡蛋清中的水分含量约为8 7 - 3 8 8 6 。但各层之间有所不同，外层稀薄蛋白、中层 浓厚蛋白、内层稀薄蛋白、系带膜状层的水分含量分别为8 9 、8 4 、8 6 和8 2 。 b 蛋清中的蛋白质 鸡蛋清中蛋白质的含量为总量的1 0 8 1 1 6 。其中除不溶性卵黏蛋白之类的特异性 蛋白以外，一般为可溶性蛋白质，总的来看是由多量的球状水溶性糖蛋白质及卵黏蛋白 纤维组成的蛋白质体系。蛋清各层之间蛋白质组成差别不大，稀薄( 水样) 蛋白和浓厚 蛋白的蛋白质成分由同样的基本蛋白质组成，如表1 2 所示。 2 鸡蛋清中三种蛋白质的连续化提取研究 现在已从鸡蛋中分离出近4 0 种不同的蛋白质，其中有2 4 种蛋白质含量少，它们的 性质尚未很好确定；存在量较多而又易于分离的蛋白质及其组成，和它们的物理、生物 学性质已有相当部分被搞清楚了，但是有些仍然不清，有待进一步研究。含量较多的蛋 白质有1 2 种主要类型，见表1 3 。 c 蛋清中的碳水化合物 蛋清中的碳水化合物分为两种状态存在，一种是与蛋白质呈结合状态存在，在蛋清 中含0 5 ；另一种是呈游离状态存在的，蛋清中含o 4 。游离的糖中9 8 是葡萄糖， 其余是微量的果糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖和核糖。蛋白中的糖类含量虽然很少，僵鼍 与蛋白片、蛋白粉等蛋制品的色泽有密切关系。 d 蛋清中的脂质 孚 新鲜蛋清中含微量的脂质，约占0 0 2 。中性脂质和复合脂质的组成比是7 “：1 ， 中性脂质中蜡、游离脂肪酸和游离甾醇是主要成分，复合脂质中神经鞘磷脂和脑苷酯类 是主要成分。将带壳蛋贮藏期间，随着蛋黄膜的弱化，甘油三酯和胆甾醇酯将由蛋黄移 行至蛋清中。 e 蛋清中的酶 蛋清中除含有主要的酶溶菌酶外，还发现有三丁酸甘油酯酶、肽酶、磷酸酶、过 氧化氢酶、州一乙酰葡萄糖胺苷酶、小甘露糖苷酶和超氧化物歧化酶滞3 0 l 等。 f 蛋清中的维生素及色素 蛋清中的维生素以维生素b 2 较多，此外还有维生素c 、b 3 、p p 等。蛋清中的色素 很少，其中含有少量的核黄素，因此干燥后的蛋白中带有浅黄色。 g 蛋清中的无机成分 蛋清中的无机成分含量较少，种类却较多，主要有k 、n a 、c a 、m g 、c 1 等，其具 体含量见表1 - 4 。 陕西科技太学硕士学位论文 卵自蛋白 5 4 04 5 4 8 i 在鸡蛋清的胶凝过程中起 主导作用 2 抑制胰蛋白酶、枯草杆菌 蛋白酶活性 3 作为营养添加剂、载体、 稳定剂、封阻剂被广泛应用于 食品工业 kn ac a m g c if espz nic um n 1 3 8 01 3 9 15 8 5i 2 4 11 7 2l2 2 5 1 6 5 3 2 3 7 91 5 00 0 7 200 6 20 0 4 1 4 鸡蛋清中三种蛋白质的连续化提取研究 1 2 蛋清中三种主要的蛋白质概述 蛋清中含量较多的1 2 种主要类型蛋白质及其主要特征示于表1 3 ，其中卵白蛋白、 卵伴白蛋白( 卵铁传递蛋白) 、溶菌酶为三种主要的生物活性蛋白质。 1 2 1 卵白蛋i 刍( o v a l b u m i n ) a 卵白蛋白的结构及性质 卵白蛋白在蛋清中的含量最多，约占蛋清中蛋白质的5 4 ，它是一个近于球形的磷 糖蛋白，是蛋清中蛋白质的代表类型，其中包含所有的必需氨基酸。卵白蛋白不止是一 种，是电泳性质稍有不同的三种组分( a l 、a 2 及a 3 ) 的混合物，a 卜a 2 及a 3 以8 5 ：1 2 ：3 的比率组成。