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悬浮式生物芯片的测试技术研究 摘要 y 8 7 7 8 2 7 生物芯片技术是一个多学科高度交叉的领域。生物芯片从形态上可以分为两 类：片式生物芯片和悬浮式生物芯片。由于片式芯片的工艺复杂成本高，极大的 限制了它的应用范围，特别是l 临床的使用。而悬浮式生物芯片由于它独有的灵活 性将使其迅速从实验室走向产业化特别是临床使用成为可能。生物芯片是采用分 子杂交原理进行工作，将待检测样品加以荧光染料标记，然后和己知结构的生物 芯片进行充分杂交，最后用检测装置分析杂交荧光信号。因此生物芯片的检测技 术是决定生物芯片能否得到应用的关键因素。 首先介绍了目前国际上所使用的悬浮式生物芯片检测技术即基于流式细胞 仪的一维串行检测技术，然后描述了本课题所设计的悬浮式芯片检测系统的结构 及其工作原理。测试系统包括微流场系统、光学系统及信号处理系统。为了提高 检测速率首次提出二维流场设计进行二维检测。本课题研究的悬浮式生物芯片检 测技术，由于采用了c c d 凝结成像、并行检测的方法，将大大的提高悬浮式生物 芯片的检测速度。系统采用较简单的结构实现荧光检测，这将大大的降低整台装 置的成本。 微流场系统包括微流通道及样品推射装置。采用三种方法制作了多种尺寸的 微流通道：机械加工、激光烧蚀和蚀刻法。从试验结果分析了各种微流通道的特 点。为了保证系统检测数据的可靠性在流场的检测区域必须没有死区和湍流。从 理论上分析了微球在流场中的宏观运动特征。最后给出试验观察到的流场中微球 运动和静止的形态，得出了微球在流场的检测区域作平稳运动的结论。 光学系统由激发光光学系统、荧光收集成像系统和滤色系统构成。激发光光 学系统将激发光源发出的光束按照_ 定的要求投射于液流通道上的检测区域，以 激发微球体上标记的荧光物质。荧光收集成像系统收集检测区域内微球体上的荧 光信号，并将检测区域成像于c c d 光敏面。滤色系统：在系统光路中，滤选激 发光谱，以及滤选和分离荧光信号。提出了光学系统每个部分的设计要求及各参 量间的相互制约关系。 从一般荧光检测系统结构出发，详细分析了检测系统的探测灵敏度和系统各 参量之间的关系。得到了荧光检测系统的探测灵敏度的理论表达式。最后计算出 本课题所设计的悬浮式生物芯片的检测灵敏度大约为7 9 个荧光分子pm 2 。并且 进行了实验验证。 生物芯片检测系统的光学系统性能常用四个指标衡量：空间分辨率、聚焦深 度、工作距离和视场范围。从分析这四个指标相互制约关系出发，提出将多束相 干照明方法用于悬浮式生物芯片检测系统，并从理论上进行了分析并得出结论： 采用较小数值孑l 径的收集透镜和较大的照射光锥锥角，可获得较大的工作距离和 视场范围及理想的聚焦深度，同时又使空间分辨率不受数值孔径约束，极大地提 高了生物芯片测试的灵活性。而且由于激发光的强度提高使得荧光信号更容易获 取。 关键词：悬浮芯片；两维；c c d 凝结成像：荧光；微球；灵敏度；微流场 i i r e s e a r c hc h ld e t e c t i o nt e c h n o l o g i e su s e di ns u s p e n s i o nb io c h i p a b s t r a c t t h eb i o c h i pt e c h n o i o g yi sac r o s sn e l dw h e 丁em a n ys u b j e c t sa r ei n v o l v e d i ti sd i v j d e d 砷ot 、v o k i n d s 怕mi t sc o n 矗g u m t i o n ：t h es l i c eb j o c h i pa n ds u s p e n s i o nb i o c h i p 1 1 l ea p p l i c a t i 伽o ft l l es l i c e b i o c h i pi sc 蚰n n e dg r e 列yb yhc o m p l i c a t e dm 8 n u f a c “鹏掣o c e d u r e 锄di 毽h i 曲c o s t ，e s p e c i a l l y b l o “i n gi to f f 行o mc i i l l j cu s et h ep a r t i c u l a rn e x i b i j j t yo f m es u s p e n s i o nb i o c h i pm a d ei tp o s s m l et h a t t h es u s p e n s i o n b i o c h i pc ou l dr e a 】i 四bi n d u s 廿i a l i z a 七i o n 的m1 a b o r a t o r yr a p j d l me s 昨c i a yt h ec 】i n i c a l d i a g n o s j s t h eb i o 曲i pe x p e r i m e m sw e r eb a s e do nm eh y b r i d i z a 廿。