（食品科学与工程专业论文）己烯雌酚酶联免疫快速检测试剂盒的研制.pdf

己烯雌酚酶联免疫快速检测试剂盒的研制 姓名：王蓓专业：食品科学与工程导师：胥传来 摘要 己烯雌酚( d i e l h y l s t i l l s l r o l 。d e s ) 属于人工合成的雌激素，在人和动物体内会产生雌 激素样效应。由于己烯雌酚对人体的致癌和致畸作用，世界各国均规定动物养殖中不得以任 何途径和方式使用d e s 。本论文旨在研制快速检测己烯雌酚( d e s ) 的酶联免疫 ( 唧e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l l s a ) 试剂盒。 首先用氯乙酸钠修饰d e s 分子中的一个酚羟基从而合成单羧甲醚己烯雌酚 ( d i e t h y l s t i l b e s t r o lm o n o c a r b o x y m e t h o x y f l u r a n e ，d e s m c m e ) 。然后以混合酸酐法将 d e s m c m e 与载体蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，b s a ；o v a l b u m i n ，o v a ) 偶联形成完全抗 原，并以紫外扫描分析完全抗原的偶联比率，再将得到的免疫原d e s - b s a 按免疫程序免疫 新西兰白兔。结果发现己烯雌酚及其衍生物存在着顺反异构转化现象，极性有机溶剂的溶剂 化作用促使顺反异构体的转化。高分辨质谱测得合成的d e s - m c m e 分子量为3 2 5 。人工免 疫原及包被原的最适结合比为1 3 和l o 。采用间接酶联免疫测定。产生的抗血清的稀释度可 以达到1 0 2 4 0 0 。 以此抗血清为基础，建立d e s 的间接酶联免疫方法。考察了反应时间、离子强度、洗 液的浓度以及抗体稀释液的p h 等影响因素。最终得到标准曲线的线性回归方程为y 钏2 9 7 8 x + 1 4 7 5 6 , r 2 = 0 9 9 8 6 ，其线性范围为0 1 2 5 1 1 9 m l ，5 0 抑制率对应的浓度( i c 5 0 ) 为1 8 9n g - m f l ，帅抑制率对应的浓度( 晟低检测限，l o d ) 为0 0 8n g m l 1 利用五种结 构类似的甾体化合物检测其特异性，均无明显的交叉反应。特异性好。利用空白样品添加实 验检测其精密度和准确度，d e s 以l n g g 和5r i g - g 1 两个浓度分别添加到空白样品中测定回 收率。结果表明：牛肉组织回收率为5 0 8 ( p , 6 。变异系数为3 7 8 艿；猪肝的回收率为3 0 5 0 。变异系数为4 6 7 9 。 将本试剂盒与荷兰e i 瓜o d i a g n o s l l c a 公司的试剂盒进行比较，回收率、变异系数 等结果基本一致，与l c m s m s 方法比较，检测结果较接近。本论文研制的e l i s a 试剂盒 的各项参数都达到了国外试剂盒的指标和要求，可用于实际检测。 关键词：己烯雌酚；氯乙酸钠；多克隆抗体；酶联免疫；优化 d e v e l o p m e n t o fa r a p i dd e t e r m i n a t i o nf o rd i e t h y l s t i l b e s t r o lb ye n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y n a m e ：w a n gb e i s p e c i a l t y ：f o o ds c i e n c ea n de n g i n e e r i n gp r o f e s s o r ：x uc h u a a l a i a b s t r a c t d i e t h y l s f i l b e s t r o l e s ) ，a r t i f i c i a le s t r o g e n , h a sb e e nb a n n e df o ri t sc a r c i n o g e n e s i sa n d t e r a t o g e n e s i sp r o p e r t i e si nm o s tc o u n t r y t l l i ss t u d yi st od e v e l o pd e sr e s i d u a li m m u n o a s s a y r e a g e n tk i t d i e t h y l s t i l b e s t r o lm o n o c a t h o x y m e t h o x y f l u r a n ew a ss y n t h e s i z e db ym o d i f y i n go n ep h e n o l i c h y d r o x y lg r o u po fd e sm o l e c u l e n 七c o n j u g a t i o n so fd e s m c m ew i t hb o v i n es e r j