（无机化学专业论文）基于纳米材料修饰的高灵敏电化学免疫及适体传感器的研究.pdf

_ 多 一上 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 第一章绪论1 1 1 纳米材料：1 1 1 1 纳米材料概述1 1 1 2 纳米材料的分类与特性1 1 1 3 纳米材料在电化学生物传感器方面的应用1 1 2 生物传感器概述3 1 3 电化学生物传感器概述一4 1 3 1 电化学免疫传感器4 1 3 1 1 概述4 1 3 1 2 电流型免疫传感器检测原理4 1 3 1 3 信号增强的电流型免疫传感器的应用4 1 3 2 基于核酸适配体的电化学传感器6 1 3 2 1 适体概述6 1 3 2 2 适体电化学传感器7 1 3 2 3 电化学适体传感器的应用7 1 3 2 4 展望9 1 4 本文研究思路9 第二章基于a u t i 0 2 复合纳米粒子的灵敏癌胚抗原免疫传感器研究1 0 2 1 引言_ 1o 2 2 物质与方法11 2 2 1 试剂1l 2 2 2 仪器1 l 2 2 3 纳米铁氰化镍( n i n p s ) 的制备1 2 2 2 4a i 卜t i 0 2 纳米颗粒的制备1 2 2 2 5 免疫传感器的制备1 3 2 2 6 检测方法1 3 2 3 结果与讨论1 4 2 3 1a u - t i 0 2 纳米颗粒的表面形态分析1 4 2 - 3 2 不同修饰电极的电化学特性表征。1 4 2 - 3 3 实验条件的优化一1 6 2 3 4 免疫传感器的响应性能l7 2 3 4 1 传感器对c e a 抗原响应的循环伏安图和校正曲线1 7 2 3 4 2 传感器的选择性18 2 3 4 3 传感器的再生性和稳定性1 8 2 3 4 4 传感器回收率的测定和实际应用。1 8 2 4 结论1 9 第三章电化学条形码量子点的反胶束合成及其在检测癌标记物方面的应用2 0 3 1 引言。2 0 3 2 实验部分2 0 3 2 1 试剂2 0 3 2 2 仪器2 1 3 2 3 电化学条形码量子点的制备2 1 3 2 4 条形码量子点的电化学解码2 1 3 2 5 用条形码量子点( c d s 1 p b s 1 ) 做标记对c e a 进行检测2 1 3 3 结果与讨论2 2 3 4 结论2 5 第四章基于超灵敏双重信号放大的蛋白质生物检测适体传感器研究2 6 4 1 引言2 6 4 2 实验部分2 6 4 2 1 试剂2 6 4 2 2t b a2 - a l p s w c n t 生物藕合物的制备一2 7 4 2 3 具体实验步骤2 7 4 2 4 电化学检测2 7 4 3 结果与讨论2 8 4 4 结论31 参考文献3 2 作者部分相关论文题录3 9 致谢4 0 两南大学硕十学位论文摘要 基于纳米材料修饰的高灵敏电化学免疫及 适体传感器的研究 无机化学专业硕士研究生张玉勇 指导教师向云教授、柴雅琴教授 摘要 随着纳米技术的发展，由于纳米材料机械的、电的和光的统一特性，如：高的表面体积比、 良好的稳定性、小尺寸效应、较好的生物相容性和强的吸附能力，利用纳米材料来构建电化 学生物传感器已引起了人们广泛的关注。尤其是纳米金、条形码量子点和碳纳米管在生物检 测方面的应用，更是引起了人们的注意。 由于电化学免疫传感器的制备简便，经济，分析时间短，小尺寸和灵敏性好，其已成为 一种强有力的检测蛋白质的工具。适体是人工合成的寡核苷酸，对于各种目标物( 从小分子 到蛋白质大分子) 具有特异性的识别能力。由于适体比常见抗体具有很好的选择性，稳定性 和易识别能力，近年来，适体作为生物检测识别元件已引起了人们的广泛关注。 1 基于a u t i 0 2 复合纳米粒子灵敏检测癌胚抗原免疫传感器的研究 我们合成了一种新型的a u - t i 0 2 纳米颗粒，并用其构建了一种检测癌胚抗原( c e a ) 的免标 记电流型免疫传感器。球形的a u - t i 0 2 纳米颗粒对生物分子的固定提供了良好的微环境，提高 了蛋白质的表面覆盖度，而且具有大的表面体积比、良好的成膜能力、很好的稳定性，并且 合成过程简便、快速。电化学免疫传感器的制备过程用循环伏安技术( c v ) 和交流阻抗技术 ( e i s ) 进行了表征。并对a u t i 0 2 纳米颗粒进行了透射电子显微镜( t e m ) 表征。利用a u - t i 0 2 纳米颗粒构建的电化学生物传感器表现出了良好的性能：灵敏度高、检测限低、检测速度快 等。 2 电化学条形码量子点的反胶束合成及其在检测癌标记物方面的应用 用反胶束法合成了具有生物功能的电化学条形码量子点( q d ) 。该方法使得编码元素z n 2 + ， c d 2 + 和p b 2 + 限制在了单个量子点之内，有效地避免了其他方法合成条形码量子点时出现的胶束 现象。z n 2 + ，c d 2 + 和p b 2 + 的独特的电位，再加上其电流强度可以控制，为制备的电化学量子点 提供了良好的编码能力。另外，为了使合成的量子点用于生物医学方面的研究，在制备量子 点的同时，用有机物对量子点表面进一步进行了功能化。为证明合成的条形码量子点在生物 两南大学硕+ 学何论文摘要 检测方面的应用，用条形码量子点作为标记物对癌胚抗原( c e a ) 进行检测。新合成的条形码 量子点在生物检测、信息加密和产物示踪等方面有望得到应用。 3 基于超灵敏双信号放大的蛋白质生物检测适体传感器的研究 通过双信号放大策略我们构建了一种检测蛋白质的超灵敏电子适配体传感器。目标物凝 血酶被夹心在“电极表面的适体”和“适体一酶碳纳米管藕合物”之间，再加上多酶之间的 氧化还原反应产生的生物催化电信号，使得分析信号进一步增强。用该方法进行信号放大的 适体传感器的检测限为8 3f m o l l ，与常见的单酶标记检测凝血酶的方法相比较，本方法的灵 敏度提高了四个数量级。