玎r e a c t i 佃t h et e s ls 蜘p l ew a s t a g g e dw i t ht h en u o r e s c e n td y e sa n d h y 晰d i z e dw 纳t l l es 咖c 嘶db i o c h j ps u 衢c i e m l y 1 1 1 e h y b d i z a 恼叨r e a c t | o nn u d r e s c e n ts i g n a li s 柚a l y z e db yd e t e c d o na p p a r a t u sl a s t l ys o 山ed e t e c t i o n t e c l l l l o l o g yi st l l ek e yf k t o ro f b i o c h i pa p p l i c a t i o n 1 1 1 ee x i s t i l l gs u s p e n s i o nt e c h 0 1 0 9 yw h i c hw a se m p l o y i l l go n ed i m e n s i o nd e t e c t i o nm e t h o d b 器e do nt h ec ”o m e 廿yw a si l l 打o d u c e da t6 r s t ，m e nt l l e c 矗g u r a t i o na l l dd e t e c t i o np n c i p l eo f t l l e s u s p e n s i 彻b j o c h i p ，w h i c hi sd e s j 印e db yu s ，i sd e s c r i b e d ，1 1 1 e r ea r em j c 心们u i d i c 亭y s t e m ，o p t j c a l s y s 把m 柚ds i g n a lp m c e s s i n gs y s t e mi 1 1t l l es u s p e n s i o nb j o c h i pd e t e c t i o ns y s 锄t h en o v e ld e s i g no f t w od i m e n s i o nm i c r o f l u i d i c 行e l d dn od i m e n s i o nt e s t 迹gm e t h o dw e f ep 代渤t e df 奴i yf b r e l l l l a i l c i n gi t s 柚a i y s i ss p e e d w i ma d o p t i i l gc c dc o a 叫a t ei m a g i i l gm e m o da n dp 啪l l e ld e t e c t i o n m e t h o d ，t l l ea n a l y s i so u t p u tw a se i l l l a n c e dg r e a t l yt h ec o s to ft h es u s p e t l s i o nb j o c h i pd e t e c t i o n a p p a r a m sw a sr e d u c e db ya d d p t h l gb n e fc o n 石g u r a 虹o nd e s j g no ft 1 1 en u o r e s c e n c e 柚a j y s ss y s t e m e n o m o u s l m m i c m - n u i d i c6 e l ds y s t 锄i sc 伽p o s e db ym i c r oc l l a l l n e la 1 1 ds 锄p l ed r i v j i l gd e v i c e 1 h e e k 协d so fm e t h o d sw e r ee m p l o y e di nf 撕i c a t i l l gd i 珏b r e n ts i i t i j 盯oc h 蛐n e l s ：m e c h 如i c a lw a y 1 a s e r a b l a t i o n 锄de t c h i n g t h ec h 啪c t 鲥s t i c so f t h o s ec h a 衄e 】sw e r ea n a l y z e d 丘d me x p 嘶m e n tr e s u l t s t h e m a c m s c o p i c a lm o v e m e mc h a r a c t e ro fm i c m - b e a d si nn u i d i c 矗e l dw a s 卸a l y z e d 廿l e o r e d c a y t h e s t a t e s0 f 锨t j ca n d m o v i n gm c r o - b e a d sw e r eo b s e 】e db y 腻p e r i m e n t ，t b ec 伽c l u s i o no f m i c r o 七e a d