（食品科学与工程专业论文）巴氏杀菌奶中优势微生物预测模型的建立及风险评估.pdf

摘要 从不同批次的巴氏杀菌奶中分离出优势菌，经生理生化实验和a p i 细菌鉴定系统，鉴定其 为假单胞菌和蜡样芽孢杆菌，确定这两种菌为建立预测模型的目的微生物。 采用b a r a n y i 方程为一级模型，r a t k o w s k y 方程为二级模型，建立了假单胞菌和蜡样芽孢杆 菌混合生长的预测模型。分别测定两种菌在5 ，7 ，1 0 ，1 3 ，1 6 c 生长曲线，用b a r a a y i 方程拟合生 长曲线，得出特定温度下的生长速率和迟滞期。对一级模型的统计验证表明，一级模型拟合曲 线的相关系数r 2 都在0 9 5 以上，标准误在0 5 以下，模型的拟合度较好，且假单胞菌生长曲线 的拟合度总体上大于蜡样芽孢杆菌的生长曲线的拟合度。 采用线性回归，将一次模型的参数代入r a t k o w s k y 方程，可得n - - - - 次模型，即生长速率和 迟滞期随温度变化的回归方程。各线性模型的相关系数最小为0 9 1 4 ，最大为o 9 6 7 ，均达到了 o 9 0 以上，回归方程的标准误在o 0 2 5 4 - 0 0 7 1 9 之间，则回归方程在显著水平( n ；o 0 5 ) 上差 异显著。模型的拟合度较高。对模型的验证结果表明，的残差都在土0 0 5 范围内，可认为预 测模型在= 0 0 5 的水平上是可信的。假单胞菌和蜡样芽孢杆菌的偏差因子分别为0 8 1 4 和 1 0 2 1 ，准确因子分别为1 2 9 4 和1 0 9 1 ，均在可接受范围内，且与文献报道的数值较为一致，因 此模型预测结果可信。因此，一级预测模型和二级预测模型能够有效地预测蜡样芽孢杆菌和假 单胞菌在5 1 6 范围内的生长情况，为巴氏杀菌奶的安全性和质量评价提供定量的数据。 将预测模型应用于定量风险评估，用m o n t ec a r l o 分析来模拟各风险因子的对蜡样芽孢杆 菌在运输、储藏和消费过程中的数量变化，确定了消费时的浓度分布。通过敏感性分析，确定 了对蜡样芽孢杆菌细胞浓度影响最大的因素为家庭储藏的温度和时间。因此要建议消费者在消 费阶段降低巴氏杀菌奶的储藏温度，缩短储藏时间。 关键词：食品安全，巴氏杀菌奶，假单胞菌，蜡样芽孢杆菌，预测模型 a b s t r a c t t h ep r e d o m i n a n tb a c t e r i ai np a s t e u r i z e dm i l lw e r ei s o l a t e df r o mp a s t e u r i z e dm i l ko fd i f f e r e n tb a t c h e s t h r o u g hp h y s i o c h e m i c a le x p e r i m e n t sa n da p ib a c t e r i ai d e n t i f i c a t i o ns y s t e m ，t h ep m d o m i n a l l t b a c t e r i aw c l a g i d e n t i f i e da sp s e u d o m o n a ss p a n db a c i l l u sc e r e l 话a n dw e r eu s e da st h et a r g e t m i c r o o r g a n i s m st oe s t a b l i s hp r e d i c t i v em o d e l s p r e d i c t i v em o d e l sw e r ee s t a b l i s h e dt op r e d i c tt h em i x e dg r o w t hk i n e t i c so fp s u d o m o n a ss p a n d b a c i l l u sc e r e u s ，u s i n gb a r a n y ie q u a t i o na sp r i m a r ym o d e la n dr a t k o w s k ym o d e la ss e c o n d a r ym o d e l t h eg r o w t h “l l v e sa t5 ，7 ，1 0 ，1 3 ，1 6 cw e i em e a s u r e da n df i t t e dw i t l lb a r a n y im o d e l ，f r o mw h i c h t h eg r o w t hr a t e sa n dl a gt i m e su n d e re a c ht e m p e r a t u r ew e r ec a l c u l a t e d t h es t a t i s t i c a lv a l i d a t i o no f p r i m a r ym o d e l ss h o w e dt h a t c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t