（化学专业论文）饮料中咖啡因的紫外光谱和气质联用分析方法研究.pdf

浙江大学硕士毕业论文 摘要 咖啡因广泛应用于当今许多碳酸饮料和能量饮料中。随着可乐饮料如可口可 乐，百事可乐等在全世界的风靡，各种可乐饮料已经成为人们饮食当中摄取咖啡 因次数较高的一个重要来源，但大量或长期摄取咖啡因有损人体的健康。因此， 各国对饮料中咖啡因的含量都做出了相应的规定和限制。现有的咖啡因分析方法 中，光谱分析方法简单，直接，但很难避免样品基质和其它物质的干扰，所得结 果往往有较大误差；色谱及色谱质谱联用分析方法准确、灵敏度高，但往往样品 前处理步骤繁琐，需要使用大量的有机溶剂，分析时间较长，所需的分析费用也 相对较高。因此，发展一种简便、有效、经济、环保的分析方法用于饮料中咖啡 因的日常质量控制和法规检测显得尤为重要。 本论文中，我们分别采用紫外光谱分析方法和气质联用分析方法测定饮料中 咖啡因的含量，并针对两种不同分析仪器的特点分别发展了两种不同的样品前处 理技术。对紫外光谱分析，针对它简便、快速的特点，我们采用离心萃取的前处 理方法，因为离心萃取分相迅速，传质平衡速度快，仅需离心3m i n ，就可取萃 取液进行紫外光谱分析；同时由于紫外光谱分析方法不具备分离功能，容易受到 基质干扰，我们选择了与待测样品组成接近的不含咖啡因的娃哈哈儿童可乐饮料 为空白，并将此空白按相同样品前处理方法进行处理，所得的溶液选作紫外光谱 分析的参比溶液，从而扣除紫外光谱分析中基质的加和性干扰。对气质联用分析， 针对它高灵敏度，高准确度，强大的分离鉴定功能以及易实现自动化的优点，我 们采用单步自发溶剂微萃取的前处理方法，整个前处理过程只需将少量样品和萃 取溶剂加入气质联用自动进样样品瓶中，无其它任何附加操作，等自发萃取达到 平衡后气质联用自动进样器直接取下层清液进样分析。只要计算好自发溶剂萃取 达到平衡所需的时间，一个连续的自动化的分析程序就可以顺利实现了。 论文对样品前处理条件包括萃取溶剂的选择，样品与溶剂的混合方式、混合 体积比以及混合时问等进行了最优化。通过方法的线性范围、检测限、精密度及 准确度实验对方法的可行性和可靠性进行了严格的验证，并将发展的方法应用到 市售可乐饮料的咖啡因含量分析当中。总结起来为：( 1 ) 离心萃取一紫外光谱分 浙江大学硕士毕业论文 析方法，首次将大相比离心萃取应用于仪器分析样品微制备过程。该方法将2m l 三氯甲烷直接加入装有1 0 0l a l 可乐饮料的离心试管中，离心萃取3m i n 后取下 层清液在2 7 8n l n 处进行紫外光谱测定，操作简单，快速，重现性好，相对标准 偏差小于3 ；在三种可乐饮料中加入不同浓度的咖啡因标准溶液，回收率在 9 6 6 - 1 0 6 1 之间。线性范围为0 5 - 3 0m g l ，相关系数( r 2 ) 为0 9 9 9 9 ； 检测限为0 0 0 1m g l 。将该方法应用到市售可乐饮料中咖啡因含量分析上，所 得结果与官方报道结果一致。( 2 ) 单步自发溶剂微萃取气质联用分析方法，是 一种微型化、自动化、高通量的饮料中咖啡因含量的分析方法。该方法只需将 2 5 此饮料与1m l 萃取溶剂氯仿加入气质联用自动进样样品瓶中，等待g c m s 直接进样分析。经过1 5m i n 自发混合萃取后，g c m s 自动进样器直接取下层萃 取液进样分析。该方法分析饮料中咖啡因的线性范围是0 0 0 1 - - - 2 0m g l ，其相关 系数( r 2 ) 为0 9 9 9 9 ；五次日间独立分析饮料中咖啡因，相对标准偏差不超过 2 ；检出限为0 0 0 0 1m g l ；在三种不同可乐饮料中加入不同浓度水平的咖啡因 标准溶液，回收率在9 9 0 1 0 4 8 之间。方法简单，准确，样品和溶剂消耗少， 能实现自动化，适合批量分析饮料中的咖啡因含量。 关键词：离心萃取，自发溶剂微萃取，大相比，自动化，紫外光谱，气质联用， 咖啡因，可乐饮料 i i 浙江大学硕士毕业论文 a b s t r a c t c a f f e i n ec a nb ea p p l i e df i t sa l la d d i t i v ei nm a n yp o p u l a rc a r b o n a t e dd r i n k s p e o p l ec o n s u m ec a f f e i n ei ns o f t - d r i n kb e v e r a g e st h r o u g h o u tt h ew o r l d h o w e v e r , t h e i n t a k eo fh ig ha m o u n t so fc a f f e i n eh a sb e e ns h o w nt op r o d u c en e g a t i v ee f f e c t so n p r e m e n s t r u a ls y n d r o m e a n dp r e g n a n c ya n dt op r o m o t e i n f e r t i l i t y a n dc a n c e r e s p e c i a l l y ，i n f a