（分析化学专业论文）核酸修饰电极生物传感器与活体大脑的电化学探测.pdf

中国科学技术大学博士学位论文 中文摘要 本文对核酸分子的性质及其在化学传感器 ( 尤其是电化学传感器)领域中 的应用以及大脑内神经递质的探测研究进行了较为细致的综述，在此基础上开 展了以 脱氧核糖核酸 ( d n a )、核糖核酸 ( r n a )和核酸碱基等为修饰物的电 化学 传感器研究。 借助 扫描电 镜( s e m) 及x 射线光电 子能谱( x p s) 等表面分析 技术、 循环伏安 ( c v )和差分脉冲伏安 ( d p v ) 等电化学手段进行了电极结构 与性质的表征， 研究了 神经递质多巴 胺 ( d a )、肾上腺素 ( e p) 、去甲肾上腺 素 ( n e ) 和其他生物活性小分子尿酸 ( u a )、 抗坏血酸 ( a a ) 、 色氨酸 ( t 甲) 及酪 氨酸 ( t yr) 等物 质的电 化学行为，并 制备了 胆 碱 ( c h) 与 n afion结 合的 双 层膜修饰碳纤超微电极，初步进行了小鼠大脑内 d a 释放的检测。具体包括如下 内容: 采用循环伏安电 化学聚合法得到了 二聚对氨基苯磺酸 ( p p 一 a b s a )， 并以 此为基础进一步沉积小牛胸腺d n a 薄层得到了双层复合膜修饰玻碳电极 ( d n a / p p 一 a b s 刀g c e )。 研究 发现， p p 一 abs a 在 g c e 表面呈树枝状分形结构， 组成颗粒直径约2 00nln的纳米点阵， 纳米点呈现良 好导电性， 对d a、 u a 有一定 的 催化作 用。 而双层 膜修 饰电 极d n ajp p 一 a b s 刀g c e 对u a、 d a 和a a 有强烈的 电催化氧化作用，使 三者的 d p v 氧化峰分别出现在。 3 08、 0 . 17 2 和 一0 04 v( vs. s c e)， 因而能够进行同时测定。该电 极对d a 有明 显的表面富集和增强电流响应 的作用， 而对a a 有强烈的排斥和降低干扰的作用， 能在1 000 倍a a 共存时选择性 测定d a 和u a ， 检测限分别为88nlnol 几 和0 . 19娜01 几，电 流灵敏度比单层修饰 电 极dn刀 g c e和 pp一 a b s 习 g c e 分别高 4 倍和 5 倍， 双层膜修 饰电 极的 优秀催化 能力来自 于d n a 层和 p p 一 a b s a 层的协同作用。 在g c e 上恒电位电沉积r n a 制备了r n a 修饰电极 ( r n 刀g c e ) 。条件实验 表明， r n a 在电极表面进行共价固载的 优化电 位为1 8v (vs s c e) ，和d n a 的固 载情况相近。 rn刀 g c e ( 1 8 v) 对 a a 、 d a 和 u a的 氧化具 有强烈的电 催化 作用，使三者的d p v 氧化峰分别出 现在众016 ， 0 . 168和 0 .3 12 v 。该电 极对d a 有强烈的表面富集作用，能大大提高测定灵敏度，同时对a a 具有优秀的排斥作 用，能降低a a 阴离子的催化电流因而提高干扰的能力，可在大量a a( 约5 0 0 0 中国科学技术大学博士学位论文 倍) 共存下同时测定d a 和u a 的浓度:在2. o m mof l a a 共存时d a 的浓度线性范 围为0. 37 一36 卜 in o l 几( 检测限为 0. 2 砰 mo】 几 夕 ， u a 的 浓度线性范围为以 74 一73 林 m 。 比 ( 检测限 为住 36卿。 比)。 r n 刃g ce (1s v)同 时 表现了 优秀的 选择性、 高的灵敏度和高的稳定性。 制备了 系列核酸修饰电极， 包括ct-d n a / g c e 、 r n 户 j g c e 、寡聚核普酸修 饰电 极p o l y ( d a ) igc e 、 p o l y ( d 叨 /gc e 、 p o l y ( d g )/gc e 、 p o l y ( d c ) /gc e 、 以 及腺 嚓 吟 ( a d e ) ， 胸腺啥吮 ( t h y ) ，鸟嗓岭 ( g u a ) ， 胞啼睫 ( c yt ) ， 尿啼睫 ( u r a) 单 碱基修饰的g ce， 考察它们对1 知的电 化学催化传感能 力。 详细比 较发现， 核 酸尤其是富含鸟嚓吟核昔 ( g) 和胞嗜吮核昔 ( c ) 碱基片段的核酸修饰的电极， 对口帅 的氧 化有良 好的 催化作用; 嗓吟 碱基、 喀陡碱 基修 饰的电 极也都对trp 有 催化氧化作用，因此证明了核酸修饰层的催化作用并不仅在于其特定的序列和 构象， 核酸的基本构建模块一 碱基， 应该是产生催化作用的基本元素。