（发育生物学专业论文）大鼠骨髓间充质干细胞在生物材料表面定向分化的研究.pdf

东南大学学位论文独创性声明 本人卢明所交的学f 市论文是我个人在导师指导卜进j r 的研究l ：作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得东南人学或其它教育机构的学位或证l s 而使川过的材料。与我一同i ：作的同：占对本 研究所做的任何贡献均已住论文巾作了明确的说明并表示了谢意。 蹶生签名：l 蛩垫塾日j i j ：列! ：【：丝 东南大学学位论文使用授权声明 东南人学、中困科学技术信息研究所、国家图l s 馆有权保留本人所送交学位论文的复印f i ，l ：和电 子文档，可以采川影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相 一致。除住保密j j j 内的保密论文外，允许论文被奄阅和借阅，可以公布( 包括以电子信息形j 弋刊登) 论文的全部内容或| | | 、英文摘要等部分内容。论文的公布( 包括以电子信息形式刊登) 授权尔南人 学研究生院办理。 研究生签名：户a 姜兰釜酶师签名： 日期：塑r ，名 料表面定向分 、纯化与鉴定 em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e m c e l l s ，b m s c s ) 的方法。对所培养的b m s c s 进行表面标志鉴定并柃测它们向脂肪细胞分 化的潜能。方法：从大鼠股骨下端抽耿骨髓，以贴擘培养法分离、纯化并扩增大鼠 b m s c s ；流式细胞仪( f c m ) 检测所培养的第二代细胞的细胞表面抗原；用成脂诱导剂 对第二代细胞进行诱导分化，分别在第7 天、第1 4 天和第2 1 天对绣导后细胞进行油红 o 染色，观察胞浆内脂滴出现情况。结果：所培养细胞为成纤维细胞样，原代细胞呈集 落状生长；第二二代细胞的细胞表而抗原c d 2 9 和c d 9 0 为阳性，造衄细胞潜系标志c d 4 5 为阴性；在诱导后第7 天、第1 4 灭和第2 1 天，镜下可见分别约有7 、3 5 和6 5 的 细胞内积聚了可被油窒 0 染液着色的脂滴，证实这些细胞发生了成脂分化。结论：本研 究成功地在体外分离、纯化和扩增了人鼠b m s c s ；这些扩增后的第二代细胞表达b m s c s 表面标志，具有良好的增贿及m 脂肪细胞分化的潜能。 关键词：大鼠；骨髓问充质。l ：细胞；分离；细胞表面抗原；成脂分化 第二章具有微米级化学图案的生物材料聚乙二醇和聚磺酸基甜 菜碱一异丁烯酸的生物相容性鉴定 目的：在生物材料表面构建微米级的化学图案，将b m s c s 接种其上，观察b m s c s 在 生物材料表面的生长情况，进行扛物柏容性鉴定。方法：消化第一代b m s c s ，以2 0 l o7 l 的密度将细胞接种于具有微米级化学图案的聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 和聚磺酸琏甜菜碱一异丁烯酸( s u l f o b e t a i n em e t h a c r y l a t e ，s b m a ) 1 - 物材料表面，继续 培养一周先右时f 1 1 j ，取出卜述细胞进行吖啶橙( a c r i d i n eo r a n g e ，a o ) 染色，观察细胞 l 中义猢萤 生长情况。结果：接种有b m s c s 的p e g 材料膜和s b m a 材料膜，经过吖啶橙染色后， 可以看出b m s c s 在两种材料表面均生长良好，而且有图案处，e 长密度明显高于无图案 处。结论：具有微米级化学图案的p e g 和s b m a 有良好的生物棚容性，为下一步在这 两种生物材料表面进行b m s c s 的定向分化研究打下了良好的琏础。 关键词：骨髓问充质干细胞；聚7 , 2 - _ 醇；聚磺酸基甜菜碱异丁烯酸；微米级化学图案； 生物相容性 第三章大鼠骨髓间充质干细胞在生物材料表面定向分化为脂肪 细胞 目的：将b m s c s 接种到具有微米级化学图案的生物材料表而，结合化学物质诱导，找 到合适的分化条件，实现b m s c s 在较短的时| 1 j j 内高效分化为脂肪细胞。方法：通过贴 擘培养法体外分离纯化大鼠b m s c s ，取第一二代b m s c s 接种到普通玻片表而和具有微米 级化学图案的生物材料p e g 和s b m a 表面，并使用成脂诱导剂进行诱导分化，对诱导 分化的细胞分别在第5 天、第1 0 天和第1 5 天进行油红o 染色，观察比较在不同材料表 面的诱导分化效率。结果：b m s c s 成脂诱导分化后，经油红o 染色，可见诱导组细胞 胞浆内出现大量红染脂滴，诱导分化效率随培养时问的延长明显增高；在p e g 和s b m a 两种生物材料表而的诱导分化效率没有明显筹别，并且在生物材料表面诱导比在普通玻 片j ：诱导分化效率明娃增高。结论：成脂涛导剂和生物材料微米级化学图案的共同作用 能够加速b m s c s 向脂肪细胞方向分化，并且诱导分化效率比单独使用诱导剂的情况明 显提高。 