其中a l 含2 摩尔的磷酰基，a 2 含l 摩尔的磷酰基，而a 3 不含磷酰基。 将a l 和a 2 用磷酸酶处理时，变为不含磷酰基的分子。这些磷酰基都与丝氨酸的羟基结 合。卵白蛋白是单一的肽链，每一个分子有一根糖链。n 端和c 端的氨基酸各自为乙 酰甘氨酸和脯氨酸。糖链通过n 乙酰葡萄糖胺以n 苷键结合于天门冬氨基酸残基上。 卵白蛋白的糖含量是3 2 ，其中甘露糖2 ，n 乙酰葡萄糖胺是1 - 2 。将卵白蛋白用 蛋白酶彻底消化而得的糖肽( 分子量约为1 5 8 0 ) 是不均一的，至少有5 种。每分子卵 白蛋白有1 个双硫键和4 个巯基。这4 个巯基中的3 个在未变性的状态下，与巯基试剂毫 具有弱的反应性，但若变性则4 个都成为富有反应性的巯基。 荽 蛋清蛋白质的多数功能特性依赖于卵白蛋白) 。卵白蛋白在鸡蛋清的胶凝过程中起蘧 主导作用；它对胰蛋白酶有强烈抑制作用并且抑制程度与温度、p h 值等密切相关，还。 能部分抑制枯草杆菌蛋白酶活性 3 2 1 ；卵白蛋白中包含所有的必需氨基酸且比例合理，因 此可作为营养添加剂被广泛应用于食品工业。另外，卵白蛋白在生物化学中已成为一种 重要的参考蛋白质。高度纯化和结晶的卵白蛋白作为载体、稳定剂、封阻剂或标准物等， 在食品工业中发挥了重要的作用。尽管对卵白蛋白己进行了大量深入细致的研究，但对 其生物学特性和功能的了解不够全面。 b 卵白蛋白的分离提取 蛋清中的卵白蛋白在其等电点时用硫酸铵或硫酸钠盐析，容易得到卵白蛋白的针状 结晶m 】：还可用采用三氯醋酸丙酮提取，冷丙酮沉淀，磷酸盐透析和d e a e c e l l u l o s e 离子交换层析分离出鸡卵白蛋 刍0 2 1 。 1 2 2 卵铁传递蛋i ! l ( o v o t r a n s f e r r i n l a 卵铁传递蛋白的结构和性质 卵铁传递蛋白是一种更易溶的非结晶性白蛋白，1 8 8 9 年o s b o r n e 将这种蛋白质命 名为副卵白蛋白或卵伴白蛋白，电广泛使用着卵铁传递蛋白的名称。卵铁传递蛋白的分 陕西科技大学硕士学位论文 子量7 0 0 0 0 - - , 7 8 0 0 0 ，含甘露糖o 8 ，不含半乳糖和唾液酸。此种蛋白质是近似于血清铁 传递蛋白的蛋白质，每个蛋白质分子中有两个配位中心可与f e ”、c u 2 + 或z n 2 + 等金属离 ：矛结合。金属离子结合部位的氨基酸组成和立体结构还有很多不明之点，据报道卵铁传 j 递蛋白中的3 个酪氨酸残基，还有2 个组氨酸残基，色氨酸残基与键合有关，这个配位 复合体的构造还在研究中。 卵铁传递蛋白在与f e 3 + 结合时呈红色，在4 6 5n l l l 处有最大吸收值：而与c u 2 + 结合 时，在4 4 0n m 处有最大吸收值，呈现黄色；但是与z n 2 + 即使形成复合体也是无色的。 卵铁传递蛋白容易热变性，与金属形成复合体时热变性温度提高，对蛋白质分解酶和各 种变性处理的抵抗性变高。金属离子复合体于p h 6 以下时解离，也是显著影响稳定性 的原因之一。卵铁传递蛋白的双硫键在没有变性剂而仅有还原剂存在时也容易被切断， 但在复合体状态时变得对还原作用显示出非常高的抵抗性。这表明由于形成复合体使分 子的结构更加稳定了。卵铁传递蛋白无论是在电泳还是色谱中都被分为两种组分，这两 种成分的肽结构图非常相似，可以推断两者的一级结构基本一致，两组分的热变性基本 相同，而且也没有由于化学修饰而产生的性质的差别。 卵铁传递蛋白属于免疫活性蛋白，具有抗菌及免疫功能。