详细研究 了 尿喀陡共 价修饰电 极对尹帅， 勺r ， a a ， d a ， ep， n e， 等小 分子的电 催化氧化作 用， 从分子相互作用和分子识别的角度对其催化机理进行了探讨，表明催化能力和 传感性能与分子的结构密切相关，具有六元含n杂环结构的分子能更容易与固 载在电极表面的尿喀吮残基通过氢键和二 电子相互作用， 初步揭示了分子“ 手臂” 的作用。 最后，制备了碳纤维柱电极、 盘电极、以及刻蚀纳米电极，并制备了 胆碱 共价修饰的碳纤维电极 ( c h/ c f m e ) ，进而吸附涂敷 n a fi on 纳米薄层得到 n afi创 岁 c l 岁 c f m e .该电极修饰， 利用c h 单分子层和n a fi o n 层正负电 荷之间的 静电 相互作用， 得到了牢固结合的双层， 同时， 结合了 胆碱层的高催化氧化d a 作用和n a fi o n 层排斥八 a和d a的代谢物等阴离子的作用，具有良 好的活体检 测性能。 将该电极成功地运用于检测小白鼠大脑内的神经递质d a的释放， 检测 到了 纹状体内d a的电 化学信号， 并发现针刺激矢状缝附近的间脑处头皮， 能观 测到明显的d a释放脉冲。 中国科学技术大学博士学位论文 ab s t r 即t b as e do nd e t a i 1 e dr e v i e ws o nn u c l e i ca c i d( d n a a l l dr na )s e l l s 0 f s a l l d n e uro t ran s mi tt er d e t e c t i o n si nc e r e b r u n 1 ， s y s te m aticre s e arch、 v a sc arr i e do ut for e l ect roc hemi c al s e n s o rfab ri c ati o n sb ys u r f a c e i nvo l v i n gd n a ，r n a ，uraci landc h o l i ne e to mo d i fi c atio no fb i o act i v es p e c i e s s e m， x p sande l e c tr o c h e m i c a l c y c l i cv o l t a n l m e t ry ( c v )a n dd i ffer e ni i alp u l s ev o l t a m e t ry 田p v ) w e re i nvo l v i n g u s e dforcha r a c t e r i z atio no f the s ee l e c tr o d e st h e s es e n s o r s 、 v e r e u s e dfor e l e ctro c h e m i c al s ens i llgo fb i o act i v e mo l e c u l e s i ncl u d i n g d o p am i n e e p i n ep加ne tryp to p h an 伍p ) ，noe p i n e p h r i ne (ne ) ，uricaci d(ua ) ，a s c o rb i ca c i d ( d a ) ， ( a a) ， ( t rp ) andty ros i n e( t y r)etc. an a fi o 可 c hd ual l a y e r m o d i fi e dc ar b o n fi b e r e l e c t r o d e w asfa b r i c ated and u s e d fo r i n 一 v iv o d e te rmi n at i o n a i 1 d m o ni t o r i n g the d arel e a s e i nmo u s e c e r e b r u n l . t h e d e t ail s a r e a s fol l o ws : ap o l y ( p 一 a m i n o b e n z e n s u l fo n i ca c i d ) d i m e rm o d i fi e dg l as s yc a r b o ne l e c t r o d e ( p p 一 a b s a / g c e ) was p r e p ar e db yc ve l e ct r o 一 p o l 卿e