so fa l lf i t t e dg r o w t hc u r v e sw e r el a r g e rt h a no 9 5 a n dt h es t a n d a r de r r o l sw e r eb e l o w0 5 ，i n d i c a t i n gag o o df i t t i n gd e g r e eo f t h em o d e l s i na d d i t i o n ，t h e f i t t i n g d e g r e eo f p s u d o m o n a ss p ，w a s g e n e r a l l y b e t t e r t h a n t h a t o f b a c i l l u sc e r e u $ t h es e c o n d a r yi i 日d c l ，w h i c hd e s c r i b e dt h ec h a n g eo fg r o w t hr a t ea n dl a gt i m ew i t ht i m e ，w a s o b t a i n e db yi n c o r p o r a t i n gt h eg r o w t hp a r a n ：e t g r so fp r i m a r ym o d e li n t or a & o w s k ye q u a t i o nw i t h l i n e a rr e g r e s s i o nt e c h n i q u e t h ea v e r a g ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t so fl i n e a rm o d e l sr a n g e df r o mo 9 1 4 t 0o 9 6 7 w i t ha l la v e r a g eo fo v e r0 9 0 t h es t a n d a r d 目l o r s 咄b e t w e e n0 0 2 5 4t oo 0 7 1 9a n dt h e r e g r e s s i o ne q u a t i o ns h o w e das i g n i f i c a n td i 舟e c r e l l c ea tt h el e v e lo faz o 0 5 t h es e c o n d a r ym o d e l s w e r ev a l i d a t e dt i 嘧o u g hp l o t t i n gm e t h o da n ds t a t i s t i c a lm e t h o d t h er e s u l ts h o w e dl l l a lt h em o d e l s w 盯es t a t i s t i c a l l yr e l i a b l ea ta2o 0 5f o f 龇r e s i d u e so fq mf e l lw i t h i nt h er a n g eo f 士0 0 5 t h eb i a s f a c 0 吣a n d a c c u r a c y f a c t o r so f p s e u d o m o n a ss p a n d b a c i l l u s c e l ) l l $ w e i e o 8 1 4 a n d l 0 2 1 a n d l 2 9 4 a n d1 0 9 1 ，r e s p e c t i v e l y t h ev a l u e so f b i a sf a c t o ra n da c c u r a c yf a c t o ra g r e e dw i t ht h o s ei nl i t e r a t u r e a n dw e r ea c c e p t a b l es t a t i s t i c a l l y a sar e s u l t , t h ep n m a r ym o d e l sa n ds c c o i l d a r ym o d e l se s t a b l i s h e di n t h i sp a p e rc o u l de f f e c t i v e l yp r e d i c tt h eg r o w t hk i p m t i c so fp s e n d o m o n u ss p a n db a c i l l u sc e r e u sa t 5 - 1 6 c ，a n d p r o v i d e q u a n t i t a t i v e d a t a f o r e v a l u a t i n g t h es a f e t y a n d q u a l i t y o f p a s t e u r i z e d m i l l m o n t ec a r l os i m u l a t i o nt e c h n i