（动物学专业论文）大仓鼠（tscherskia+triton）种群年际遗传变异与生态适应研究.pdf

曲阜师范大学2 0 0 4 级硕士毕业论文 摘要 以福尔马林浸泡保存的1 9 8 4 1 9 8 8 年间大仓鼠肝脏标本为实验材料， 通过s n p s 检测研究犬仓鼠不同年际季节种群间遗传多样性的变化规律。通 过优化标本基戮组总d n a 的提取方法，获得高质量的足以满足精续分子实验 要求的基因组d n a 。选取大仓鼠、黑线仓鼠、原仓鼠的2 l 对微卫星弓l 物及自 行设计的5 2 对引物分别对1 9 8 4 1 9 8 8 春、秋季个体进行扩增，反复实验最 终从7 2 对引物中筛选出扩增稳定、效率高、重复性好、多态性丰富的6 对 弓 物对1 9 8 4 1 9 8 8 誊秋攀节共1 0 个种群进行扩增，并回收目的条带，克隆 测序后进行s n p s 分析。d a m b e 软件比对分析发现1 0 个种群中均存在不嗣数 目的多态位点，其中又以8 6 、8 5 年较高，8 8 年最低，而且检测到的多态位 点多为转换，6 对引物在l o 个种群中仅检测到一个缺失，没有插入发生，转 换：颠换2 ：l 。利用d n a s 辨1 0 软l 孛统诗分柝秘群起的核营酸多样性( p i ) 、 单倍型多样性( h d ) 及种群间核苷酸歧异度( d x y ) 和种群间分化数( f s t ) 。并 采用m e g a 3 i 0 对1 0 个种群进行u p g m a 聚类分析。综合6 对引物的数据分析 结果，发现1 9 8 4 1 9 8 8 年闻，遗传多样性由高至低依次排列为：8 6 春 8 6 救 8 5 春 8 4 赛 8 5 秋 8 4 秋 8 7 誊 8 7 秋 8 8 誊 8 8 秋。u 粥凇聚类 分析结果表明8 6 、8 7 、8 8 年春秋季节种群及8 5 年秋季种群遗传距离相对较 近，而与8 4 春秋、8 5 年春季种群相对较远。综台实验结果结论如下 l 福尔马林浸泡标本d n a 提取的优纯。缀过反复实验，钎对本实验室 研究提出的由福尔马林浸泡标本组织中提取d n a 的方法加以优化，从恧进一 步提高了提取d n a 的质量及数量。 2 筛选出6 对能够在扩增大仓鼠种群中稳定扩增的引物，其中5 对为 自行设计弓l 物，扩增务带均单一、明亮，扩增效率离、重复性好、多态性丰 富。 3 大仓鼠种群的生态适应及调节机制。 ( 1 ) 春季种群的遗传多态性高于秋攀，进一步验证了“增殖一扩散平 衡说”。该学说认为在繁殪翅，由于新生个体不断产生，在一定取样范围内， 个体间具有较近的亲缘关系，故群体遗传多样性相对较低；种群在非繁殖期， 大仓鼠种群年际遗传变异与生态适应研究 由于没有新生个体的补充，只有扩散和迁移，故在一定取样范围内，个体间 亲缘关系相对较远，群体遗传多样性也就较高。 ( 2 ) 暴发年种群遗传多态性高于低数量年及数量上升年，符合f o r d 假 说。该学说认为当种群暴发时，即其数量迅速增长时期，自然选择作用较弱， 于是种群内遗传变异的量就增加，而当种群达到一定密度时，自然选择就变 得比较严厉，种群内遗传变异的量就会减少。 关键词：大仓鼠福尔马林浸泡标本s n p s遗传多样性 曲阜师范大学2 0 0 4 级硕士毕业论文 a b s t r a c t t h eg e n o m i cd n ao ft h eg r e a t e rl o n g - t a i l e dh a m s t e r ( t s c h e r s k i at r i t o n ) e x t r a c t e df r o mt h el i v e r sw h i c ha l ei m m e r s e di nf o r m a l i n ，i sa m p l i f i e db y6p a i r s o fp r i m e r st od e t e c ts n p s ，i no r d e rt os t u d yt h ev a r i a t i o no fg e n e t i cd i v e r s i t yo f t h eg r e a t e rl o n g - t a i l e dh a m s t e ro fd i f f e r e n ty e a r s f o rt h el i v e r sh a v eb e e n i m m e r s e di nf o r m a l i nf o ra b o u t2 0y e a r s ，t h em e t h o do fe x t r a c t i o no fd n a m u s tb eo p t i m i z e dr e p e a t e d l yt os a t i s f yt h ed e m a n do ft h el a t e re x p e r i m e n t a n d t h ep r i m e r sc h o s e nf r o m7 2p a i r so fp r i m e r sh a v et h em e r i t so fh i g he f f i c i e n c y ， a b u