s c h a d e 和c a r o l i n e 首次报 道了卵铁传递蛋白对大肠杆菌等的抑制作用与血清中的转铁蛋白相同p 4 j ”。v a l e n t i 等 人的实验证实卵铁传递蛋白的抗菌性在数量和质量上与人类的乳铁蛋i ! i ( l f ) 相似l j 6 1 ，而 抗病毒的性能甚至优于乳铁蛋白和血清转铁蛋白唧。在新生豚鼠由细菌诱发的感染实验 中，也证实了这些蛋白质具有相似的保护作用，从而引出了营养性免疫力的概念。卵铁 传递蛋白对于提高机体免疫功能、增强抗病防病的能力、防治贫血等都具有非常重要的 意义。母乳喂养的新生儿对肠道细菌的抵抗能力比用非母乳喂养的新生儿强，这是因为 某种程度上母乳中含有较多的乳铁蛋白。而卵铁传递蛋白与乳铁蛋白在结构和生物活性 上相似，并且临床实验证明，婴儿服用后，并无异源蛋白常有的过敏等不良反应【3 7 3 s ) 。 因此卵铁传递蛋白作为一种良好的免疫功能因子或生物医药产品，其应用前景十分广 阔。 卵铁传递蛋白属于广谱抑菌剂，既抑制需铁的革兰氏阴性菌( 如大肠菌群、沙门氏 菌和志贺氏菌等) ，也抑制革兰氏阳性菌( 如金黄色葡萄球菌、杆菌和单细胞李斯特菌) ； 但对铁需求不高的微生物( 如乳酸菌) ，则基本不抑制p 删。 卵铁传递蛋白的抗菌机理是直接性的“铁剥夺”和间接性的“膜渗透”两种机制的联合 作用。“铁剥夺”机制是，卵铁传递蛋白可以阻断细菌对铁源的利用。铁离子是几乎所有 细菌生长所必需的物质( 是细菌生物氧化酶所必需的) ，不同病原菌对铁有不同的吸收 利用机制，从其所处的环境或寄主中获得铁源。如在膜上形成孔道吸收外界的铁或者在 膜上表达相关受体来获取铁或含有铁的有机分子( 如转铁蛋白、血红蛋白、血红素等) 。 鸡蛋清中三种蛋白质的连续化提取研究 而卵铁传递蛋白可作为一种铁结合性的糖蛋白与病原微生物竞争性地结合其赖以生存 的铁离子或与其受体结合，并将受体从细胞膜上解离下来，阻断铁的吸收途径，使细菌 由于缺乏铁源抑制生长；“膜渗透机制是，卵铁传递蛋白能够破坏细胞膜，使细胞膜去 极化、p h 梯度消失或在膜上形成孔洞，杀死细菌。卵铁传递蛋白靠其本身所带有的正 电荷与g + 细菌细胞膜上磷壁酸( 1 a ) 或g 细菌细胞膜上的脂多糖( l p s ) 产生静电吸引，使 抗菌肽附着于膜的表面，然后靠疏水结构造成细胞膜结构的改变，并进一步引发形成离 子通道或插入细胞膜使膜裂解，引起内容物外泻，使细菌死亡i ( 9 - 5 3 1 。 b 卵铁传递蛋白的分离提取 蛋清中虽含有大量的卵铁传递蛋白，但卵铁传递蛋白分离的研究进展却相对较慢， 以往有关卵铁传递蛋白的分离提取都是采用盐沉淀法或离子交换法州s 】，但这些方法都 存在种种缺点。近年来，有采用j p o r a t h f * ) 发明的固定化金属螯合亲和色谱( t m a c ) 的新 方法，分离纯化蛋清中的转铁蛋白。并对影响其分离的因素进行了研究。采用此方法并 结合超滤技术可在分离卵铁传递蛋白的同时得到溶菌酶、蛋白粉等副产品，可大大提高 鸡蛋综合利用的广度和深度阳。 1 2 3 溶菌酶0 l y s o z y m e )潍 洼 a 溶菌酶的结构和性质。 镡 溶菌酶，又称胞壁质酶，化学名称为n 乙酰胞壁质聚糖水解酶。自1 9 9 2 年謦l e m i n g 于鼻粘液中发现了溶菌酶开始，确定了在鸡蛋清中含有大量的溶菌酶。其后于 9 3 7 年 首先由a b r a h a m 和r o b i n s o n 从蛋清中分离出结晶状的溶菌酶。 蛋清溶茵酶是相对分子质量1 4 3 8 8 1 8 0 0 0 ，等电点为l o 5 1 1 0 的碱性蛋白质，在 蛋清中也部分地与卵粘蛋白、卵铁传递蛋白、卵白蛋白结合而存在。