q u ew a su s e dt os i m u l a t et h ei n f l u e n c eo f e n v i r o n m e n t a lf a c t o r so nt h e n u m b e ro fb a c i l l u sc e r e u sd u r i n gt r a n s p o r t a t i o n , s t o r a g ea n dc o n s u m p t i o n t h em a t h e m a t i c a l d i s t r i b u t i o no fe e l lc o n c e n t r a t i o na tt h ee n do fc o n s u m p t i o nw a sd e t e r m i n e dt h r o u g hs e n s i t i v i t y a n a l y s i s h o m es t o r a g e 石m ea n dt e m p e r a t u r e 瓢r c 糟i d e n t i f i e da st h ef a c t o r st h a th a v et h el a r g e s t i m p a c t s o i lt h en u m b e ro f b a c i l l u sc e r e l 口 k e yw o r d s ：f b o ds 琥吼p a s t e u r i z e dr m l l ，p s e u d o m o n a ss p ，b i l l u sc e r e u s ，p r e d i c t i v em o d e l s i i 独创性声明 y9 3 9 2 6 8 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 巷敏时间；钆，石年6 月叫日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名： 苍致 芬钙 时间：诫年月2 日 时间： 加二年g 玛王 日 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 当奶从奶牛身上被挤出，称为原料奶。然后必须经过杀菌消毒，以达n - - 个目的，其一是 杀死致病微生物，如结核杆菌、大肠杆菌等；其二是杀死奶中的微生物代谢的酶类；其三是最 大限度地保证生奶的营养。目前主要有两种杀菌方式：巴氏消毒和超高温灭菌。巴氏消毒工艺 采用7 2 7 5 c 自n 热1 5 - 2 0 秒，超高温灭菌法( u h t ) 采用1 3 8 1 4 2 c 加温2 4 秒。由于巴氏消毒 工艺比较温和，所以只将原料奶中对人体有害的细菌和部分酶杀死并同时最大程度地保留其营 养成分，经巴氏灭菌法消毒的牛奶被称为“巴氏奶”，是国际公认的真正的新鲜牛奶。而超高 温灭菌法则瞬时消灭了细菌和酶，经此法消毒的牛奶在无菌状态下包装，保质期大大延长，所 以被称为常温奶。 巴氏消毒工艺对奶源的质量要求很高国内标准每吨原奶的细菌含量不得超过2 0 万个， 国际标准不得超过5 万个。而超高温灭菌法对奶源没有要求。而且，“巴氏鲜奶”对运输提出 更高的要求，需要全程4 1 0 “冷链”保存，保质期不超过1 0 天，因此对消费者而言，“巴 氏鲜奶”也就更新鲜，更营养。而常温奶无须冷藏，保质期可达6 1 2 个月，行业内称之为“牛 奶罐头”。 1 2 影响巴氏杀菌奶货架期的主要微生物 巴氏杀菌奶营养丰富而且配比合理，是一种天然的微生物培养剂，因此种种细菌、酵母、 霉菌以及病毒都极易在其中生存并高速繁殖。事实上，当牛奶早在牛的乳房中还没有被挤出之 前，可能就有微生物在其中活动了。随着牛奶被挤出、贮存、运输，甚至在杀菌加工之后，稍 有疏忽微生物始终都有可能在其中存活。实际生产证明。无论如何强化热处理还会存活微生物， 绝对无菌是不存在的。巴氏杀菌奶只是达到了商业无菌要求。原料中既含有细菌的营养细胞， 也含有细菌的芽孢，牛奶经巴氏灭菌后，大多数致病菌和腐败菌被杀死达到商业无菌，但有 些嗜热芽孢菌和嗜冷菌不能杀死。形成芽孢的有芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、芽孢乳杆菌，脱硫 胎状菌和芽孢八叠球菌5 个属。在低温条件下，嗜冷菌多见的细菌有假单胞菌属、产碱杆菌属、 无色杆菌属、黄杆菌属、克雷伯氏菌属。这些菌在冷藏条件下能迅速繁殖，虽然这些菌经过加 热可被杀死，但它们产生的非常耐热的蛋白酶和脂肪酶即使经过处理，仍会有的残留，有些对 牛奶的成份起化学作用而不利于保藏。有些致病菌，如葡萄球菌、结核菌、溶血性链球菌、病 原性大肠菌、沙门氏菌、李斯特菌、布鲁氏菌、肉毒杆菌等，一旦存活在牛奶中，就会引起人 们食物中毒，或传染上疾病( 伍良军，2 0 0 4 ) 。 