r i z a t i o nund e ro p t im i z e d c o ndi ti o n . t h e n ， at h i nfi l m o fc t 一 d n aw as d e p o s i te do nth ep p 一 a b s a/g c e ， o b ta i n i n gab i 一 l aye rc o m p o s i t em o d i fi e de l e c t r o d e ，d n ajp p 一 a b s ajg c e .t h e p p 一 a b s ad e p o s i t e d fo r m s a g rass 一 l i kez 一 dfr a c t a l p al t e me d n ano l atti c e o n t 11 e g c e s u r fa c e . t he z 一 dn anoc lu s te r so f p p 一 a b s ah aveg o o de l e c tr i cc o l1 d u ctiv i tyand c a l a 1 ytic ac t iv i tyt o w ard e l e c t rochemi c alo x i d atio n s o f d aandu a . t he c o m p o s ite e l e ctro d e d n a/p p 一 a b s aig c ep re s ente ds upe r i o r e l e c troc a t a 1 ytic acti v i tyto w ar d s th e o x i d atio no f d a ， i j aa n da a ， w h o s e d p vo x i d at i o np e ak app e aredat0 3 0 8 、 0 . 1 7 2 an d 刁.0 0 4 v(v ss c e)r e s p e ct i v e l y ， al l o w i n g s i m u 1tane o u s d e t e r m i n at i o n o f t h e s e s p e c i e s i n a m i x t u r e . thi s e l e c tr o d e sho w e do bvi o u s abi l i t yfo r i n c re as i n g t h e c l 1r r e nt r e s p o n s efo rd a andu a t hr o u gh s urfaceenr i c hi n e nt ，andr e duc i n g i n te rfer e nc e o f a ab y r e p e l l i n g . wi th1 0 0 0 fo l d c o e x i s t e n c e o f a a ， th i s e l e c tr o d e c an b e u s e d tod et e rmi ned aand u as e l ecti v e l y w itha d e t e c t i n g l i m it o f 8 8 nmo l 几and 0 . 1 9卜 m o l /l， r e s p e c t i v e l y . t h ec urre n t s e n s i t i v i tyw a s abo ut4and5fo l do f at d n a/g c ea n dp p 一 a b s a/g c efo r d aan du a ， the s 即e r s e n s i n gabi l i t y o f t h i s 中国科学技术大学博士学位论文 hi 一 l aye r e l e c trod e w asfr o mthe s y n e r g i c e ffecto f d n a明 d n a ll o 矛 p a b s ac hi s t er s itwasp r 0 pos ed t h a t the 下 一 el ec trons tacki ng of the d n a b as e画rsandth e c o nj u g atedarom a 1 i crillg s o f the c o n d u c t i v ed i mer m a yh a v ei nter 拟i o ns， whi c h m i ght p r o v idea p e r fe ctp a t h