（食品科学专业论文）食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇胶体金免疫快速检测技术研究.pdf

摘要 摘要 脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d o n ) 是单端孢霉烯族毒素之一，广泛存在于谷物和饲料中， 严重危害人类和动物的健康。目前的检测方法操作繁琐，大多需要专门的仪器进行配套 检测，无法满足快速、简便、现场检测的要求。本文以多克隆抗体和胶体金合成标记技 术为基础，根据免疫层析的原理，建立了食品中d o n 胶体金免疫快速检测方法。 通过d c c 法合成d o n 完全抗原，d o n 与b s a 的初始摩尔比为5 0 ：1 ，得到 d o n 完全抗原中d o n 与b s a 的摩尔比为9 7 ：1 。通过红外光谱扫描以及e l i s a 实 验验证了d o n b s a 的偶联成功。将d o n b s a 免疫新西兰大白兔，得到抗体的最高 效价为1 2 8 0 0 ，抑制率i c 5 0 为1 0g g m l ，与t - 2 毒素、n i v 的交叉反应率分别为9 1 ， 4 9 。 采用柠檬酸三钠还原法成功制各了粒径为1 0n n l 和2 0 姗的胶体金，并在紫外图 谱上进行了表征。胶体金标记抗体的最适p h 为9 0 ，最适抗体加入量为o 0 6 6m g m l 、 0 0 7 2m g m l 。胶体金标记抗血清得到免疫胶体金探针，胶体金、抗体溶液、免疫探针 复合物做紫外扫描，2 8 0n i 1 附近有蛋白特征峰出现，与胶体金复合后，原出现在5 2 0h i l l 处的胶体金的特征峰，峰值增高，并平移至5 4 01 1 1 1 1 附近，证明大分子蛋白抗体与胶体 金偶联成功。 标记前后的抗体蛋白红外光谱扫描的结果表明，标记前后抗体蛋白的特征基团结构 没有发生明显的变化。对抗体探针进行荧光光谱扫描分析，胶体金对抗体蛋白的内源荧 光有猝灭作用，并且随着胶体金浓度的增加，抗体的荧光强度呈现有规律的降低，发射 光的位置不变。 以胶体金标记多克隆抗体作为探针，d o n b s a 作为竞争抗原，构建了胶体金免疫 检测体系( g i c a ) 。确定最佳包被抗原浓度为1 0g g m l ，缓冲液体系：1 0 甲醇+ o 0 5 吐温2 0 的p h7 4p b s 溶液，胶体金的最佳粒径2 0n l n 左右。g i c a 目测检出限为1 m g k g ，检测时间为1 0 1 5m i n 。方法的重复性良好。方法的稳定性良好，试纸条室温 保存3 个月，4 保存6 个月。对自然污染的样品进行e l i s a 和g i c a 检测，结果 证明两者有良好的一致性。 关键词：呕吐毒素食品胶体金免疫检测 a b s t r a c t a b s t r a c t d e o x y n i v a l e n o l ( d o n ) ，a so n ef u n g it o x i nb e l o n g i n gt ot h eg r o u po ft r i c h o t h e c e n e s ，i s w i d e l yd i s t r i b u t e di nc e r e a la n df e e d s t u f f s ，a n di t sr a p i dd e t e c t i o ni si m p o r t a n tf o rf o o ds a f e t y h o w e v e rm o s to ft h ec u r r e n t l yu s e dm e t h o d sa r et i m e c o n s u m i n ga n da l s on e e de x p e n s i v e i n s t r u m e n t s ，w h i c hc a n n o ts a t i s f yt h er e q u i r e m e n tf o rar a p i d ，c o n v e n i e n t ，a n do n - s i t e d e t e c t i o no ft h ep r e s e n c eo fd o ni nf o o ds a m p l e s t h u s ，a ni m m u n o c h r o m a t o g r a p h i cs t r i p s y s t e mu s i n gc o l l o i d a lg o l d l a b e l e dp o l y c l o n a la n t i b o d y ( p c a b ) s p e c i f i ct od o n 硒t h em a k e r w a sd e v e l o p e df o rr a p i dd e t e c t i o no fd o ni nf o o d s t h ef u l l - a n t i g e no fd o nw a sf i r s tp r o d u c e db yc o n j u g a t i n gd o nt ob o