溶菌酶占蛋清中蛋 白质的3 - 4 ，在系带膜状层或系带中的含量比其它蛋白层中至少多2 3 倍，它在各 蛋白层中含量基本相同。 溶菌酶的一级结构已被j o u e s 等及c a n f i e l d 分别确定了，这项工作是近代化学的最 伟大的成就之一，是仅次于第一个被确定了氨基酸顺序的蛋白质胰岛素之后，第二个 被定出一级结构的蛋白质。蛋清溶菌酶的一级结构是包含有1 2 9 个氨基酸的单个多肽 链，分子内有四个二硫键交联。溶菌酶更高级的结构已为p h i l l i p s 等采用x - 射线衍射法 所确定。溶菌酶分子状如卵形，大小为4 5 a 3 0a 3 0a 。溶菌酶分子构想中，螺旋结构 只占2 5 ，大部分是无规则卷曲结构。溶菌酶还有两个特点。其一是在分子表面的那些 残基有亲水性，第4 0 - - 8 5 个氨基酸残基多为亲水性残基。而在分子内部一般都是疏水的， 即由疏水性氨基酸残基组成的核作为中心；其二是溶菌酶分子的表面上，有一个深陷的 “凹槽”，其大小恰好能容纳多糖底物的6 个单糖单元，这正是溶菌酶的活性部位，即溶 陕茜科技大学硕士学位论文 菌酶通过其肽键中第3 5 位的谷氨酸和第5 2 位的天冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成 微生物细胞壁的n 乙酰葡萄糖胺与n 一乙酰胞壁质酸问的b 1 4 一糖苷键，使菌体细胞壁 溶解而起到杀死细菌的作用。典型的溶菌酶敏感菌是藤黄微球菌或溶壁微球菌，枯草杆 菌等部分革兰氏阳性细菌。 溶菌酶具有杀菌作用，一直被作为食品抗菌剂使用。1 9 9 2 年，f a o w h o 食品添加 剂专家委员会确认了溶菌酶在食品中使用的安全性。目前溶茵酶的杀菌特性已被应用于 食品、医药等行业。如溶菌酶可被连接到脱乙酰壳聚糖、硅胶和交联聚乙烯等载体上制 成一种膜内含酶，可与液体食品接触，并可有效抑制微生物的生长繁殖。 溶菌酶除具有直接杀菌作用之外，还有其它生物学功能，如与病毒形成不溶性复 合物而具有抗滤过性病原体的作用、免疫细胞激活作用和抗肿瘤作用i 。同时它也是基 因工程及细胞工程必不可少的工具酶，是实现细胞融合操作的必需酶，随着生物工程的 迅速发展，溶菌酶在该领域将具有极高的应用价值。 b 溶菌酶的分离提取 国内外从鸡蛋清中分离提取溶菌酶的报道较多，除采用传统的直接结晶法外，还发 展了亲和层析法、离子交换层析法及多种方法相结合的生产技术。 1 ) 结晶法 结晶法是一种传统的制备溶菌酶的方法，最先由m a y e r , a b r a h a m 等人开始研究， 于1 9 3 6 - 1 9 3 7 年获得溶菌酶结晶状物质，到1 9 4 5 年，a l d e r t o n 等提出了直接结晶法制 备溶菌酶的方法，8 0 年代以来，通过对此法进行改进，使产率得以提高陬叫。 劫亲和层析法 亲和层析法是蛋白质分离纯化的最有效的方法之一，有时甚至仅用一步亲和层析便 可达到分离要求。它是利用生物分子之间具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。亲和 层析法分离、纯化溶菌酶的研究开始于7 0 年代，该法是利用酶分子独有的专一性结合 位点或结构性质的分离方法盼州。目前制备溶菌酶所用亲和吸附剂主要有c c 一纤维素、 l l s e p h a r o s e 琼脂糖、c m 一甲壳质、几丁质、c m 一几丁质、脱氨几丁质等p 一一h 】。 最新研究报道，一种新型磁性亲和载体可用作亲和吸附剂，吸附溶菌酶。 