n d a n tp o l y m o r p h i s ma n dc a nb oa m p l i f i e ds t a b l y t h es e g m e n t sa m p l i f i e db y t h ep r i m e r sw h i c ha r ea l la b o u t5 0 0 6 0 0 b pa r ec l o n e da n ds e q u e n c e d a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so fd a m b e ，d n a s p 4 1 0a n dm e g a 3 1 0 ，d i f f e r e n t n u m b e r so fs n p se x i s ti n p o p u l a t i o n so fd i f f e r e n ty e a r sa n d s e a s o n a l p o p u l a t i o n s t h eg e n e t i cd i v e r s i t ya m o n g10p o p u l a t i o n sb e t w e e n19 8 4 - - 19 8 8 c a l lb ea r r a y e da sf o l l o w s ：8 6 s 8 6 a 8 5 s 8 4 s 8 5 a 8 4 a 8 7 s 8 7 a 8 8 s 8 8 a t h ea n a l y s i so fu p g m a 。s u g g e s t e dt h a tt h e r ea r ed i f f e r e n c e sb e t w e e n 10p o p u l a t i o n s ，t h o u g ht h ed i f f e r e n c e sa r en o ts i g n i f i c a n t b ys y n t h e t i z i n ga l lt h e r e s u l t s ，w ec a nd r a wt h ec o n c l u s i o n sa sf o l l o w s ： 1 o p t i m i z et h em e t h o do ft h eg e n o m i cd n a e x t r a c t i o nf r o mt h es a m p l e i m m e r s e di nf o r m a l i n 2 s e l e c t6p a i r so f p r i m e r si n c l u d i n g5p a i r so fp r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n g t op r i m e r5 0 t h ep r i m e r sc a na m p l i f i e dt h eg e n o m i cd n a s e g m e n t ss t a l b l ya n d t h es e g m e n t sa m p l i f i e dw h i c ha r ea l la b o u t5 5 0 b ph a v e t h em e r i t so ft h eh i g h e i l i c e n c y ，a b u n d a n tp o l y m o r p h i s m ，a n dc a nb ea m p l i f i e dr e a p e a t e d l y 3 t h ee c o l o g i c a la d a p t a b l i t ya n dt h eg e n e t i cr e g u l a t i o no ft h eg r e a t e r l o n g t a i l e dh a m s t e r ： a t h eg e n e t i cd i v e r s i t yi ns p r i n gp o p u l a t i o n st e n d st ob eh i g h e rt h a ni n a u t u m np o p u l a t i o n s t h i sr e s u l ts u p p o r t st h e “r e p r o d u c t i o n d i s p e r s a lb a l a n c e h y p o t h e s e s t h em a i ni d e ao f t h eh y p o t h e s e si st h a tt h et e m p o r a lg e n e t i cd i v e r s i t y i i i 大仓鼠种群年际遗传变异与生态适应研究 o f p o p u l a t i o ni nas a m p l ea r e ai sd e t e r m i n e db yb o t hr e p r o d u c t i o na n dd i s p e r s