（分析化学专业论文）高效液相色谱化学发光联用技术研究.pdf

中周科学技术人学博= 卜学位论文 摘要 摘要 本论文综述了化学发光分析的原理、研究现状和最新进展。指出高效液相色 谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h p l c ) - - 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n c e ， c l ) 联用技术由于其将高效的色谱分离手段与高灵敏的化学发光检测技术结合 为体，已成为一种理想的超痕量分离分析工具，是分析化学目前研究热点之一。 但是目前可用于分析的化学发光体系较少，大大限制了h p l c c l 的分析应用范 围。基于此，本论文以进一步挖掘现有化学发光反应的分析应用潜力、发展 h p l c c l 分析新技术为出发点，系统研究了酚和苯胺类化合物对各种化学发光 体系的增强和抑制作用规律、机理和分析应用潜力。在此基础上，建立了系列 同时测定多种酚和苯胺类物质的高效液相色谱一化学发光检测新方法，并对其在 药物、环境、食品和生命科学中的应用进行了研究。其具体研究工作如下： 1 基于酸性条件下酚类物质对c e 4 + t w e e n2 0 体系的增强作用，建立了一 个同时测定水杨酸、间苯二酚、间苯三酚、对羟基苯甲酸、2 , 4 一二羟基苯甲酸和 问硝基酚的h p l c c l 方法。该法采用的流动相为甲醇和1 5 乙酸的混合物，使 用等度或者梯度洗脱进行。对所测试的六种化合物，检测限在1 4 0 5 0 2n g m l 范围内；对0 1i _ t g m l 化合物进行1 1 次平行测定的相对标准偏差为1 9 2 9 。 该法的检测限低于文献报道方法，并且其c l 反应和色谱流动相很好地兼容，使 用梯度洗脱不会导致c l 基线漂移，为h p l c 测定复杂体系中的酚类物质提供了 一个简单、快速、灵敏的途径。应用此方法，成功测定了皮炎呤酊剂中的问苯二 酚和水杨酸以及苹果汁中的对一羟基苯甲酸。 2 系统研究了3 6 种芳香族化合物在不同介质中对l u m i n o l d m s o o h 一 一h 2 0 体系的影响。发现二羟基酚和邻、对位取代的氨基酚以及苯二胺能抑制化 学发光；而具有三个或者三个以上羟基的酚( 间苯三酚除外) 能增强该体系化学 发光。通过对加入化合物前后c l 发光光谱图以及u v _ v i s 光谱图的变化，综合 探讨了抑制和增强化学发光反应的机理，提出其抑制或增强作用取决于化合物是 否消耗或者增加c l 体系中的超氧阴离子自由基( 0 2 一) 。基于抑制效应，建立了 测定对苯二胺、邻苯二胺、对氨基酚、邻氨基酚、间苯二酚和对苯二酚的h p l c - c l 中闺科学投术人学博i 学位论文 摘蛩 方法。对所测定的化合物，该法的检测限为0 2 1 3 2 3 5n g m l ，比文献报道方法 的检测限低1 - 3 个数量级；1 1 次平行测定的相对标准偏差为0 9 2 9 。最后， 应用该法成功地测定了氧化型染发剂和染发废水中的中间体。 3 基于反式白藜芦醇对l u m i n o l - k 3 f e ( c n ) 6 体系的增强作用建立了直接测 定葡萄酒中自藜芦醇含量的h p l c c l 分析法。使用的流动相为甲醇溶液 ( v v = 3 5 ：6 5 ) ，通过c 8 柱进行分离。该法无需任何前处理步骤直接进行定量分析。 该法测定反式白藜芦醇的线性范围为0 5 7 5 0n g m l ，检测限为0 1 7 n g m l ，1 1 次 平行测定的相对标准偏差为1 1 6 。该法的检测限比文献报道方法低1 2 个数量 级，并且无需任何前处理可对葡萄酒中的白藜芦醇直接进行分析。分析结果显 示，国产葡萄酒中的反式自藜芦醇的含量在o 1 6 1m 】范围内，平均含量为0 3 4 m g l ，回收率为9 2 2 1 1 4 7 。最后，通过c l 发光光谱图和u v - v i s 光谱图详 细讨论了化学发光的增强作用机理，认为自藜芦醇与k 3 f e ( c n ) 6 反应生成白藜芦 醇自由基，该自由基与溶解氧反应，使发光体系中的0 2 一含量增加，导致了化 学发光增强作用。 4 基于三羟基酚对l u m i n 0 1 k 3 f e ( c n ) 6 体系的化学发光增强作用，建立了 一个同时测定间苯三酚、没食子酸和焦醅酚的h p l c c l 分析方法。该法测定没 食子酸、间苯三酚、焦醅酚的检测限分别为0 1 9 、0 1 4 、o 2 6n g m l ，对1 0n g m l 化合物进行1 1 次平行测定的相对标准偏差分别为1 5 9 、o 7 3 和1 7 3 。该法 的检测限优于文献报道的方法，且无需预浓缩或衍生步骤，可直接进行测定。该 方法成功应用于血清中间苯三酚和宁泌泰胶囊中没食子酸的测定。最后，通过研 究c l 发光光谱图和u v - v i s 光谱图，分析了增强作用的机理，认为三羟基酚能 使发光体系中的0 2 一含量增加，导致了化学发光增强作用。 关键词：高效液相色谱流动注射分析化学发光酚类化合物苯胺类化合物 i i ! 