关键词：大鼠；骨髓问允质干细胞；微米级化学图案；成脂分化 英文摘要 a b s t r a c t a s t u d y 0 1 1i n d u c i n gt h er a tb o n em a r r o w m e s e n c h y m a ls t e mc e l l sd i f f e r e n t i a t i o n d i r e c t i o n a l l yo nt h es u r f a c eo f bi o m a t e r i a l s g r a d u a t e ：z h o ux i n h a n g t u t o r ：m a ox i s o u t h e a s tu n i v e r s i t y c h a p t e r1i s o l a t i o n ，p u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fr a tb o n e m a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s o b j e c t i v e ：t oc r e a t eam e t h o do fi s o l a t i n g ，p u r i f y i n ga n dp r o l i f e r a t i n gr a tb o n em a r r o w m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ( b m s c s ) i nv i t r oa n di d e n t i f yc e l ls u r f a c em a r k e ro f t h eb m s c sa n d d e t e c tt h e i rp o t e n t i a lo f a d i p o g e n i cd if f e r e n t i a t i o n m e t h o d ：t h er a tb o n em a r r o wa r e o b t a i n e df r o mt h ee n do ft i b i a ea n dt h er a tb m s c sa r e i s o l a t e d ，p u r i f i e da n dp r o l i f e r a t e db y a d h e s i v ec u l t u r em e t h o d t h ec e l ls u r f a c ea n t i g e n so f t h e2 1 1 dp a s s a g ec e l l sa r e a n a l y z e db y f l o wc y t o m e t e r ( f c m ) a f t e ri n d u c e di n t oa d i p o c y t e so ft h e2 叫p a s s a g ec e l l si nt h e a d i p o g e n e s i ss u p p l e m e n tm e d i u mf o r7 ，1 4a n d21d a y s ，t h e s ei n d u c e dc e l l sa r es t a i n e db yo i l r e do d y et oo b s e r v et h ea c c u m u l a t i o no fl i p i dd r o p l e t si nt h ec y t o p l a s m r e s u l t s ：t h e c u l t u r e dc e l l sa r ef i b r o b l a s t i cm o r p h o l o g ya n dt h ep r i m a r yc e l l sg r o wa sc o l o n i e s t h ec e l l s u r f a c ea n t i g e n sc d 2 9 ，c d 9 0o ft h e2 n dp a s s a g ec e l l sa r e p o s i t i v e ，w h i l et h eh e m a t o p o i e t i c l i n e a g e sm a r k e rc d 4 5i sn e g a t i v e a tt h e7 椭d a y , t h e14 t hd a ya n dt h e2 1 “d a ya f t e ra d i p o g e n i c d i f f e r e n t i a t i o n ，t h e r ea r ea b o u t7 ，3 5 a n d6 5 c e l l st h a tt h ea c c u m u l a t i o no f l i p i dv e s i c l e s i nt h e mw h i c hs t a i n e dw i t ho i lr e do i td e m o n s t r a t et h a tt h ec e l l sh a v eb e e ni n d u c e di n t o a d i p o c y t e s c o n c l u s i o n ：w es u c c e s s f u l l yi s o l a t e ，p u r i f ya n dp r o l i f e r a