ma l b u m i n ( b s a ) a n do v a l b u m i n ( o v a ) a ss y n t h e t i ca n t i g e n sw c r ep r e p a r e db yt h em i x e d i da h h d f i d e m e t h o da n dt h ec o n j u g a t i o nm t e sw e l ea n a l y z e db yu l t r a v i o l e ts c a n n i n g n e wz e a l a n dw h i t e r a b b i t sw e r ei m m u n i z e dw i t hd e s - b s a 1 1 髑u i t sd e m o n s w a t e dt h a tt h ei s o m e r i z a t i o nw a s p r e s e n ti nc i sa n dt r a n so f d e sa n di t sd e r i v a t u s , w h i c hw a se f f e c t e do b v i o u s l yb yp o l a rs o l v e n t s h i g l lt t s o l u t i o nm a s ss p c c l l x l ms h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to fd e s - m c m ew a s3 2 5 1 1 地 o p t i m a lc o n j u g a t i o nr a t i o so fi m m u n o g e na n dc o a t i n ga n t i g e nw e r e1 3a n di 0 t h ed i l u t er a t eo f a n t i s e r m nc o n l dr e a c h1 0 2 4 0 0 t h r o u g h 雒i n d i r e c te n z y m e - l i n k e di m m u n u s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) b a s e do nt h i sa n t i s e r u m ，e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b o n ta s s a y ( e l i s a ) f o rt h ed e t l 州o no f d e sh a db e e nd e v e l o p e d s e v e r a lp h y s i c o c h e m i c a lp a r a m e t e r s , s u c h 鹳i n c u b a t i o nt i m e , i o n i c s t r e n g t h , d e t e r g e n tc o t a c o n t r a f i o na n dp ho ft h ea n t i b o d yd i l u t i o nw e r eo p t i m i z e d n 屺l i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o no f m cs t a n d a r dc u r v ew a sy = - 0 2 9 7 8 x + 1 4 7 5 6 彰= o 9 9 8 6 t h er a l l g eo f l i n e a r i t yw a sf r o m0 1t o2 5n g m r l t h e5 0 i n h i b i t i o nv a l u e ( i c s o ) a n dt h el i m i to fd e t e c t i o n ( l o d ) w e f c1 8 9a n d0 0 8n g - m i 一r e s p e c t i v e l y t h es p e c i f i c t yw a se v a l u a 把db yf i v ea n a b u l i c s t e r o i d so fs i m i l a rs t r u c t u r e a n dn o n eo f t h e mh a ds i g n i f i c a n te r o s s - r e a e t i v i t y t h ea c c o r a e ye n d p r e c i s i o no ft h i sa s s a yw e r ee v a l u a t e db ym e a l l so fs p i k e ds a m p l e s w h e nd e sw a ss p i k e da t l e v e l so f1a n d5n g g ，t h er e c o v e r i e so fb e e fr a n g