3 1 离子交换层析法 离子交换层析是依据被分离物质与分离介质间异种电荷的静电引力的不同来进行 物质分离的方法m 1 。将该法应用于溶菌酶的分离、纯化开始于8 0 年代，具有快速、简 单、经济，并能实现大规模自动化连续生产的特点1 6 0 ) 。目前国内外已用于溶菌酶分离纯 化的离子交换剂主要有7 2 4 ，7 3 2 型弱酸性阳离子交换树脂，d 9 0 3 ，d 2 0 1 大孔离子交 换树脂，c m 一纤维素，磷酸纤维素，d e a e 一纤维素，羧甲基琼脂糖，大孔隙苯乙烯 鸡蛋清中三种蛋白质的连续化提取研究 系强碱性阴离子交换吸附树脂，c m - s e p h a d e x 阳离子交换树脂，d u o l i t ec - 4 6 4 树脂， c m - t o y o p e a r l 树脂，a m b e r h t ec g 一5 0 树脂等1 6 0 “”“”。 。 近年来，还发展了将多种方法相结合制备溶菌酶的新技术。如亲和层析与离子交换 层析结合m 1 、离子交换层析与结晶法结合mn 一一、超滤与结晶或层析法结合”* n 铀l 。 1 3 小结及本研究工作要点 1 3 1 研究现状评述与本研究的立项依据 综上所述，具有生理生化活性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面的作用已必 不可少。我国鸡蛋资源丰富，而蛋清中含有大量的生物活性蛋白质，如：卵白蛋白在鸡 蛋清的胶凝过程中起主导作用，能抑制胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶的活性，作为营养添 加剂、载体、稳定剂、封阻剂已被广泛应用于食品工业；卵铁传递蛋白属于广谱抑菌剂， 既抑制需铁的革兰氏阴性菌( 如大肠菌群、沙门氏菌和志贺氏菌等) ，也抑制革兰氏阳 性菌( 如金黄色葡萄球菌、杆菌和单细胞李斯特菌) ，并且它对于提高机体免疫功能、 增强抗病防病的能力、防治贫血等都具有非常重要的意义；溶菌酶除具有直接杀菌作用 之外，还有其它生物学功能，如与病毒形成不溶性复合物而具有抗滤过性病原体的作 用、免疫细胞激活作用和抗肿瘤作用【，s l ，同时它也是基因工程及细胞工程必不可少的工 具酶，是实现细胞融合操作的必需酶，随着生物工程的迅速发展，溶菌酶在该领域糨具 有极高的应用价值。对这些生物活性蛋白质的充分开发和利用是使鸡蛋发挥其最大馕值 的途径。国内外从鸡蛋清中分离提取生物活性蛋白质的研究有一些，且主要集中于对溶 菌酶的提取，如：采用三氯醋酸丙酮提取，冷丙酮沉淀，磷酸盐透析和d e a e c e l l u l o s e 离子交换层析分离出鸡卵白蛋白1 3 2 ，, 采用盐沉淀法【卅、离子交换色谱法嘲或固定化金属 螯合亲和色谱法嗍分离提取鸡卵铁传递蛋白；关于溶菌酶的分离方法主要有：结晶法、 离子交换色谱法、亲和色谱法、超滤法、反胶团提取法等。但这些方法大多只集中提取 一种目标蛋白质，原料无法回收利用，不能实现连续化提取。 1 3 2 本研究主要工作 j 本研究以鸡蛋清为原料，分离提取其中三种主要的生物活性蛋白质，即卵白蛋白、 卵铁传递蛋白和溶菌酶。重点和难点是实现连续化操作，以实现鸡蛋的综合利用。 陕西科技大学硕士学位论文 2 材料与方法 2 1 技术路线 鸡蛋清中三种主要的蛋白质均为水溶性蛋白质，采用水稀释微滤法对鸡蛋清进行 预处理后，再用盐析法和离子交换层析法分离提取。