嗜冷菌在贮存期间，能产生热稳定性胞外降解性酶类( 主要是蛋白酶、脂肪酶和碱性磷酸 脂酶) ，在巴氏消毒过程中基本不受影响，这类热稳定性胞外蛋白酶和脂肪酶甚至经过巴氏杀菌 处理后仍能保持部分活性，造成乳及乳制品风味及质地上的变异，主要表现为( 范江平，2 0 0 3 ) ： 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 蛋白酶分解乳蛋白后，导致产品发苦，水解过程中释放的氨基酸会使褐变反应加剧，分 解k 酪蛋白，引起蛋白胶凝化。 分解脂肪后，导致游离脂肪酸增加，导致产品发生变化，如出现苦味或腐败味。 另外，其中的某些致病菌如蜡样芽孢杆菌可能产生非常耐热的毒素这些毒素经超高温处 理后仍有少量残留，消费者饮用了这种产品后，会导致中毒。 目前用于检测生奶中嗜冷菌数量的方法有多种，最常见的方法是在5 7 培养1 0 d 后计数， 或将样品2 l 增菌培养后，采用选择性培养基在2 1 培养2 5h 后，将样品中g 杆菌作为嗜冷 菌污染的指标，这些方法比较繁琐，在时间耗时较长，并且作要在细胞浓度达到相当的数量级 才能被检测到，而此时巴氏奶已经开始腐败了，因此传统方法具有明显的滞后性。其预测只适 于特定的测试条件，任何条件( 如加工，储存条件) 的改变都会降低其可靠性，因此这种试验 的预测价值有限。另外，这类方法是诊断性而非预测性的，只能确定食品是否变质，而不能及 早判定变质的程度( m c m e e k i n ，1 9 9 6 ) 。近年来兴起的预测微生物学可以对巴氏杀菌乳贮存中 微生物的生长和死亡情况提出合理的预测，有助于确定产品的货架期。 1 3 预测微生物学及其在巴氏杀菌奶安全控制中的应用 预测食品微生物学( p r e d i c t i v ef o o d m i c r o b i o l o g y ) 是一门在微生物学、数学、统计学和应 用计算机科学基础上建立起来的新兴学科。它的发展方向是研究和设计一系列能描述和预测微 生物在特定条件下生长和死亡的模型。它是依据各种食品微生物在不同加工、储藏和流通条件 下的特征信息库，通过计算机的配套软件，判断食品内主要病原菌和腐败菌生长或残存的动态 变化，从而对食品的质量和安全性做出快速评估的预测方法( m c m e e k i n ，1 9 9 3 ) 。它可以预测产 品生产后的储藏、运输、销售、消费等各个环节的质量和安全性，比传统方法具有快捷、简便、 高效等优点。 1 3 1 预测微生物模型简介 预测微生物模型假设，食品或模型系统中的微生物生长或失活，在正常生物差异限度内是 可以预测的，也能够用若干数学方程式描述。有许多不同的预测模型分类方法，一般根据w h i t i n g 和b u c h a n a n ( w h i t i n g , 1 9 9 5 ) 的分类方法将模型分为两个大类，即生长模型和失活存活模型。 然后每个模型具有三个不同层次的模型水平。 1 3 1 1 初级模型( p r i m a r ym e d e i ) 初级模型主要表达微生物数量与时间的函数关系。模型的微生物定量为每毫升菌落形成量 ( c f u m 1 ) ，毒素的形成，底物水平、代谢产物等。初级模型包括m o n o d 方程、g o m p e r t z 方 程、l o g i s t i c 方程，b a r a n y i 方程等。其中最为常用的是o o m p e r t z 方程，通过非线性回归可从该 方程解出迟滞期( x ) 、比生长速率( “) 和细胞最大近似浓度( a ) 三个变量。 1 3 1 2 次级模型( s e c o n d a r ym o d e l ) 次级模型主要表达初级模型的参数( x 、a 等) 与环境变量( 温度、p h 值、a 、气体 浓度等) 之间的函数关系。较为常用的有响应面模型( r e s p o n s es u r f a c em o d e l ) 、平方根模型 2 中圄农业大学硕士学位论文 第一章绪论 ( s q u a r e r o o t m o d e l ) 、a r r h e n i 哪模型、r a t k o w s k y 模型等。 1 3 1 3 三级模型( t e r t i a r ym o d e l ) 三级模型主要指建立在初级和次级模型之上的电脑应用软件程序。这些程序可以在计算机 上运行，随时反映在既定的环境条件下，微生物数量与环境条件参数的对应关系。 1 9 9 2 年，英国农业、渔业与食品部( u km i n i s t r yo f a g r i c u l t u r ef i s h e r i e sa n df o o d ) 发起建 立了商业化的软件包食品微模型( f o o dm i c r o m o d e l ) ，预测1 2 种病原菌的生长和死亡 ( m c c l u r e ，1 9 9 4 ) 。 与此相应，美国农业部( u s d a ) 也建立起以c o m p e r t z 方程和反应表面方程为基础的的病 原菌模型程序( p a t h o g e n m o d e l i n g p r o g r a m ) 。用户可以选择目的微生物，输入环境变量的值， 从而得出预测的微生物的迟滞期和代时以及生长图表。随后，美英两国认识到，有必要共同建 立一个联合统一的模型数据库，来整合资源，避免重复建模。在第四届国际预测性食品模型会 议上，两国科学家宣布，将在因特网上共同建立世界上最大的预测微生物学信息数据库。