v i n es e r u m a l b u m i n ( b s a ) a c c o r d i n gt ot h em e t h o do fd c c am o l a rr a t i o no f9 7 ：1b e t w e e nd o na n d b s aw a sa b t a i n e di nt h ec o n j u g a t i o nr e a c t i o nf r o ma ni n i t i a lm o l a rr a t i oo f5 0 ：1 a f t e rt h e s u c c e s s f u lc o n j u g a t i o no fb s at od o nw a sv e r i f i e db ye l i s aa n di rs p e c t r a , t h ep c a bt o d o n - b s aw a st h e np r o d u c e db yi m m u n i z i n gr a b b i t s t h er e s u l t so fc h a r a c t e r i z i n gp c a b s h o w e dah i g h e s tt i t e ro f12 8 0 0 晰t l la ni c 5 0o flo p g m l ，a n di t sc r o s sr e a c t i v i t y 埘t ht - 2 t o x i na n dn w a s9 1 a n d4 9 r e s p e c t i v e l y c o l l o i d a lg o l dw e r ep r e p a r e dt h r o u g hr e d u c i n gh a u c h 3 h 2 0b ys o d i u mc i t r a t e ，a n di t w a st h e nc h a r a c t e r i z e db yu v - s p e c t r a t h eo p t i m u mp hf o ra n t i b o d yl a b e l l i n g 、 ，i mc o l l o i d a l g o l d ( a l s oc a l l e dg o l dl a b e l e dp r o b e ) w a s9 0 ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fa n t i b o d yw a s 0 0 6 6 m g m l ，0 0 7 2m g m l t h ep r o b ec o l l o i d a lg o l dp a r t i c l e s ，a n da n t i b o d yw e r ea n a l y z e d b yu v - s p e c t r a , a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o n j u g a t i o nw a ss u c c e s s f u l c o m b i n a t i o no fp c a bw i t hc o l l o i d a lg o l dp a r t i c l e sw a sa l s oc h a r a c t e r i z e db yi rs p e c t r aa n d f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y t h ee x p e r i m e n t a lr e s l u t ss h o w e dt h a tt h es t r u c t u r eo fp c a bw a sn o t c h a n g e d , b u ti t sf l u o r e s c e n c ec a n b eq u e n c h e db yt h ec o l l o i d a lg o l d , a n di t sp o w e rw a ss t r e n g t h e n e d a st h ec o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e & h o w e v e rn oc h a n g e so f t h ee m i s s i o ns p e c t r u mp r o f i l ew a sf o u n d a r a p i d ，s i m p l ea n ds e n s i t i v ec o l l o i d a lg o l dl a b e l e di m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ct e s t ( g i c a ) f o rd e t e c t i o no fd o ni nf o o d sw a se s t a b l i s h e d t h eo p t i m u