里型堂垫查查兰翌主兰些丝壅 垒! ! ! ! ! ! ! a b s t r a e t t h e p r i n c i p l e ，a n a l y t i c a l a p p l i c a t i o n a n d r e c e n t d e v e l o p m e n t o f c h e m i l u m i n e s c e n c ef c l ) w e r er e v i e w e d d u et oac o m b i n a t i o nb e t w e e nap o w e r f u l s e p a r a t i o nt o o l - h i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n da n u l t r a s e n s i t i v ec ld e t e c t i o n ，h p l c c l t e c h n o l o g y i so f g r e a t i n t e r e s t sf u rt h e d e t e c t i o no ft h ea n a l y t e sa tu l t r a - t r a c el e v e li nc o m p l e xm a t r i c e sa n di sc u r r e n t l ya n i m p o r t a n ts u b j e c ti na n a l y t i c a lc h e m i s t r y n e v e r t h e l e s s ，t h ea n a l y t i c a la p p l i c a t i o no f h p l c - c ld e t e c t i o nh a sb e e nr e s t r i c t e dd u et or e l a t i v e l yf e w e rc l r e a c t i o n sa v a i l a b l e t h ea i mo ft h i sw o r ki st oe x t e n dt h ea n a l y t i c a lp o t e n t i a lo f p r e s e n tc lr e a c t i o n sa n d t od e v e l o pn e wh p l c - c l t e c h n o l o g i e s i n t h i sd i s s e r t a t i o n ，t h er u l e ，m e c h a n i s ma n d a n a l y t i c a la p p l i c a t i o no fe n h a n c e m e n to ri n h i b i t i o nb yp h e n o l sa n da n i l i n e so fs e v e r a l c lr e a c t i o n sw e r es t u d i e d o nt h i sb a s i s ，n e wh p l c c lm e t h o d sw e r e d e v e l o p e d f o r t h ed e t e r m i n a t i o no fn u m e r o u sc o m p o u n d si nc o m p l e xm a t r i c e sa n di t s a n a l y t i c a l a p p l i c a t i o n si np h a r m a c e u t i c a l ，e n v i r o n m e n t ，f o o d sa n d l i f es c i e n c e sw e r e i n v e s t i g a t e d t h er e s e a r c hw o r kw a si l l u s t r a t e di nd e t a i l e da sf e t t o w s ： 1 an o v e lm e t h o df o rt h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o n o fs a l i c y l i c a c i d ， r e s o r c i n o l ，p h l o r o g l u c i n o l ，p h y d r o x y b e n z o i ca c i d ，2 , 4 一d i h 【y d r o x y b e n z o i ca c i d a n d m n i t r o p h e n o lb yh p l c w i t hc ld e t e c t i o nw a sd e v e l o p e d t h ep r o c e d u r ew a sb a s e d o nt h ec h e m i l u m i n e s c e n te n h a n c e m e n tb