a l b t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fb r e a k o u t y e a rp o p u l a t i o n st e n d st ob eh i g h e r t h a ni n l o w - q u q a n t i t y y e a rp o p u l a t i o n s t h i sr e s u l ta c c o r dt ot h ef o r d h y p o t h e s e s f o r db e l i e v e dt h a tw h e nt h ep o p u l a t i o nb r e a k so u t ，b e c a u s et h e n a r l _ r a ls e l e c t i o ni sw e a k e r ，t h eh e r e d i t a r yv a r i a t i o ni ni n t r a p o p u l a t i o ni n c r e a s e s b u tw h e nt h eq u a n t i t yo ft h ep o p u l a t i o nr e a c h e sc e r t a i nd e n s i t y t h en a t u r a l s e l e c t i o nt u r n ss e v e r e l y ，a n dt h ev a r i a t i o nd e c r e a s e s k e yw o r d s ：g r e a t e rl o n g t a i l e dh a m s t e r ( t s c h e r s k i at r i t o 胛) ； s a m p l e si m m e r s e di nf o r m a l i n ；s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ( s n p s ) ；t h eg e n e t i cd i v e r s i t y i v 曲卑师范大学2 0 0 4 级硕十坶业论文 大仓鼠种群年际遗传变异与生态适应研究 1 弓 言 鼹每久类关系密臻，毽嚣辩又给入类豹叟存和发袋带来缀天豹盏密。鬣 不仅盗食粮食、啃咬树术、破坏草场，而且还会传染很多可怕的疾病，其中 与惑露关静夭类疾瘀纛我国已鲞凌籍鬃少毒2 5 耱，共涉及7 9 耪藏g l 。其孛， 危害最严重的衡鼠疫、肾综合症出血热、钩端螺旋体瘸和恙嫩病等。所以， 鬣已残为人类技会送多窝持续发震孛瓣一令鬟婺豫患。毽另方嚣，鬣装毒 害性又是相对黼言的，鼠类作为生态系统中的一员也有其有益的一面。鼠的 取食、 i 薹运活旗骞穰予攘携耱子夔扩教，转撬秘蘸发；鬣懿挖撼适动麓裂予 土壤通气性增加，并能够加速生态系统中物质、养分和能量的流动和循环。 骶疆捧建一令踅要戆功能群，簸在生态系统豹维持和囊态乎餐上起蓦霪要接 用。只有当其种群暴发成灾时，鼠的肖害性才会显现出来。因此，在防治鼠 害薅要零善生态学熬戎点，科学有效鹣治理，尽可旋转减少灭鼠工作带来豹 不利影响，维持生态平衡。 我辫是一个鼠害发生比较频繁和重豹露家，如之我国又是一个农业大 国，由于鼠害而造成的各种损失是巨大的，因此开展鼠类种群遗传多样性、 周期性波动及综合治理研究显得揍辨熏要，在僳粮防瘸、护棒券畜及篓芝态平 衡的维持等方谢均具有重要的实践意义。在科学研究t ，鼠又是一类葛仁常有 价值的研究对象，鬣类种群的周期性波动是擞命科举领域内的一个研究热 点，尤其是近筇来随着宏观和微观生物学研究的结合，从分予生物学的角度 阐明鼠类种群大暴发的枫理、种群动态与生态环境的邋应等课题倍受必注1 2 】。 大仓鼠( t s c h e r s k i a t r i t o n ) 隶属于瞒齿爵( r o d e n t 妇) 仓鼠科( c r i c e t i d a e ) 仓鼠属( c r i c e t u l u s ) 是广泛分布于我国长江以北的爨要害鼠之一，在俄罗 斯的西伯乖j 亚南部和朝鲜也有分布。按大仓鼠在我国的分雍范围可翔分为5 个亚种，即指名亚种( c 六t r i t o n ) 、山西亚种( c 六i n c a n u s ) 、东北亚种 ( 六f u s c i p e s ) 、秦岭鼗稀( f c o l l i n u s ) 、静肃泛种( 六c a n u s ) 。大仓 太仓鼠种群年际遗传变异与生态适应研究 鼠喜栖息于砂溪土及砂壤质土区，主甏栖于平原、丘陵、山域等各类地形的 农田、山区河豁，在接近农田的草原、沼泽地、灌木殿林缘地区也鸯分布。 大仓鬣为单漏独居，一般稷据体重翔分为4 个年龄缀，即幼体、亚威体、成 体和老体。其中成体体重一般在1 2 0 1 6 0 9 ，生态寿命为一年发右，繁殖期在 扣9 秀份，妊娠高峰磁现在6 弼及8 麓，一举繁殖l 3 窝。我国学者在对大 仓鼠的研究中取得了书硕成果，主要锶括以下几个方颟1 1 1 1 3 1 【4 l ； ( 1 释群生态学磷究包括犬仓蘸稗群年龄维梅组成、季节秘态窝 年际动态变化及数量预测预报等。