mc o n c e n t r a t i o no fe n v e l o p ea n t i g e n w a s1 0 p g m l a b u f f e rs y s t e mc o m p o s e do f p b s ( p h7 4 卜1 0 m e t h a n o l + 0 0 5 t w e e n 2 0w a s u s e dt od e t e c tt h ed o n t h eo p t i m u mp a r t i c l ed i a m e t e ro fc o l l o i d a lg o l dw a sf o u n dt ob e2 0 n m ， a n dt h ed e t e c t i o np r o c e s sc o u l db ef i n i s h e dw i t h i n15 m i n , w h i c hi sr e p r o d u c i b l ea n ds t a b l e w i t hv i s u a lo b s e r v a t i o n , t h el o w e s tl i m i tw a sf o u n dt ob elm g lc o r r e s p o n d i n gt olm g k g d o ni ns a m p l e s t h es h e l f - l i f eo fi m m u n o s t r i p sw a st h r e em o n t h sa tr o o mt e m p e r a t u r ea n ds i x m o n t h sa t4 c c o m p a r i n g 、i t i lc o m m e r c i a le l i s ak i tu s i n gn a t u r a l l yc o n t a m i n a t e df o o d s a m p l e s ，c o n s i s t e n tr e s u l tw a so b t a i n e du s i n gt h ed e v e l o p e dg i c a m e t h o d k e y w o r d s ：d e o x y n i v a l e n o l ( d o n ) ，f o o d s ，c o l l o i d a lg o l d ，i m m u n o c h r o m a t o g r a p h i ct e s t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是蠢人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：引奎他日 期：乒眇8 易1 9 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 了侵织导师签名：) 趺j 段l 第一章绪论 1 1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇简介 第一章绪论 1 1 1 脱氧雪腐镰刀茵烯醇的发现、命名及其结构 脱氧雪腐镰刀菌烯醇( d e o x y n i v a l e n o l ，缩写d o n ) ，又称呕吐毒素( v o m i t o x i n ) 属 单端孢霉烯族化合物。最早于1 9 7 0 年在日本香川县的一次赤霉病大麦中毒的病毒中发 现，1 9 7 2 年，由日本的m o r o o k a 等首次从赤霉病大麦中分离，y o s h i z a w a 等阐明了这 种新的真菌毒素的结构，并将其命名为4 - d e o x y n i v a l e n o l ( d o n ) t 矧。1 9 7 3 年v e s o n d e r 等 在美国，从被镰刀菌污染的玉米中分离出了同样的化学物质，由于该种物质可以引起猪 产生呕吐症状，故命名为呕吐毒素【l 捌。目前，研究资料表明，d o n 主要由镰刀菌属 f u s a r i u m 的几个种产生，尤其是禾谷镰刀菌( f u s a r i u mg r a m i n e a r u m ) 和黄色镰刀菌 ( f u s a r i u mc u l m o r u m ) 【3 】。据报道还有其它的一些镰刀菌也可以产生d o n ，雪腐镰刀菌 ( f n i v a l e ) 、燕麦镰刀菌( f a v e n a c e u m ) 和串珠镰刀菌( f m o n i l i f o r m e ) 等【。 c l b 0 0 i l j l l 图1 1d o n 的化学结构式 f i g 1 - ic h e m i c a ls t r u c t u r eo fd o n d o n 的化学名称为3 0 l ，弛，1 5 一三羟基草镰孢菌9 一烯8 酮，分子式为c 1 5 h 2 0 0 6 ，分 子量2 9 6 3 。属于b 型单端孢霉烯族化合物，其结构如图1 1 所示。 1 1 2d o n 的理化性质 d o n 的结晶为无色针状，熔点为1 5 1 - 1 5 3 ( 2 ，不饱和酮基的存在使得其在短波紫外 下有吸收峰。