yp h e n o l i cc o m p o u n d so ft h ec e r i u m ( i v ) 一 t w e e n2 0s y s t e mi nas u l f u r i ca c i dm e d i u m t h es e p a r a t i o nw a sc a r r i e do u tw i t ha n i s o c r a t i ce l u t i o no rw i t hag r a d i e n te l u t i o nu s i n gam i x t u r eo fm e t h a n o la n d1 5 a c e t i ca c i d f o rs i xp h e n o l i cc o m p o u n d s ，t h ed e t e c t i o nl i m i t sw e r ei nt h er a n g e1 4 0 - 5 0 2n g m la n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s ( r s d ) ( n = l 1 ) f o rt h ed e t e r m i n a t i o no f o 1 g g m lc o m p o u n d sw e r ei n t h e r a n g e1 9 - 2 9 c o m p a r e dw i t hm e t h o d si n l i t e r a t u r e s ，t h ep r o p o s e dm e t h o di sm o r es e n s i t i v et h a np r e v i o u sm e t h o d s m o r e o v e r ， t h ec lr e a c t i o nw a sw e l le o m p a t i b l ew i t ht h em o b i l ep h a s eo f h p l c ，n o b a s e l i n ed r i f t w a so b s e r v e d 、撕t hag r a d i e n te l u t i o n t h e r e f o r e t h ep r e s e n tm e t h o dd o e so f f e ra n i i i 中同科学投术人学博l 学位论文 a l t e r n a t i v e ，s e n s i t i v e ，a n ds i m p l ea p p r o a c hf o rt h ed e t e c t i o no fp h e n o l i cc o m p o u n d s s e p a r a t e db yh p l c t h e m e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no f s a l i c y l i ca c i da n dr e s o r c i n o li nd e r m a t i t i sc l e a rt i n c t u r ea n dp - - h y d r o x y b e n z o i ca c i d i na p p l e j u i c e s 2 t h ee f f e c to f3 6a r o m a t i cc o m p o u n d so nt h el u m i n o l d i m e t h y l s u l f o x i d e - o h 一h 2 0c lr e a c t i o nw a ss y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d i t w a sf o u n dt h a td i h y d r o x y b e n z e n e s ， a n do r t h o - a n d p a r a - s u b s t i t u t e da m i n o p h e n o l sa n dp h e n y l e n e d i a r n i n e si n h i b i t e dt h e c la n d p h e n o l s w i t ht h r e eo rm o r et h a nt h r e eh y d r o x y l se x c e p t p h l o r o g l u c i n o lt e n d e d t oe n h a n c et h ec l t h ec li n h i b i t i o no re n h a n c e m e n tm e c h a n i s mw a s p r o p o s e dd u e t ow h e t h e rs u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l ( 0 2 一) i nt h ec ls y s