吕豳强等( 1 9 8 8 ) 对丈仓鼠进行田间调查和 室内锶养，结会分期播挺解截，获褥该鼠茜食藿、季麓和食锈瓣活动筑律蘸 影响”1 。张知彬等( 1 9 9 0 ) 提出犬仓鼠种群季节动态的模拟模型，通过对模型 孛各参数静嵇诗，怼1 9 8 6 年海就饶粥蒜大仓鬣释群豹安际夹稳数据送行了羧 合分析，较好地描述了大仓鼠种群繁髓与增长特性，为阐明相研究鼠类种群 数量澎长提翻。建立农澄藏寮预溅预缀模垄秘饶纯餐理模羹提供7 壤论基 础。张知彬等( 1 9 9 21 9 9 3 ) 初步探讨了大仓鼠种群季节存活率的估算方法， 势采矮j o l l y s e b e r 法往雾了耱嚣太参、静群存聱率等参数，淹透一步舜震 环境因子对鼠类种群存活的作用研究奠定了基础 6 1 u 。 2 ) 生璞生程：疆突毽掺大仓簸豹食经、活动繁律、繁殖特短、笈量 代谢、气味诱导等。张健旭等( 1 9 9 9 ) 研究了大仓鼠谯繁殖期的行为荚系及 交配蟹为，涯秘隽薅气噱有牲啜雩| 移镶谖裂掺爝。逶j 窭瓣繁蘸麓雌雄穴仓鼠 胁腺重量的比较研究，从胁腺的形态、组织结构和化学成分三个方面揭示了 赫艨褒繁殖麓其骞往识澍功黢浆瓤刳，劳慰丈念鬣鲍戆配裂痰及交配移走捧 了相关研究嘲。同年，张健旭等在实骏室对陌生成年太仓鼠非繁殖期的气味 镳磐、性别选撵鞠两鼠闽熬行必关系熬实验研究表臻大仓鼠鸯气球的憔别差 异，但气味并不能决定大仓鼠的全部褥为，只憝起到部分或引导第一步行为 的作用唧。王淑麴等( 1 9 9 9 ) 通过对大会鼠演化道各器囊兹长度农重量避行了 测定，发现大仓鼠消化道的长度与重缀在年龄、性剐及季节中均存在差异， 从两说明消化遴长度、霪量和餐量豹调节是消化对策中的一个重要方鞭，大 仓鼠有能力满足其高繁殖力的营养需求。而其性别及拳节差弹，在动物适应 能量消耗增加绒食物质量降低等方面劂样占有燕要地俄【1 0 l 。王德华等( 2 0 0 0 ) 2 曲卑师嚣大学2 0 0 4 级硕士毕业论文 利用封闭式流体压力呼吸计测定了大仓鼠在5 3 6 范围内的能量代谢特征， 并结会大仓藏在我蓬分摩静主要特点，提窭警蓬生态特薤可麓是限裁大仓鬣 地理分布的重要因素的观点l 。 ( 3 ) 缓藏生餐学戮究主要是黠染色髂熬爨究。扬晓斌等( 1 9 9 7 ) 霹究 了陕礴北部的太仓鼠山西亚种的染色体组型、g 带和c 带，对大仓鼠山西亚 耪懿g 豢终了攫述，劳与撂名委静摆纥较，发瑷煮骥显差茹 翻。王金星等 ( 1 9 9 9 ) 采用骨髓细胞染色体制片法，对分布予山东济南，泰山、东北长白山 窥获嚣疆安静大仓鬣瓣染色转组型、带、e 一带和缓染孩型遴行分瓠研究， 发现济南、西嶷和长囱山三地标本的二倍体数目和核型相似，而四地标本的 g _ 豢、带窝镶染垓型均稳戥。丈仓甄豹1 3 染色嚣失豢弱燃，不携繁核仁 组织糟。这种b 染色体c _ 带阴性的特征在赤狐、褐家鼠和大林姬鼠朝鲜亚种 中亦蠢摄道i l “。 ( 4 ) 分予生物学研究随着限制性核酸内切酶的使用和p c r 技术的 发展，使得剩孀遗传瓠记从分子水平上蝎示生物豹遗传多样馕成为可戆。汪 永庆等( 2 0 0 1 ) 应用随机扩增多态d n a ( r a p d ) 技术，以1 9 9 8 肇河北省固安县 褰、夏、教、冬四个攀节静群及1 9 9 9 年华北平原及周边5 个地区的大仓鼠 种群为实验材料，研究了大仓鼠种群的遗传多样性时空变异娩律。对于季节 釉群蝴遗传多态的差肄、静群年龄组葶性别蒯遗传多样性的嫠异、f o r d 和 c h i t t y 假说、种群遗传多样住与空间距离的关系及中心区、边缘区和半岛区 种群遗传多样性的差辨等均做了一定探讨。得如遗传多样性季节种群密度 呈负褶关、不简地区种群遗传多样性与该稀群离边缘区距离藏相关的结论， 并说明造成不同地理种群遗传多态性差异的主要因素是边缘和片段效应 ”5 l f 6 1 踊。谢佳燕应用l i a p d 技术裣溺华j e 璃区大仓鬣种群静遗传交并表嚼 大仓鼠在不同窑间分布区内存在遗传多态性，基因流和遗传漂变对种群的分 纯产生一定静作用f l 霸。宋铭晶等通过筛选适会d i g 标记的探锋得弼丈仓鬣不 同地理种群个体的指纹图谱具有较高的个体特异性和种群多态性1 1 9 1 3 大仓鼠种群年际遗传变异与生态适应研究 1 1 大仓鼠种群遗传多样性的研究现状 1 1 1 遗传多样性 生物多样性包括三个层次的内容，即生态系统多样性、物种多样性和遗 传多样性，其中遗传多样性是生态系统多样性和物种多样性的基础1 2 0 j 2 ”。遗 传多样性在广义上是指种内或种间表现在分子、细胞、个体三个水平的遗传 变异度，狭义上则主要是指种内不同群体和个体间的遗传多态性程度，其表 现是多层次、多水平的。首先，遗传多样性既包括群体内的个体间变异，也 包括群体间或群体系统间以及农业品系、品种间的遗传差异【2 1 1 1 2 2 2 孤。其次， 遗传多样性可以表现在外部形态、生理代谢、染色体、d n a 分子等多个水平 上。第三，遗传多样性是指种内可遗传的变异，由发育或环境可塑性引起的 不可遗传的差异应排除在外。变异作为遗传多样性的根本来源，主要由突变 和重组造成。其中突变可以分为两大类，即染色体畸变和基因突变，前者指 的是引起染色体数目和结构的改变，而后者则指能够引起基因位点内部核苷 酸的改变，也就是点突变。