t er a tb m s c si nv i t r o t h e s ee x p a n d e d2 ”p a s s a g ec e l l se x p r e s ss u r f a c em a r k e r so fb m s c sa n dp o s s e s sag o o d p o t e n t i a lo fp r o l i f e r a t i o na n da d i p o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n k e yw o r d ：r a t ；b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ；i s o l a t i o n ；c e l ls u r f a c ea n t i g e n s ； a n ds u l f o b e t a i n em e t h a c r y l a t e ( sb m a ) w i t hm i c r o n s c a l ec h e m i c a lp a t t e r n sa tad e n s i t yo f2 0 10 7 l t h e nt h e g r o w i n g s t a t eo fb m s c si so b s e r v e d b y a c r i d i n e o r a n g e ( a o ) s t a i n i n g r e s u l t s ：b m s c sg r o ww e l lo nt h es u r f a c eo f p e ga n ds b m aw h i c hi so b s e r v e db y a os t a i n i n g ，a n dc e l ld e n s i t yo np a t t e r n e dd e p a r t m e n ti ss i g n i f i c a n t l yh i g h e l - 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s c a l ec h e m i c a lp a t t e r n t h e nb m s c s a r e i n d u c e db ya d i p o g e n e s i ss u p p l e m e n tm e d i u m t h ei n d u c e db m s c sa r eo b s e r v e da tt h ef i f t h d a y , t h et e n t hd a y a n dt h ef i f t e e n t hd a yb yo i lr e d0 s t a i n ，a n dt h ea d i p o g e n i cr a t e sa r e c o m p a r e do nt h es u r f a c eo f d i f f e r e n tm a t e r i a l s r e s u l t s ：a f t e ri n d u c e d ，m a n yr e dl i p i d d r o p l e t si nc y t o p l a s mo ft h et r e a t m e n tg r o u pc e l l sc a nb eo b s e r v e db yo i lr e d0s t a i n t h e e f f i c i e n c yo f i n d u c t i o na n dd i f f e r e n t i a t i o nw i t hi n c u b a t i o nt i m es i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d t h e r e i sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo nt h ea d i p o g e n i cr a t e so ft h et w ob i o m a t e r i a l sp e ga n ds b m a ， b u tt h ea d i p o g e n i cr a t e so nt h eb i o m a t e r i a l si sm o r et h a no nt h eg l a s s c o n c l u s i o n ：t h e d i f f e r e n t i a t i o no f r a tb m s c si n t oa d i p o s ec e l l sc a nb ea c c e l e r a t e db yt h ec o m b i n e di n d u c t i o n o f t h ea d i p o g e n e s i ss u p p l e m e n tm e d i u ma n do nt h es u r f a c eo f b i o m a t e r i a l sw i t hm i c r o n s c a l e c h