该数 据库以食品微模型软件和病原菌模型程序为基础，又增加了科研院所、大学、企业以及文献资 料提供的数据，目前拥有约2 5 0 0 0 个有关微生物生长和存活的数据档案，可以在因特网上免费 下载( w w w c o m b a s e c c ) 。c o m b a s e 的国际性信息共享计划，已经在为全世界的食品安全专家 提供帮助，使他们能够更好地改进食品加工条件以避免有可能出现的卫生问题。 其它三级模型有：澳大利噩t a s m a n i a 大学建立的假单胞菌预测软件( p s e u d o m o n a sp r e d i c t o r ) ， 预测乳制品中假单胞菌的生长( n e u m e y e r , 1 9 9 7 ) ；还有海产品腐败预测软件( s e a f o o ds p o i l a g e p r e d i c t o r ) 预测海产品在恒定和波动温度下储藏时的货架期；与之类似的食品腐败预测软件( f o o d s p o i l a g ep r e d i c t o r ) 预测水分活度和波动温度对嗜冷假单胞菌的影响。 1 3 2 模型的验证 任何模型在使用之前都要验证其有效性。迄今为止没有模型验证的标准方法，已经报道的 主要验证方法有： 作图法：即作出预测值实测值的对比图，直观地判断= 者的相关性。此方法常需要将 原始数据转换成对数或平方根形式，以给出较为客观的评价。 统计法：通过一些统计学方法，如f 检验、t 检验、均方误( m e a ns q u a r ee r r o r ) 、相关系数 ( 产) 、偏差因子( b i a sf a c t o r ) 、准确因子( a c c u r a c yf a c t o r ) 等，来衡量不同模型拟合微生物生 长情况的好坏。 比较法：比较模型预测的生长速率、代时等数据是否与文献资料中的数据相吻合，如果文 献数据缺乏，需要另外做储藏试验( s t o r a g et e s t ) 或激惹试验( c h a l l e n g et e s t ) ，提供微生物生长 数据进行比较。 需要指出的是，任何一种单独的验证方法都不能全面地衡量模型的预测效果，因此，验证 模型时要综合几种方法来给出合理的评价。另外，许多模型是在实验室培养基上建立的，这样 条件容易控制，易于建模。但是食品成分比较复杂，跟培养基有很大的不同。因此，越来越多 的研究者认为( m c d o n a l d ，1 9 9 9 ) ，应该将培养基上建立的模型在食品上进行验证，看其能否 如实反映微生物在实际情况的生艮。 3 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 3 3 模型应用举例 在二十世纪8 0 到9 0 年代，由于食品安全问题的严峻形式，预测微生物学的研究对象主要 是食晶中的病原菌( 如单核增生李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等) 。后来，随着食品企 业对自身产品质量问题的关注，腐败菌模型也逐渐发展起来。开始的腐败菌模型主要应用在水 产品和乳品中，并且主要针对细菌建模近年来渐渐扩展到其它的食品领域和微生物，如真空 包装肉中的乳酸菌模型( c a y r e 。2 0 0 3 ) ，芦笋中的嗜冷菌模型( o i m m o ，1 9 9 8 ) ，面包中的接合 酵母模型( m 锄b r e 1 9 9 9 ) ，饮料中的黑曲霉模型( b a b y , 2 0 0 1 ) 。 另外，某些食品货架期，不只是取决于腐败菌，还取决于其中病原菌的生长。在一定温度 下，若腐败菌比病原菌生长得快，食品可能在病原菌未产生毒素之前已腐败变质，这时病原菌 造成危害的可能性就会大大减小。但若病原菌比腐败菌生长得快，就会在食品腐败前已产生毒 索，使食品变得不安全。所以确定食品的货架期要综合考虑腐败菌和致病菌的生长情况。 1 3 4 未来与展望 1 3 4 1 迟滞期建模 迟滞期的模型对货架期预测有重要意义，因为延长迟滞期可以减缓细菌的生长，从而相应 地延长货架期。但是对迟滞期建模要比对生长速率建模困难得多。因为生长速率只取决于细胞 当前生长的环境条件，而迟滞期却在很大程度上受细胞接种前的培养条件的影响( k b u z a ， 1 9 9 2 ) 。前培养条件和生长阶段影响细胞适应新环境的时间。对数期的细胞适应新环境最快，而 稳定期和饥饿的细胞需要更多时间来适应从低温转到高温的细胞的迟滞期要比从高温转到低 温的细胞的迟滞期要短。另外，然而，目前的建横方法很难对前培养条件对迟滞期的影响进行 定量的分析，这将是今后一个很重要的研究领域。 1 3 4 2 菌问相互作用 由于微生物的相互作用，纯培养菌的生长特性与和其它菌共同培养时的生长特性有很大的 不同。而食品基质营养丰富。往往有很多微生物共同生长，各菌问可能相互促进或抑制，比如， 乳酸菌产乳酸可以减低p h 值，许多微生物产抑菌物质，阻碍其它菌的生长等。因此模型的建 立要考虑各苗间的相互作用，使得模型能够反映微生物生长的实际情况( m a l a k a r , 2 0 0 3 ) 。 