s m o v 吨s 诅b l yi nn u i d i cw o b 协岫dl 删y o p n c a ls y s t e ml sc a m p o s e do fe x c 破瞳i o no p t l c a ls y s t e m ，f i u o r e s c e n c ec 0 1 1 e c t i o ni l n a g m g s y s t e m 柚dn l 姐3 1 1 1 e 麟c i 诅t i o nl i 曲tb e a mw a sp m j e c t e dt ot h et e s ta r e ao fm i c mc h a i l n e l b y e x c i t a t i o n o p t i c a ls y s t e m i 1 1o r d e rt oe x c “e 玎u o r e s c e t d y e st 雄删i nt h em i c r o b e a d s t h e i i i 日u o r e s c e n c es i g n a ic a i n e 行o mm i c r o - b e a d si nm et e s ta r e aw a sc o l l e c t e da ，1 dt h et e s ta r e a 眦si m a g e d t oc c da ts a m et i m eb yt h en u o r e s c e n c ei m a g i n gs y s t e m t h ee x c i t a t i o nl i g h ta n dn u o r e s c e n c ew e r e d i s t 血g u i s h e da 1 1 ds e l e c t e db ye x c i t 8 t i 佣a n de m i s s i 椰甄k r s t h ed e s i 印d e m 赫d sa n d 也ec o n n i c t i n g r e l a t i o n 帅o n gt h ep a r a m e t e r so f t l l eo p t i c a ls y s t e mw e r ep r e s e i l t e d t h er e l a t j o nb e m e e nt h es e n s i “v i t ya n dt h ee a c hp a r a m e t e ro ft h ed e t e c n o ns y s t e mw a s a i l a l y z e di nd e t a i lf r o mm ev i e wo fc o n v e n t i o n a in u o r e s c e n c et e s t i n gs y s t e mc o n f i g u r a t i o n n e f o m l u l ao f s e n s i t i v i t yo f n u o r e s c e n c ed e t e c t i o ns y s t e mw a so b 诅i n e d t h es y s t e ms e n s i i i v i t yo f o u r s u s p e n s j o nb i o c h i p 锄a l y s i sw a se s t i m a t e da b o u t7 9n u o 耐岬2 a n di tw a sv a l i d a t e db y e x p e r i m e n t t b eo p 甘c a lc h a r a c t e r so ft l l eb i o c h i pd e t e c o ns y s t e m j ss c a l e db yf o l 】o w i n gf o l i rp a r 啪e t e r s ： s p a t i a ir e s o l u t i o n ，d e p t l lo f n e l d ，w o 一【i l l gd i s t 柚c e 如d 右e l do f v i e t h ec o n 竹i c 畦n gr e l a t i o no f t h ef o u r p 啪m e t e r sw 盯e 柚a l y z e d 柚d 协es u s p e n s o nb i o c h i pd e t e c t i o m e t h o dw a sp r e s e m e db yu s m gt h e m u l t i - b e 锄i 1 1 t e r f e i n t i a li l l u m i n a t i o n t h ec o n c l u s i o nr e 鲫l t e d 丘d mt l l e o r e d c a l 卸a l y s i si st h a tt h e 1 0 n g e rw o r k i n gd i s t 蛐c e ，w i d e r 丘e l d0 fv i e w 孤di d e a ld 嘤ho f 