n t sa n dc h i l d r e n s h o u l db ec a u t i o n e dn o tt oc o n s u m ee x c e s s i v e c a f f e i n eb e c a u s eo fi t ss t i m u l a t i n ge f f e c to nt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e ma n dc a r d i a c m u s c l e t h e r e f o r e ，c a f f e i n ea n a l y s i si sr e q u e s t e dt oe n s u r ep r o p e rc a f f e i n el e v e l si n b e v e r a g e sa n d t om e e tr e g u l a t o r ys t a n d a r d s a r a p i d ，a c c u r a t ea n do r g a n i cs o l v e n ts a v i n gm e t h o dh a sb e e nd e v e l o p e df o rt h e u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r y ( u v ) d e t e r m i n a t i o no fc a f f e i n ei nb e v e r a g e s a n df o r t h ef i r s tt i m e ，c e n t r i f u g a le x t r a c t i o np r o c e d u r ew i t hb i gp h a s er a t i ow a sa p p l i e dt o s a m p l em i c r o p r e p a r a t i o np r i o rt o i n s t r u m e n t a la n a l y s i s t h em e t h o di n v o l v e st h e m i x i n go f10 0g ls a m p l ew i t h2m l c h l o r o f o r ma n da3m i n u t ec e n t r i f u g a le x t r a c t i o n p r o c e d u r ei nac e n t r i f u g a lt u b e t h ec l e a rs o l u t i o no b t a i n e dw a sd i r e c t l yd e t e r m i n e d b yu va tw a v e l e n g t h2 7 8n l n t h em a n i p u l a t i o nw a ss i m p l e ，a n dr e p e a t a b i l i t yo ft h e m e t h o dw a sg o o dt h a tt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o nw a sl e s st h a n3 f o rt h e i n d e p e n d e n tm e a s u r e m e n t r e c o v e r y o ft h ec a f f e i n ew h e na d d e dd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o no fs t a n d a r dc a f f e i n es o l u t i o nt ot h r e eb r a n db e v e r a g e sw a si nt h er a n g e 9 6 6 6 - - 10 6 1 al i n e a rc a l i b r a t i o nc u r v ew a sg e n e r a t e dw i t hc a f f e i n ec o n c e n t r a t i o n r a n g i n gf r o m0 5 0 - - 3 0m # l ，g i v i n gt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n ta s0 9 9 9 9 t h e m e t h o dp r o v i d e sa0 0 01m e n - d e t e c t i o nl i m i to fc a f f e i n e t h ed e v e l o p e dm e t h o dw a s a p p l i e d t od e t e r m i n ea m o u n to fc a f f e i n ei nc o m m e r c i a lb e v e r a g e s g o o