预测模型可以定量巴氏杀菌奶中主要腐败菌和病原菌的生长或残存情况，是预测巴氏奶质 量和安全性有效工具，同时还可以指导产品的研发，优化生产过程和销售链。微生物预测模型 模拟出来的结果，有助于提高实验设计并能预测结果的范围。但是预测结果并不是百分之百的 可靠，它只是作为一种获取信息的工具，并不能取代微生物学家的经验和判断。 1 4 食源性微生物风险评估 细菌病原体的风险评估是独特的难题，任何评估食源性细菌危害风险的方法，都将因生跃、 加工、贮藏和消费前食品制备的方法等因素而复杂化。它们可以因为文化和地域的不同而发生 4 很大的变化。这些因素对给定的食品进行变量设置( s c e n a r i os e t ) ，是细菌危害风险评估中的 基本要素。 1 4 1 定量风险评估( q u a n t i t a t i v er i s k a s s e s s m e n t ) ( 寒怿，2 0 0 5 ) 定量的风险评估指通过对暴露水平和剂量一反应的量化表达，对风险问题进行量化评价， 强调用数学方法描述风险问题中各要素之问的关系。应明确评估中假设的逻辑和理论基础。定 量的风险评估可分为点估计和概率估计。 点估计( p o i n t - e s t i m a t e ) ：数据输入为单一的数字，例如：平均值或9 5 置信区间上限值 ( 数据区间的高端，表示“最坏的情况”) 。点估计应用比较简便，在工作中可以很快完成， 可有效用于风险的筛选或表明某个潜在风险并不显著。但是点估计对风险情况缺乏全面、深入 的理解通常忽略变化性和不确定性。“最坏情况”评估通常描述一个完全不可能发生的设想， 由此得到的确定性的评估结果，可能反而带来对风险问题的错误理解。 概率估计( p r o b a b i l i s t i ca s s e s s m e n t ) ：数据输入为一个可能的取值范围，该范围内每一个 值的概率表示一个概率分布。进行概率评估要求评估人员具备相当的专业知识，并对所分析的 系统具有较充分的了解。在概率评估的结果中，尤其强调结合评估的变化性和不确定性。暴露 评估的分析和计算相对较为复杂，有时不得不应用相关的工具及计算机软件等。但概率评估估 计几乎所有的可能性及其可能的发生方式，认识到真实世界存在的变化性，包括我们对真实情 况了解程度有关的不确定性。 1 4 2 风险评估的途径( 毕金峰，2 0 0 4 ) 致病性细菌危害风险评估包括如下四个步骤( 亦适用于食品中的化学成分危害的风险评 估) ： 危害识别 暴露评估 剂量反应评估 - 风险描述 风险评估的最后结论是在考虑评估结果的基础上做出的。 1 4 2 1 危害识别( h a z z r di d e n t i f i c a t i o n ) 所谓“危害”，即食品中潜在的对人体健康造成不良效应的生物学、化学或物理性的因子 或条件。识别可能对人体健康造成不良作用的、可能存在于某种或某一类特定食品中的生物学、 化学或物理性的因子的过程即“危害识别”。在大部分情况下，由食品毒理学家、微生物学家、 医生或其他专业人士等负责对危害进行识别。 ( 1 ) 对致病性细菌的生长环境特点( 包括宿主) 的说明 除了生长温度环境外，环境的酸碱度( p h ) 、水分活度( a w ) 、渗透压和气体状态，都能 够影响致病性细菌的生长、繁殖和产生毒素( 见于部分产毒性致病菌) 。 ( 2 ) 对致病性细菌的生物学特性的说明 致病性细菌通常是革兰氏染色阴性或阳性，无芽孢或有芽孢，有鞭毛或无鞭毛，动力试验 呈阳性或阴性；生长的p h 范围为2 5 - 9 6 ，最适宜的生长酸碱度范围通常是恒温动物体液的中 性p h ：最适宜的生长温度范围通常是恒温动物体温的范围( 3 6 - 4 2 ) 。 ( 3 ) 对致病性细菌流行病学的说明 对致病性细菌流行病学的描述就是对不同国家( 环境) 中致病性细菌与人类细菌性食物中 毒的关系，以及这种关系差异的描述。在人类共同生存的地球上，世界各国由于环境差异、饮 食习惯、食品种类、食品加工方法、食品运输及贮存条件和个人卫生习惯等的不同，因而所引 起的细菌性食物中毒的情况，也有较大的差别。之所以不同国家( 环境) 中占首位的细菌性食 物中毒是由不同的致病性细菌引起的，均与不同国家( 环境) 的环境差异、饮食习惯、食品种 类、食品加工方法、食品运输及贮存条件和个人卫生习惯等的因素不同有关。所以，在不同国 家( 环境) 中致病性细菌的风险因素也具有很大的差别。 ( 4 ) 对不同国家( 环境) 中致病性细菌风除因素的说明 在环境差异、饮食习惯、食品种类、食品加工方法、食品运输和贮存条件以及个人卫生习 惯等各个方面，与致病性细菌风险因素密切相关的主要是环境差异、饮食习惯、食品种类和食 品加工方法；当然，食品运输和贮存条件以及个人卫生习惯等方面的因素不能排除。 1 4 2 2 暴露评估( e x p o s u r e a s s e s s m e n t ) “暴磊评估”是对于通过食品的可能摄入和其它有关途径暴露于人体和或环境的生物、化 学和物理性因子( 风险源及相关风险源) 的定性和域定量评价。在微生物风险评估中的暴露评 估或者是对所消费食品中的致病性细菌的数量、或者是对细菌毒素含量的评估。