如i dw 8 so b t a 啦d ，t h es p a t i a l r e s o l u t i o nw a sn o tr e s 廿i c t e db y 山en aa ts 帅et i m eb yu s i n gs m a l l e ra p e r c 町ec o l l e c 血gl e n sa i l d b i 鹊e r 锄9 1 eo ft h ec 伽eo fj l l m n i n a t i o nb e 锄s t h en e x j b 1 时o f b i o c h i pa 岫l y s j sw a se n h 知c e d g r e a t l ya n di ti se a s 衙t oo b t a i nt h en u o r e s c e n c es i 印a la s ar e s u 】to f h j g l l 日i n t e n s 衄o fe x c i 协t i o n l i g h t k e yw o r d g ：s u s p e i l s i 叩b i o c l l i p ；t w o 曲n 蜘s i o n ；c c dc o a g i i l a 把i m a g i n g ； n u o r e s c e n c e m j c r o - b e a d s ；s e n s n i v n y ；r e 9 0 1 谢o n ；m i c r o _ m 埘i c6 e l d i v 浙江大学博士学位论文 第一章绪论 从生物芯片的概念、分类、制备、检测、数据处理等方面简要介绍了生物芯 片技术的基本知识，生物：笛片技术的主要应用领域。分析了传统生物芯片技术的 局限性。介绍了悬浮式生物芯片技术的概念、目前流行的检测方法及其特点，讨 论了悬浮式生物芯片技术的优点。提出了本课题的主要研究内容和目标。 1 1 论文的选题背景 随着基因信息学、分子生物学、医学诊断学的迅速发展，急需对可遗传信息 进行高效快速的检测和分析的新型技术工具。生物芯片正是满足这种需要的新型 技术，因而近年来得到了迅速发展3 1 。 1 1 1 生物芯片的基本概念 自从1 9 9 1 年s p a f o d e r 等人首次提出d n a 芯片概念以来，生物芯片技术已 经得到了飞速发展。它以计算机、光电及生物技术为依托，将生命科学中许多不 连续过程( 如样品制备、生化反应、信号检测) 集成到一块芯片上去，并将这些 离散过程连续化和微型化，以实现对这些大量生物信息进行快速并行处理。 一般生物芯片从形态上可分为两大类：固态的片式生物芯片与液态的悬浮式 生物芯片。固态生物芯片利用分子杂交技术的特性将大量d 片断( 或蛋白质分子) 按一定顺序排列，并固定于某种固相载体表面( 玻片、尼龙膜等) ，形成致密有序 的d n a ( 或蛋白) 点阵【m ”】。点阵与标记的样品分子进行杂交后，检测杂交信号， 从而实现对d n a 、蛋白质、细胞以及其他生物组分的准确、快速、的检测和分析， 进而获取样品分子的数量和序列信息等【1 0 17 1 。由于这种生物芯片的高密度，样品 量很少，杂交信号弱，必须用灵敏度高的光电倍增管或c c d 相机来探测信息。液 态的悬浮式生物芯片体系，由许多不同的小球体( b e a d s ) 为主要基质构成，每种 小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，就构成 了一个液相蛋白质芯片系统【1 7 - 1 9 1 。 图1 1 悬浮芯片系统 浙江大学博士学位论文 1 1 2 固态片式生物芯片 a 用于d n a 分析的生物芯片 b n a n o g e n 公司的微电极芯片 图1 2 微阵列生物芯片 通常固态生物芯片也称为片式或微阵列生物芯片( 图1 2 ) 。它采用光导原位 合成或微量点样“”埘等微加工、自动化和化学合成技术方法，将大量核酸片段( 寡 核苷酸p n a 、c d n a 、基因组d n a ) 或多肽分子以预先设计的方式固定在面积较小 的基片( 玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体) 上，芯片上探针分子的 种类、数量及分布皆是确定的，在生物化学实验或检测中可以与待测未知样品中 的目标分子发生杂交反应：反应过后，目标分子将与对应种类的探针分子相结合 浙江大学博士学位论史 而滞留于生物芯片上，所有的样品分子皆以示踪物( 主要为荧光物质) 进行标记， 通过激光共聚焦扫描或c c d ，对芯片上滞留的分子上标记的示踪物所发出的信号 进行检测分析，确定示踪物信号的分布及强弱，可以得到样品分子中包含的目标 分子的种类、数量等信息。它具有高通量、并行检测、快速解读的优点，用于进 行d n a 序列测定，基因多态性检测，基因突变的检测，基因表达的检测，分子扩 增与样品分离【0 1 0 j 。 生物芯片技术主要包括四个基本要点1 1 0 j ：芯片阵列的构建、样品的制备、生 物分子反应，芯片信号检测。 1 芯片制各目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处 理片芯( 玻璃片或硅片) ，然后使d n a 片段或蛋白质分子按顺序排列在片芯上 4 。