dr e s u l t sw e r e r e c e i v e d a na u t o m a t e dh i g h - t h r o u g h p u tg c m sm e t h o db a s e do ns i n g l e s t e ps p o n t a n e o u s s o l v e n tm i c r o e x t r a c t i o nw a sa l s od e v e l o p e df o rt h ed i r e c tq u a n t i f i c a t i o no fc a f f e i n ei n b e v e r a g e s w i mt h ep r e s e n tm e t h o d ，a sl i t t l ea s2 5l x lo ft h ec o m m e r c i a ls a m p l e sw a s r e q u i r e dt ob em i x e dw i t h1 m lc h l o r o f o r mi na2m la u t o s a m p l e rv i a l a f t e r15 m i n u t e ss p o n t a n e o u sm i x i n ge x t r a c t i o n ，t h em i x t u r ew a sd i r e c t l yi n j e c t e di n t ot h e i i i 浙江大学硕士毕业论文 g c m sb yt h ea u t o s a m p l e r t oo b t a i nt h eb e s te x t r a c t i o ne f f i c i e n c yf o rt h eb e t t e r q u a n t i f i c a t i o na n da u t o m a t i o n , e x t r a c t i o np a r a m e t e r si n c l u d i n gs o l v e n ts e l e c t i o n , e x t r a c t i o nm o d e ，e x t r a c t i o nt i m e , a n dt h er a t i oo fv o l u m eb e t w e e no r g a n i ca c c e p t o r p h a s ea n d t h es a m p l e ，w e r eo p t i m i z e d t h em e t h o d o l o g ye x h i b i t e de x c e l l e n tl i n e a r i t y b e t w e e n0 0 01a n d2 0m e c l 研lt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n to f0 9 9 9 9 t h er e l a t i v e s t a n d a r dd e v i a t i o n ( r s d ) a n dl i m i t so fd e t e c t i o n ( l o d ) o ft h i sm e t h o dw e r el e s st h a n 2 a n d0 0 0 01 m g l ，r e s p e c t i v e l y r e c o v e r yo ft h ec a f f e i n ew h e ns p i k e dt ot h r e e b r a n db e v e r a g e sw a si nt h er a n g e9 9 0 , - - - - 10 4 8 t h em e t h o dd e v e l o p e dw a ss i m p l e ， a c c u r a t e ，h i g h t h r o u g h p u t ，o r g a n i cs o l v e n ts a v i n ga n dc o u l do f f e ra u t o m a t i o nf o r b a t c h a n a l y s i so f c a f f e i n ei np o p u l a rc o m m e r c i a lb e v e r a g ei n d u s t r i e s k e y w a r d s ：c e n t r i f u g a le x t r a c t i o n ，s i n g l e s t e ps p o n t a n e o u ss o l v e n tm i c r o e x t r a c t i o n ， b i gp h a s er a t i o ，a u t o m a t e dp r o c e d u r e ，u vg c - m s ，c a f f e i n e ，b e v e r a g e s i v 