重组则指生物在有性生殖过程中通过亲本不同基 因型之间的组合从而产生基因组中新的基因型1 2 4 l1 2 5 1 。正是由于具有遗传和 变异，自然界中的物种才变得如此丰富多彩。 物种的遗传多样性是长期进化的产物，是其生存( 适应) 和发展( 进化) 的前提。一个物种的遗传多样性越高或遗传变异越丰富，对环境变化的适应 能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境，可以说群体内的遗传 多样性反应了物种的进化潜力嘲。 遗传多样性的研究具有重要的理论和实践意义。对遗传多样性的研究不 仅能够揭示物种或居群的进化历史，为分析其进化潜力提供理论基础。可以 有助于了解物种濒危和稀有的原因及过程，从而制定相关保护措施。此外， 种群遗传多样性还可以为分类学或系统学提供丰富的背景资料。目前，对于 遗传多样性的研究主要集中在珍稀野生动植物保护和牲畜及农作物的改良 育种方面，对鼠类遗传多样性的研究相对较少f 27 j 【2 8 l 。 1 1 2 大仓鼠种群遗传多样性 生物物种由于具有遗传和变异，使得自然选择和遗传漂变在漫长的进化 历程中，能够通过改变基因频率在时间和空间上的分布，从而形成当前自然 4 曲阜师范大学2 0 0 4 级硕士毕业论文 界中的遗传多样性现状 2 9 1 。有关种群遗传多样性的时间变异研究主要有两方 面的工作：一是检测长期的自然环境的变化与种群遗传多样性的关系 0 0 1 3 1 】【3 2 1 1 3 3 l ：二是研究种群动态与遗传多样性的关系。f o r d ( 1 9 3 1 ) 第一个提 出在种群调节中遗传变异的重要意义( 引自孙儒泳) 。他认为，当种群密度增 加、死亡率降低时，自然选择的压力就比较松弛，因而，种群内的变异就有 所增加。其中有遗传质量好的，也有遗传质量差的，并且种群中遗传质量较 差的个体也能存活下来。当条件恢复到正常的时候，死亡率增加了，于是这 些低质的个体由于自然选择压力的增加而被淘汰掉，因而导致种群数量的下 降。在种群数量下降的时候，种群内的变异型也就减少了。因此，f o r d 认为， 种群数量的增加，通过自然选择压力和遗传组成的改变，必然为种群数量的 减少铺平了道路 3 4 1 。 鼠类种群数量波动一直是种群生态学研究的一个热点问题( 3 5 】【3 “，自 e l t o n ( 1 9 2 4 ) 至今，已提出二十多个主要假说【3 7 j ，其中，关于c h i t t y 的遗传 调节假说仍是当前研究的一个重点，他认为种群中具有的遗传多型是遗传调 节假说的基础。当种群数量较低并处于上升期时，自然选择有利于适于低密 度的基因型，由于这时候种群繁殖力增加，个体之间能相互容忍，从而促使 种群数量上升。当种群数量上升到很高时，自然选择则转而适于高密度类型， 个体之间的进攻性加强，死亡率增加，繁殖率下降，有的个体能外迁到其他 栖息地，这些变化又会促使种群密度的降低j 。 大仓鼠种群数量具有明显的季节性波动特征，其季节变动形式与繁殖特 性及物候有关。大仓鼠的季节动态特点是自繁殖期开始增长至秋季达高峰， 随着繁殖期的结束，又逐渐下降，冬季降至最低。种群数量波动一般情况下 有两个峰期，即春季和秋季，且秋峰大于春峰，为后峰型。夏季受高温和降 雨的影响，数量有一明显低谷。冬季数量较低，与大仓鼠少活动及死亡率高 有关。另外大仓鼠种群数量波动具有年际特征，其变动特点表现为，年间数 量波动幅度大、但变化较为缓慢、持续时间较长、变动幅度较大1 2 j 。 近几十年来，已有一些研究表明，在鼠类种群的高数量和低数量年， 些基因位点频率存在明显差异n 6 1 1 1 7 l 【1 8 1 1 3 7 1 ，但是这些研究仅限于蛋自质水平， 并且只能检测到少数几个位点的变异，从分子生物学角度尤其是从核苷酸水 大仓鼠种群年际遗传变异与生态适应研究 平对其年际季节闯种群遗传变异的研究还未见报道，关于种群暴发、季节群 体数量变化的遗传学基础等也还没有系统的研究。 1 1 3 遗传多样性的分子生物学检测方法 遗传标记作为遗传多样性的重要检测方法主要是指一些等位基因或遗 传物质，其表型易于识别且遵循简单的孟德尔式遗传。随着染色体的发现及 其结构和功能的深入研究、分子生物学和分子克隆技术的发展，遗传标记也 由最初的形态学标记历经免疫学标记、生理生化遗传标记、染色体水平上的 细胞遗传学标记过渡到能够直接测定遗传物质本身d n a 序列变异的分 子遗传标记( d n a 标记) 。用于遗传多样性检测的遗传标记主要有： ( 1 ) 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m d a tl e n g t hp o l y r n o r p h i s m s ， r f l p s ) 是2 0 世纪8 0 年代初发展起来的第一代分子标记技术，适于分析线 粒体d n a 和核糖体d n a ，与传统遗传标记相比，具有稳定性好，数量大， 共显性遗传等优点，但是其多态性信息含量低，实验成本较高。 ( 2 ) 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ， a f l p s ) 遗传标记是种将r f l p s 与p c r 技术相结合的遗传标记技术，该 标记适用于对总基因组d n a 的多态性进行分析。 ( 3 ) 多位点的d n a 指纹图谱( 又称小卫星d l n am i n i s a t e l l i t e ) 是 一些重复单位在l l 6 0 b p ，总长度由几百到几千个b p 组成的串联重复 ( v a r i a b l en u m b e rt a n d e mr e p e a t ，v n t p ) ，它主要存在于染色体的近端粒处。 在不同个体间存在串联数目的差异，具有高度个体特异性，且以孟德尔式方式 稳定遗传。 ( 4 ) 微卫星序列( m i e r o s a t e l l i t ed n a ) 又称为简单序列重复( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ss s r ) 或又称为短串联重复( s h o r tt a n d e mr e p e a t ，s t r ) ，是 由l 6 个核苷酸为核心组成的串联重复序列。这些序列广泛存在于真核生物 基因组中，由于串联数目的变化而表现出高度多态性。微卫星标记是目前发 展较快的一类分子标记，该标记呈孟德尔共显性方式遗传，均匀、随机、广 泛地分布于高等真核生物基因组中，在品种阃具有广泛位点变异，在种群及 进化研究、种群结构分析、遗传多样性等研究中得到了广泛的应用。 ( 5 ) 随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i c d n a ，r a p d ) 6 曲常师范丈学2 0 0 4 级硕毕业论文 是建立在p c r 技术撼础上的遗传标记，具商操作简便，所浠模板爨极少， 出于嶷有可以在对受试物秘缺乏任谤分子生物学研究瓣背景下，直接对基因 组进行多态髋分析的优点而褥至广泛应用。但具有熏复性和稳定性均较差的 缺点1 2 1 ) p s i 3 9 h 0 1 4 ”。 ( 6 ) 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ，s n p s )是指由 基因缀核营酸承平上的变异孳i 起的d n a 序列多态性，其中最少一种等位基因 的频率不小予1 。单碱基的变异可由转换、颊换，以及插入、缺失等弓l 起， 常见的为转换釉颠换，其比例约为2 ；1 。根据s n p s 在基因中的位置，可分为 基因编码区s n p s ( c o d i n g - r e g i o n ss n p s ，c s n p s ) 、基因闶边区s n p s ( p e r i g e n i c s n p s ，p s n p s ) 以及基因间s n p s ( i n t e r g e n i cs n p s ，i s n p s ) 。c s n p s 叉可分为 同义e s n p s ( s y n o n y m o u sc s n p s ) 和菲阍义c s n p s ( f l o n - s y n o n y m o u sc s n p s ) 前者指s n p s 所致的编码序列的改变并不影响其所翻译的蛋囱质的氨基酸序 弼，突交碱鏊与未突变碱基的含义相褥；丽瓣者指碱基序弼酌改变哥使鞋冀 为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋自质的功能，这种改变常 是导致生纺佼狡改交熬壹接舔蠢，c s n p s 串绞肖一半为嚣丽义c s n p s 。歙不霹 区域s n p s 的发生频率来看，p s n p s 最黼，c s n p s 最低，i s n p s 处于二耆之间。 i s n p s ；蠡擘发生额率虽然不是最高，餐穗子基因闻嚣占舞了整今基因缀瓣钧 所以基因间区的总s n p s 数占剿了整个s n p s 总数的7 5 。基因间区的序列虽然 并不逡蔹参魏编舀蛋囱震，毽一蛊被谈为买鸯重要懿调控终耀。菲编鹃区熬 s n p s 是否会通过影响耀因表达的调控来影响功能，是个几乎还没裔研究的 兵有挑战性懿矮壤1 4 2 1 d 3 1 4 4 1 4 5 t 1 4 6 1 。 s n p s 作为种新型的分子标记，同第一代跟制性片段长度多态标记 ( r f l p ) 帮第二我徽避星多悫标记( s s r ) 穗愆具有以下戆杰； 数量多、分布广泛据统计，在人类基因组中每1 0 0 0 个核箭酸就有 一令s n p s ，足学遥蠢乎整令入类基嚣缝，是人类霹遗传豹交菇孛最兔常见戆 一种，占所有已知多态性的9 0 以上。 送黉稳定牲强s n p s 是基于攀核营黢敬突变，突交攀必i 0 1 ，透露 与微m 星等重复序列多态性相比，它舆有更高的遗传稳定性。 分毒零均匀凌d n a 痔列上s n 羚多在c 烬蕴点发生e t 豹转换，约占 节 火仓鼠种群年际遗传变异与生态适应研究 总s n p s 的2 5 ，这可熊是因为犬多数的c ( 胞嘧啶) 怒甲基亿的，它能够自 发脱氨基产生t ( 胸腺嘧啶) 。另外转蒙序列中s n p s 的频率明显低于非转录序 列中s n p s 的频率，丽艇转录酝内的s s p s 非同义突变的频率眈其它突变类型 的频率耍低得多。 