e m i c a lp a t t e r n sa n dt h ea d i p o g e n i cr a t e si n c r e a s e ds i g nif i c a n t l yt h a na l o n eu s i n gt h e a d i p o g e n e s i ss u p p l e m e n tm e d i u m k e yw o r d s ：r a t s ；b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ；m i c r o n - s c a l ec h e m i c a lp a t t e m s ； a d i p o g e n i cd i f f e r e n t i a t i o n v i i i 3 17 17 2 l 2 4 2 7 第一二章：具有微米级化学图案的生物材料聚乙一：醇和聚磺酸基甜菜碱一异j 烯酸的生物相容性 鉴定2 8 1 材料和方法 2 实验结果 3 讨 仑 参考文献 第三章：大鼠骨髓问充质干细胞在生物材料表面定向分化为脂肪细胞 1 材料和方法 2 实验结果 3 讨论 参考文献 结论 作者简介 致谢 v l 8 1 4 7 8 8 2 7 0 2 3 4 2 3 3 3 3 3 4 4 5 5 5 s 缩略测 m e m b m s c s h s c s f b s p b s f c m c f u f p d g f b f g f t g f bl e g f a f g f p g a s c p l g a 狂；m x f i t c p e g s b m a 缩略词 e a g l e s m i n i m u me s e n t i a lm e d i u me a g l e s 最低必须培养基 b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s骨髓问充质干细胞 h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s 造血干细胞 f e t a lb o v i n es e r u m胎牛血清 p h o s p h a t eb u f f e rs a l i n e 磷酸击 ；：缓冲液 f l o wc y t o m e t e r流式细胞仪 f i b r o b l a s tc o l o n y f o r m i n gc e l l s成纤维细胞集落形成单位 p l a t e l e t - d e r i v e dg r o w t hf a c t o r 血小板衍生牛长因子 b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r碱性成纤维细胞生长因子 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - pi转化生长凶子bl e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r 表皮生k 因了 a c i df i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r酸性成纤维细胞乍长因子 p o l y g l y c o l i ca c i d 聚砼琏乙酸 s c h w a n nc e l l施万细胞 p o l y a i t i c g l y c o l i ca c i d 聚乳酸乙醇酸 3 - 1 s o b u t y l 1 m e t h y l x a n t h i n e 3 异丁基一1 一甲基黄嘌呤 f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e异硫氰酸荧光素 p o l y e t h y l e n eg l y c o l 聚乙二_ 醇 s u l f o b e t a i n em e t h a c r y l a t e聚磺酸基甜菜碱异丁烯酸 v l l 前占 1 l j 一 月i j昌 组织修复与替代是医学界面临的重要问题之一，而组织工程学的出现和发展为解决 这一问题提供了新思路和研究方向。组织工程学( t i s s u ee n g i n e e r i n g ) 足一门多学科交叉的 新兴学科，它涉及材料学、工程学及生命科学等诸多领域。“组织工程的概念最早是 由美国国家科学基会会于1 9 8 7 年j 下式确立，定义为：应用生命科学和工程学的原理与 技术，在正确认识哺乳动物j 下常及病理两种状态下组织结构与功能关系的基础上，研究、 丌发用于修复、维护和促进人体各种组织或器官损伤后功能和形态生物替代物的学科。 组织 ：程学的基本原理是将体外培养扩增的、具有特定生物学功能的种子细胞( s e e dc e l l ) 与可降解生物材料( b i o d e g r a d a b l ep o l y m e r ) 相结合形成细胞- 材料复合物，在体外培养一定 时问后植入体内，用以修复或替代病损组织、器官，随着种子细胞在体内或体外不断增 殖并分泌细胞外皋质，生物材料被逐渐降解吸收，最终形成与相应组织、器官形态和功 能相一致的组织或器官，从而达到修复病损和重建功能的目的。 