浙江大学硕士毕业论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝至三盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名t 丁p rj 碲 签字日期：j 埘年月弓日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：j 庙心v 芎 签字日期：洲年6 月3 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 6 l 电话： 邮编： 眵一 狐淑 名 卧 戳 瑚 i y 岂 黝 胖 浙江大学硕士毕业论文 第一章绪论 咖啡因是一种具有药理活性的物质，在通常的饮料如咖啡，茶和可乐饮料以及头 痛药，止疼药中都发现有咖啡因的存在1 1 1 。适量食用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经等 作用，临床上用于神经衰弱，伤风，偏头痛等疾病的治疗 2 1 ，但大量或长期摄取咖啡 因有损人体的健康，如咖啡因自身的毒性，引起肝、肾、心血管等各种并发症，特别 是妇女和儿童更要在医生指导的咖啡因摄取含量范围内食用【3 川。当前，随着可乐饮 料如可口可乐，百事可乐等在全世界的风靡，各种可乐饮料已经成为人们饮食当中摄 取咖啡因次数和频率较高的一个重要来源。因此，各国对饮料中咖啡因的含量都做出 了相应的规定和限制。 有关饮料中咖啡因分析方法的研究已经有众多的报道。主要包括：光谱分析方法， 色谱及色谱质谱联用分析方法，电泳分析方法以及咖啡因流动注射自动分析方法等。 研究早期采用的光谱分析方法简单，直接，但很难避免样品基质和其它物质的干扰， 所得结果往往有较大误差1 5 石】。之后发展的各种色谱分析方法及色谱质谱联用分析方 法，准确可靠、灵敏度高，但是这些方法往往样品前处理步骤繁琐，需要使用大量的 有机溶剂，分析时间较长，所需的分析费用也相对较高【7 一o l 。因此，发展一种简便、 快速、环保、易自动化的分析方法用于饮料中咖啡因的日常质量控制和法规检测是众 多研究者追求的目标。 本论文中，我们将分别采用紫外光谱分析方法和气质联用分析方法测定饮料中咖 啡因的含量。研究的目标主要集中在样品前处理和分析技术的自动化开发上。我们知 道，样品处理在现代仪器分析过程中是一个既耗时又极易引进误差的步骤，是现代仪 器分析技术发展的一个重要领域，样品处理的好坏直接影响仪器分析的最终结果，所 以样品的处理一直是广大仪器分析研究者十分关注的问题。尤其对色谱分析而言，好 的样品制备方法及其技术不仅能最大限度的发挥现代色谱仪器的分析测定功能，同时 利用这些技术也提高了色谱工作者使用色谱仪器分析各种样品的能力。现代色谱分析 样品制备技术的发展趋势就是使处理样品的过程要简单、处理速度要快、使用装置要 小、引进的误差要小、对欲测定组分的选择性和回收率要高【l l 】。传统的样品制备包括 了许多冗繁的操作，如大体积溶剂萃取，滤纸过滤或真空抽滤、分液漏斗进行液液 浙江大学硕士毕业论文 分配，用k d 浓缩器和旋转蒸发器挥发大体积的溶剂和进行样品浓缩等过程，占用 大量的时间，消耗大量的溶剂和样品，处理步骤冗长，不但容易损失样品、产生较大 误差，而且有毒溶剂的大量使用还会影响操作人员健康，污染环境。为此，无溶剂或 少溶剂、准确度高、快速、简便、易自动化的样品制备方法的研究成为当今分析化学 家的前言研究课题之一【1 2 1 。 本研究综合目前较流行的样品前处理技术的优点，分别针对紫外光谱和气质联用 分析的特点发展了两种新的样品处理技术，即离心萃取和自发溶剂微萃取。对紫外光 谱分析，针对它简便、快速的特点，我们采用离心萃取的前处理方法，因为离心萃取 分相迅速，传质平衡速度快，仅需离心几分钟，就可取下层清液进行紫外光谱分析； 对气质联用分析，针对气质联用仪高灵敏度，高准确度，强大的分离鉴定功能以及易 实现自动化的优点，我们采用单步自发溶剂微萃取的前处理方法，整个前处理过程只 需将少量样品和萃取溶剂加入气质联用自动进样样品瓶中，无其它任何附加操作，等 自发萃取达到平衡后直接由气质联用自动进样器取下层清液进样分析。该前处理非常 简单，结合气质联用分析能够实现饮料中咖啡因分析方法的自动化。 同时，本论文对样品前处理的条件包括萃取溶剂的选择，样品与溶剂的混合方式、 混合体积比以及混合时问等进行了最优化。通过方法的线性范围、检测限、精密度及 准确度实验对方法的可行性和可靠性进行了严格的验证，并将发展的方法应用到市售 可乐饮料的咖啡因含量分析当中。 