w a y for charge l r 溯 port ( c 刀n 刀 mthe con d 以桩 n g d n a chai nstot h e g c eand 俪i 1 i t a t e the e l e c t r 0 n tr ans fer p r o c e s s e s . f o rc o m p 如s o nw i t hthe d n a g r a ft e de l 民 t r o d e ，ar n ag r a a e dg c e ( r n a 心 c e ) was p r e p a r e d 妙e 1 e ct ro c h emi c ald e p 0 si ti ono f r n aatth e o p ti m i ze d p o 比 n t ia l o f1 8v( v s . s ce) . i t wasfo u n dth atth i s el e c trode pres e n 玄 ss tron g e l e c t r o 一 c a ta l ytic abi l i tyfor u a ， d aa n d a a ， w h o seano di c d p vp e aks app o ared at 0 .3 1 2 ， 0 . 1 6 8 a n d一 0 .o l 6 v，re sp e c t i v e l y，s i 而l artothe d n ag r a n e d e l e c 七 o d e . t h e r n a /gc e h ass t r o nge n r l c 知 的 e nte fl 七 c t fo r d aa n d s 叩er io r excl usi veabili tyfo r a a. t h ec o 一 e x i s t e n c eo f 5 0 0 0fol da ad i dn o t i nie l 介rewi tht h ed e l e c t i o no f dao r ua. inthe p r e s e n c eo f 2 0tnmof la a ， al i nearrange of0 3 7to3 6卜 m o u lw i t ha d e t e c ti on l i m i t o f o .zp n l o 比 fo r d a ， 明d i n th e r 助 名 e o f o 卜7 4 to7 3 仁 m o 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th e b as e s ， asthe b ul l d i n g b lo c k o f nuc l e i c 即 i d ， ar e the key e l e m e nts fo r g e n e r at i n g e l e c t r o 一 c a t a l yt i c abi l i ti e s 甲 w 七 fo cuse d th e s to d y o n t h e urac i i gr a fted g c e (ur 留 g c e) for t rp ， tyr ， d a ， e 只n e ， u aa n da aoxid ation re a c t i ons ， 胡dt h e m e c h a n i sm for the c a t a 1 yt i c a c t iv ity w a s p ro p o s edb 邸 e d o n m o l e c u l e s i nter 咖 o ns. t h e mol ecul arre cognitj 加abil 沁 was re 1 ated tothe mo1 ec ul ars t r u c t u r e . iti n d l c ates t h a t the m o l e c u l e s w h i c h h a v e the n6 一e m b e r h e 加 ro c 产l i c ri n g c o u l d m ore e as i l y 中国科学技术大学博士学位论文 i ntera c t 侧thurac i l gr a n e d onth e g c et hr o u ghhb o n d a n d 兀e l e c t ro n s ac t i o n . a n “ a r ll l e ffec t ” o f s i d e c h a in s i n t hem o 1 e c u l e s w a s d i s c u s s e d asa s i gni fi c 劝t i nt e ract i o n 几c l o r f i 耐l y， ( c h/c f me)， 讹 伪b ri c ateda c hol lne ( c h)c o v a l 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r )发现的，以 后奥特曼 ( r.a l tmann )等人制得不含蛋白质的核酸，并于1 8 89年正式命名为核 酸 【 1 ， 21 。