16 】。目前已有将4 0 万种不同的d n a 分子放在1 平方厘米的芯片产生，并且正 在制备包含5 0 1 0 0 万个d n a 探针的人类基因检测芯片。 2 样品制备探针或靶为d n a ( 蛋白) ，则称为基因芯片( 蛋白芯片) 。基因 芯片有寡核苷酸芯片和c d n a 芯片。无论那种芯片包括二种模式：一是将靶d n a ( 蛋 白) 固定于支持物上，适合于大量不同靶d n a ( 蛋白) 的分析，二是将大量探针 分子固定于支持物上，适合于对同一靶d n a ( 蛋白) 进行不同探针序列的分析【1 0 1 。 3 生物分子反应芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测的关键一步。通过 选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错 配比率。将经过标记( 同位素或荧光) 的样品核酸和固定在芯片上的成千上万的 探针分子进行杂交反应，杂交的基本过程如图1 3 所示 体16 】： 图1 3 生物芯片的杂交反应过程 浙江人学博士学位论文 首先从待测细胞和参考细胞中提取出相应的r n a 信息，经过一系列生物化学 过程后r n a 被转录成d n a 并标记上不同的荧光燃料，标记过的d n a 和已知结构的 生物芯片进行杂交反应，若生物芯片上有此基因的互补基因，该基因就会与之结 合，固定在生物芯片上，否则该基因就会在漂洗过程中被清洗掉。然后，经过杂 交反应的生物芯片被烘干后，用生物芯片荧光分析仪扫描得到相应的荧光图像， 荧光的强度间接地反映了杂交反应的程度【1 0 l 。 4 芯片信号检测常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中，通过采集 各反应点的荧光位置、荧光强弱，再经相关软件分析图像，即可以获得有关生物 信息。 生物芯片检测的流程如图1 4 。 图1 4 生物芯片检测流程 生物芯片的检测就是获取标记物变化信息的过程f 1 0 1 ，是生物芯片相关技术的 一个重要组成部分。近年，人们已经提出和发展了多种生物芯片检测方法，包括 4 浙江大学博上学位论文 荧光法、质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应和直接 电荷变化检测等。相应地产生了各种检测仪器，如共焦扫描荧光探测系统和c c d 荧光探测系鲥坤】，量子生物化合反应生物芯片探测系统，单光子微荧光探测系统， 近场光学与微光学生物芯片探测系统等。荧光测试方法因其分辨能力和灵敏度高， 定位功能强而被普遍采用，并取得了相当的成功【l 睨”。其中最重要的是共焦扫描 荧光探测系统和c c d 荧光探测系统，已经相当成熟，并实现产品化f 1 9 _ 2 ”。 由于利用生物芯片可以一次性地得到大量实验数据，因此需要一个专用的软 件系统来处理数据。完整的生物芯片数据处理系统，应该包括：吝片图像分析和数 据提取，芯片数据的统计学分析和生物学分析，：占片的数据库积累和管理，芯片 表达基因的国际互联网检索，表达基因数据库分析和积累等功能。图1 5 为生物 芯片信息处理过程数据流示意图。 图1 5 生物芯片数据流 浙江大学博士学位论文 1 1 3 悬浮式生物芯片 1 悬浮式生物芯片的结构 悬浮式生物芯片又称为悬浮阵列和液相芯片。体系由许多不同的小球体 ( b e a d s ) 为主要基质构成，每种小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体 悬浮于一个液相体系中，就构成了一个液相悬浮式生物芯片系统，利用这个系统， 可以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测，这种检测技术称之为 x m a p ( f l e x i b l em u l t i a n a l y t ep r o f i l i n g ) 技术1 8 j 2 也5 1 。图1 6 是一个悬浮式生 物芯片的示意图，在微球体上吸附或采用化学方法接联上蛋白质，低聚核苷酸， 多糖，脂质，缩氨酸或单核苷多态基因片段等生物大分子作为探针分子( c a p t u r e m o l e c u l e ) 。为了便于探针分子的固定，在球形基质的表面进行了一系列的修饰， 可适合各种蛋白，肽，核酸等生物分子的固定。如图1 6 中右图所示，探针分子 可以俘获以示踪物( r c p o n e r m o l e c u l e ) 标记的与探针分子相对应的待测样品分子 ( a n a l ”e ) 。 探针分子报告分子 t 微球 待测分子 图1 6 悬浮式生物芯片的示意图 一次悬浮式生物芯片的检测中往往需要数十万甚至更多的微球体携带多种探 针分子进行检测，每个微球体上只有一种探针分子，为了能够区分携带不同探针 分子的微球体，在悬浮式生物芯片的制各过程中需要对其进行光学编码【1 8 】。 所谓的光学编码，即是采用荧光物质对微球体基质进行标记以得到独特的色 彩分类编码标志。