2 浙江大学硕士毕业论文 参考文献 【1 】pn a w r o t , s j o r d a n , j e a s t w o o d ，j r o t s t e i n ，a h u g e n h o l t z ，m f e e l e y , f o o da d d i t c o n t a m 2 0 ( 2 0 0 3 ) 1 【2 】程嘉芝，柴瑞华，高爽，杨金玲，辽宁中医药大学学报，2 0 0 7 ，9 ( 4 ) ：1 7 7 【3 】l f e n s t e r , b e s k e n a z i ，g c w i n d h a m ，s h s w a n ，j p u b l i ch e a l t h81 ( 1 9 9 1 ) 4 5 8 【4 】b s t a v r i c ，f o o dc h e m t o x i c 0 1 2 6 ( 1 9 8 8 ) 5 4 1 【5 】v l m c d e v i t t , a r o d r i g u e z , k r w i l l i a m s j c h e m e d u e 7 5 ( 1 9 9 8 ) 6 2 5 【6 】r l u c e n a , s c 矗r d e n a s ，m g a l l e g o , m v a l c m e e l ，a n a l c h i m a c t a5 3 0 ( 2 0 0 5 ) 2 8 3 。 【7 】e d c o n t e ，e f b a r r y , m i e r o e h e m ，j 4 8 ( 1 9 9 3 ) 3 7 2 【8 】m p r o s e k , a g o l c w o n d r a , i v o v k ，j p l a n a rc h r o m a t o g r 一m o d t l c13 ( 2 0 0 0 ) 4 5 2 9 】s b h a w t h o r n e ，d j m i l l e r , j c h r o m a t o g r 6 0 3 ( 1 9 9 2 ) 18 5 1o 】m j y a n g , m l o a o n ，j p a w l i s z y n ，j c h e m e d u e 7 4 ( 1 9 9 7 ) l13 0 【1 l 】王立等编著，色谱分析样品处理，化学工业出版社，北京，2 0 0 1 【l2 】l h k e i t h ，m m w a l k e r ，h a n d b o o ko f a i rt o x i c c r cl e w i sp u b l i s h e r s 1 9 9 5 3 浙江大学硕七毕业论文 第二章分析样品前处理技术及咖啡因分析方法研究进展 2 1 咖啡因概述 咖啡因是存在于许多天然植物( 如茶叶、咖啡豆、可乐果、可可豆等) 中的一类 属于甲基黄嘌呤的生物碱，其学名为l ，3 ，7 三甲基黄嘌呤，分子结构见图2 1 ： h 亍h 3 c h 3 h 图2 1 咖啡因的分子结构 f i g 2 - 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fc a f f e i n e 咖啡因具有一定的药理活性，在通常的饮料如咖啡、茶和可乐软饮料以及头痛药、 止疼药中都发现有咖啡因的存在【l 】。适量食用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经等的作用， 临床上用于治疗神经衰弱，伤风，偏头痛等疾病的治疗1 2 1 。但是，大剂量或长期使用 也对人体造成损害，特别是它有成瘾性，一旦停用会出现精神萎顿、浑身困乏疲软等 各种戒断症状。因此它被列入了受国家管制的精神药品范围，国家药品监督管理局对 其生产，购销和使用，出口，储运等都制定了相应的法规和条例【3 】。 咖啡因广泛应用于当今许多的碳酸饮料和能量饮料中。随着快速消费品、饮料等 行业的快速发展，咖啡因已成为人们在日常生活中食用次数较多的具有药理活性的物 质。研究结果表明：大剂量或长期食用咖啡因会对人体造成许多不利的影响，尤其对 妇女和儿童的危害更大【4 。5 1 。因此，各国对饮料中咖啡因的含量都做出了相应的规定 和限n t 6 j 。但现有的咖啡因分析方法往往存在样品处理消耗时间长，分析费用高，而 且通常需使用大量的有机溶剂等缺点，因而如何简便、快速、安全、准确地分析饮料 中的咖啡因含量已成为法规检查和质量监测中一个十分重要的问题。 4 浙江大学硕士毕业论文 2 2 咖啡因分析方法研究进展 有关咖啡因的定性定量分析方法研究已经有众多的报道。主要包括：光谱分析方 法，色谱及色谱质谱联用方法，电泳分析方法以及咖啡因流动注射自动分析方法等。 目前有关咖啡因的分析方法的研究和开发主要集中在色谱分离如气相色谱、液相色谱 和离子交换色谱等；其它检测方法如f t i r ，电分析方法等以及联用技术的开发和应 用；样品前处理和分析技术的自动化分析方法的开发。 2 2 1 饮料中咖啡因的光谱分析方法 早期有关饮料中的咖啡因的分析研究大多采用比较简单的仪器和设备进行分析， 如滴定和分光光度法。但这些方法在分析前都要经过比较繁琐的萃取步骤，有些分析 前还需要经过柱色谱的分离等分析步骤，并且这些方法的准确度和灵敏度都不是很 高，因此现在的分析中很少使用。随着光谱技术的发展，光谱的分析方法如紫外光谱 分析方法和红外光谱分析方法在咖啡因的分析中有一定的应用1 7 - 1 0 】。但是早期的紫外 光谱分析方法往往会产生比较明显的正误差【1 0 1 。后来研究者们发展了一阶，二阶倒数 紫外光谱等背景校正方法应用到咖啡因的分析当中【1 1 d5 1 ，但这些方法又要求不同的样 品类型要设计不同的背景校正方法【1 4 】。