目前人们根据核酸的化学结构和生物功能将其分为两大类:含有核 糖的称为核糖核酸 ( ri b o ll u c leicaci d)，简称r n a ;含有脱氧核糖的称为脱氧核 糖核酸 (d eo x yr i bonuc leio ac id) ， 简称d n a 。 d n a 是 遗传 信息的 载体，主要存 在于细胞核中，在线粒体、叶绿体和质粒中也有少量存在。 r n a 除了在r n a 病 毒中作为遗传信息的载体外，在真核和原核生物的细胞中都存在着三种主要类 型的r n a，即信使r n a( m r n a ) 、核糖体r n a( r r n a )和转移r n a( t r n a) ， 它们主要的功能是参与蛋白 质的合成。19 44年埃弗利 ( qave ry) 等人首次证明 d n a 是遗传性的 物质基 础。 50年 代初， 查加夫 ( e. c h ar g aff) 运用较精确的 层析 法，发现了各种生物共有的1 n a 碱基等比规律。1 9 53年遗传学家华生 ( j 刀w白 t s on) 和物理学家克里克(f毛rick)提出了d n a 双螺旋结构的立体模型， 不仅阐明了d n a 的结构，而且为d n a 分子如何复制如何传递遗传性状提供了合 理的说明。 目前核酸的研究处于飞速发展的时期，近年来发展的分子遗传学和基因工 程技术， 为工农医的实际应用开辟了 崭新的 局面。 d n a 传感器的研制与开发， 也 成为分子生物学和生物化学中最为活跃的 研究领域之一。人们可以用已知序列 的d n a 片断( 寡聚核昔酸) 去检测未知的d n a 序列，从而研究基因突变，为遗传 病的诊断以 及防治研究提供服务。 大规模的1 ) n a 阵列传感器( d n a 芯片 ) 的 研究 和应用， 可以大大推进包括人类基因组和后基因组计划在内的各类基因组研究， 寻找和发现新的基因， 研究基因的功能， 以 及生物体在进化、 发育、 遗传等过程 中的规律; d n a 与 其它小 分子 ( 尤其是能 识别特定碱基 序列的小分子) 或一些药物 之间相互作用的研究，使核酸科学的理论研究与生产实际紧密地结合了 起来。 中国科学技术大学博士学位论文 那.z d n a j r n a与靶向分子的相互作用及其电 化学研究 d n a 瓜 n a作为生命遗传的物质基础 ( d n a分子是生物体的遗传信息库， 而r n a分子参与遗传信息表达的一些过程)，能与许多分子发生相互作用 ( 不 仅是特定序列的核酸还有其他外源分子)，在生命活动中具有重要的意义。进 入90年代， d n a与其靶向 分子相互作用的 研究已 成为化学和生命科学热门课题 之一。 例如人们常以 药物作为d n a /rn a靶向分子中的一种， 研究其与d n a之 间的相互作用， 不论是对阐述药物的作用， 还是对病变机理的研究， 尤其对药物 的体外筛选都是非常有意义的。这些研究不仅为设计新的药物和疾病的化学处 理方法提供了理论依据， 而且对筛选特定药物的简便方法提供了 参考。 d n a j r n a探针广泛应用于基因工程、分子生物学研究及医学检验等领域。 d n ajr n a探针， 是指可以 与待测核酸分子进行杂交的d n a /rn a片段， 其大小 不一， 可包含十几至几千个核昔酸。 用d n a /rn a探针技术测定两条不同来源的 核酸单链的杂交情况， 可以对它们的同源性程度进行分析， 以此检测特定核昔 酸序列在样品中的存在及含量， 因而可以 用于序列特异性的基因检测， 识别与它 互补的 核 酸片 段l 3 7 一 40 ， 来获 得有关生命遗传的 信息， 也可以 作为r f a的 一 种 检测方法。 用特定的 探针来检测某些特定的 基因片段1 引一 4 6 ， 如滤过性病毒细 菌的基因片段等，对于疾病诊断具有重要意义。 d n a 一 蛋白质相互作用，是生命延续和进化的物质基础，是研究基因表达调 控的一个重要领域。 