d o n 易溶于极性的溶剂如水、甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯，不 溶于正己烷和乙醚。d o n 耐热、耐压，在弱酸中不分解，加碱、高压以及热蒸汽的处 理可以破坏其部分毒力【4 】。 1 2d o n 的毒性及其作用机理 人类和动物误食了含有d o n 的粮食及其制品后，会产生一定的毒性效应。呕吐毒 素与某些真菌毒素共存时会发生协同作用，例如：呕吐毒素和萎焉酸( 一种最常见的镰 江南大学硕士学位论文 刀菌毒素) 二者之间的相互作用就是协同作用。萎焉酸本身对动物毒性不大，即使在浓 度很高的情况下也是如此，然而当它和呕吐毒素并存时，会使呕吐毒素的毒性增强【5 1 。 1 2 1d o n 的致呕吐作用 由于d o n 主要造成口腔和肠胃道的损伤，容易引起呕吐，据刘绍伟报9 】道，猪的 d o n 经口最小呕吐剂量为0 1 - 0 2m g k g ，猪摄入0 5m g k g b w 的d o n ，5 - 7m i n 后即可 开始呕吐。d o n 还可以引起拒食反应，对不同动物的致呕吐剂量如表1 1 所示。致呕吐 作用的机理除了d o n 对粘膜的刺激作用外，同时也有对中枢神经的作用【6 j 。 表卜1 不同染毒途径的d o n 致吐剂量 t a b 1 - 1v o m i t i n gd o s eo fd o ni nd i f f e r e n tw a y s 1 2 2d o n 的急性毒性 d o n 的急性毒性与动物的性别、种类、年龄和给药途径有关。雄性动物比较敏感， 经口毒性小于皮下注射，不同给药途径的各种动物的半致死剂量如表1 2 所示【6 】。 动物的d o n 急性中毒症状主要表现为站立不稳、反应迟钝、呕吐、食欲下降等。 一般用呕吐毒素灌胃1 - 6 天动物死亡，生理解剖可见胃粘膜充血脱落【l 】。 人类食用了含有一定量呕吐毒素的食品后，会出现胃部的不适应，恶心、呕吐、头痛、 头晕、腹痛、腹泻。还可有全身无力、口干、流涎，少数患者有发烧、颜面潮红等症状。 在粮食匮乏的年代d o n 引起的中毒很常见，主要集中在北方的国家和地区，如前苏联、 北欧、北美、加拿大都曾发生过由于d o n 引起的“醉谷病”或称为“醉黑麦病”；在我 国长江中下游地区经常发生d o n 中毒，东北地区也发生过类似的中毒事件，当地老百 姓把这种小麦叫做“病麦”或“毒麦 【| 7 1 。 表1 2 不同染毒途径的l d 5 0 t a b 1 - 2l d s of o rd i f f e r e n tc o n t a m i n a t i n gw a y s 2 第一章绪论 1 2 3d o n 的慢性毒性 国内曾有人以含d o n 毒素1 8 - - 2 0m g & g 的赤霉病小麦，按o 5 5 0 的不同比例 混入饲料中，喂养大鼠1 8 个月，发现高比例组动物睾丸、子宫、肝、肾脏受到一定的 损害【引。 李群伟首次提出d o n 与人类骨关节炎的发病率有关，并已经初步证明了，d o n 在 骨关节炎发病过程中的病因学意义 7 1 。 1 2 4d o n 的细胞毒性 d o n 具有很强的细胞毒性，对原核细胞、真核细胞、植物细胞、肿瘤细胞等均具 有明显的毒性作用。d o n 对原核细胞的毒性作用可能通过三种不同的方式： 1 ) 作用于亚细胞水平； 2 ) 通过与细胞膜相互作用； 3 ) 通过自由基介导的脂质过氧化作用。 d o n 还可作用于骨髓造血干细胞产生细胞毒性。 由于d o n 的细胞毒性，它能使动物脑的神经递质发生改变。p r e l u s k y 等报道，猪 喂给呕吐毒素，能提高脑中5 一羟色胺( s e r o t o n i n ) 和5 羟引哚乙酸( 5 h y d r o x y i n d o l e a c e t i c a c i d ) 的浓度，对脑神经产生麻痹作用。经研究p r e l u s k y 等又进一步证明，即使是低剂 量的d o n 也能引起猪脑中5 羟引哚乙酸水平的提高【9 】。 1 2 5d o n 的皮肤毒性 d o n 可以引起兔、豚鼠、小鼠皮肤红肿、出血、坏死、结痴。病理检查可见表皮 坏死、真皮组织化脓和广泛的细胞坏死，但是d o n 对皮肤的坏死作用比其它的单端孢 霉烯族毒素要小。上野等认为，造成皮肤毒性的机制是血管渗透性的增加，随后造成炎 性反应、水肿、渗出、坏死【7 】。 1 2 6d o n 的遗传毒性 长期摄入被d o n 污染的病麦或粗毒素对动物有一定的毒性，可影响动物的生长、 繁殖率和子代的存活率，甚至可使生长停滞，形成“僵鼠”，并产生对心、肝、肾的伤害， 严重时损害机体造血系统，从而造成死亡。但不同种属、性别的动物对d o n 的敏感程 度不同，猪是最敏感的动物，反刍动物比其它动物受的影响小，奶牛的健康状况、产奶 量、摄食量几乎不受影响，牛奶中也检测不到d o n 及其脱氧产物【1 0 1 。此外，不同性别 对d o n 的敏感度也不同，可能与d o n 在体内的代谢途径和激素的作用有直接关系。 1 2 7d o n 的免疫毒性 研究表明，d o n 可能对免疫系统有影响。