t e mw a sc o m p e t i t i v e l y c o n s u m e do ri n c r e a s e db yc o m p o u n d s b a s e do nt h ei n h i b i t e dc l ，an o v e lm e t h o df o r t h es i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o n o f p p h e n y l e n e d i a m i n e ，d p h e n y l e n e d i a m i n e ， p - a n a i n o p h e n o l ，d - a m i n o p h e n o l ，r e s o r c i n o l a n dh y d r o q u i n o n e b yh p l cw i t h c l d e t e c t i o nw a s d e v e l o p e d t h ed e t e c t i o nl i m i t sw a s i nt h er a n g eo f0 2 1 3 2 3 5n g m 1 t h ed e t e c t i o nl i m i t so f t h ep r o p o s e dm e t h o dw e r e1 3o r d e r so f m a g n i t u d el o w e rt h a n t h em e t h o d si nl i t e r a t u r e s t h ea n a l y t i c a lt i m ew a sl e s st h a n1 4m i n u t e s t h er e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tt h eh p l c c lm e t h o di ss e n s i t i v ea n d t i m e s a v i n gf o rt h ed e t e c t i o n o f a l lt e s t e d c o m p o u n d s t h e m e t h o dh a sb e e n s u c c e s s f u l l ya p p l i e d t od e t e r m i n e i n t e r m e d i a t e si no x i d a t i v eh a i rd y e sa n dw a s t e w a t e ro f s h a m p o o i n g a f t e rh a i rd y e d 3 b a s e do nt h ee n h a n c e m e n tb yt r a n s r e s v e r a t r o lo ft h ec h e m i l u m i n e s c e n c e f r o m l u m i n o l p o t a s s i u mf e r r i c y a n i d es y s t e m i na l k a l i n e m e d i u m ，a nh p l c - c l m e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft r a n s - r e s v e r a t r o li nr e dw i n e s s a m p l e sw e r es e p a r a t e do i l ac sc o l u m nu s i n gi s o c r a t i ce l u t i o no fm e t h a n o l w a t e r ( 3 5 ：6 5 ) q u a n t i f i c a t i o no f i r o n s r e s v e r a t r o li nr e dw i n e sw a sp e r f o r m e dw i t h o u ta n y s a m p l ep r e t r e a t m e n t i ta l l o w sf o r t h ed e t e r m i n a t i o no ft r a n s r e s v e r a t r o li nt h er a n g e 0 5 7 5 0n g m lw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 17n g m 1 t h er s d i s1 16 f o r10n g m l t r a n s r e s v e r a t r o l ( n = l1 ) t h ed e t e c t i o nl i m i to f t h ec ld e t e c t i o nw a s1 - 2o r d e r so f m a g n i t u d el o w e r t h a nt