目前，b e l a y 等【5 】人仍采用普通的紫外光谱分 析方法分析咖啡豆中的咖啡因含量，他们将紫外光谱分析所得的数据通过一种叫做 g a u s s i a nf i t 的计算方法进行校正，成功的扣除了样品基质产生的干扰，但他们的分析 样品前处理步骤非常繁琐。 随着傅立叶变换红外仪的发展和进步，红外光谱在可乐饮料的咖啡因分析中的应 用也在不断的发展。同时，因近红外独特的一些优点如对样品不需要进行前处理或者 只需简单的处理；n i r 信号可以用来做定量分析和测试样品的不同物理参数( 如颗粒 大小，药片的硬度或者药套的厚度等) ，在固体样品的定性及定量分析上有一定的优 势。因此许多研究者也将近红外运用到茶，咖啡，药物等体系中咖啡因的分析当中1 4 ， 1 “9 1 。但是该方法的最低检测限一般比较高，同时方法校正的过程也需要一定的时间， 因此它的应用也受到了一定的限制。 2 2 2 咖啡因的色谱及色谱质谱联用分析方法 随着色谱分析技术的发展，更多的现代分析仪器被应用到饮料中咖啡因的分析当 5 浙江大学硕士毕业论文 中。在早期的研究中，研究者们采用薄层色谱，简单液相色谱对可乐饮料中的咖啡因 进行了分析 2 0 - 2 1 1 。后来高效液相色谱和气相色谱的发展对饮料中咖啡因的分析方法的 发展带来了机遇。在此之后研究者们采用高效液相和气相色谱发展了许多饮料中咖啡 因分析的新方澍2 2 - 2 8 1 。如m u t h a d i 等【2 6 】发展了两种色谱分析方法( g c 和h p l c ) 对食 品和饮料中的咖啡因以及其它的黄嘌呤衍生物进行了分析，两种色谱方法的检测限都 在n g 的水平上。c o n t e 等【2 2 】人运用碱性气溶胶气相色谱火焰离子化检测器对饮料中 的咖啡因进行了分析，样品经超声后用二氯甲烷萃取，再用色谱进行分析。其方法的 线性范围为4 8 0 6 0 0 0 0m g l ，检测限为4 7 8n g ( 进样量为l 微升，分流比为1 2 ：1 ) 。因 咖啡因在中性或者弱酸性的水溶液中是以中性分子的形式存在，因此通常采用含有机 溶剂的乙酸或者磷酸缓冲盐做流动相的反相液相色谱进行分析。美国官方分析化学师 协会a o a c ( a s s o c i a t i o no f o f f i c i a la g r i c u l t u r a lc h e m i s t s ) 和我国国家标准分析方法中 对可乐型饮料中的咖啡因也都有采用h p l c 来进行分析【2 9 3 0 1 。 离子交换色谱是以离子交换剂( 树脂) 作固定相，利用各种组分的离子交换亲和 力的差异来进行分离的一种分离方法。该方法在咖啡因的定量分析以及咖啡因与其他 生物碱的分离分析中也有一些成功的应用。在早期的研究中，研究者们将反相离子对， 离子反应液相色谱应用到咖啡因与其它生物碱如茶碱，可可碱的分析当中【3 1 - 3 4 。c h e n 等【3 5 】后来发展了两种离子色谱分析方法连续分析食品和药物制剂的咖啡因，茶碱，可 可碱。样品经等量洗脱分离后对其在2 7 4n l n 处的紫外吸收进行检测，三种物质的检 测限都在i t g m l 以下，整个分析在1 2m i n 内完成。同时该研究小组 3 6 】也采用阴离子 交换色谱分析方法对食品和药物制剂中的人工甜味剂，防腐剂，咖啡因，可可碱以及 茶碱的进行了连续分析，整个分析时间为4 5m i n ，方法中所有物质的检测限在p g m l 以下。k h a s a n o v 等【3 7 】用离子交换色谱对含多种组分的天然物质如茶叶，咖啡豆，速溶 咖啡和含咖啡因的饮料食品中的咖啡因的含量进行了分析。总之，离子色谱在一些中 性有机物的分析上较之h p l c 是一种更加优越的方法。该方法的特点是：分离效率高， 富集比例高，分析成本较低，色谱柱大多能再生反复使用，但分析耗时长。至今该方 法在咖啡因的分析中的应用仍没有液相色谱广泛和普及。 在色谱分离技术与质谱等检测手段的联用技术的发展和进步过程中，气质联用仪 的发展和商品化是最迅速和成熟的。在过去的几十年中，气质联用仪已经发展成为了 一种强大的分离和鉴定分析仪器，并且在食品，工业，环境等领域得到了广泛的应用。 6 浙江大学硕士毕业论文 这一技术在饮料中咖啡因的分析中也得到了很好的应用1 3 8 4 0 】。骆传环等【3 5 】通过氯仿溶 剂萃取以及内标定量气质联用方法对多种饮料中的咖啡因含量进行了测定得到了较 好的结果。h a w t h o r n e 3 9 】等用固相微萃取气质联用的方法发展了一些无溶剂消耗的咖 啡因分析方法来分析可乐型饮料和茶饮料中的咖啡因。同时y 锄g 等【加】还将这一方法 推广到大学本科生实验教学课程当中。此外，h p l c 与多级串联质谱联用在复杂样品 中低浓度物质及咖啡因的检测和分析灵敏度，样品处理量的提高等方面发挥了独特的 作用【4 l - 4 4 1 。在一些成分比较复杂的样品中，如体液血清，尿液，废水等，体系中其它 大量的有紫外吸收的化合物会影响常用的h p l c u v 分析方法中咖啡因的检测灵敏度 和选择性m ；同时体系中有些化合物的含量与方法的检测限范围非常接近，因此仅仅 运用色谱的方法往往难以满足对这些化合物的分析和检测需要【4 2 】。