由此可见，种子细胞、生物材料、生长网子是构成组织工程的三大基本要素。种子 细胞足组织工程化组织能够再生的首要物质基础，一般来讲，用于组织构建的种子细胞 必须满足以下几点要求：易获取，来源广，数量充足；易二了二体外分离培养，增殖 力强，可大量扩增；具备特定尘物学功能，移植后能保持生物学特性，与支架材料 有良好的兼容性；纯度高，具备特定功能的细胞占主导；无免疫排斥反应，植入 体内能耐受机体免疫。这些要求是种子细胞能够再生特定组织或修复特定组织缺损的重 要保证。自从1 9 9 9 年和2 0 0 0 年连续两年干细胞研究被列为年度十大科学成就以来，干 细胞科学备受人们的关注! 骨髓问充质干细胞( b o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s b m s c s ) 是半个世纪以来在多种哺乳动物骨髓中发现的除造血干细胞以外的另一种成体 干细胞。大量研究表明它不但具有良好的体外扩增和向中胚层与非中胚层起源细胞分化 的潜能，而且还具有易于获取、遗传背景稳定、易于外源基因的导入和表达、免疫源性 低、能够分泌多种生物活性因子、可自体移植等优点，因此它被认为是基于细胞和组织 工程的替代性细胞治疗及基因治疗的理想种子细胞，b m s c s 为修复或熏建损伤性和退 行性病变的机体组织器官功能提供了新的治疗途径。 随着组织工程的发展和干细胞研究的深入，人们开始研究材料的表面化学和拓扑形 貌对b m s c s 行为的影响。细胞具有敏锐的感知和应答周嗣微环境( m i c r o e n v i r o n m e n t ) 的能力，因此其行为和功能在很大程度上受微环境冈素的影响。研究表明，生物材料的 表嘶。阽能如亲疏水性、电荷性、生物活性、表面形貌等直接影响细胞与生物材料之i n j 的 i 东南人学硕i ：学位论文 相互作用，生物材料的表面形貌已被证明可调符细胞延展的程度和细胞的形状，从 而影响细胞的生长和功能。因此，生物材料的仿生表面研究是生物材料领域的一个重要 研究方向。2 0 0 4 年，c h e nc s 的研究组首次提出了b m s c s 的形状( 细胞骨架) 可通过 调控r h o a r o c k 细胞骨架张力( r h o 为g t p a s e ，激活r o c k 蛋白激酶) 这一信号传 导通路，决定其是分化成为脂肪细胞还是成骨细胞。因此，人们有可能通过调控细胞生 长的密度和形状，结合适当的化学物质刺激来达到高效定向分化b m s c s 的目的，而体 外细胞培养中细胞，长的密度和形状可以通过表面图案化技术来控制。2 0 0 6 年，d a l b y m j 的研究组又发现人骨髓基质细胞对于表面的纳米级形貌具有很强的反应。在最新的 研究报道中他们首次提出，在采用电子束刻蚀技术得到的具有纳米孔洞排列( 介于高度 规则与完全无规则之问) 的培养基底上，b m s c s 可以在不加化学诱导剂的情况下定向 分化为成骨细胞，其效率与加了促使向成骨细胞分化的诱导剂地塞米松的情况接近。通 过以上的研究，我们可以看出细胞形状可以调控b m s c s 的定向分化。因此，我们可以 采j j 微加工技术( 如光刻蚀、软刻蚀、等离子刻蚀、电子束刻蚀等技术) 结合化学方法， 获得具有微米和纳米尺度的化学图案( c h e m i c a lp a t t e m ) 和形貌图案( t o p o g r a p h i cp a t t e r n ) ， 然后将具有良好种子细胞特性的b m s c s 与微纳米图案相互作用，研究b m s c s 的定向 分化。 在本项目中，我们将研究b m s c s 在微米级和纳米级图案化表硒的细胞行为( 如粘 附、增殖、分化) ，特别是定向分化。从应用的角度考虑，我们选择两种材料作为基底： 聚乙二醇( p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，p e g ) 和聚磺酸基甜菜碱异丁烯酸( s u l f o b e t a i n e m e t h a c r y l a t e ，s b m a ) 。这两种材料都具有良好的生物相容性，我们将在两种材料表面分 别制备微米级化学图案和具有纳米孔洞的形貌图案，微米级和纳米级的细胞外信号能调 控细胞功能。我们将通过调节微米级化学图案的尺寸和纳米级孔洞的排列，研究不同图 案化表面对b m s c s 的行为，特别是定向分化的影响。一方面引导细胞特定地生长在化 学微图案区域，通过控制图案的尺寸达到控制细胞形状的目的，结合化学物质诱导，希 望找到合适的分化条件，实现b m s c s 在较短的时间内高效分化为成骨细胞或高效分化 为脂肪细胞。以期将来将成骨细胞植入三维支架材料形成工程化骨组织用于骨再生和骨 修复，脂肪细胞用于整形外科可供消除皱纹及凹陷性疤痕的细胞移植之用。相信我们的 研究能够为b m s c s 在组织- i ：程领域中的应用丌辟出新的途径! 本研究系国家自然科学基金项目应 j 基础研究( 编号6 5 0 7 0 3 1 8 0 2 ) 文献综述 文献综述 骨髓问充质干细胞的生物学特性及其在组织工 程中的应用 1 9 7 6 年，f r i e n d e n s t e i n 等【l 】将骨髓细胞：悬液种植于塑料培养皿中，数小时后将非贴 壁细胞倒掉后，有形态类似于成纤维细胞的细胞贴壁生长，这些细胞随后迅速增殖并呈集 落样排列，当时将其称为成纤维细胞集落形成单位( f i b r o b l a s tc o l o n y f o r m i n gc e l l s ， c f u f ) 。