e df r o m5 0 t o 溉w i t ht h ec o e f f i c i e n to f v a r i a t i o no f 3 7 8 6 a tt h es et i m e , t h er e c o v e r i e so f p o r k1 i v e rr a n g e df r o m3 0 t o5 0 w i t i lt h ec o e f f i c i a n to f v a r i a t i o no f 4 6 7 9 i tw a sf o u n dt h a tt h er e c o v e r ya n dt h ec o c 街c i o n to fv a r i a t i o no ft h i se l i s ak i tw e r e c o n s i s t e n tw i t ht h eo l l ef r o mt h ee u r o - d i a g n o s t i c ac o m p a n yi nh o l l a n d , a n dt h ed e t e o t i o r lt 屯s u l t s w e s i m i l a rt ot h ei e s u i t so b t a i n e db yt h eu ：，m s m s s oi tc o u l db ec o n c l u d e dt l l 砒a l lo ft h e p a r a m e t e r so f t h ee l i s ak i tw ed e v e l o p e dh a dr e a c h e dt h el e v e lo f f o r e i g ns t a n d a r d s , a n di tc o u l d b eu s e da sas c r e e n i n gm e t h o di np a c t i c o k e y w o r d ：d i e t h y l s t i l b e s t r o l ；s o d i u mm o n e c h i o r o e c e t e t e ；p o l y c l o n a la n t i b o d y ；e l i s a o p t i m i z a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：量整日期：年月e l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 互蓝 导师签名： 日期：年月日 第一章绪论 第一章绪论 食品安全是保护人类健康，提高人类生活质量的基础。随着对食品安全性认识的深入，f a o w h o 等国际组织多次召开过各种专家会议，讨论有关食品安全的问题。近年特别对动物性食品的源头一 饲料、饲料添加剂、兽药和兽医防疫更为关注。6 0 年代开始讨论食品中农药残留；年代开始讨论 食品中兽药残留；1 9 9 7 年开始讨论动物长期使用抗菌药，特别是作饲料添加剂，会导致细菌耐药性 滋生的问题。 所谓食品安全是指食品按其原定用途进行制作和，或食用时不会使消费者受害的一种担保，也就 是说，食品中不应含有可能损害或威胁人体健康的有毒，有害物质或因素，不会导致消费者急、慢 性中毒或感染疾病，不会产生危害消费者及其后代健康的隐患。欧美等发达国家早在5 0 年代就已经 逐步实行了食品安全市场准入制度，我国在这方面与发达国家还有很大的差距。2 0 0 2 年在国家质量 技术监督检验检疫总局、农业部、卫生部等部门的共同努力下，我国首批对大米、面粉、植物油、 酱油、食醋五类产品实施了市场安全准入制度。随着我国食品市场安全准入制度的逐步完善，食品 安全问题已经成为人民关心的重大社会问题。2 0 0 4 年我国又开展了对饮料、肉制品、乳制品等十类 产品进行市场准入的审核工作，并且食品安全、食品卫生已经被写入中央文件“十一五”发展规划 和纲要中。近来，人们一直呼吁全面加强对食品安全的管理，确保公众健康和人民生命安全。的确， 从安徽阜阳奶粉事件到“苏丹红一号”染色剂超标，从“毒粉丝”、“毒酱油”到陈馅月饼，都让公 众无法对食品放心，所以在公众健康日益受到威胁的今天，加快食品安全立法，建立新的食品质量 安全体系已经刻不容缓。 一般来说，动物性食品安全包括“无疫病、无污染、无残留”这三方面。病害来源于动物本身 染疫污染来源于饲养、加工、运输和贮存。残留来源于伺喂饲料、药物治疗和环境污染。而兽药 及饲料添加剂残留则是目前我国动物性食品安全的最大威胁和隐患。加快我国动物性食品兽药残留 的研究，对于有效控制药物残留，提高动物性食品的质量和安全，具有重要的现实意义。 动物食品安全已成为全世界关注的焦点，其中兽药及药物添加剂残留问题是影响动物性食品安 全的最主要因素之一。兽药残留是指动物在使用药物预防、治疗疾病或使用促生长饲料添加剂时， 药物的原形或其代谢产物蓄积在动物的细胞、组织、器官或可食性产品( 如蛋、奶) 中。这些药物 以游离的形式或以结合的形式残留于组织中，与组织蛋白结合的药物可能存留时间更长。兽药残留 给人们的生命安全带来隐患。例如，我国近年来经常发生的“瘦肉精”残留事件，使上万人中毒。 