因此，色谱方法与 各种检测分析方法的联用技术尤其是与质谱的联用在这些领域发挥了越来越大的作 用。 2 2 3 咖啡因的毛细管电泳分析方法 毛细管电泳是指以毛细管为分离室、以高压直流电场为驱动力的一类新型电泳技 术，在生命科学以及生物样品的测试中，如蛋白质，多肽以及低聚核苷酸的分析中发 挥着重要的作用。有关毛细管电泳在茶，药物等体系中对咖啡因与多酚、有机酸等物 质的同时分离的应用表明：这一方法在简化分析过程、提高分离选择性、加快分析速 度等方面发挥了重要的作用。同时，研究者们也发展了一些毛细管电泳方法应用到可 乐饮料中的咖啡因以及咖啡因与甜味剂、防腐剂的同时分析中【4 5 舶】。基于在电泳缓冲 溶液中加入十二烷基磺酸钠并且使得它的浓度足以形成胶束发展起来的胶束电动毛 细管色谱( m e c c ) 大大扩充了电泳分析方法的应用范围。该方法将毛细管区带电泳 以及反相高效液相色谱的优点有机的结合了起来：如高分离效能，高选择性，分析速 度快，同时在分离过程中可以通过条件的改变实现化学选择性的变化等【4 9 5 0 1 。因而其 在茶和药物中的咖啡因与其他多酚和有机酸的分离分析中的应用也受到了研究者的 重视。文献中也有关于饮料中咖啡因的m e c c 分析方法的报道 4 9 弓o 】。 从以上可乐饮料中咖啡因毛细管电泳分析方法中可以看出：与h p l c 相比，毛细 管电泳有分离效率更高，分析速度快，操作简单、流动相不需要有机溶剂以及分析成 本低等特点。但是如前所述：电泳分析中毛细管柱填充需要专门的技术、方法的重现 7 浙江大学硕士毕业论文 性也不如h p l c 和g c ，并且毛细管柱的平衡需要花费较长时间，有研究者在对咖啡 因和可可碱的标准溶液的分析中还观察到分析条件下咖啡因色谱峰分裂的现象【5 0 1 。因 此，这种方法在可乐饮料中的咖啡因分析以及质量控制中的应用受到一定的限制。 2 2 4 饮料中的咖啡因自动分析方法 在追求分析效率提高和发展环境友好的分析方法的今天，样品前处理和分析仪器 的微型化、集成化以及自动化吸引了众多研究者的目光【5 l 】。各种分离技术如液相色谱， 仪器已经商品化的固相微萃取等与f t i r 、紫外、质谱，蒸发光散射检测器( e l s d ) 等检测技术的集成及自动化分析方法在发展自动化程度高、分析效率高的咖啡因分析 方法中发挥着重要的作用。该技术在饮料、药物、血清等样品中的咖啡因分析以及咖 啡因与其他组分的连续分离分析中的应用也在不断的发展中。 h a l v a x 等【5 2 】曾将流动注射萃取，富集装置与一个简单的液相色谱实现在线相连对 可乐饮料中的咖啡因进行了分析。在该分析方法中，水溶液样品先经载气通过不同大 小的环引入一个萃取环，样品经萃取后进入个卷曲的槽膜分离器，它将水相和有机 相进行分离，然后有机相再通过一个预柱到达液相色谱进行分析。当使用自动进样器 时，整个分析过程可以完全自动化。但是由于当时受进样圈以及预柱和分析柱液膜材 料等的限制，该方法的检测限和选择性都有待于进一步提高。随后发展的基于固相萃 取( s p e ) 技术的流动注射分析方法在可乐饮料的咖啡因分析中很好的解决了这些问 题。在通常的方法中，我们往往都需要采用些如萃取，富集以及分离步骤等的样品 前处理步骤，但是这些离线的步骤通常耗时长，工作量大，并且需要大量的溶剂。s p e 的发展以及其萃取装置的商品化使得通常的萃取分离等步骤能在一个简单的装置中 一次进行，同时s p e 与其它检测分析技术的联用对分析效率和灵敏度的提高以及溶剂 消耗的减少等方面起到了重要的作用。该方法在可乐饮料中咖啡因的分析中也有很多 的应用。如d a g h b o u c h e 等【5 3 】发展了一种固相萃取一f t i r 流动注射分析对饮料中的咖啡 因进行了分析研究。l u c e n a 等【5 4 1 人后来也发展了一种多参数连续流动注射分析仪对饮 料中的总糖、色素以及咖啡因进行了分析并将该方法应用到2 0 种不同饮料样品的分析 中。 以上可乐饮料中咖啡因的流动注射分析方法很好的将可乐饮料样品的前处理如 萃取步骤与组分的检测在线结合了起来，实现了饮料中咖啡因含量测定以及咖啡因与 8 浙江大学硕士毕业论文 其他组分同时分析的自动化。这为我们发展快速、灵敏、环境友好的咖啡因分析方法 提供了重要的途径。但是这些方法的普及和广泛的应用还有待于分析仪器微型化和集 成化的实用性发展及其商品化仪器的普及。 2 3 样品处理技术的进展和发展趋势 从上面我们对咖啡因分析方法的综述可以看出：各种分析方法都有其独特的优 势，但一些方法也不可避免存在其自身的缺陷。在实验测定仪器确定的情况下，有关 咖啡因的分析方法研究和开发主要集中在样品前处理和分析技术的自动化开发上。 2 3 1 样品处理的重要性及发展趋势 样品处理在现代仪器分析过程中是一个既耗时又极易引进误差的的步骤，是现代 仪器分析技术发展的一个重要领域，样品处理的好坏直接影响仪器分析的最终结果， 所以样品的处理一直是广大仪器分析研究者十分关注的问题。尤其对色谱分析而言， 好的样品制备方法及其技术不仅能最大限度的发挥现代色谱仪器的分析测定功能，同 时利用这些技术也提高了色谱工作者使用色谱仪器分析各种样品的能力。