该过程一般是在微球体合成后，通过荧光染料扩散或诱捕过程 繁一 土+ 乍 i 浙江大学博士学位论文 ( 内部标记，如图1 7 左) 或者表面吸附( 外部标记，如图1 7 右) 1 1 8 m ) 进行， 将特定的荧光物质渗透到微球体内或附着在微球体表面。 囝 瓤矾倒瞻m 辅k 蛐嘲南_ 忡 同血e 髓h d 8 0 u l 证 1 1 w q 岬懈 图】7 微球体基质编码标记不意图 分类标记荧光物质通常有两种，根据生物反应过程的要求以及分析系统检 测的要求确定具体的荧光物质种类。每种荧光标记物分别( 假定) 有1 0 个等级的 标记浓度1 8 ，2 3 1 ，每个微球体上均携带这两种荧光标记物，而携带不同种类探针分 子的微球体之间，其两种荧光标记物标记浓度等级的配对是不同的。如图1 8 中 所示。 1 0 2 4 日9 6 7 6 b 梨6 4 0 糕 躺5 1 2 囊 婪嘲 2 8 6 1 2 b 口 一一 一一 一一一 一一 一一一 一 一一 一一一 一一一 一一一一一 一一一 一一一一一一 一一 一一 一一一 一 一 一一一。 一一 1 1 2 92 5 73 8 55 1 3 6 4 17 明71 0 2 4 分类标记荧光1 l _ iilil 、l i | i ；i 图1 8 分类标记荧光物质示意图 7 -一-一-一一-一i 浙江大学博士学位论文 图中的1 0 0 ( 1 0 1 0 ) 种色彩的分类信号光是由两种波段的荧光合成的。每 个微球体上的分类荧光标记物在生物芯片检测过程中受到激发，所发射出的两种 分类荧光信号相应的分别存在1 0 种强度，荧光信号在被系统收集、分色并由两个 探测器件分别探测后，分辨出每种分类荧光信号的强度，就可以确定该微球体的 分类标记特征，进而对微球体上：的荧光信息依照其携带的探针分子的种类进行区 分。依此，可以把微球体基质分为1 0 0 种，利用这l o o 种微球体基质，最多可携 带1 0 0 种不同的探针分子，就可以实现在一次检测过程中同时对样本中的最多1 0 0 种不同的样品分子( 探针) 进行检测。 2 悬浮式生物芯片的检测原理 目前悬浮芯片比较流行的是采用基于流式细胞仪的串行检测方法【1 8 - 埘。球形 基质，探针分子，被检测物，报告分子是液相蛋自芯片的4 个主要构成部分( 见图 1 6 ) 。芯片检测分析主要包括3 个步骤【2 o 】： ( 1 ) 探针分子的固定。将探针分子固定在微球表面。 ( 2 ) 将这种标记好探针的球形基质与样品反应。探针可以与相应的目的分子 特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子也与目的分子特异性的结合， 对反应进行定量分析。 图1 9 悬浮式生物芯片的检测流程 浙江大学博士学位论文 图1 1 0 悬浮式生物芯片检测的信号示意图 ( 3 ) 反应结果的检钡0 。 目前检测的原理是使单个的球形基质通过检测通道，并使用双色激光同时对 球形基质上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测。红色激光激 发的是球形基质上的红色分类荧光，根据球形基质的不同色彩编号，可以将球形 基质分类，从而将各个不同的杂交反应区分开来。绿色激光激发的是绿色报告荧 光分子，目的是确定球形基质上结合的报告荧光分子的数量，从而确定球形基质 上结合的目的分子的数量。因此，通过红绿双色激光的同时检测，可以确定被结 合的检测物的种类和数量。【2 3 q 1 】 1 1 4 固态生物芯片与悬浮式生物芯片的特点比较 固态生物芯片技术的优点是：高通量、可并行检测、快速解读。缺点是它的 制作工艺复杂、成本昂贵，不宜根据每个不同检测对象制作不同的生物芯片【7 - 13 1 。 另外点阵不易制作均匀、杂交反应亲和力弱、并需小心冲洗，这对芯片的检测带 来很大的不便。这些都大大限制了它的应用1 2 7 】。 悬浮式生物芯片的技术优点是：微球体的反应面积大( 若微球体直径为5 5 微米，反应面积为9 5 0 3 平方微米) ，使得表面上固定的反应试剂浓度高( 1 2 1 0 6 反应分子) ，检测灵敏度高，动态范围大( 3 4 个数量级) 1 2 m 6 】。可根据每个 检测对象的需要随时进行有目的的配置( 微球、生物探针) ，而不是固定的平面微 阵列，这将大大降低成本；悬浮式生物芯片也不存在冲洗问题，易于信号的准确 检测，而且液相环境更有和于保持蛋白分子的天然构象，也更有利于探针和被检 测物的反应，因此悬浮式生物芯片的应用前景广阔【2 7 4 3 1 。 9 浙江大学博士学位论文 1 2 论文的立项依据和研究内容 目前国内外均采用流式细胞分析术对悬浮式生物芯片进行测试分析，其最大 的缺点在于采用串行式测试分析f 3 8 4 “，导致该技术测试分析速度慢，制约了悬浮 式生物芯片的应用。本实验研究了一种全新的两维悬浮式生物芯片的并行测试分 析技术，该技术采用c c d 凝结成像技术相结合的方法，将悬浮式生物芯片的分析 测试速度提高约两个数量级3 8 4 3 1 。这就使得悬浮式生物芯片既具有固态生物芯 片的高通量、快速的优点，又克服了固态芯片技术的不足，从而使该技术具有诱 人的前景。本技术将强有力的推动悬浮式生物芯片技术在临床诊断、基因研究、 新药开发、物种改良等领域的应用。