兽药残留还会严重影响我国动物性产品的出口，造成巨大的经济损失。近年来我国畜产品和水产品 出口欧盟、日本等国屡屡受阻，如2 0 0 2 年出口欧盟的水产品中因含氯霉素残留而遭到全面禁运，损 失6 亿多美元；2 0 0 3 年山东出口瑞典的禽肉因含呋吗唑酮残留遭封杀。 近年来食品中的兽药残留在国内外已经成为一个影响广泛和颇具争议的问题，其与公众健康息 息相关，也直接关系到产业界的经济效益。自2 0 世纪4 0 年代后期，发现许多动物激素能够促进动 物生长、提高饲料转化率和改善某些商品价值，尤其是在发现抗生素既能用于疫病防治，亚治疗剂 量用药又具有促生长剂的作用后，激素和抗生素被作为添加剂，大量且普遍的用于畜禽养殖业。虽 然抗生素过度及不当使用产生的潜在危害日益受到人们的关注，但在现代养殖业中，迫于规模化、 工厂化、高密度饲养方式下疫病防治的压力，抗生素药物作为防治目的的使用还将继续。抗生素在 亚治疗剂量下作为药物性饲料添加剂，在实际生产中被证明能使畜禽病死率显著降低，饲料利用和 转化率提高，产品的某些性能改善( 如提高瘦肉率) ，生产效能提高。药物添加主要作用表现为：( 1 ) 防病作用，抵抗病原微生物，抗菌和保持肠道中微生物生态平衡，提高免疫力，阻断致病过程，减 少病死率；( 2 ) 促生长作用，一些抗生素能使畜禽肠壁变薄，增加肠粘膜通透性，有利于养分吸收。 微量抗生素进入体液循环后能刺激脑垂体，增加促生长激素的分泌；( 3 ) 减少肠道内细菌对养分的消 耗，提高饲料的利用率。由于药物添加一般能提高养殖生产效能并带来巨大利润，2 0 世纪5 0 年代 江南大学硕士学位论文 以来，亚治疗剂量，即治疗剂量l ，3 或更低的抗生素被作为动物日粮添加剂普遍使用。1 9 9 6 年，世 界兽药饲料添加剂市场金额高达1 4 8 5 亿美元，其中抗生素占4 5 8 。 综上所述，我国动物性食品的安全形势十分严峻，尽管各级政府主管部门出台很多政策和措施， 但是由于监测监控技术的相对落后，造成监管不力。要想从根本上控制兽药残留保障动物性食品安 全，就必须进行有效的检测，尤其是快速检测的研究。只有尽快加强对动物源食品中兽药残留的监 测研究，开展兽药安全性评价，完善监控体系建设，才能促进我国食品畜牧业经济的健康可持续发 展，减少环境污染，保证人民身体健康，增加畜禽产品的出口创汇，重新塑造我国、我国动物性产 品在国际上的良好形象。 已烯雌酚( d e s ) 为人工合成的二苯乙烯类雌激素药，曾作为促生长剂广泛应用于畜牧业。自 从人们发现动物因食用d e s 在组织中残留给人类健康造成危害以来，世界上绝大多数国家禁止在食 品动物中使用d e s 。2 0 0 2 年我国农业部规定d e s 及其盐、酯制剂禁用于所有食品动物的所有用途。 然而，目前滥用己烯雌酚的现象依然存在。为了提高食品质量水平，保障人民身体健康，提高我国 农业和食品工业的市场竞争力，国家将“食品安全关键技术”列为“十五”重大科技专项。因此， 有必要研究灵敏、高效、稳定的己烯雌酚残留检测方法。 1 1 己烯雌酚概论 1 1 1d e s 的理化性质 d e s 化学名为( e m ，4 弋l ，2 一二乙基- 1 ，2 一亚乙烯基) 双苯酚，分子式为c 1 8 h 2 0 0 2 ，分子量为2 6 8 3 5 ， 熔点为1 6 9 1 7 2 c ，白色片状结晶，能溶于醇、醚、氯仿、脂肪油和稀碱溶液，几乎不溶于水，见 光易被氧化，紫外最大吸收波长为2 4 2 n m 。结构式如图1 - 1 。 h h 图l l d e s 化学结构式 ， f i g l - lc h e m i c a ls t r u c t u r eo f d i e t h y l s t i l b e s l t o l 1 1 2d e s 的药理性质 己烯雌酚是雌性激素，它有顺反两种异构体，它们的化学性质大致相同，只有与空间排列有关 的化学反应才显出差异。顺反异构体在生理活性或药理作用上往往表现出很大差异。供药用的是反 式异构体，其生理活性较强，而顺式异构体则较弱。己烯雌酚在人体中可产生类似雌激素的效应， 最早被用来治疗妇女流产和早产，后来进一步被广泛应用于产后母亲停奶、治疗妇科病、治疗腺癌、 淋病、小孩的粉刺，乃至抑制长得太高的十几岁小孩的成长速度。而且还被用作动物饲料添加剂， 以促进动物生长，提高产量。 1 2d e s 的残留与危害 d e s 对人生殖系统的影响在阴道表现最为明显。研究人员记录了各类与应用d e s 相关的阴道 上皮细胞畸形病例，包括阴道上皮细胞腺病，宦颈糜烂、宫颈和阴道横向的纤维绞合病。h e r b s t 掣1 l 的进一步研究表明，这些病的发生和d e s 有关。环境因素和日常食物中引起两性各类雌激素靶组织 2 第一章绪论 异常的d e s 已经越来越引起人们的关注。这些异常包括乳腺癌、子宫内膜异位、纤维瘤、雌性子宫 癌、性别改变、精子浓度降低、慢性前列腺肥大、前列腺癌症、睾丸癌及男性生殖系统问题。对人 造雌激素d e s 所进行的研究提示，在个体发育的关键阶段d e s 能够导致应用d e s 的组织发生永久 性的细胞和组织改变。这些改变包括雌性和雄性均为结构性、功能性或是长期性的病理学变化，也 包括肿瘤的形成。 