1 9 8 7 年，f r i e n d e n s t e i n 的研究结果发现，该种细胞在一定条件下可分化成多种 中胚层来源的细胞，他们把该种细胞命名为问充质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ， m s c s ) 。在骨髓中，除了以更新循环血组分的造血干细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ，h s c s ) 外，另一种同样来源于中胚层的具有自我更新和分化潜能的非造血性干细胞即骨髓基质 ( 干) 细胞( b o n em a r r o ws t r o m a l ( s t e m ) c e l l s ，b m s c s ) 【2 3 1 或骨髓问充质干细胞( b o n e m a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，b m s c s ) 4 1 。m s c s 是来源于中胍层的成体干细胞，主要 存在于全身结缔组织和器官f u j 质中，以骨髓组织中含量最为丰富，具有自我更新和增殖 能力，在适。 的微环境早具有多向分化潜能，可向中胚层起源细胞( 如成骨细胞、成软 骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞) 1 5 础j 和非中胚层起源细胞( 如神经细胞、肝脏细胞、表 皮细胞和心肌细胞) 9 n nj 分化。b m s c s 相对胚胎十细胞而言，具有方便获取、易于分离 培养和扩增纯化、遗传背景稳定【5 1 、易于外源基冈的导入和表达【12 1 、免疫源性低等优点 f 1 3 1 ，此外白体b m s c s 移植还可避免异体胚胎干细胞移植所致的免疫排斥、畸胎瘤的产 生以及伦理道德，i ：的制约等问题i i4 | 。鉴于b m s c s 的这些优点，其早已作为理想的种子 细胞被广泛应用于组织工程、细胞移植、基因治疗及器官移植等领域。 本文主要针对b m s c s 的生物学特性以及近年来它在组织工程中应用方面的研究进 展作一论述。 1 b m s c s 的生物学特性 1 1b m s c s 分离、培养与纯化 b m s c s 在全骨髓中的比例约为1 ：l 1 0 5 ，0 1 1 0 6 1 0 1 0 6 个骨髓柯核细胞中仅含 有1 个b m s c s ，且随着年龄的增加或体质的衰弱，细胞数量逐渐减少，而组织工程需要 大量的种予细胞，故如何分离得到高纯度的b m s c s 并在体外大量扩增显得极为重要。目 前常用的分离方法有：密度梯度离心法：将骨髓细胞恳液铺于p e r c o l l ( 1 0 7 3 9 m 1 ) 1 5 】 或f i c o l l ( 1 0 7 7 9 m 1 ) 【l5 】淋巴细胞分离液上离心，利用它们所形成的不连续密度梯度叮 东雨人掌坝l j 学位论文 以获得骨髓一p 的单个核细胞，再将这些细胞进行贴壁培养以弃去末贴壁细胞。此方法的 优点是可以除去骨髓中绝大部分的混杂细胞使得分离的b m s c s 较纯( 9 5 ) 【5 1 ，缺点 是操作较复杂、一般只适用于骨髓量多的人类等大型哺乳动物。全骨髓贴壁培养法： 主要是根据b m s c s 为贴擘生长犁细胞而造血细胞为悬浮生长型细胞，直接将骨髓细胞悬 液科，植于培养器皿内，于培养第2 4 - - 7 2 h 更换培养液以弃去悬浮生长的血细胞。此方法的 优点是操作简嗨、获得的b m s c s 多，缺点是可能会有一些巨噬细胞、网状上皮细胞、成 纤维细胞和血细胞混杂。流式细胞仪分选法：根据b m s c s 体积小，相对缺少颗粒的 特性，利用流式细胞仪对b m s c s 进行分选，此方法容易造成细胞的污染和大量丢失。 免疫磁珠分选法【i6 】：它利用鼠单克隆抗体s t r o 一1 能够与b m s c s 表面抗原特异地识别与结 合，将偶联在抗体卜的磁珠标记于b m s c s 上，使它们在磁场作用下分离，该法是目前获 得b m s c s 纯度最高的方法，缺点是需要骨髓鼍多、对细胞活性有一定影响，且技术要求 较高，仪器和试剂昂贵，不能普及，主要应用于b m s c s 特异表面标志物的探索研究。现 在对于鼠类等小型哺乳动物b m s c s 的研究大多采用全骨髓贴壁培养法【6 】。在体外培养 时，b m s c s 的生长受多种冈素影响，主要有：血清：培养b m s c s 的胎牛血清最好是 1 0 ，有助于b m s c s 贴壁、扩增及多系潜能的维持，而高浓度血清中含有大量促进细胞 增殖分化的凶子，容易使细胞过早出现老化；种植密度：一般认为以1 0 5 细胞c m 2 的 密度培养较为合适。