本论文由国家自然基金“悬浮式生物芯片的 测试技术研究”( 编号6 0 3 7 8 0 4 2 ) 资助。 为很好地完成该项目，论文期间完成了以下研究工作： 1 设计并研制悬浮芯片的微流通道。为了适合不同尺寸和不同浓度的微球稳定地 流过检测区域设计加工了不同尺寸的微流通道，深度分别为3 0 u 、5 0 u 、5 0 u 和 8 0 u 【4 l j 。 2 。对微流场进行理论分析，并且得到影响微流场的稳定性关键因素m l 。同时也 从实验上对流场进行了大量仔细观察。获取了微球在流场中的动态行为，验证了 流场的稳定性即在流场中无死区和湍动。 3 对检测系统中的光学系统进行了初步分析设计。得到一个能够获取微弱荧光信 号的光学检测系统，系统对片式生物芯片进行荧光信号检测，获取了芯片不同位点 蛋白的清晰图像。 4 从理论上对所有采用荧光标记的生物芯片检测系统的探测极限灵敏度和系统 的各个参数间关系进行了分析，所得到的理论表达式和实验数据进行了比较，理 论分析与实测数据基本相符【4 2 4 3 1 。 5 提出将多束相干照明方法用于悬浮式生物芯片检测系统，并从理论上进行了分 析并得出结论：采用较小数值孔径的收集透镜和较大的照射光锥锥角，可获得较 大的工作距离和视场范围以及理想的聚焦深度，同时又使空间分辨率不受数值孔 径约束，极大地提高了实验的灵活性。而且由于激发光的强渡提高使得信号更容 易获取。 1 0 塑坚查兰竖主兰垡堡塞 参考文献： 1 徐炳森，项黎新，劭建中生物芯片研究及其进展浙江大学学报理学板，2 0 0 1 ，2 8 ( 4 ) 4 4 2 4 4 8 2 s k m o o r e m a k i n gc h i p st op r o b eg e n e s i e e es p e c t r u m ， 2 0 0 l ， 3 8 ： 5 4 6 0 3 赫 s c h e n a 。 r a h e l l e r ， t p t h e r j a u lt ，e ta 1 ， m i c r o a r r a y s ：b i o t e c h n 0 1 0 9 y s d is c o v e r yp l a t f o 瑚f o rf u n c t i o n a lg e n o m i c s t r e n d sb i o t e c h n o l ，1 9 9 8 ， 1 6 3 0 l 一3 0 6 4 王立强，陆祖康，林斌生物芯片及其荧光信号检测光学仪器，2 0 0 2 ，2 4 ( 4 5 ) ：7 一1 3 5 马立人，蒋中华生物芯片( 第二版) 北京：化学上业出版社， 2 0 0 2 ：2 4 2 5 6 l e m i e u xb ，a h a r o n ia ，s h e n am o v e r v i e wo fd n a c h i pt e c h n o l o g y m o l e c u l a rb r e e d i n g ， 1 9 9 8 4 ：2 7 7 2 8 9 7 j x u ，x h e ，y z h o u ，e t a 1 r e s e a r c h a n d a p p l i c a t i o n s o f b j o c h i p t e c h n 0 1 0 9 i e s c h i n e a s es c i b u l l ，2 0 0 0 ，4 5 ：1 0 卜1 0 7 8 e s l a n d e r a r r a yo fh o p e n a t g e n e t ，1 9 9 9 ，2 l ：3 4 9 ，md h i m a n ，r b o i 王1 a ，d j 0 k a n e ，e ta 1 g e n ee x p r e s s i o nm i c r o a r r a y s ：a2 1 “c e n t u r y t o o l f o rd i r e c t e dv a c c i n ed e s i g n v a c c i n e ，2 0 0 1 ，2 0 ：2 2 3 0 1 0s p a f o d o r ，r p r a v a ，x c h u a n e ta 1 m u l t i p l e x e db i o c h e m i c a la s s a y sw i t h b i o l o g i c a lc h i p s 怕 “m1 9 9 3 ，3 6 4 ：5 5 5 5 5 6 1 1 m ，s c h e n a m i c r o a r r a yb i o c h i pt e c h n 0 1 0 9 y e a t o np u b l i s h i n g ( u s a ) ，2 0 0 0 1 2 g j b o u l n o i s d r u gd i s c o v e r y i n t h e n e wm i l l e n n i u m ：t h ep i v o t a l r o a lo f b i o t e c h n o l o g y t r e n d sb i o t e c h n 0 1 ，2 0 0 0 ，1 8 ：3 l 一3 3 1 3 t r