h o s em e t h o d si nl i t e r a t u r e s t h em e t h o di ss e n s i t i v e ，s e l e c t i v e ， s i m p l e ，r a p i da n d r e l i a b l e i tc a r lb eu s e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fi r o n s - r e s v e r a t r o li n w i n e s b y d i r e c ti n j e c t i o nw i t h o u ts a m p l ep r e t r e a t m e n t t r a n s - r e s v e r a t r o lw a sd e t e c t e d i v 中用科学技术人学博i 学位论文 i nc h i n e s er e dw i n e sw i t ht h er e c o v e r i e so f 9 2 2 1 1 4 7 c o n c e n t r a t i o n sr a n g e df r o m 0t o1 6 1 m g li nc h i n e s er e dw i n e sa n dt h em e a nv a l u ew a so 3 4r a g 1 t h ec l e n h a n c e dm e c h a n i s mw a sp r o p o s e dd u et ot h a tt h ef r n n s - r e s v e r a t r o lr e a c t e dw i t h p o t a s s i u mf e r r i c y a n i d et op r o d u c er a d i c a la n i o n ，f o l l o w e db yt h er e a c t i o nw i t h0 2 t o g e n e r a t e0 2 一，i n c r e a s i n g0 2 一c o n c e n t r a t i o n ，r e s u l t i n gi nc l e n h a n c e m e n t 4 i tw a sf o u n dt h a tt r i p h e n o l sc o u l de n h a n c et h e l u m i n o l f e r r i c y a n i d e c l r e a c t i o n b a s e do nt h i sc lr e a c t i o n ，a n o v e lm e t h o df o rt h es i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no fp h l o r o g l u c i n o l ，g a l l i ca c i da n dp y r o g a l l o lb yh p l cw i t hc l d e t e c t i o nw a sd e v e l o p e d t h ed e t e c t i o nl i m i t so fg a l l i ca c i d ，p h l o r o g l u c i n o la n d p y r o g a l l o l w e r e o 1 9 ，o1 4 ，0 2 6n g m l ，r e s p e c t i v e l y t h er s d ( n 3 1 1 ) f o rt h e d e t e r m i n a t i o no f1 0n g m lc o m p o u n d sw o r e1 5 9 ，o 7 3a n d1 ，7 3 ，r e s p e c t i v e l y t h e d e t e c t i o nl i m i t so ft h e s ep h e n o l i cc o m p o u n d su s i n gt h ep r o p o s e dm e t h o dw e r em u c h 1 0 w e rt h a nt h o s eo ft h em e t h o d si nl i t e r a t u r e st h em e t h o da l l o w sf o rs i m u l t a n e o u s a n ds e n s i t i v ed e t e c t i o no fc o m p o u n d sw i t h o u tp r e c o n c e n t r a t i o no rd e r i v a t i z a t i o ns t e p t h em e t h o dh a sb e e ns u c c e s s f u l l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fp