d e s 对生育能力也有影响，孕妇受d e s 影响，剖腹产、产后出血的可能性更大。另外，c - r e e n w a l d 等嘲于1 9 7 1 年证实d e s 和阴道癌之间的相关性极其密切，动物实验也已经证实了包括d e s 在内的 外源性激素属于潜在的致癌物 4 1 。b e r a l 和c o l w e l l n 进一步研究结果显示，使用d e s 会增加患卵巢 癌的风险。 1 9 3 4 1 9 7 1 年间临床上大量使用人造雌激素d e s 保胎，结果在肉体和心理方面给母亲及其儿 子、女儿带来了严重的不良影响。母亲患乳腺癌的风险高于常人，子女患生殖道癌症、生殖器畸形、 功能紊乱、不孕的几率明显增加。心理疾病的发病人数比不使用d e s 而发病的人数高出一倍，其发 病特征表现为：愤怒，心理焦虑、自卑、有犯罪感等州。 此外，d e s 对免疫系统及免疫功能、胸腺及胸腺细胞的发育、淋巴细胞均有影响。 由于在畜牧养殖业中d e s 能促进蛋白质的合成代谢、提高动物日增重和饲料效率”】而被广泛应 用，这给人类的健康造成了很大危害。因而对畜产品生产过程进行监控和执法势在必行，一是制定 最高残留限量的强制性标准：二是改进残留分析方法和技术，发展快速，准确和灵敏度高的质量检 测手段。而后者正是本研究的主旨和主要内容。 1 3d e s 残留的分析检测技术 d e s 残留的分析方法及其灵敏度和特异性在监控中的作用非常重要。目前，国内外检测d e s 残 留主要采用如下技术：气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用技术、毛细管电泳法、薄 层色谱法、荧光分析法、免疫分析法。 1 3 i 气相色谱法( g c ) 气相色谱是以气体作流动相的色谱过程。气体的粘度小、扩散系数大，在色谱柱内流动的阻力 小，组分在两相间的传递速度快，有利于高效、快速的分离。早期的气相色谱柱主要采用填充色谱 柱进行分析，近年来使用的色谱柱主要为毛细管柱，多由石英拉制而成。用于毛细管柱的固定液要 求有良好的熟稳定性，化学稳定性、分离选择性和湿润性，在众多的固定液中，聚硅氧烷类固定液 使用频率最高i s 。气相色谱法灵敏度较高，但需要衍生化过程，该方法是在二十世纪7 0 年代建立的。 d o n o h o 等例和c o f f i n 等l l ”分别报道了用气相色谱法检测牛等动物组织中的d e s 残留。他们根据d e s 溶解于稀碱性溶液的特性，用n a o h 溶液和c h c l 3 反复分批萃取，然后将其衍生化后检测，检测限 可达2 - 1 0p p b ，回收率为7 0 。t i r p e n o u 等【i ”对c o f f i n 等的方法进行了进一步的改良，以苯溶液和 n a o h 溶液提取d e s ，经硅胶柱提纯后，回收率提高到8 1 。在气相色谱的基础上，人们进一步发 展出了气相色谱一质谱联用( g - c - m s ) 技术，g c - m s 技术是联用技术中最活跃的技术。在此，质谱 仪实际上被作为o c 的一种质量选择检测器。采用c - c - m s 技术检测d e s 残留，检测限低于o i p p b i l ”。 郭志峰等“”用g c - m s 法测定了鸡蛋中的d e s ，结果检测限为0 0 5l a g g - 1 。 1 3 2 高效液相色谱法( h p l c ) 与气相色谱法不同，液相色谱中流动相也参与组分的分离过程。h p l c 缺乏适用于多数同化激 素的高灵敏检测器，分离和检测能力不如毛细管g c m s 。但h p l c 可直接分离同化激素，不需要衍 生化处理过程，操作简单、柱效高、载样量大。用h p l c 检测d e s 残留时，需要灵敏度高、专一性 强的检测器。由于紫外检测器专一性不强，而荧光检测器需要衍生化处理，因此国外报道d e s 的 h p l c 检测中多采用电化学检测器。r e u v e r s 和 a g a n a 等【1 4 ”j 用h p l c 电化学检测器检测动物组织 中的d e s 残留，检测限分别为o 1 o 2p p b 和1p p b ，回收率分别为6 5 8 和8 3 6 。林奕芝等【i ”用 h p l c 法测定了肉及肉制品中五种激素的残留量，结果d e s 的检出限为1 5 n g ，回收率范围为8 7 6 。 江南大学硕士学位论文 李薇等【1 7 】用h p l c 法测定了儿童保健品中d e s 的含量，最低检出量为o 0 6 1 1 9 ，回收率为9 3 1 。陈 永红等1 8 1 9 1 报道用h p l c 紫外检测器检测人尿及保健品中2 0 种激素，d e s 的检出限为0 0 2 p g m l 一。 陈杏琴等印悃h p l c 方法检测了石家庄市场销售鸡肉中的d e s 残留，结果在随机抽样的4 0 份肉鸡 中均检测有d e s ，其中d e s 含量在0 2 1 0m g k g 1 的共1 6 份，占检测样品的4 0 ；d e s 含量在1 0 5 0 m g k 9 1 的共2 1 份，占检测样品的5 2 5 ；d e s 含量在5 o 1 0 0m g k 9 1 的共3 份，占检测样品的7 5 。 