e s i s d r u gd is c o v e r yo f t h ef u t u r e ：t h ei m p l i c a t i o n so f t h e h u a ng e n o m e p r o j e c t t r e n d sb i o t e c h n 0 1 ，2 0 0 l ，1 9 ：4 9 6 4 9 9 1 4 m v a n d u i n ，h w o o l s o n ，d m a s o n ，e ta 1 g e n o m i c si nt a r g e ta n dd r u gd i s c o v e r y b i o c h s o c t r e n d s ，2 0 0 3 ，3 l ：4 2 9 - 4 3 2 1 5 a c p e a s e ， d s o l a s ，e j s u l l i v a n ， e ta 1 l i g h t g e n e r a t e do l i g o n u c l e o t i d e 浙江大学博士学位论文 a r r a y sf o rr a p i dd n as e q u e n c ea n a l y s j s 伢似 腑j 爿d兜f 吲，】9 9 4 ， 9 l 5 0 2 2 5 0 2 6 1 6 g m c g a l 】，l i g h t d i r e c t e ds y n l h e s i so fh jg h d e n s i t yo l g o n u c l e o t i d ea r r a y su s i n g s e m i c o n d u c t o rp h o t o r e s i s t s 厅口c 他上d & ，龇1 9 9 6 ，9 3 ：1 3 5 5 5 1 3 5 6 0 1 7 ，m s c h e n a ， d s h a l o n ，r w ， d a v i s ， e ta 1 q i l a n t i t a t i v em o n i t o r i n go f g e n e e x p r e s s i o np a t t e r n sw n hac o m p l e m e n t a r yd n am i c r o a r r a y 品f 期c b1 9 9 5 2 7 0 ：4 6 7 4 7 0 1 8 t t h o r s e n ，s j m a e r k l ，s r q u a k e m i c r o f l u i d i c l a r g e s c a l e i n t e g r a t i o n s c i e n c e 2 0 0 2 2 9 8 ：5 8 0 一5 8 4 1 9 q i a g e n i n c l i q u i c h i p “a p p l i c a t i o n sh a n 曲o o k ( 髓0 l ) h 丌：w w q i a g e n c o m 2 0 0 3 0 6 2 0 石岩，倪旭翔，陆祖康生物芯片测试方法进展光学仪器，2 0 0 3 ，2 5 ( 3 ) ：5 2 5 5 2 1 郑旭峰，王立强，倪旭翔，陆祖康光机二维扫描技术在激光共聚焦生物芯片扫描仪中 的应用光学仪器，2 0 0 3 ，2 5 ( 4 ) ：3 0 一3 4 2 2 w e b br h c o n f o c a lo p t i c a lm i c r o s c o p y r e p p r o g p h y s 1 9 9 6 ，5 9 ( 3 ) ：4 2 7 4 7 1 2 3 j w ，g r a t e ，c j b l e a ，a e j a r r e l l ，d p c h a n d l e r a u t o m a t e ds a m p l e p r e p a r a t i o nm e t h o df o rs u s p e n s i o na r r a y su s i n gr e n e w a b l es u r f a c es e p a r a t i o n s w i t h m u l t i p l e x e d f l o 霄c y t 伽e t r y f l u o r e s c e n c ed e t e c t i o n 且加 ，凸面，翻加组 2 0 0 3 4 7 8 ：8 5 9 8 2 4 h o uj f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n s t h el a t e xc o u r s e 2 0 0 0 ，5 1 7 1 9 ：( a m s t e r d ，t h en e t h e r l a n d s ) 2 5 ，r j e r r 0 1 df u l t o n ，r a l p hlm c d a d ，p e r r yls m i t h ，e ta 1 a d y a n c e dm u lt i p l e x e d a n a l y s