h l o r o g l u c i n o li n s e l x l ma n dg a l l i ca c i di nn i n m i t a ic a p s u l e t h ee n h a n c e dm e c h a n i s mw a sp r o p o s e d b a s e do nt h er e s u l t so fc la n du vs p e c t r u m i tw a ss u g g e s t e dt h a tt r i p h e n o l sa r e o x i d i z e db yf e r r i c y a n i d et op r o d u c ep h e n o x y lr a d i c a l s ；p h e n o x y lr a d i c a l sr e a c tw i t h 0 2o rl u m i n o ia n i o n t of o r m0 2 一o rl u m i n o l r a d i c a l s ，l e a d i n gt ot h ec l e n h a n c e m e n t k e y w o r d s ：h p l c f i ac l p h e n o l s a n i l i n e s v 中罔科学挫术人学搏l 学位论文 第一章文献综述 化学发光的发展历史及特点 化学发光( c h e m i l u m i n e s c e n e c e ，c l ) 可定义为在一些化学反应中，吸收了 反应所释放的化学能而处于电子激发态的反应中间体或反应产物从激发态回到 基态时所产生的一种光辐射。人们把通过化学反应产生的光现象称之为化学发 光，而把生物体内的发光和有酶参与的化学反应产生的光成为生物发光 ( b i o l u m i n e s c e n c e ，b l ) 。从化学角度来说，上述发光都经历了化学反应，因此， 通常人们也把生物发光纳入化学发光的范畴。 自然界存在着丰富多彩的发光现象，大气上空的晚霞是最常见的一种气体化 学发光，萤火虫和一些海洋生物的发光是一种最常见的生物发光。1 5 世纪，德 国医生b r a n d 发现某种“白色磷光体”能在黑暗中持续发光，此现象被广泛地 关注。1 9 世纪后期，法国生理学家d u b i o s 首次解释了发光的化学机制，把发光 现象归属于一种相对简单的有机反应。1 8 7 7 年，r a d z i s z e w s k i 【l 】发现了洛酚碱 ( 2 ，4 ，5 一三苯基眯唑) 在碱性介质中被过氧化氢等试剂氧化而发出绿色的光。 1 9 2 8 年，a l b r e c h t 【2 观察到鲁米诺( 3 - 氨基二甲酰肼) 在碱性介质中的化学发 光行为。1 9 3 5 年，g l e u 和p e t s c h 3 报道了光泽精( n ，n 二甲基二丫啶硝酸盐) 与过氧化氢反应产生化学发光。然而，大多数化学发光非常微弱，且存在寿命很 短，化学发光的研究发展缓慢。直n - 十世纪6 0 年代，随着电子技术的迅速发 展，集成电路的广泛使用，高灵敏度光电倍增管的出现，化学发光反应才逐渐应 用于分析化学。而到八十年代，随着分析仪器的发展，化学发光新体系的发现， 化学发光丌始广泛地应用于化学分析、环境科学、生命科学和医学等领域【4 1 l 】。 近年来，随着发光免疫分析技术及荧光素酶报告基因的应用，化学发光已逐步形 成一个产业 1 2 】，特别是在某些关键技术，如生物传感器 1 3 1 、基因序列分析 1 4 1 、 活体细胞a t pf 1 5 ，1 6 的测定等方面取得的一系列重大突破，使化学发光的应用 范围进一步扩大，几乎涵盖了现代科学的各个领域。 化学发光分析法不需要外部光源，消除了瑞利散射和拉曼散射，同时也克 中闭利学技术人学f 雌i 学位沦文第一章义献综述 服了光源不稳定而导致的波动的缺点，从而降低了噪声，提高了信噪比。再加 上灵敏的光电检测技术，使该法具有灵敏度高( 通常可达纳克级或皮克级) 、线 性范围宽( 通常可达三个数量级) 、仪器设备简单、分析快速、易实现自动化等 优点。这样，化学发光检测法就成为一种有效的痕量及超痕量分析技术，非常适 合于环境、生物、医学、临床化学等领域复杂、低含量组分的分析。 2 化学发光分析的原理 化学发光现象是化学激发过程中产生的结果，而这一激发过程是借助于化学 反应使分子的总能量有所提高。一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以 下条件：第一是该反应必须提供足够的激发能，并由某一步骤单独提供，因为前 一步反应释放的能量将因振动弛豫消失在溶液中而不能发光；第二是要有有利的 反应过程，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态；第三是激 发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子，或者能够转移它的能量 给另一个分子使之进入激发态并释放出光子。