1 3 3 液相色谱，质谱( l 洲s ) 联用技术 l c m s 是除g c m s 之外，又一种集高效和多组分定性、定量于一体的系统。该技术对高沸点、 不挥发和热不稳定的化合物的分离和鉴定具有独特的优势。目前，g - c m s 已经成为激素残留或者兴 奋剂检测中普遍采用的方法。常碧影等1 采用l c m s 对混合饲料中d e s 进行了检测，以3 4 倍噪 音量的信号为准，l c m s 的最低检测限可达0 5n g ，取样为1 0g 时，最小检出浓度为0 0 2 5m g k g - l ， 不同饲料的回收率分别为：猪配合饲料为9 4 1 4 ；鸡配合饲料为9 1 9 6 ；鱼配合饲料为8 9 4 8 ； 浓缩饲料为8 7 2 0 ；预混合饲料为9 1 5 1 。说明l c m s 的灵敏度完全适合检测饲料中d e s 浓度( 较 低的最低检测限和最低检测浓度) ，且有很好的准确度和精密度，并能适合各种动物饲料中d e s 的 测定。与国外a o a c 的法定方法相比，不仅灵敏度提高近2 - 3 个数量级( 1 0 m g k g - 1 卸1m g k g 1 ) ， 且操作省时、易行，而且依据三离子原则，用m z 2 6 7 准离子峰和2 5 1 、2 3 7 两个离子碎片峰配合保 留时间，既可定性又可定量。 1 3 4 毛细管电泳法 毛细管电泳法是指将样品置于电场中，由于组分的不同，它们在电场中泳动的速度也不一样。 因此经过一定时间的电泳后，各组分将按照其速度大小排列，依次抵达检测器而被检出，得到按时 间分布的电泳图谱。与h p l c 相比，毛细管电泳具有操作简单、色谱柱不受样品污染、分析速度快、 分离效果高、样品用量少、运行成本低等优点，有利于实际样品的分析，但其在进样准确性和检测 灵敏度方面不及h p l c 。近2 0 多年来，毛细管电泳的研究工作变得十分活跃，在残留分析方面的应 用不断增加。林培英等田1 建立了毛细管电泳法测定d e s 片剂中d e s 含量的方法，d e s 的迁移时间 约为2 8 6m i n ，测试样品只需4m i n 。平均回收率为9 9 8 1 ，测得d e s 的最低检测限为1 0 0p g m l 1 。 1 3 5 薄层色谱法( t l c ) 薄层色谱法( t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , t i c ) 是k i r c h n e r 等在5 0 多年前在经典柱色谱法及纸 色谱法基础上发展起来的一种色谱技术。薄层色谱法具有使用设备简单、操作简便、分析速度快、 灵敏度高、选择性好、固定相和流动相的选择范围大等优点。它既适用于微量样品的分析，也可用 于较大量样品的制备嗍。徐英宏等田】采用薄层色谱法对复方己烯雌酚药物中的d e s 进行了测定，发 现此法能够排除其他成分的干扰，取得了较为满意的结果。 1 3 6 荧光分析法 荧光分析法是利用某些物质的荧光光谱特性来进行定性或定量的分析方法。它的主要特点是测 定的灵敏度高，最低可检测到1 0 1 0 _ 1 0 - ”g m l 。由于能发荧光的物质的数目不多，因而其选择性也 较高。雌激素由于其结构上含有苯环、存在共轭结构故可用荧光分析法进行分析。d e s 本身无荧光， 与浓硫酸反应后再水解可生成有荧光的产物，相当于d e s 与水发生加成反应的产物( 记作h d e s ) 。 此反应过程受浓硫酸的用量及放置时间的影响。潘祖亭等陋1 在实验中发现，反应过程受浓硫酸的用 量及放置时间的影响。当硫酸用量与d e s 之比为l m l ：l m g 时，需反应8 - - 1 0h ；当二者之比为1 0 m l ：l m g 时，9 0 - 1 0 2m i n 即可达到最大且稳定的荧光强度。试验中控制实验条件为i m g d e s 加入1 0 m l 浓硫 酸，室温放置1 0 0r a i n 。在上述条件下测定d e s ，平均回收率为9 9 6 。按实验方法作出了d e s 荧 光分析工作曲线，在0 4 5 l 旷t o o l l 1 浓度范围内，荧光强度与浓度之间星良好的线性关系，线性 回归方程为f - - 2 1 0 2 c + 0 9 5 8 9 ，相关系数r = 0 9 9 9 6 ，检测限为2 o l 矿t o o l l 1 。近年来，时间分辨荧 光免疫分析法由于其灵敏度高，稳定性好，无放射性而在应用中逐渐多起来。 1 3 7 免疫分析法 1 3 7 1 放射免疫技术( r i a ) 1 9 5 9 年，y a l o w 和b e r s o n 博士 2 0 1 共同发表。竞争性蛋白质结合原理”，并依据此原理发展出放 射免疫技术口珂，由于此项技术具有灵敏度高( 可检测i l g 至鸺，甚至f g 的超微量物质) 、特异性强 4 第一章绪论 ( 可分辨结构类似的抗原) 、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。 因此在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分 子物质及肿瘤标志物等的定性与定量测定。但因为它必须使用放射性核素，需要防护和防止污染； 标记物有效使用时间短；难以实现操作和测量的自动化等，因而它的进一步发展受到一些局限。 