d o n 既是一种免疫抑制剂，又是一种 免疫促进剂，其作用与剂量有关。免疫抑制作用表现为d o n 通过其倍半萜烯结构抑制 转录、翻译过程；而免疫促进作用与机体正常免疫调节机制有关。在体内d o n 可以抑 江南大学硕士学位论文 制对病原体的免疫应答，同时又可以诱发自身的免疫反应。d o n 引起实验动物免疫系 统的疾病与人类i g a 肾病极其相似，同时d o n 还可以诱发辅助性t 细胞超诱导产 物一细胞因子的产生，激活巨噬细胞、t 细胞产生炎症前细胞因子【l 。d o n 影响动物 的免疫功能和繁殖功能，同时还能降低血清中i g g 和i g a 水平，使畜禽抵抗力降低， 继发各种疾病。 1 2 8d o n 的三致( 致癌、致畸、致突变) 作用 国内外对此研究结果不太一致，但多数研究结果均表明d o n 具有致畸、胚胎毒性， 可能是一种潜在的致癌物质。 d o n 的诱癌实验尚未成功，国内外也无其致癌作用的明确报道，因此其致癌作用 尚无定论。但流行病学研究发现，d o n 与食管癌的发病率呈正相关f 1 2 1 。 有动物实验表明，长时间小剂量喂食被呕吐毒素污染的饲料，可以诱发不同器官的 肿瘤。i s e r s o n 等进行的d o n 慢性毒性实验发现，实验组动物发生肝癌【1 3 1 。l a m b e rl a 等用大鼠进行了d o n 两阶段皮肤诱癌、促癌实验，结果表明，d o n 不是一种致癌剂 或诱癌剂，但皮肤组织学发现d o n 诱发弥漫性磷状上皮增生【1 4 1 。 v e s e l y 等研究了d o n 对三日龄鸡胚的毒性作用，经8 天孵化后发现d o n 的毒性作 用剂量范围很窄，为l 3m g k g b w ，实验组鸡胚有头部畸形、身体发育畸形，畸形率 明显高于对照组l l 引。 1 3d o n 的污染情况 d o n 广泛存在于自然界中，人类和动物所消费的小麦、玉米、大麦等经常被呕吐 毒素所污染。研究表明，在美国、德国、新西兰、保加利亚、匈牙利、俄国、中国、朝 鲜以及阿根廷6 0 1 0 0 的检测样品被d o n 污，其含量竟高达4 4 0 0p g k g ( 是美国食 品药品监督局制定人类可食量1 0 0 0p g k g 的4 倍) 。在1 9 9 1 年，美国的一项研究显示， 5 0 的样品d o n 含量水平是1 9 0 0g g k g 或是远远高于1 0 0 0i - t g k g1 1 6 j 。此外，呕吐毒素 曾在加拿大和中国引发了两场较大的肠胃疾病风暴【1 7 】。 显而易见，d o n 也会存在于农业加工产品中，例如：面包、啤酒以及饲料等，而 且，这种真菌毒素也可能会引起工作环境污染的问题，在谷物的一些加工过程中( 例如： 研磨、焙烤、酿造) ，呕吐毒素可能会漂浮于空气中，进入呼吸道危害工作人员。 对一些亚洲国家的未加工的农产品和加工过的饲料样品进行检测时发现，中国的饲 料样本中，含有一定量的呕吐毒素，超过7 0 的样本被呕吐毒素污染。 图1 2 为1 9 9 8 - 2 0 0 1 年中国饲料样品中呕吐毒素的平均含量( 单位：g g k g ) 。 2 0 0 0 年的样本中呕吐毒素的最高含量达到4 5 8 2u g k g | 1 8 】。2 0 0 3 年中国配合饲料样 品中呕吐毒素的阳性检出率为1 0 0 ，平均含量为6 0 0u g k g ；据报道，2 0 0 5 年中国饲 料原料的呕吐毒素检出率为1 0 0 ，对人类的健康产生威胁。美国食品及药物管理局 ( f d a ) 规定食物中呕吐毒素的安全标准是1 0 0 0g g k g ，呕吐毒素的含量超过1 0 0 0g g k g 就会对人及一些动物健康产生损害【博】。 4 第一章绪论 2 0 0 1 图1 - 21 9 9 8 2 0 0 1 年中国饲料样品中呕吐毒素的平均含量。 f i g 1 2a n v e r a g ec o n t e n to fd o n i nc h i n e s ef e e d si n19 9 8 - 2 0 01 在欧美等地2 0 多个国家和地区中，d o n 是小麦和玉米等谷物中存在的主要 单端孢霉烯族化合物。在t a b a d a 等收集的来自1 9 个国家5 0 0 份谷物样品中， 有4 5 5 0 随机抽检的样品中均含有d o n 2 叫；t u t e l y a nv a ( 2 0 0 1 ) 在俄罗斯调查的 2 1 6 6 份样品中，d o n 的检出率高达6 9 【2 l j ；2 0 0 0 - 2 0 0 1 年f a o 的统计数据数据显 示，d o n 的污染率小麦为5 7 ，玉米为4 l ，燕麦为6 8 ，大麦为5 9 ，黑麦 为4 9 ，大米为2 1 蜊2 引。在我国相应的调查中发现，各地区谷类食物中d o n 的 污染率均在5 0 以上，并且其污染程度有着明显的地区性差异。 鉴于d o n 对人类和动物的危害，我国要求动物饲料中的d o n 不得超 , d _ 2 0 0 0g g k g ， 而人类消费品中的含量不得超过1 0 0 0g g k g 1 9 j 。