在食品中化学 成分的含量可能因为加工而发生略微变化的同时，致病性细菌的数量则是动态变化的，并且可 能在食品基质中显著地增加或减少。细菌数量的变化受到一些复杂因素相互作用的影响，这些 因素诸如以下： ( 1 ) 所涉及的致病性细菌的生态学； ( 2 ) 食品的加工、包装和贮存； ( 3 ) 制作步骤，如烹调它能够抑制细菌因子； ( 4 ) 与消费者有关的文化因素。 暴露评估考虑的是可能存在于食品中的致病性细菌的发生和数量，以及确定剂量的消费( 食 用) 数据。 食品中的生物体( 细菌、寄生虫等) 的含量在土壤、植物、动物和生食品中测得的量不同 于个体摄食时该物质的含量。对于生物体而言，在适宜的环境条件下，由于复制( 繁殖) ，微生 物污染物的含量可能会显著地增加。因此，食品在消费时其中细菌因子的含量，对于在生食品 中所测得的或在动物、植物或土壤中所测得的含量之比，可能有显著的不确定性。 以下的暴露评估技术描述，主要以禽( 畜) 及其产品的生产( 养殖) 、运输、加工、贮存和 制作、处理及消费为范例。 6 中国农业大学硕士学位论文第一章绪论 1 4 2 3 剂量反应评估( d m e - r e s p o n s e a s s e s s m e n t ) 剂量一反应评估的目的是对食品中病原体的存在所产生不良作用的严重性和持续时间进行 定性或定量的评价。剂量反应资料在描述产毒的致病性细菌时是有用的。但是，在描述致病性 细菌的侵染菌株的危害时，这样的资料可能基本上是无用的。许多食源性致病性细菌的剂量 反应资料很有限，或者根本不存在。在此基础上的剂量反应评估资料难以得到，以及也可能由 于多种原因而不准确，这些原因有： ( 1 ) 致病性细菌的宿主敏感性差异极大； ( 2 ) 同一种特定病原体的感染率变化很大； ( 3 ) 同一种病原体的不同种的毒力差异极大； ( 4 ) 由于频繁的突变，导致致病性发生遗传学方面的变化； ( 5 ) 食品中或消化系统中的其它细菌的拮抗作用可能影响致病性； ( 6 ) 食品可以调节细菌感染和，或在其它方面影响宿主的能力。 “剂量反应评估”可以包括如下几个方面： ( 1 ) 对致病性细黼性的影响和相关食品成分影响的说明 致病性细菌的特性影响包括传染性的影响。关于这种微生物引起感染和疾病能力的毒力和致 病性的影响；一个致病性细蓥感染获得性的宿主特性，包括其易感性、性别、环境因素、遗传、 潜在疾病和协同治疗等。食品成分的影响也应当被提到。 ( 2 ) 致病性细菌的传染性、毒力和致病性 致病性细菌的毒力和致病性密切相关；致病性细菌的毒力通常是由它们所产生的内毒素或 外毒素引起的。产生内毒素的致病性细菌即前述的、可造成所谓“食源性感染( i n f e c t i o n ) ”的 细菌，如肠出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 ；产生外毒索的致病性细菌即前述的、可造成所谓“食源 性中毒( i n t o x i c a t i o n ) ”的细菌，如金黄色葡萄球菌。 ( 3 ) 相关食品对致病性细菌感染、生存、繁殖和产毒的影响 不同类型的食品和不同加工类型的食品对致病性细菌感染、生存、繁殖和产毒会产生不同 的影响。例如，在新鲜乳液中，含有多种抗菌性物质，它们能对乳中存在的微生物具有杀灭或 拟制作用，在含菌少的鲜乳中，其抗菌作用可维持3 6 个小时( 在1 3 1 4 ( 2 的温度下) ；若在污 染严重的乳液中，可维持1 8 个小时。 ( 4 ) 致病性细菌的剂i t - 反应调查和评估 可以通过饲喂研究来获得剂量反应的数据，并进而获得暴露剂量和感染概率之间的相关 性。其它与建立一个可靠的剂量反应疾病相关性有关的数据包括： 其他部分人群、包括更易感人群的剂量一反应数据； 试验对象菌不同菌株的数据，以及涉及到剂量反应的菌株之间的差异： 有关食品基质对剂量反应影响的数据。 7 中国农业大学硕+ 学位论文 第一章绪论 引起感染反应的剂量取决于若干个因素，包括：病原的毒力及其特性、所摄入致病性细菌 的数量、经其而导致感染的媒介物和个体的易感性、个体通常的健康和免疫状态以及可能改变 微生物或宿主状态的食品基质的特点等等。因此，任意个体由于暴露到食源性病原菌所引起的 疾病发生的可能性，取决于宿主、病原和食品基质效应的综合作用。 剂量反应关系已经在专家导出数据、流行病学或动物试验数据或所有这些综合数据基础上 确定。这些剂量反应关系覆盖了生物学终点即感染率、发病率和死亡率的范围，并且利用人类 流行病学的数据对之进行了评价。所有模式都假定每个细菌可以单独发挥作用，而且一个单独 的细菌具有潜在引起疾病的能力( 最小感染剂量是一个细菌) 。应用指数模式推断，一个单独细 菌引起疾病的概率被假定与摄入所有致病性细菌引起疾病的概率相同，而且这个概率可由一个 简单的参数“r 值”来表达。之所以选择指数剂量反应模式，是因为它公认的实用性( 即f i t ) ， 它的简单性( 作为一个简单的参数模式) ，以及当外推到低剂量影响范围时的线性特点。指数剂 量反应模式的方程是： p _ - 1 一e “ p 是严重疾病的发病概率，n 是摄入的剂量( 被食入的致痫性细菌数量) ，r 是单个细菌引 起疾病的概率；所有这些参数界定了所考虑人群的剂量一反应关系。