技术路线如图2 1 鲜鸡蛋分离鸡蛋清纱布过滤微滤超滤卵白蛋白的盐析沉淀 r d e a e - s e p h a r o s ef f 广溶菌酶粗品 离子交换层析叫卜- i bq - s e p h a r o s e f f _ j b 卵铁传递蛋 ：= 自粗品 图2 - 1 鸡蛋清中三种主要蛋白质的连续化提取技术路线 f i g 2 - 1f l o wc h a l to f c o n t i n u o u si s o l a t i o no f t h r e em a i np r o t e i n sf r o me g gw h i t e 2 2 鸡蛋清的预处理一水稀释微滤法 鸡蛋清中含有大量的浓厚蛋白，它主要是由卵粘蛋白和卵类粘蛋白构成的一种里纤 维状的胶体物质，粘度很大l 。因而，降低蛋清的粘度、破坏蛋白质问相互作用力、增 加可溶性蛋白质的溶出和提取率是需要解决的首要问题。某一物质在溶剂中溶解度的大 小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守“相似相溶”的原则川。由于蛋清 中主要的生物活性蛋白质均为水溶性蛋白质，所以试验采用水稀释结合微滤的方法，即 选择不同的稀释倍数、盐离子浓度、酸碱度、静置时间，以降低蛋清黏度并实现对其中 水溶性蛋白质的初步提取，然后通过膜过滤，以测定平均微滤速度及微滤液中蛋白质含 量来评价蛋清粘度降低效果及蛋白质回收率。上述操作在实现蛋白质初步分离的同时， 亦是后续各种提取工艺的基础。 2 2 1 水稀释徽滤法原理 稀盐的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常用的溶剂。提取时 需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定，不同的蛋 白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的 升高而增大，因此，温度高有利于溶解，缩短提取时间；但另一方面，温度升高会使蛋 白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质时温度一般不宜过高。蛋白质是具有 等电点的两性电解质，提取液的p h 值应选择在偏离等电点两侧的p h 范围内。用稀酸 或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质 构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏 鸡蛋清中二种蛋白质的连续化提取研究 一 碱性的提取液。 微孔过滤( 又称精细过滤，m i c r o f i | t m t i o n ，m f ) 【8 2 嘲用于过滤0 o l p m 1 0 9 r e 粒径的 颗粒，如细菌、血液及大分子等物质，与普通过滤类似，微孔过滤属筛网过滤。其分离 机理是根据分子或微粒的大小和膜孔径大小不同而被筛分分离。在静压差的作用下，小 于膜孔的粒子通过滤膜，比膜孔大的粒子则被截留在膜面上，使大小不同的组分得到分 离。微滤一般经历以下几个阶段：( 1 ) 过滤初始阶段，比膜孔径小的粒子进入膜孔，其 中一些由于各种力的作用被吸附于膜孔内，减少了膜孔的有效直径；( 2 ) 当孔径内吸附 趋于饱和时，微粒开始在膜表面形成层滤饼层；( 3 ) 随着更多微粒在膜表面的吸附， 微粒开始部分堵塞膜孔，最终在膜表面形成一层滤饼层，膜通量趋于稳定。微孔滤膜一 般包括：混合纤维素酯膜( c a - c n ) 、硝酸纤维素膜( c n ) 、格栅膜，孔径范围在o 1 5 5 1 l m 之间，是精细过滤中的关键材料。 