美国食品和药品管理局( f d a ) 公布的 小麦及其制品中的d o n 建议含量如下：用于人类消费的麦麸、面粉和胚种中的d o n 限 量为1 0 0 0g g k g ；用于饲养小鸡或年龄大于4 个月的食用牛的谷物及其副产品，d o n 限 量为1 0 0 0 0g g k g ，并建议这些不得超过牛或鸡总食量的5 0 ；用于饲喂猪或其它动物 的谷物及其副产品的d o n 限量为5 0 0 0g g k g ，并且不得超过总食用量的4 0 ( f a d 1 9 9 3 ) 。 1 4d o n 的检测 国际上对呕吐毒素的检测方法研究进展较快。采用薄层色谱法( t l c ) 和高效液相 色谱法( h p l c ) 等检测方法；采用柱净化法结合电子捕获检测器的气相色谱法 ( g c e c d ) ；高效液相结合质谱的方法( h p l c m s ) 、放射性免疫测定法( a ) 【2 3 】： c a s a l e 等则提出了酶联免疫( e l i s a ) 的检测方法【2 4 】。 在国内，魏润蕴等先后报道了采用甲醇水提取，以x a d 4 柱净化，双向展开的 薄层色谱检测方法及气相色谱法【2 5 ，2 6 】；郭玉凤等提出了使用p i b c i 衍生化的液相色谱 检测方法【2 7 】；阳传和等报道了酶联免疫吸附的测定方法【2 8 1 ；张鹏等提出了采用免疫亲和 柱( i a c ) 或多功能净化柱( m f c ) 净化结合高效液相色谱法【2 9 1 。 1 4 1 薄层色谱法( t l c ) o 7 6 5 4 3 2 1 江南大学硕士学位论文 这是g b t 5 0 0 9 1 1 1 - 2 0 0 3 采取的谷物及其制品中呕吐毒素的检测方法，其检测限为 1m g k g 。适用于谷物( 小麦、玉米、大麦等) 及其制品( 蛋糕、饼干、面包等) 和中呕吐 毒素的测定。 谷物及其制品中的呕吐毒素经乙腈水( 8 4 ：1 6v ) 提取、净化、浓缩和硅胶g 薄层展开后，加热薄层板。在制备薄层板时加入三氯化铝，使d o n 在波长3 6 5n l i l 紫外 光下显蓝色荧光，与标准比较。 1 4 2 高效液相色谱法( h p l c ) 样品经乙腈7 j ( ( 8 4 ：1 6 ) 溶液提取，提取液通过m y c o s e p t m2 2 7 2 9 l m u l t i s 矗m2 1 6 柱 净化、浓缩，c 1 8 色谱柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。 d o n 经h p l c 分离后可用荧光检测器( f l u o r e s c e n c e d e t e c t o r ，f l d ) 、紫外检测器 ( u l t r av i o l e td e t e c t o r , u v ) 、二极管阵列检测仪( d i o d ea r r a yd e t e c t o r ，d a d ) 检测。实验 证明，d a d 比f l d 的效果好，不需衍生；d a d 最低检出限比f l d 要低；d a d 检 测比f l d 响应强。2 0 0 1 年m a t e o 使用d a d 的最低检出限可达5u g k g ，而f l d 的 最低检出限为2 5u g k g 3 0 1 。谷物中d o n 的h p l c u v 的最低检出限可达1 0 0 1 6 0 0 u g k g ；h p l c - m s 可达1 2 4 0u g k g ；h p l c - f l d 可达2 0u g k g 。 1 4 3 气相色谱法( g c ) 运用气相色谱检测d o n 需要通过d o n 上的三个羟基使之衍生成为七氟丁酰 ( h e p t a f l u o r o b u t y r y l ，h f b ) 、三氟乙酰( t r i f l u o r o a c e t y l ，t f a ) 或三甲基硅烷( t r i m e t h y l s i l y l ， 刚s ) 化衍生物。 本方法适用于谷物中呕吐毒素含量的测定。用乙腈水( 8 4 ：1 6 ，v ) 提取谷物中的 呕吐毒素，经去脂和经弗罗里硅土柱、s e p - p a k 柱两次柱净化后，用具电子捕获检测器的 气相色谱仪测定呕吐毒素的三甲硅烷衍生物进行定量，用气相色谱质谱定量和确证。 由于d o n 的共轭羰基使它对电子捕获检测器( e c d ) 敏感，因而g c e c d 和 g c m s 被认为是最灵敏的方法，应用g c e c d 最低检出限可达1 0 5 0u g k g ，甚至更 低；用g c m s 的最低检出限则可低达5u g k g 3 1 1 。 1 4 4 酶联免疫吸附测定法 e l i s a 是一种快速检测d o n 的常用方法，具有高选择性、灵敏、快速、方便等 特点。另外，采用e l i s a 检测的样品通常不需要净化，即使要净化也是最低程度的。 e l i s a 的主要缺点是，所用抗体与d o n 的乙酰化类似物的交叉反应致使其检出值偏 高，较易出现假阳性。另外，1 9 9 7 年s c h u h m a c h e r 等的比较研究证实，使用e l i s a 方 法难以在纯有机溶液剂中检测d o n l 3 2 】。我国卫生部建立的d o n 的e l i s a 法最低检 出量为5n g m l ，检测范围为5 1 0 0 0n g m l ，被批准为国家推荐标准检测方法 ( g b t 5 0 0 9 1 11 - 2 0 0 3 ) 1 3 3 1 。