1 3 7 2 化学发光酶免疫测定( c h e m i l u m i n e s c e n te n z y m ei m m u n o a s s s a y ，c l e i a ) h a l m a n 在1 9 7 7 年基于放射免疫分析的基本原理，将酶的化学发光与免疫反应结合起来建立了 化学发光免疫分析。化学发光免疫分析包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学 发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化形成一个激发态的中间体，当这 种激发态中间体回到稳定的基态时，同时发射出光子，利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免 疫反应系统是将发光物质( 在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原( 化学发光免疫分 析) 或抗体( 免疫化学发光分析) 上 以标记方法的不同，化学发光免疫分析法分为化学发光标记免疫分析法和酶标记。c l e i a 的测 定步骤与e l i s a 基本相同，仅最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过化学发光反应发出的光在特 定的仪器上进行测定。 c l e i a 是一种高度敏感的微量测定技术，凡具有抗原性的物质( 包括半抗原) 都可以用c l e i a 测定。c l e l a 起步于8 0 年代初，快速发展于9 0 年代，但是c l e i a 的测定成本高，包括检测设备及 试剂都很昂贵，在一定程度上限制了c l e i a 的发展1 2 6 j 。 1 3 7 3 酶联免疫检测技术( e l i s a ) 酶联免疫分析技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶促反应的高敏感性而建立的免疫分析技 术。1 9 7 1 年瑞典学者e n g v a l l 和p e r l m a n t 27 】报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的圃相免疫测 定方法，称为酶联免疫吸附试验。联合国粮农组织( f a o ) 也向许多国家推荐此项技术，美国化学会 将免疫分析和气相色谱、液相色谱共同列为药物残留分析的支柱技术 2 8 j 。其基本原理与r i a 相同。 先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗 原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应；用洗涤的方法分离抗原抗体复合 物和游离成分；然后加入酶催化底物使之显色，进行定性或定量测定。最初发展的免疫酶测定方法， 是使酶与抗体或抗原结合，用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸 附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。这种技术就 是目前应用最广的酶联免疫吸附试验，俗称e l i s a ( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ) 。在小分子半 抗原检测中最常用的方法有竞争法和间接法。 ( 1 ) 竞争法：此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，将特异 性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经 过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量星负相关。国外目前研制使用的d e s 免疫 检测试剂盒就是根据这一原理制备的。德国b i o p h a r m ( 拜发) 公司研制的d e s 检测试剂盒可用于动 物尿、胆汁、肌肉、粪便、动物血清或血浆、饲料样品中d e s 残留的检测。其检测尿液d e s 的检 测限为2 0 0 p p t ，回收率为8 5 ；饲料样品中d e s 的检测限为5 p p b ( 规定标准为1 0 p p b ) ，回收率为 7 2 ；动物血清或血浆的d e s 检测限为1 0 0 p p t ，回收率大于9 2 。国内胡鲲等例用德国b i o p h a r m 的d e s 检测试剂盒检测了中华鳖肌肉中的d e s 残留，共检测了3 批样品，检测结果分别为 o 7 2 5 0 0 1 l p g k g 1 、o 9 9 6 + o 0 0 8 p g k g 1 、0 4 5 9 o 0 2 0 , g - k 9 1 平均最低检测下限为o 0 1 2 5 g - k 9 1 ， 平均回收率7 4 8 。 ( 2 ) 间接法：此法是测定抗原或抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本( 含 相应抗体) 与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体( 酶标二抗) 和底物进行测定。