当某一处于激发态的分子发射光 子，即按量子力学允许的途径跃迁返回到较低能态时，其能量e 的改变与辐射频 率两者间的关系服从下列方程式： 巨一e 2 = a e = h v ( 1 - 1 ) 上式中h 为普朗克常数，v 为辐射频率。 1 出于化学发光不包含热和电功，因此，化学发光反应所需的自由能变化可 由下列公式计算： 一a g h c 无， ( 1 - 2 ) 上式中h 为普朗克常数，c 为光速，五。为激发分子发射的长波波长的上限。如果 五。的单位为r l i i l ，则对1m o l 物质而言有： 一a g h e 丸2 8 5 7 1 0 4 千卡五。摩尔 ( 1 _ 3 ) 由式( 1 3 ) 可知，4 0 0 7 5 0r i m 的可见光发射所需要的a g 的数值应在7 1 3 8 千卡之间。许多具有过氧化物中间产物的氧化反应都可以满足这个要求，在分解 2 叶t 田科学投术入学博 j 学位论义 筇一帝文献综述 时，过氧化物将多余的能量传递给适当的接受体，如反应剂、产物或特选的添加 剂。 化学发光从不同的角度划分可分为以下几种类型：若某一化学反应生成了某 种电子激发态的产物，当电子回到基态时，以辐射光的形式释放能量，这种反应 为直接化学发光反应。反应过程如下所示： a + b j c + d ( 1 4 ) c 斗c 十h v ( 1 5 ) 若是反应最初生成的激发态中间体不发光，而是将激发能转移到其他能量受 体上导致其他物质发光，这叫做间接化学发光反应或者敏化化学发光反应。反应 过程为： c + f 斗c + f ( 1 6 ) ，哼f + h v( i 7 ) 间接化学发光反应产生的光谱，不是来自于化学发光试剂本身，而是来自于 荧光受体。因此，该反应可通过选择荧光物质使激发与发射波长、化学稳定性与 量子产率联系起来。 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度( i c l ) 或发光总量来确定反应中 相应组分含量的分析方法叫做化学发光分析。化学发光反应之所以能用于分析测 定，是因为化学发光强度与化学反应速度相关联，因而一切影响反应速度的因素 都可以作为建立测定方法的依据。 在任一给定的时间t 时，i c l 可用下列方程式表示 1 7 j ： 1 ( z = 政z d e ( t ) d t ( 1 8 ) 上式中d c ( t ) l d t 为特定时间化学发光反应速度，政。是化学发光的量子产率。对 某一个化学反应为一常数，其反应速度可按质量作用定律表示出与反应体系中物 质浓度的关系。因此，通过测定化学发光强度就可以测定反应体系中某种物质的 浓度。原则上讲，对任何化学发光反应，只要反应是一级或假一级反应，都可以 通过公式( 1 - 8 ) 进行化学发光定量分析。例如，在直接化学发光反应中，如果物质 b 保持恒定，而物质a 的浓度变化可视为一级或假一级反应，则： 3 中同科学技术人学博i j 学位论文第乖史献综述 l ? f1 1 c 1 ( o d t = 沁 洲( 0 d t ) d t = c 。( 1 - 9 ) 即化学发光强度与a 的浓度成正比，据此，可进行a 物质的定量分析。 3 化学发光法测定的分析物的分类 化学发光分析测试的物质通常可以分为以下三类：第一类物质是化学发光反 应中的反应物，这类物质可由化学发光发应直接测定；第二类物质是化学发光反 应中的催化剂、增敏剂或抑制剂，这类物质可被间接测定：第三类物质是通过偶 合反应，间接测定有机或无机化合物。 3 1 被测物作为反应物参与化学发光反应 在直接化学发光反应中，被测物a 或b 都可以直接被测定。例如，在碱性条 件f ，光泽精可以与一些还原性的物质反应产生发光，可以借此来测定这些还原 性的物质，如抗坏血酸 1 8 ，1 9 ，2 0 、还原性糖 1 9 ，2 1 、尿酸 2 0 ，2 1 、碱性磷 酸酶 2 2 等。何治柯等用四价c e 直接氧化化学发光反应测定了尿样和草酸一：乙 酯中的草酸盐及游离的草酸 2 3 ，2 4 。根据c i o 。对鲁米诺的氧化作用，可用于测 定c i o 。，其他物质如c 1 2 的干扰可用流动注射法消除 2 5 。 3 2 被测物作为催化剂或能量接受体等参与化学发光反应 许多化合物的分析都是采用鲁米诺发光体系。通常情况下，所采用的氧化剂 是过氧化氢，一般情况下此反应进行得非常缓慢。但当有某些催化剂存在时，反 应非常迅速。最常用的催化剂是金属离子，在很宽的范围内，金属离子浓度与发 光强度成正比，从而可以用来分析某些含有金属离子的有机化合物，灵敏度相当 高。这类反应是化学发光测定无机物的主要反应。例如环境水样中，c r ( i i i ) 和 c r ( 1 v ) 【2 6 2 8 、c u 2 9 、f c ( i i i ) 和f e ( i i ) 3 0 - 3 2 1 、m n ( i i ) 【3 3 ，3 4 等的 测定都是根据金属离子对鲁米诺发光反应的强催化作用来进行的。 4 中罔科学技术人学博卜学位论殳筘一章义献综述 在有机物中，很多物质对化学发光反应具有增强或者抑制作用，其增强或者 抑制的强度与有机物浓度之间存在着一定的关系，据此可划有机物进行定量分 析。这类反应是有机物化学发光分析的重点。