密度太低，不利于b m s c s 的生长，密度太高时细胞生长较慢，可能 足 l 于细胞i h j 的相互接触，或者足因为细胞释放到培养基中的因子影响了b m s c s 的生 长；细胞凶子：如血小板衍生生长冈子( p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r ，p d g f ) 和碱性 成纤维细胞7 t - 长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，b f g f ) 对大鼠的b m s c s 有较强的促 增殖作用，而转化生长因子- b ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 ，t g f b ) 、表皮生长因子 ( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r ，e g f ) 、酸性成纤维细胞生长因子( a c i df i b r o b l a s tg r o w t h f a c t o r ，a f g f ) 对b m s c s 的增贿没有明显的作用，但使用细胞因子调控增殖时要注意细胞 因子可能引起b m s c s 的定向分化。 1 2b m s c s 的表型及鉴定 目前研究发现b m s c s 的表面抗原具有非专一性，一般认为b m s c s 表达s h 2 、s h 3 、 c d l 3 、c d 2 9 、c d 4 4 、c d 4 9 b 、c d 7 1 、c d 9 0 和c d l 2 0 a 等标志，而不表达c d 3 4 、c d 4 5 、 c d l 4 、c d 3 1 、c d l 3 3 等造血干细胞表面标记【5 1 ，但这些抗原均具有i 日j 质细胞特征，无 特异性。另外，b m s c s 还表达a2 s m a c t i n 、白细胞抑制冈子( l i f ) 、单核细胞集落刺 激凶予( m c s f ) 1 1 7 j 和一些细胞渊子受体及细胞黏附分子如整合素业基o1 、a4 、q5 、 b1 等，它们在b m s c s 向损伤部位的趋化及与基质的结合中起重要作用。因此，需要 4 联合使用多种表面标汇物来纯化鉴定b m s c s 。它对表西i 抗原s b 2 1 0 、s h 2 2 、s h 2 3 、s h 2 、 c d 2 9 、c d 4 4 、c d 7 1 、c d 9 0 、c e l 0 5 、c d l 0 6 、c d l 2 0 a 和c d l 2 4 等均呈阳性反应，而 对造血干细胞的标志抗原c d l 4 、c d 3 4 、c d 4 5 均呈阴性反应。到目前为止，鉴定b m s c s 主要依赖在培养诱导分化过程中b m s c s 所表现出来的 二细胞特性及其分化后的成熟细 胞表型特征来鉴定。主要有3 方面：形态学：目前认为体外分离培养的b m s c s 为贴 壁生长的成纤维细胞样细胞，多呈梭形或三角形，核椭圆形居中，原代细胞呈对称的克 隆状生长。c o l t e r1 1 8 】等进一步发现在单个细胞衍生的b m s c s 克隆内含有梭形样细胞、 大而平的细胞以及能够快速自我更新的小而圆的细胞。他们【l9 】还发现在生长稳定期的 b m s c s 中含有一个数量较多的体积大、含有中等量的颗j 最的细胞( m m s c s ) 和一个数 量少、体积小的无颗粒细胞( r s 一1 ) 。前者为增殖缓慢的成熟m s c s ，而后者则不在细 胞周期中。在指数增殖期，r s 1 细胞可转变为体积小、多颗粒细胞( r s 2 ) ，后者又 可以转变为m m s c s ；至指数增殖后期，r s 2 细胞减少而r s 1 细胞数鼍增加。r s 1 细 胞和r s 一2 细胞可循环再生，它们是成熟m s c s 的前体细胞，被称为循环十细胞( r e c y c l i n g s t e mc e l l s ) ，即所谓的r s 细胞。细胞表面表达物：b m s c s 对神经生长因子受体、 s t r o 1 抗体识别抗原、s h 2 、s h 3 和s h 4 抗体识别抗原早刚性，彳i 表达c d l 4 、c d 4 5 、 c d 3 4 、c d 4 1 、c d l 4 d 、c d l l b 、c d 3 l 造血系细胞表面抗原等，对s h 2 、s h 3 、c d 2 9 、 c d 4 4 、c d 7 1 、c d 9 0 、c d l 0 6 、c d l 2 0 、c d l 0 5 和c d l 2 4 等均旱刚性反应。分化潜 能：b m s c s 是骨髓源性的成纤维样细胞，在一定的条件下叮分化为成骨细胞、脂肪细 胞、软骨细胞等3 个主要的细胞系1 5 q j 。虽然经过大量努力，目前仍然无法分离出特异 的细胞表面标志，从表面标志纯化、鉴定b m s c s 的方法还有待进一步研究，鉴定b m s c s 不但要检验其干细胞特性，同时要检验其是否可以分化为以上细胞系的能力。 1 3b m s c s 的免疫学特点 b m s c s 具有独特的免疫表型和免疫调节能力。已有的研究显示，b m s c s 不表达组 织相容性复合体m h c 1 1 类分子和f a s 配体( f a s l ) ，不表达或者极低水平表达m h c i 类 分子，也不表达共刺激分子如c d 8 0 、c d 8 6 、c d 4 0 和c d 4 0 l ，很难被机体免疫系统识 别，并在体内和体外均表现出一定的免疫抑制作用。在b m s c s 输注到异基因体内后， 可能逃避宿主的免疫监视系统在宿主体内长期存活，因此b m s c s 移植越来越成为广 大学者的研究热点。k r a m p e r