r n a是遗传信息的一个中间传递者， r n a结合蛋白调控着 r n a功能的各个方面， 它负责对r n a进行运输， 帮助r n a进行翻译， 对r 刊 a 进行降解，可是说这些蛋白调节着细胞内的表达。有关 d n a/r n a和蛋白 质的 相互作用的 研究，已 经 受到 人们的 广泛的关 注4 7 5 71 。 研究 d n a 厂 r n a和蛋白 质的相互作用， 常用的技术有d n a印迹体外体内分析、 凝胶迁移率分析、 筛选 ( s e l e x ) 、 表面等离子共振技术、 位点专一d n a 一 蛋白 质交联法、 紫外交联和 染 色 质 免 疫 沉 淀 技 术( c hrom at i n im m l ln o p recip i tat i o n as s 叮 ， c h l p ) 等 金属离子可以同核酸的不同 位点发生作用1 5 8 一 6 3 ， 进而影响核酸的构象。 一般来说， 单价的阳离子 主要和核酸骨架的 磷酸根发生静电 作用【 58，6 2 ， 6 3 ， 二价 中国科学技术大学博士学位论文 的 离子( 主要是过渡金属离子) 既 和磷酸根作 用又和 碱基作 用 61，631 . 金属离 子 与核酸相互作用时，首选的碱基一 离子作用位点是鸟嗦睁上的 n 7和 06 位置， 这些阳离子还可以同碱基的其他位置如胞咄咤的 n 3和腺嗦吟的 n l发生作用 641 。据此， 人们常常利用 d n a /l u 冈 a作模版，来合成金属纳米材料， 例如以 d n a为模版可制备ag 纳米簇 651 、 导电的ag 纳米线 6 61， 以r n a为模版可制 备p d 纳米粒子等 6 7 ， 6 8 . d n a 瓜n a 与小分子尤其是药物分子的相互作用也是近年来人们研究的热 点， 例如rna 识别氨基酸 68一 73 、以 及含氨基的 抗生素类药物的 研究 7 4 一 77 ， 抗肿瘤药 物s n( c h 众c1 2 和d n a 瓜 创 a 相互 作用的 研究 汇 78 。 ds d n a 与 靶向 小分 子 相互作用的 模式较为复杂， 通常包括三种: 其一， 外源分子或离子插入d n a 分子 双螺旋的碱基之间; 其二， 外源分子或离子与d n a 分子的带负电荷的核糖磷酸 基骨架之间的静电相互作用; 其三， 通过非特异性的静电作用结合到荷负电的 d n a 双螺旋外部。 对d n a 与蕙环抗生素道诺霉素( d auno m ycin，d n m ) 加合物的 研 究 79一 83 发现， 蕙环化合物是通过其带正电 荷的 糖残基与d n a 之间的静电 作用， 及蕙环平面与d n a 的嵌入结合面形成了 加合物。 小分子与d n a 键合常会诱发许多生物效应.阿霉素和柔红霉素分子的芳基 部分可嵌入d n a 碱基对之间， 水合顺铂和d n a 链上鸟缥吟碱基配位而使它们具 有抗癌作 用 84 。 铂配位化合物类药物的 抗癌作用， 被认为 是由 该药物与癌细 胞 d n a 的 共价结合致使d n a 模板失活所致。 r n a 能折叠成多种复杂的构象和结构，这些构象可以作为识别药物分子的 基础。 很多以 r n a 为标靶的药物分子， 可通过连接到核糖体r n a 干扰转录过程， 来实 现它们的 生物作用或达到治 疗作用 85 一 88 1 。 含 氨基的抗生素类药物的杀 菌 作用，就是通过直接连接到细菌的核糖体r n a( 305) 的16s r r n a 来千扰转录 过程中的 迁移来实现的 f 89 ，9 0。 近几年来， 有三类的 r n a 分子已 经被确定为 含 氨基类抗生素药物的 靶点1 8 8 一 9 01 :第一类是 催化性rna ( c a ta l ytic r n a)或称为 核酶 ( ri b o z y m e s ) ， 包括1 型自 剪接内 含子( 5 o l f s p l i c 访 9 脚叩i i ntro ns) 【 9 1 一 9 3 和锤头状核酶( h a m m e rheadri bozy me) 9 4 一 981 ; 第二 类是含有蛋白 质结合位点的 r n a 区， 包括人类免疫缺陷病毒( h w)的内 环蛋白 应答元件 ( revrespons i ve e l e m e n t ( r r e ) ) 9 9 ，1 0 0 和反启 动子区 ( tr ans. a c t i vati昭 化 g i o n( t a r ) ) 1 0 1 ; 中国科学技术大学博士学位论文 第三类 是 筛选出 的 特定的高 亲和性的 适配子区( a p t a 川 er s ) l 02，1 0 31。 研究药物分子与d n a / r n a 的作用机理，大多采用荧光光谱、紫外光谱、圆 二色光谱、线性色谱、i h n m r 法等手段， 但也可使用电化学方法。