现代色谱仪 对样品的分析所用时间越来越短，但是色谱分析样品的制备过程所用的时间却仍然很 长。据统计表明【5 5 1 ，大部分色谱实验室中用于样品制备过程的时间约占整个分析时间 的2 3 ，而只有1 0 的时间用于色谱分析，其余时间是用于分析测定结果和报告等。 为了提高分析测定效率，改善和优化色谱分析样品制备的方法和技术是一个非常重要 的问题。 目前，色谱分析样品制备方法正处在多种处理技术并存、已有的技术和新开发出 来的技术不断组合的局面下，这种局面的目的和结果就是要实现快速、有效、简单和 自动地完成分析样品制备过程。除此之外，与各种样品制备技术相关的装置其操作程 序越来越简便，装置的体积和重量也越来越小。现代色谱分析样品制备技术的发展趋 势就是使处理样品的过程要简单、处理速度要快、使用装置要小、引进的误差要小、 对欲测定组分的选择性和回收率要高。 2 3 2 现代样品制备技术概述 传统的样品制备包括了许多冗繁的操作，如大体积溶剂萃取，滤纸过滤或真空抽 滤、分液漏斗进行液液分配，用k d 浓缩器和旋转蒸发器挥发大体积的溶剂和进行 9 浙江大学硕士毕业论文 样品浓缩等过程，占用大量的时间，消耗大量的溶剂及样品，处理步骤冗长，不但容 易损失样品、产生较大误差，而且有毒溶剂的大量使用还会影响操作人员健康，污染 环境。为此，无溶剂或少溶剂、准确度高、快速、简便、易实现自动化的样品制备方 法的研究成为当今分析化学家的前言研究课题之一。目前，已开发出来的新的样品处 理技术，诸如固相萃取( s p e ) 、固相微萃取( s p m e ) 、基质固相分散技术( m s p d ) 、 搅拌棒吸附萃取法( s b s e ) 、液相微萃取( l p m e ) 、液膜萃取，微波辅助萃取( m a e ) ， 加速溶剂萃取( a s e ) 、超临界流体萃取( s f e ) 以及最新的q u e c h e r s 5 & 5 8 】技术等 在食品安全、大众健康、环境保护、贸易结算等各个领域发挥越来越大的作用。 ( 1 ) 固相萃取 固相萃取( s o l i d p h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 是近年发展起来的一种样品预处理技术， 由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩。 固相萃取法通常采取柱分离，所用柱称为s p e 柱，它是由柱管、筛垫、固定相三部分 组成的。其中，固定相( 填料) 是s p e 柱中起分离作用的部分，因而也是最主要的部 分。不同类型的填料，s p e 操作方法也略有不同。以c 1 8 填料为例，基本实验步骤如 下，第一步：柱预处理，使用3 5 m l 甲醇润湿小柱，活化填料，以使固相表面易于和 被分析物发生分子间相互作用。同时，可以除去填料中可能存在的杂质。再用3 5 m l 水或适当的缓冲溶液冲洗小柱，转移过多的甲醇，以便样本与固相表面发生作用。填 料未经预处理或未被溶剂润湿，会引起溶质过早穿透，影响回收率。第二步：加样， 使样品经过小柱，弃去废液。第三步：除去干扰杂质用中等强度的溶剂，将干扰组分 洗脱下来，同时保持分析物仍留在柱上。对反相萃取柱，清洗溶剂为适当浓度的洗脱 液，挥干溶剂以备后用或直接进行在线分析。 与传统的液液萃取( l i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n ，l l e ) 相比，s p e 具有如下优点【5 9 6 0 】： ( 1 ) 速度较快，缩短了预处理时间；( 2 ) 较高的精密度和准确度；( 3 ) 分析物的高回收率： ( 4 ) 有机溶剂的低消耗，降低了实验成本，又减少了对环境的污染；( 5 ) 不出现乳化现 象，易获得较为纯净样品；( 6 ) 操作简单，易于自动化。正因为这些优势，s p e 在国内 外日趋受到重视，现已用于g c ，l c ，m s ，n m r ，u v v i s ，从等的样品预处理唧击。 近些年来，s p e 研究成为一个热点，s p e 技术正在进一步发展完善。 ( 2 ) 固相微萃取 l o 浙江大学硕士毕业论文 固相微萃取( s o l i dp h a s em i c r o e x t m c t i o n ，s p m e ) 是在固相萃取技术的基础上发展 起来的一项新的样品预处理技术。s p m e 的装置类似于一个微型注射器，主要由手柄 和萃取纤维头两部分构成，纤维头是一根lc m 长涂有不同高分子聚合物功能层的熔 融石英纤维，装在类似于微量注射器的针管内，针管可以保护纤维头不易折断。平时 萃取纤维头收在针管内，萃取时针头穿过样品瓶中，压下管芯，使纤维头从针管中伸 出，直接浸人溶液中( 直接浸入方式) 或置于易挥发样品的上部空间( 顶空方式) ，使萃 取纤维暴露在样品中进行萃取，萃取吸附时间平均大约2 0 - 3 0r a i n ，达到吸附平衡( 常 辅以磁力搅拌、超声波或微波等措施) ，再将纤维头收回到针管内，针管从样品瓶中 退出。固相微萃取的选择性主要取决于高分子功能层材料的性能，不同的涂层对分析 物的亲合力不同，按照“相似相溶”的原则，分析物容易被极性相似的固相萃取剂