国内一些单 位在研制小分子半抗原单克隆抗体时多采用这一原理和技术。何方洋等p ”用间接法测定了他们制备 的克伦特罗单克隆抗体与克伦特罗、沙丁胺醇的反应性，结果表明克伦特罗与单克隆抗体的反应性 为1 0 0 ，而沙丁胺醇不与该单克隆抗体发生反应。王永成等【3 1 1 在制备雌三醇单克隆抗体的过程中 用间接法来筛选雌三醇阳性杂交瘤和测定单克隆抗体效价，得到了稳定分泌雌三醇单克隆抗体的杂 交瘤细胞。覃雅丽等【3 2 1 在制备氯霉素单克隆抗体时，采用间接法来筛选阳性杂交瘤细胞、测定细胞 5 江南大学硕士学位论文 培养上清和小鼠腹水中氯霉素单克隆抗体的效价，制备出了一株氯霉素单克隆抗体杂交瘤，检测细 胞培养上清效价为1 ：2 5 6 ，诱生小鼠腹水的抗体效价可达l ：6 x1 0 。 1 3 8 不同分析方法的比较 g - c 灵敏度较高，但需要衍生化过程；h p l c 可直接分离同化激素，不需要衍生化处理过程，操 作简单、柱效高、载样量大，但缺乏适用于多数同化激素的高灵敏检测器，分离和检测能力不高。 l c m s 联用的优点非常显著，它是除g c m s 之外，又一种集高效和多组分定性、定量于一体 的系统。该技术对高沸点、不挥发和热不稳定的化合物的分离和鉴定具有独特的优势。但是该方法 所需仪器昂贵，样品前处理复杂，操作时需要专门的技术人员，不便推广应用。 与h p l c 相比，毛细管电泳具有操作简单、色谱柱不受样品污染、分析速度快、分离效果高、 样品用量少、运行成本低等优点，有利于实际样品的分析，但其在进样准确性和检测灵敏度方面不 及h p l c 。 薄层色谱法具有使用设备简单、操作简便、分析速度快、灵敏度高、选择性好、固定相和流动 相的选择范围大等优点，但工作量较大。 荧光分析测定的灵敏度高，但由于能发荧光的物质的数目不多，因而其选择性也较高。 r i a 方法特异性强，灵敏度高，但由于这种方法需要有同位素防护设备，对试验人员有一定的 损害，并且有仪器昂贵，假阳性率高，废液不易处理等缺点。 c l e i a 方法灵敏度高，应用范围广，但是其测定成本高，检测设备及试剂相对来说比较昂贵， 因此在一定程度上不利于c l e i a 的推广。 e l l s a 方法应用了抗原抗体免疫反应的特异性，灵敏度高，干扰小，与仪器分析相比，简化了 样品预处理和纯化过程。但是由于免疫酶的活性非常不稳定，在应用过程中很容易受到操作条件的 影响，反应试剂需低温保存。在实际操作过程中很难达到这一要求，使得免疫酶的活性大大降低， 从而影响到结果的准确性。应用时还必须通过多次洗涤，才能使反应产物和游离底物进行分离，影 响到结果的重复性。随着经济的发展，人们对食品质量和健康水平的要求提高，研究与发展简便、 快速、灵敏、适于现场检测的方法势在必行。e l i s a 方法由于稳定性好，成本投入低廉等方面的特 点，得到了迅猛发展，逐步取代了一些落后的检测方法。 1 4 本课题的研究背景、目的及意义 d e s 于1 9 3 8 年首次在英国一家实验室人工合成。d o d d s 等发现d e s 具有很强的雌激素特性， 随后这一发现导致了d e s 在养殖业的普遍应用。通过口服和体内植入d e s ，能够促进牛、羊和鸡等 养殖动物的快速增长，提高饲料转化率。在1 9 7 0 1 9 7 3 年间大量的调查和研究报告表明，使用d e s 的妇女涉及了4 3 个主要妇产科问题。由于d e s 对人类的危害，世界各国目前都明确规定禁止在养 殖动物中使用d e s 。我国也在1 9 9 9 年制定的中华人民共和国动物及动物源食品残留监控中规定 d e s 的最大残留检测量为不得检出。但由于利益的驱动，d e s 仍在被违禁使用。尤其在我国，部分 畜禽生产者盲目追求养殖经济效益，违法使用d e s ，导致动物性食品中d e s 残留严重超标，这些含 有d e s 的动物性食品大量流入国内消费市场，严重危害着人民的身体健康。另外，随着我国加入 w t o ，和国际市场接轨，这些含有违禁残留物的动物及其加工品在对外贸易中不但不能赚取外汇， 反而影响我国的国际贸易声誉，甚至危害我国畜牧业的健康发展。因此，必须对饲料和动物性食品 中的d e s 残留实施严格监控，这是保证动物及动物性食品安全、合格的关键措施。 常用于d e s 残留检测的技术主要包括气相色谱、液相色谱、气一质联用、免疫分析等，尤其是 免疫分析技术特别适合于大批量样品的筛选。在免疫分析中，抗体的获得是重要的一环，它的特异 性和亲和性不仅决定分析方法的特异性和灵敏度，而且决定许多方法的可行性。国外已经建立了成 熟的d e s 残留免疫检测方法，并有相关的诊断试剂盒。目前国内各单位检测d e s 主要采用h p l c 法或是g c - m s 法，这些方法都存在检测成本高、检测仪器昂贵、检测周期长和检测技术复杂等缺点 因此国家食品安全“十五重点攻关项目”中明确指出，要求建立我国d e s 残留标准检测方法及其体 6 第一章绪论 系，这不仅对保证我国食品安全、人民身体健康有着重要的意义，同时对于提高我国动物产品出口 贸易、打破发达国家贸易技术壁垒、促进我国畜牧业健康发展也有着重要意义。 本论文旨在建