电化学方法 主要是利用极谱和伏安技术， 包括循环伏安法、线性扫描伏安法、直流极谱法 (dc p)、交流极谱法(ac p)、吸附溶出伏安法(adsv)、吸附转移溶出伏安法 (asts v)、 微分脉冲极 谱法(dp p) 、卷积伏安法、 计时库仑法(cc)、阴极( 阳极) 溶出 伏安法 (cs v， a s v)、方波伏安法(s w v ) 、 示波滴定法等。电 化学方法研究 d n a/r n a与其它分子的相互作用，是基于这些分子存在与否所引起的 d n a j r n a 体系伏安特性的变化，包括由于嵌入反应引起的体系式电势的移动、 当 小 分子与 d n a 分子 结合而导致扩散系数 d)大幅度的 下降、 扩散电 流减小等。 四困一 甲 基毗吮基) 叶琳锰( 1 1 1 ) ( m n ( 1 1 1 ) t m p y p ) 能插入d n a 分子的碱基对中间 f 1 04 ， 因而 d 值大幅 度下降，引起m ll ( m) t m p y p 微分脉冲伏安峰峰电 流大幅 度 降 低， 因而 用d n a 滴定 m n( m)t m pyp ， 可根据峰电 流的 变化求得结 合常数( 表征 结合强 度 ) 和结合 位点 的 大小( 即 碱基对的 数目 )l0 5 铂配合物与d n a 的相互作用， 可用d p p 方法检测到d n a 分子构象的局部微 小变化1 84 。 研究表明 1 0 6 ， 含铂族金属的细胞滞留 药物， 其抗癌活性与其和 d n a 的加合物的d p p 行为有相关性， 因而可以用d p p 法作为一种筛选新的铂族抗 癌活性配合物的有效方法。类似地，其它类型的分子，尤其是那些能识别特定 碱基序列的分子与d n a 分子相互作用的电 化学研究， 将在d n a 的结构与生物功 能的分析中具有特殊的价值。非电化学活性分子与d n a 的结合，只要通过它们 与某种电活性分子的竞争结合，就可以转化电化学可观测量来进行研究了。 当前， 对药物分子的电化学筛选方法的研究， 还处于起步阶段。 d n a/r n a 提供了 一个手性场来研究药物分子与核酸的相互作用， 而电化学方法则具有简 便、 快速、 灵敏度高、 低耗费 等诸多优点， 两者相结合不仅能从分子药理学水平 了解有关药物的作用信息， 为药理研究提供实验依据和线索， 而且还可为药物 的结构改变方向及药物的效力研究提供实验模型， 并在此基础上建立一种优化 的体外筛选方法。 如今，己 经利用各类 d n 刀又 n a修饰电 极来开展 d n a/r n a 与电活性物质以及各种离子之间的相互作用研究、d n a /rn a 损伤研究、 中国 科学技术大学博士学位论文 d n a 叹n a的结构形态、碱基序列研究、识别互补 d n a 爪 na的研究等。 影. 3 d n a /r 入 a电 化学传感器 生物传感器，是指用固定化的生物材料 ( 酶、抗原、抗体、激素、d n a 、 rna ) 或生 物体本身( 细胞、 细胞器、 组织) 作为敏感 元件的 传感器 l 1 07 .在 生物传感器中除了分子识别元件外，还有信号转换器十分重要，例如电化学电 极、石英晶体、离子敏场效应晶体管、热敏电阻器及微光管等， 将识别信号转 换为检测信号。其中，以生物材料为敏感元件，以电 化学电极为信号转换器， 以电势或电 流等信号为特征检测信号的传感器，就是电化学传感器。 作为生物传感器的重要组成部分，d n a/r n a传感器一直是当前研究的热 点。 按照其常用的信号转换器特征， 主要可以区分为光纤荧光法l 08， 109 、 假布 儒斯特角反射法【 1 10 、 表面等离 子共振法l l n 、 压电 共振法1 12， 1 13 】 、 石英晶 体 微天平法汇 1 1 4 ，1 1 5 ) 、 表面声波法 1 1 5 ，1 1 6 ) 、 化学 发光法 1 1 7 1 、电 位滴定法 1 1 8 ， 1 1 9 、 阻 抗法 1 2 0 ， 1 2 1 、电 容 法 1 2 2 和伏安法 1 2 3 一 1 2 8 。 电化学的d n a 很 入a 传感器，是采用电化学的方法把识别结果转化为可测的 电 信号。 根据d n a 月 又 n a 电 化学传感器的作用范围， 可以 大致分为 两类，一类是 以单链的 d n a 瓜n a 为探针， 根据碱基的特异性结合， 实现对其互补片断的单链 的 d n a 用 凶 a 识别， 称为电化学基因 传感器; 另一类是以 d n ajr n a 为敏感元件， 利用它和其他物质的相互作用来检测这些物质。 