两参数的b e t a - p o i s s o n 模 式引进了病原，宿主相互作用的不均匀性概念，且r 被假定为是可变的。 1 4 2 4 风险描述( r i s kc h a r a c t e r i z a t i o n ) 风险评估的最后阶段即风险描述。生物病原体的风险描述将根据危害识别、危害描述和暴 露评估等步骤中所描述的观点和资料来进行。风险描述是就来自特定细菌性因子对特定人群产 生不良效应潜在可能性和严重性的一个定性或定量的估计( 包括伴随的不确定性) 。风险描述是 由食品毒理学家和微生物学家根据动物试验结果做出的，风险描述结果必须包括像安全因素的 使用等不确定性。 用定量风险评估法来描述食源性细菌病原体所带来的风险，是否可能而且合适尚未确定。 因此，定性描述风险可能是目前唯一的选择风险描述必须回答三个问题： ( i ) 健康风险的本质是什么? 发生的可能性有多大? ( 2 ) 哪些个体或人群存在健康风险? ( 3 ) 不良影响或效应的严重程度如何? 风险描述的方法学通常是将暴露评估的输出结果与剂量一反应的相关性结合起来，以计算 感染致病性细菌的概率。 1 4 3 国内外微生物风险评估情况 就已经发表的风险评估的文献而言，极少有完全的包括所有法典委员会要求的正式的研究。 截止到1 9 9 9 年上半年，在已发表的关于微生物风险评估的6 6 篇文献中美国占“篇，9 2 的论 文发表于1 9 9 4 年到1 9 9 9 年( 赵志晶，2 0 0 3 ) 。近年来又发表了多篇不同食品中不同病原菌的风 险评估的论文。比较重要的有：鸡肉中沙门氏菌的定量风险评估模型( o s c a r , 2 0 0 4 ) 、牛肉馅儿 汉堡包中大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的定量风险评估模型( c a s s i n ，1 9 9 8 ) 、未成熟千酪中金黄色葡萄球 菌的定量风险评估模型( l i n d q v i s t ，2 0 0 2 ) 等。这些论文是这一新兴领域的主要参考文献。 8 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所的研究人员初步建立了三个定量微生物风险评估 模型，包括：苍蝇传播ec o l i0l 5 7 ：h 7 的定量风险评估模型( 赵志晶，2 0 0 5 ) ，我国消费带壳 鲜鸡蛋引起沙门氏菌病的定量风险评估模型( 赵志晶，2 0 0 4 ) 以及福建省生食牡蛎中副溶血性 弧菌的定量风险评估模裂，其中生食牡蛎中副溶血性弧菌的定量风险评估还得到了f a o 的资 助。上述模型的建立再国内微生物风险评估的研究与应用领域具有开拓性( 宋怿，2 0 0 3 ) 。 1 5 课题研究的内容及意义 1 5 1 研究内容 分离鉴定出牛乳中的优势腐败落和病原菌； 描述不同储藏温度下优势腐败菌的生长曲线，建立一级预测模型： 在一级模型的基础上建立温度对生长速率和迟滞期的影响的二级预测模型； 利用统计方法对模型有效性进行验证，讨论模型的适用范围和应用价值： 研究巴氏杀菌奶从出厂到零售到再到消费阶段影响病原菌生长的风险因子，并依靠模 型模拟数据对病原菌的危害进行定量风险评估。 1 5 2 研究意义 牛奶是“最接近完善的食品”，其制品在食品工业中占有重要的地位。在世界畜牧业发展过 程中，都将牛奶生产放在非常重要的位置。“民以食为天，食以安为本”，在大力发展乳品工业 发展的同时，解决好乳品质量安全问题也倍受社会的关注。一是乳品安全与每个人息息相关， 涉及千家万户的切身利益。二是乳品质量安全问题关系到食品工业本身的发展，有利于逐步增 强我国乳品工业的国际竞争力。 巴氏杀菌奶是全球乳品消费的主流，在发达国家和地区的市场上占有绝对的优势。根据欧 洲权威调查机构e u r o m o n l t o r2 0 0 3 年提供的数据，“巴氏鲜奶”的市场份额在加拿大为 9 9 9 ，在美国为9 9 7 ，在日本为9 9 3 ，在中国台湾为9 7 6 。但在整个中国市场上，“巴 氏鲜奶”与u h t 乳的市场份额之比为3 ：7 。随着消费者“新鲜”消费意识和健康观念的增强， 可以预期巴氏杀菌奶在中国所占的份额也会不断增长。 目前我国还没有对牛奶中的微生物建立预测模型和进行风险评估。对巴氏杀菌奶中的病原 菌或者腐败菌建立模型，可以合理地评价巴氏杀菌奶的质量和安全性，可以为牛奶工业中 h a c c p 体系的建立和推广提供定量数据。本文建立的巴氏杀菌奶中徽生物模型也可以为在其 它乳制品中建立微生物预测模型提供借鉴。 9 中国农业大学硕士学位论文 第二章巴氏杀菌奶中优势微生物的分离鉴定 2 1 引言 第二章巴氏杀菌奶中优势微生物的分离鉴定 对巴氏杀菌奶中的微生物建立模型，需要首先分离鉴定出优势的腐败菌或病原菌，根据其生 长特性建立起来有针对性的预测模型。 不同的微生物有不同的新陈代谢过程。在代谢过程中所产生一系列的生化变化是很复杂的， 但每一种微生物都有它各自的生化特点，因此通过生化反应试验，可以鉴别微生物的种类( 刘运 德，2 0 0 3 ) 。本章的实验选取鉴别细菌种类的典型生理生化反应和a p i 细菌鉴定系统，通过细菌 对糖的发酵作