要产生用于e l i s a 的高效、特异的单抗或多抗需要一个复 杂的过程。含i g g 或i g y 的单抗或多抗均可用于直接或间接竞争e l i s a l 3 4 】。 6 第一章绪论 1 4 5 目前的各种检测方法的比较 薄层色谱法t l c 虽然操作简便，曾被广泛应用，但是，处理样品时工作量大；在 检测过程中操作人员必须直接接触标准品，危害到操作人员的身体健康，而且本方法在 提取过程中需要使用大量的有机溶剂，这样就会对周围环境产生不利影响；灵敏度差， 提高灵敏度必须改进样品的提取和净化方法，改进和提高薄层色谱分析性能，这样就增 加了劳动强度和检测成本。 高效液相色谱法( h p l c ) 和气相色谱( g c ) 可以精确地对样品中的呕吐毒素进 行定性定量分析。但这两种方法所需色谱仪、检测器等价格昂贵，而且样品前处理比较复 杂，操作时需要专门的技术人员，不便推广应用。另外，它们也不适合大批量样品的快速 检测。 酶联免疫吸附法( e l i s a ) 快速、灵敏、准确、可定量、操作简便、无需贵重仪器 设备，且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，发展非常迅 速。简化了样品预处理和纯化过程。但是由于免疫酶的活性非常不稳定，在应用过程中 很容易受到操作条件的影响，反应试剂需低温保存。在实际操作过程中很难达到这一要 求，使得免疫酶的活性大大降低，从而影响到结果的准确性。应用时还必须通过多次洗 涤，才能使反应产物和游离底物进行分离，影响到结果的重复性，而且检测时间较长， 无法满足现场快速现场检测的要求。 1 5 胶体金免疫检测技术研究进展 1 5 1 胶体金简介 胶体金又称纳米金溶胶，是由氯金酸被还原成原金后形成的金颗粒悬液。纳米金溶 胶颗粒大小多在1 - - 1 0 0n n l ，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体 中，成为纳米金溶胶溶液，纳米金溶胶颗粒由一个基础金核及包围在外的双离子层构成， 紧连在金核表面的是内层负离子，外层离子则分散在纳米金溶胶溶液中，以维持纳米金 溶胶游离于溶胶间的悬液状态。 微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体( 2 5n m ) 是橙黄色的，中等大小的纳米金溶胶( 1 0 , - - , 2 0n m ) 是酒红色的，较大颗粒的纳米金溶 胶( 3 0 - - 8 0n m ) 则是紫红色的。根据这一特点，用肉眼观察纳米金溶胶的颜色可粗略 估计金颗粒的大小。 纳米金溶胶颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的纳米金溶胶颗粒基本是圆 球形的，较大的纳米金溶胶颗粒( 一般只大于3 0a m 以上的) 多呈椭圆形。在电子显微 镜下可观察纳米金溶胶的颗粒形态。 纳米金溶胶在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长( k 觚) 在 5 1 0 - 5 5 0n n l 范围内，随纳米金溶胶颗粒大小而变化，大颗粒纳米金溶胶的k 舣偏向于 长波长，反之，小颗粒纳米金溶胶的k 瓢则偏于短波长【3 5 】。 7 江南大学硕士学位论文 1 5 2 蚋米金溶胶免疫技术的* 起 纳米是一个长度单位。纳米科学史研究纳米尺度范畴内原子、分子和其他类型物质 运动和变化的科学o ”。免疫学分析中常以分散在水中所形成的纳米金溶胶微粒作为载 体。纳米金溶胶是带负电的疏水胶体，具有胶体的一般特性，纳米金溶胶又称胶体金。 它具有特殊的电荷性质，电子分布在特定纳米金溶胶的表面，由于功函数的束缚而不能 逸出，又由于体能态的限制而不能深入内层，形成只能平行于表面方向运动的二维电子 云1 3 6 1 。这是纳米金溶胶颗粒具有表面效应、量子效应和宏观量子隧道效应的物理基础。 由于纳米金溶胶独特的特点，被广泛应用于免疫标记、生物分子识别、d n a 生物传感 器、基因治疗和临床诊断中痕量物质的快速分析等领域p ”。 纳米金溶胶的制各与应用已有很长的研究历史。早在1 8 5 7 年f a r a d a y 首次用还原法 制各出纳米金溶胶，并对其作了系统研究，他发现，在其中加入少量电解质即可使纳米 金溶胶由红色转变成蓝色，至无色并最终产生黑色沉淀，而加入明胶等大分子物质后便 可阻止这种变化发生m l 。这一重大发现为纳米金溶胶的制备与应用提供了研究基础，在 当时立即引起许多技术领域的广泛关注。 1 , 5 3 纳米金溶胶合成及标记技术的简介 纳米金溶胶的合成方法包括物理法和化学合成法 3 9 1 。化学合成能够更好的控制颗粒 大小、形状和粒径分布。纳米金溶胶一般用氯金酸通过化学还原法制备，主要方法包括 柠檬酸钠还原法，硼氢化钠还原法，鞣酸柠檬酸钠还原法，抗坏血酸还原法，白磷还 原法，乙醇还原法等。在还原剂的作用下，氯金酸水溶液中的金离子还原成金原子，并 聚集成一个微小的晶体金核，同时晶核周围吸附一定的氧金酸离子、氢离子和柠檬酸离 子形成吸附层，依靠静电作用形成稳定的胶体溶液删。