两类传感器都是以 d n a 月 u 闷 a 分 子的固定为基础的. 其中，电 化学基因传感器一直是研究的热点。随着d n a 探针制作技术的发 展， 用d n 入 很 n a 电 化学传感器进行核酸分子杂交、 识 别的 测定， 代表了一 种崭 新的技术构思， 被认为是开辟了电化学与分子生物学交叉学科的新领域， 为生 命科学的研究提供了 一种新的方法。电化学d n 户 j r n a 传感器是非常具有发展前 途的一种生物传感器，其中以 d n a 修饰电极制作的传感器为主。 1 3 . 1电化学基因传感器 1 .3 . 1 . 1 电 化学基因传感器的设计制作 中国科学技术大学博士学位论文 电化学基因传感器测定 d n a 的整个过程包括以下几步: 1 .探针的固定，即将55 一 d n a 连接或固定到电极表面; 2 .杂交过程， 将探针电极放入被测溶液和目 标的55 一 1 ) n a 或r n a 片断进 行杂交，该过程必须控制适宜的杂交条件; 3 杂交的指示，即如何将杂交信息转为测定信号; 4 电化学的检测，以电势、电流、电导等为检测信号。 制备电化学基因传感器时，探针除了 d n a /rn a 片段外，也有采用肤核酸探 针的。 肤核酸 (pn a ) 是与核酸类似结构的物质， 它以 n 一 (2一 氨基乙基) 甘氨酸 取代d n a 中脱氧核糖磷酸集团形成， 呈电中性， 与互补的d n a /rn a 具有强烈的 结合力。p n a与d n a 结构比较见图1 . 8 。 f na 了 . 一 “ 一 . . 一 ， : 丁护”0 认 q :州翻 、 o 翻. 抓_ . .一口.，-二甲.-.户讲 图1 名p n a 与d n a 结构。 f i g . 1 . s t h e s truc tu r e o f p n aa ndd n a . 1 .3 1 .2探针固定 传感器主要包括探针与基底两个部分。基底电极的选择要考虑探针的固载 方法和传感信号的提取方式，主要有导电与不导电的选择。 d n a 探针为55 一 d n a 或寡聚核昔酸，它与被分析的55 一 d n a 序列 ( 或r n a )互补，通常固定在电极表 面，主要的固载方法可分为吸附法和共价键合法。 、吸附固载法 中国科学技术大学博士学位论文 ( 一)化学吸附法 p al ec e k 利用d n a 能在汞电极表面产生较强烈的吸附，发展了一种简便制备 d n a 修饰汞电极的方法。将电极浸入溶液中，55 一 d n a 可发生不可逆吸附，经过 冲 洗， 便可得到稳定的 55 . d n a 修饰 汞电 极【 12 9 一 13 4。 若把55 一 d n a 溶液转移至玻 碳电 极 ( g c e) 【 13 5 ， 或金电 极表面 13 6 涂均，空 气中 烘干， 无菌二次 水冲洗， 充分浸泡，就得到几乎单分子层的55 一 d n a 修饰电极。 这种化学吸附法的优点是 操作简单，但得到的55 一 d n a 修饰电极并不利于分子杂交。 ( 二) 一定电 位下的吸附 将碳糊电 极(cp e)表面控制在一定的电 位下(+ 。 svvsa g/ a g ci ) ，可吸附 55 一 d n a ， 用中性缓冲液冲洗去未吸附牢固的 55 一 d n a ， 即可制得传感电 极 13 7 。 另一种更为简单的方法是将55 一 d n a 的醋酸缓冲溶液滴加至g c e 表面，千燥后， 将电 极插入 缓冲溶液中 保持电 位+1.4 v(vs，s c e)数分钟， 即可制得传感器 1 3 8 。 在热裂解石墨电 极和以 碳为基底的任意的网板印刷电 极( sc re enpr i nted el e ctro de) 上，同 样可用这种吸附方法固载d n a 探针【 13 9 一 1 4 2)。 ( 三)自 组 (s a)膜法 基于分子自 组装作用，在固体表面自 然形成高度有序的单分子层的方法称为 s a 法。 常采用的是疏基化合物或甲 氧基在金表面的自 组装作用 1 4 3 一 1 4 6 。 利用 分子的自 组装作用制得的d n a 修饰电极表面结构高度有序，稳定性好，有利于 杂化，但对琉基化合物修饰的d n a 的纯度要求较高，分离提纯操作较繁琐。 ( 四)电聚合法 利用导电化合物在电极表面的电聚合作用，可将d n a 探针固定在电极表面 上。 f. g amie 得11 47】 以 聚 ( 3 一 乙 酸毗咯) / (3一轻基苯邻二甲 酞亚胺毗咯) 为 前 体聚合物， 将含有氨基的 d n a 或寡 聚核 昔酸 ( o d in) 嫁 接到电 极表面。 j .w an g 等【 14 8， 14 9 则将o d in在电 聚合过程中 作为平衡电 荷的