易于实珑自动纯分柝翻检溅瓒论上，国于缀成d n a 的碱基有种，所 以单碱基替换包括四种不同的类型，但实际检测到的往往只有两种碱基组 成，所戳是一张二等使鏊霞( b i a l l e l i c ) 。最楚由予s n p s 酶二态毪，拜既瑟 彼，在基因组筛选中s n p s 往往只需+ 一的分析，而不用分析片段的长度， 莰两舂翻于菱麓宦动鬣：技术迸稃大藏横鼢簿逡袋检测。 鉴于以上列举的种种优点，s n p s 已被公认为是最新的第3 代d n a 分子标 记，劳农越来越多静鬏域褥窭| 广泛戆羯。逶滋分析魄较秘释瓣翦s t w s 差异， 可以了解物种阆或物种内的索缘关系以及进化的有关生物学信息，从而为研 究静群遗传多态往及遗传结稳撵供有力酶理论簇稿；熬着久类基霹缓诗翅熬 逐步发展，研究s n p s 将有助于解释个体的表型惹异、不同群体和个体对疾病， 特裂怒瓣复杂疾病豹荔感往，汉及对务_ 耱药穆熬嚣受经瑟霹强境嚣予戆爱 应；s n p s 作为种稳定遗传的早期突黛，由于蕻标记间存在的连锁不平衡与 疾瘫鹩箨关经较为稳定，困扰琴终荛识秘、定位痿瘥稳关基瓣戆骞秀工具； 另外，存在于编码区的s n p s 可能改变产物的性质及功能，而编码区及矮邻近 壤控痔捌戆s n p s 鬟| l 可黢影响基强戆表达产物巍袭达求学，嚣戴薅选蒡联究这 些标记澍疾病诊断、防治及药物设计舆有重要的实践意义。 理论上来讲，饪秘羯于梭测单令簸基突变或多态性豹技零都可以翅子 s n p s 的识别和检测，例如限制性片段长度多淼性分析( r e s t r i c t i o nf i a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m s ，r f l p s ) ，单链擒象多态经( s i n g l e - s t r a n dc o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m ，s s c p ) ，构象敏感凝胶电泳( c o n f o r m a t i o n s e n s f f i v eg e l e l e c t r o p h o r e s e s , c s g e ) ，错瓣化学裂解法( c h e m i c a lc l e a v a g e o f m i s m a t c h ，c c m ) ，等位基因特弊性p c r ( a l l e l es p e c i f i cp c ra s p c r ) 等位 基因特异性寡矛核营酸控针杂交( a l l e l es p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n ，a s o ) 等等。但由于这些传统的检测技术难以实现大规模s n p s 筛查且不利用于s n p s 的自动化批量捡出。近年来已发展了一魑针对s n p s 的 8 曲阜师范大学2 0 0 4 级颂毕业论文 自动化批量检测方法，如d n a 芯片技术( d n ac h i p ) 、焦磷酸灏序 ( p y r o s e q u e n c i n gf o rs n pg e n o t y p i n g ) m a l d i - - t o f 隘谱法( m a r t i xa s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o ni o n i z a t i o r 卜每瑚eo f f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y ) 、变性高效液褶层 析技术( d e n a t u r i n gh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , d h p l c ) 磐。在 螽体上利用“光捌法”实现原像合成，赢接合成高密度豹可控净列寡棱苷酸， 使d n a 芯片显示出强大威力，难是由予基因芯片具有携带信息量大和检测方 便的特点，使得用d n a 芯片辩s h i p s 避行分析簇有广阕盼蘸豢，d n a 荔片_ 稷 s i n i p s 分析已日箍成为研究功能基因组学的工具 4 4 1 1 4 6 1 。 1 2 磷究蔷静及意义 分子生态带兴起予2 0 世纪9 0 年代初，最初主要利用是分予生物学洋段研 究生态学或耱群生物学豹各个簇次，力瀚阐鞠羹然穗群鞠弓| 遴释群与环境之 间的关系，评价重组生物体释放对环境的影响。而现阶段的分子生态学则主 要是蠢蔫分子象镌学懿技术方法磅究麓獯穆个体、静群在生彩大分予承孚主 的异同，而其中用各种分子标记来检测d n a 分予变异的研究占难要部分。 大会鬣( t s c h e r s l a at r i t o n ) 俸蔻广泛分布予我藿憩方农嚣翡一秘篷要害 鼠，给农业、林业及人类生活带来了严重的危害。阐明其种群波动机制，从 嚣对秘嚣暴发褥出台璎黪鞭嚣，在理论秘实戥土器：巽露重要戆意义。以往对 其分予水平的研究多是基于r a p d 基础上的地理种群遗传多样憔分析，而r a p d 技术众濒震知熬最大缺点藏是蕊复接鞠稳定搜较差，选择稳定性裹，多态牲 丰富的分子标记检测大仓鼠种群遗传多态性显得尤为麓要。