如基于环己基氨基磺酸钠对c e ( i v ) 氧化s 0 32 的敏化作用【3 5 ，可检测1 5 0m g l 的敏化剂，其他甜性物质的干扰可 以通过分离消除。对碘酚、对香豆酸、乙萘酚能增强鲁米诺一过氧化氢一辣根过 氧化酶反应，基于此的生物传感器测定上述物质的检测限为o 8 3m u m 【3 6 。本 实验室利用二元酚类有机物对鲁米诺一铁氰化钾体系的抑制作用，结合高效液相 色谱，成功测定了邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚、原儿茶酸、绿原酸、对叔丁 基邻苯二酚 3 7 。 某些物质在反应过程中，能将产生的能量传递给荧光体，使荧光体处于激发 态，当激发态的荧光体释放能量时，产生发光。在荧光体浓度较低时，发光强度 与荧光体浓度成正比，基于这一原理可测定荧光化合物。过氧草酰类化学发光反 应即属于此类。多环芳烃( 如芘) 和氨基多环芳烃( 如氨基芘) 是良好的化学发 光能量接受体，利用它们的荧光特性，结合h p l c 分离，可直接用双( 2 ，4 ，6 一 三氯苯) 草酸酯( t c p o ) 化学发光进行柱后检测 3 8 ，3 9 】。 3 3 被测物通过偶合反应参与c l 反应 所谓偶合反应就是将能产生或者消耗化学发光反应物的一个( 或一系列) 反 应与另外一个化学发光反应结合起来，实现某些物质的间接化学发光测定。该方 法一般具有灵敏度高、专一性强的优点，广泛应用于生物物质的分析。 通过柱后酶反应器或者光化学反应器，可使某些物质转化成h 2 0 2 ，以化学 发光法测定h ：0 2 ，可间接测定这些物质。如用柱后固定化胆碱氧化酶和乙酰胆 碱氧化酶将胆碱和乙酰胆碱转化成h 2 0 2 ，结合化学发光检测，分析尿液中的胆 碱和乙酰胆碱4 0 。此外，此法还可用于葡萄糖【4 0 、l 一氨基酸 4 0 、多胺【4 1 及胆搿醇 4 2 等的分析。将柱后光化学反应器和固态革酸酯( 如t c p o ) 化学 发光反应器相偶合，可用来测定醌、蒽醌、脂肪族醇、醚、醛、胺等物质 4 3 ，4 4 。 5 中困科学技术人学博卜学位论义 第一带义献综述 4 化学发光体系 化学发光分析在分析化学领域h 益为人们所瞩目，但是，能用于化学发光分 析的反应相对较少。为此，分析工作者做了各种努力。其中，将1 日的发光体系和 其他一些反应相偶合而建立起来的偶合化学发光体系，大大地扩大了化学发光分 析的应用范围，将化学发光引向了生物、医学各个领域。另外，探寻新的发光试 剂，建立高特效的化学发光体系，改善化学发光分析法的选择性，一直是研究的 重点。下面简要介绍各种化学发光体系。 4 1 酰肼类发光体系 近百年来，酰肼类化合物在化学发光分析中已经得到了广泛的研究和应用。 它们具有发光效率高、试剂稳定、反应可在水相中进行等优点。鲁米诺是这类物 质的代表。自从a l b r e c h t 2 】于1 9 2 8 年观察到鲁米诺在碱性介质中的化学发光行 为以来，人们对它进行了深入的研究。鲁米诺在碱性条件下能被一些氧化剂( 如 h 2 0 2 、0 2 、c i o 、1 2 、k 1 0 4 、a u c l 4 ) 丽氧化发出蓝色的光。其发光量子产率介 于0 0 1 0 0 5 之间 4 5 ，在水介质中，最大发射波长为4 2 5t i n l 4 6 】。其发光机理 如s c h e m e1 1 所示： h v + s c h e m e1 1 0 h _ h ，o ， c 0 0 c 0 0 - c 0 0 c o o 利用鲁米诺化学发光体系，不但可以测定很多金属离子 2 6 3 4 ，还可以测 6 c j 田科学拉术大学博十学位论文第一幸文献综述 定很多无机物和有机物，如水中的溶解氧【4 7 、n 0 2 4 8 、卤素 4 9 、硫 5 0 】等 都能使鲁米诺产生化学发光。有机物中的氨基醇类，以及带有n 0 2 、n h 2 、o h 的苯的衍生物 5 1 ，5 2 ，还有些还原剂如抗坏血酸 5 3 等对l u m i n o l h 2 0 2 c u p 发光体系具有抑制作用，据此可对这些物质进行测定。同时，火量鲁米诺的衍生 物可用于标记其它分子包括生物分子等 5 4 - 5 6 ，丌拓了l u m i n o i 体系的应用范 围。 4 2 吖啶酯类发光体系 光泽精( l u c i g e n i n ) 是这类体系的代表物，其化学名称为n ，n 一二甲基二吖啶 硝酸盐。它在碱性条件下被氧化时发出波长为4 7 0r t l t t 的光 5 7 】。它的发光量子 效率介于0 0 1 0 0 2 之间 5 8 】。在碱性介质中，过氧化氢将其氧化成四元环过氧 化物中间体，而后裂解生成激发态的吡啶酮丽发光，其发光枫理如s c h e m e1 - 2 所 示： w + o 一叩+ 叩 00 光泽精是使用较早的一种试剂，现在仍用于化学发光分析。例如，用光泽精 发光体系测定金属离子【5 9 】，抗坏血酸【2 0 】以及碱性磷酸酶 2 2 】等。6 0 年代以半 7 b c 0丫 中同科学技术大学博十学位论文 第一章文献综述 个光泽精分予独自合成了一组吖啶酯，它的量子产率高( 1 ) ，反应速度快( 9 0 的发光在l 1 0s 内完成)