纳米金溶胶标记特异性抗原或抗 体蛋白后形成纳米金溶胶一蛋白复合物，用于相应抗体或抗原的免疫分析。这种纳米金 溶胶一蛋白复合物又被称为纳米金溶胶探针。稳定灵敏的纳米金溶胶探针制备是免疫分 析成功的关键。目前主要采用直接标记的方法。由于蛋白质分子吸附在金颗粒的表 面，形成一个蛋白层，阻止了纳米金溶胶颗粒的相互接触，从而使纳米金溶胶处于稳 定状态【4 ”。( 如图1 3 ) 结果显示，纳米金溶胶标记对生物活性物质的影响较小，金标探 针仍保持原抗体分子的反应特异性。 叫 u ! ! “ 啄吨s n 图i 3 纳束金溶脏标记抗体 f i g1 3g o l d l a b e da n t i b o d y 8 第一章绪论 纳米金溶胶标记技术( i m m u n o g o l dl a b e l i n gt e c h n i q u e ) 是以纳米金溶胶作为示踪标 记物，应用于抗原一抗体反应的一种新型免疫标记技术。利用它在碱性环境中带负电荷 的性质，与蛋白质分子的正电荷基团借静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，纳米 金溶胶还可与其它多种生物大分子结合。根据纳米金溶胶的一些物理特性( 如高电子密 度、颗粒大小、形状及颜色反应) ，加上结合物所具有的生物学特性，使其在免疫学、 组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用。纳米金溶胶标记蛋白质的 原理，一般认为是由于p h 等于或稍偏碱于蛋白质等电点时，蛋白质呈电中性，此时蛋 白质分子与纳米金溶胶颗粒相互间的静电作用较小，但蛋白质分子的表面张力却最大， 处于一种微弱的水化状态，较易吸附于金颗粒的表面，形成一个蛋白层，阻止了纳米金 溶胶颗粒的相互接触，而使纳米金溶胶处于稳定状态。在低于蛋白质的等电点时，蛋白 质带正电荷，纳米金溶胶带负电荷，两者较易以静电结合形成大的聚合物。在p h 高于 蛋白质等电点时，蛋白质带负电荷，与金颗粒的负电荷相互排斥而不能相互结合。为防 止蛋白质与纳米金溶胶的聚合与沉淀，常用牛血清白蛋白、卵白蛋白、聚乙二醇或明胶 作为稳定剂。用s e p h a c r y bs 4 0 0 ( 丙烯葡聚糖s 4 0 0 ) 层析分离纯化纳米金溶胶蛋白标 记物，只适用于以b s a 作为稳定剂【4 2 1 。 由于胶体金的纳米级尺寸所具有的独特性质，使其在医学领域得到广泛的应用。如 作为标记物应用于分子的电镜和光镜的检测，应用于免疫层析诊断法和快速免疫金渗滤 法等。其中，胶体金免疫结合检测技术被称为四大免疫标记技术之一，问世2 0 多年来 发展十分迅速，在生物医学各研究领域，特别是在医学检验中得到了日益广泛的应用。 纳米金标记抗体的技术在临床检验上已得到广泛和成功的运用，如早早孕( h c g ) 检测试纸，乙肝表面抗原( h b s a g ) 检测试纸。而纳米金技术检测小分子化合物也有成 功的产品，如吗啡纳米金检测试剂盒和瘦肉精纳米金检测试剂盒等。 1 6 本课题的意义及主要研究内容 1 6 1 立题背景及意义 d o n 广泛存在于全球，主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物，也污染粮食制品， 人和动物在误食被该毒素污染的粮谷类后，可以产生广泛的毒性效应。另外，它还常与 其它的霉菌毒素如黄曲霉毒素共同污染农作物，进入人体后可以相互影响，对人类的健 康构成了很大的威胁。为了降低呕吐毒素对人类的危害，各国不断制定尽可能低的食品 中呕吐毒素的限量标准，通过质检机构进行监督实施。采用t l c 检测方法，一直是我 国国标中使用的方法，但是该方法检测灵敏度较低，精确性差，用到大量有害的有机溶 剂，而且要与高浓度的标准品直接接触，不适合大批量样品的快速检测。尽管免疫检测 法和h p l c 方法有良好的灵敏性，但是分析过程较为繁琐，检测时间长，必须借助于 分析仪器，因而，很难满足现场快速检测的要求。 胶体金免疫层析检测技术的兴起，使得检测方法的方便和快速两个优点得以同时实 现。该方法是在酶联免疫法分析的基础上发展起来的一种固相标记免疫检测技术，其特 9 江南大学硕士学位论文 点是简单、快速顺应了快速检测的发展方向、不需任何仪器设备，十几分钟内便可肉眼 观察结果，并且检测成本很低。 国家质检总局将真菌毒素列为检测项目之一，胶体金免疫检测技术的研究，为这 制度的实施提供了良好的技术保障。深入研究纳米金标记技术，研制开发高质量的金标 快速检测产品，不仅可以提高经济效益，并且对降低呕吐毒素的潜在危害，提高粮食以 及食品的储存质量起到不容忽视的作用。 1 6 2 论文主要研究内容 本课题从以下几个方面展开研究： l 利用生物化学合成方法制备呕吐毒素完全抗原，并验证其结构以及免疫原性。 2 利用动物免疫获得抗呕吐毒素多克隆抗体，然后对其纯化以及鉴定。 3 利用免疫标记技术制备呕吐毒素抗体探针，探讨胶体金颗粒与呕吐毒素抗体之间结合 的最佳条件。 4 建立金标免疫检测体系，对相关参数优化，建立最佳的检测条件。 5 金标免疫检测方法的应用，及其与e l i s a 、h p l c 检测方法的比较 1 0 第二章脱氧雪腐镰刀菌烯醇完全抗原的制备与鉴定 第二章脱氧雪腐镰刀菌烯醇完全抗原的制备与鉴定