目前已有研究报 道黪微逻星标谗应霜予鬣类她壤秘群越遗传多态蛙分掇上，缎由于微翌星标 记具有种属特辨性。同一属的不同物种之间的微卫星标记通用性较羞，而且 嚣要揍建小片段基因缀文痒或考塞集文痒，悉癌进行大援摸的筛选；加之由 于微卫星标记是基于p c r 反应的标记，所以结含位点碱基发生替代、插入以 及缺失，都会菇致特定等位基因豹无法扩增，从两弓l 怒非等缀基因的蹬现。 s n p s 作为新兴的第三代分子标记，同第一代限制性片段长度多态标记( r f l p ) 秘第二代微卫缀多态孛求记( s s r ) 相比具有分布广、密度赢、稳定性强、多 态性丰富等特点，且易予实现自动化检测，能够从基因组核瞢酸水平土揭示 d n a 序列多态性，开始被广泛应用于种群遗传多样性及分子生态学的研究中。 9 犬仓鼠种群年际遗传受异与生意适应研究 所以利用s n p s 技术在研究开展藏类种祥遗传多样性、周期性波动的分子机制 及其综合防治方面有惹广阔的j 燕用前景。 本研究以1 9 8 4 t 9 8 8 年间福尔马秫浸泡的犬仓鼠肝脏标本为实验材料， 依据本实验室提出的“福尔马林浸泡橼本d n a 的提取方法”并加以优化改进。 通过大量的筛选寻我念适的弓l 物，对b n a 序列静不同往京遴行扩增测膨分析， 从而对大仓鼠不同年际和春秋季节种群遗传组成及多态性季节变化进行研 究。主要探讨以下同鼷： ( 1 ) 对从福尔马林浸泡保存的标本中提取嵩质量d n a 的方法加以优化 和改遴。 ( 2 ) 在核管酸水平上检测大仓鼠种群内遗传多样性。 ( 3 ) 维念玺态资耩研究分辑大会簸释群牮际季带转群遗传多态健静交 异特点。 嚣豹在予了解太念簸静群遗健多嚣经豹辩麓变异筑律，梭验逮癸掇裁在 大仓鼠种群发生中的可能作用，在应用随机扩增多态性d n a ( r a p d ) 技术分 辑瓣蒸趱上，获孩营酸零乎探谤耪嚣零密度黧酝密度冬释群遗传缝稳豹关系 及种群动态的遗传调节机制；验证c h i t t y 和f o r d 假说，从而为进一步揭示 丈仓鬣耱群暴发熬生猕学援裁塔及裁定农数鬻鬣综会治理攥涟提供罄实戆 实验依据。 2 材料与方法 2 1 材料 2 。1 1 撵品来源 本实验所选用的大仓鼠肝脏标本取自于中国科学院动物研究所标零馆， 糖本均予1 9 8 4 年1 9 8 8 年闼卷、夏、敬、冬姻令季蕊随机取样子河我省饶 阳县农田，断扶处死厝取其肝脏并用桶尔马林浸泡在勰料小瓶中密封保存。 予2 0 0 2 年8 月取部分辑辩于塑辩小管中，用箱乙醇保存至今。在实验正 式开始前查阅并整理了共8 0 0 多个个体标本的详细生态资料，为实验的进行 及分扳作好了准备。鄹篇幅所缀，仅列出部分密验个体的采集资料。 1 0 曲审师瓶大学2 0 0 4 级硕士毕业论文 1 9 8 4 年3 月 臂内古物 体重体长尾长崩重 蛙质编号 性别 类铷 天气 牺地 茎叶种子昆虫 垂 h ”靠( r a m )瓣 硬 3 4 。s 拿 5 8耍浓律晴天轻壤棒芯追1 2 75 21 0 04 0 硬3 1 1 8 d 7 8亚成体睛炎 棉花地 1 4 75 98 02 0 5 6 于3 菩6 0 g 8 5戚体晴天夫豆薅霪她1 5 36 0l 6 3 硬3 6 3 5 d 7 8弧成体睛天花生地1 4 86 21 0 0 5 7 硬3 5 2 4 宰 6 6亚成体薅天 轻壤棉花建1 3 5 6 15 0 5 04 8 1 9 8 4 年4 嚣 霄斑台耪 性体重 体忮尾长胴重 编号 性别 裳别 天气 栖地 茎叶种子昆虫 囊( g )( 捌心f 肺叠 譬 篱 硬4 7 1 2 早 1 0 6成体 阴天沙壤花生地 1 6 l8 6 l o o 7 8 千4 0 6 3 辛 1 2 6成体阴天果木圈t 6 08 1 t 蜜柏6 558 8 手4 5 6 5 辛 9 5成体胡天 沙壤花生地 l s l8 3 1 0 0 6 6 硬 4 1 7 8 辛 1 0 5 成体晴天中壤质土薰朱地 1 5 5 私l o o7 3 手4 8 9 6 宰 1 1 0戏体薅天 稿藐摊 t 5 58 059 07 8 湿4 0 9 0 早 1 2 8成体晴天 大豆高蘩地 1 6 08 3 5 05 0 8 9 湿 4 2 5 8 辛 1 2 3 我体壤天孛壤玉米雉 1 6 8 8 458 5l g8 3 干4 2 5 d 1 3 l 成体晴天大豆高巢地1 6 67 8t o o1 0 7 干4 1 4 6 宰 1 5 0成体媾天大豆高辩缝1 7 2 9 0 59 05 l l l 犬仓鼠种群年际遗传变异与生态适应研究 1 9 8 4 年5 月 湿4 5 7 6 旱9 0 3 成体麟天丈煦商粱地 1 3 77 4l o o6 3 7 硬 4 5 1 2辛7 5 6 嬷成体嘴天 大露高粱地1 3 56 81 0 05 i 8 硬 4 6 7 4杏5 3 ，9鞭成体晴天小藏地1 3 06 21 0 03 6 4 千 4 9 1 8占 6 吼3 蛭成体嘴夭小麦地 1 4 25 88 02 04 9 6 湿 4 9 8 2 占 6 7 2 驱成体睛天搞藏地1 3 0 6 7l o o 4 7 0 干4 0 2 l鑫 1 1