在实际使用过程中可分为三种情况：( 1 ) 机械截流：( 2 ) 架桥：( 3 ) 吸附。机械截流 的结果造成微孔完全堵塞，架桥并没有完全堵塞微孔，此时滤液可以从微粒的间隙中通 过，形成所谓的滤饼过滤，而吸附的结果只是使有效孔径变小。在三种情况下，过滤速 度差别很大。 根据h e r m a n s - b r e d e e 的研究，滤速下降速率和过滤速率之间有以下关系卷 d 2 v d f l = k ( d v d t ) 4瓠2 1 ) n = 2 时，形成机械截流； 8 n = 3 2 时，形成吸附： n = l 时，上述三种情况同时发生； n = o 时，形成架桥：即形成滤饼过滤。在固体粒子浓度比较高，体系黏度较小时， 近似于滤饼过滤。 实际情况却往往是上述各种机理同时发生，在过滤初期，机械截流起支配作用，而 在过滤后期起支配作用的是滤饼过滤。 根据微孔过滤过程的三种情况分析，要使得过滤顺利进行，必须使其处于架桥或吸 附状态，才能保持一定的过滤速度或使其过滤速度下降缓慢。对蛋清这一含有大量浓厚 蛋白的粘稠体系，在微孔过滤时基本表现出机械截流的过滤机理，直接过滤的结果是过 滤初期膜就会被各种粘稠的大分子物质所堵塞，所以常规的微孔过滤在这样的体系中根 本无法实现。传统过滤中添加助滤剂可以减轻压力升高和介质的堵塞，将其应用于微孔 过滤中也是可行的。本试验通过添加硅藻土作为助滤剂促进过滤过程中的架桥和吸附作 用，防止滤膜孔被堵塞，过滤方式采用直流式过滤。 2 2 2 材料与设备 1 ) 混合纤维素酯微孔滤膜( 0 4 5 p r o ，0 5 0 m m )上海兴亚净化材料厂 陕西科技大学硕士学位论文 2 微孔过滤器 3 ) 硅藻土、氯化钠、盐酸 4 1m i c r o p r o c e s s o rp h 2 1lm e t e r 5 ) 2 x z - l 型旋片式真空泵 6 ) d b - 2 7 5 l t 低温冰箱 2 2 3 试验内容 上海医药工业研究所 化学纯 h a n n a 浙江临海市精工真空设备厂 海尔 a 蛋清原液的制备 将新鲜鸡蛋洗净消毒( 0 1 的新洁尔灭中浸泡2 0 m i n ) ，打蛋后将蛋清蛋黄分离， 收集蛋清液纱布过滤，除去鸡蛋清中的脐带块和碎蛋壳。 b 徽孔过滤单因素试验 1 ) 稀释倍数的影响 取1 0 m l 蛋清用蒸馏水稀释不同倍数，充分低速搅拌，以o 5m o l lh c l 在搅拌下调 节p n 值为8 ，4 1 2 下静置过夜。添加5 ( 1 0 0 m 1 ) 的硅藻土后用o 4 5 p r o ，0 5 0 m m 的 微孔滤膜微滤。评价各稀释倍数对平均微滤速度及微滤液中蛋白质含量的影响。 2 ) 硅藻土添加量的影响 取1 0 m l 蛋清用蒸馏水稀释1 0 倍，充分低速搅拌，以0 5m o l lh c l 在搅拌下调节 p h 值为7 8 ，4 下静置过夜。加入不同量的硅藻土后用o 4 5 p r o ，m 5 0 r a m 的微孔滤膜 微滤。评价硅藻土添加量不同对平均微滤速度及微滤液中蛋白质含量的影响。 3 ) 盐离子浓度的影响 取1 0 m l 蛋清用蒸馏水和1m o l l n a c i 稀释l o 倍，使稀释液中n a c i 的终浓度分别 为0 、0 0 2 5 、0 0 5 0 、0 0 7 5 、0 1 0 0 、0 1 5 0 、0 2 0 0 、o 2 5 0 m o l l ，充分低速搅拌，以o 5m o l l h c i 在搅拌下调节稀释液p h