所以，我们的方法有望替代以p c r 为基础的信号放大方法对蛋白质 进行超低量检测。 ， 气关键词：电化学纳米材料免疫传感器适体传感器蛋白质信号放大 i l j 飞 a p p l i c a t i o n sa r eg o l dn a n o p a r t i c l e s ，b a r c o d eq u a n t u md o t ( q d ) n a n o p a r t i c l e sa n dc a r b o nn a n o t u b e s ( c n t s ) e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o r sh a v eb e c o m eap o w e r f u lt o o l sd e s i g n e dt od e t e c tt h ep r o t e i n , d u et ot h e i ra d v a n t a g e ss u c ha ss i m p l ep r e p a r a t i o n , l o wc o s t , f a s ta n a l y t i c a lt i m e ，s m a l ls i z ea n d s e n s i t i v ep l a t f o r m a p t a r n e r sa r es y n t h e t i co l i g o n u c l e o t i d e s ，w h i c hp o s s e s ss p e c i f i cr e c o g n i t i o n a b i l i t i e st ov a r i o u st a r g e t sr a n g i n gf r o ms m a l lm o l e c u l e st ol a r g ep r o t e i n s b e c a u s eo ft h e i rh i 曲 s e l e c t i v i t y , s t a b i l i t y , a n de a s yr e g e n e r a t i o nc a p a b i l i t i e so v e rt r a d i t i o n a la n t i b o d i e s a p t a m e r s 嬲 r e c o g n i t i o ne l e m e n t si sw i d e l ya t t r a c t e di nb i o a p p l i c a t i o n sb yr e s e a r c h e r s p a r t1s e n s i t i v el a b e l - f r e ei m m u n o a s s a yo fe a r e i n o e m b r y o n i ea n t i g e nb a s e do i la u - t i o z h y b r i dn a n o e o m p o s i t er a m i nt h i sp a p e r , an e wn a n o s t r u c t u r e da u - t i 0 2p a r t i c l ew a ss y n t h e s i z e da n de m p l o y e df o rt h e c o n s t r u c t i o no fal a b e l f r e ea m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rf o rc a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) d e t e r m i n a t i o n t h es p h e r i c a la 洲0 2n a n o p a r t i c l e sp r o v i d e dag o o dm i c r o e n v i r o n m e n tf o rt h e i m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s ，e n h a n c e dt h es u r f a c ec o v e r a g eo f p r o t e i n , h a dl a r g e s u r f a c e - t o v o l u m er a t i o ，f i l m - f o r m i n ga b i l i t ya n dh i g hs t a b i l i t y t h ea u - t i 0 2n a n o p a r t i c l e sw e r e c h a r a c t e r i z e db yt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) t h ef a b r i c a t i o n p r o c e s s o ft h e e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o s e n s o rw a sm o n i t o r e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n de l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) t e c h n i q u e s p a r t2r e v e r s e - m i c e l l es y n t h e s i so fe l e c t r o c h e m i c a l l ye n c o d e dq u a n t u md o tb a r e o d e s ： a p p l i c a t i o nt oe l e c t r o n i cc o d i n go fa c a n c e rm a r k e r i i i - ， c d 2 + a n dp b 2 + a td i s t i n g u i s h a b l ep o t e n t i a l sw i t hc o n t r o l l a b l ec u r r e n ti n t e n s i t i e so f f e re x c e l l e n t e n c o d i n gc a p a b i l i t yf o rt h e p r o p o s e de l e c t r o c h e m i c a l ( e c ) q d s a d d i t i o n a l l y , t h es i m u l t a n e o u s m o d i f i c a t i o no ft h eq db a r c o d es u r f a c ew i t ho r g a n i ci i g a n d sd u r i n gt h ep r e p a r a t i o np r o c e s sm a k e t h e mp o t e n t i a l l yu s e f u li nb i o m e d i c a lr e s e a r c h f o rp r o o fo fc o n c e p to ft h e i ra p p l i c a t i o ni nb i o a s s a y s ， t h ee cb a r c o d e dq d sw e r ef u r t h e re m p l o y e d 雏t a g sf o ra ni m m u n o a s s a yo fac a n c g rm a r k e r , c a r c i n o e m b r y o n i ca n t i g e n ( c e a ) t h es y n t h e s i z e de cb a r c o d eh y b r i dq d sh o l dc o n s i d e r a b l e p o t e n t i a li nb i o d e t e c t i o n , e n c r y p t e di n f o r m a t i o n , a n dp r o d u c tt r a c k i n g p a r t3u l t r a s e n s i t i v ea p t a m e r - b a s e dp r o t e i nd e t e c t i o nv i aad u a la m p l i f i e db i o c a t a l y t i cs t r a t e g y w ep r e s e n ta nu l t r a s e n s i t i v ea p t a s e n s o rf o rt h ee l e c t r o n i cm o n i t o r i n go fp r o t e i n st h r o u g had u a l a m p l i f i e ds t r a t e g yi nt h i sp a p e r t h et a r g e tp r o t e i nt h r o m b i ni ss a n d w i c h e db e t w e e na ne l e c t r o d e s u r f a c ec o n f i n e da p t a m e ra n da na p t a m e r - - e n z y m e - c a r b o nn a n o t u b eb i o c o n j u g a t e t h ea n a l y t i c a l s i g n a la m p l i f i c a t i o ni s a c h i e v e db yc o u p l i n gt h es i g n a la m p l i f i c a t i o nn a t u r eo fm u l t i p l ee n z y m e s w i t ht h eb i o c a t a l y t i cs i g n a le n h a n c e m e n to fr e d o x - r e e y c l i n g o u rn o v e ld r a m a t i cs i g n a la m p l i f i c a t i o n s t r a t e g y , w i t had e t e c t i o nl i m i to f8 3f m ，s h o w sa b o u t4o r d e r so fm a g n i t u d ei m p r o v e m e n ti nt h e s e n s i t i v i t yf o rt h r o m b i nd e t e c t i o nc o m p a r e dt o o t h e ru n i v e r s a ls i n g l ee n z y m e - b a s e da s s a y t h i s m a k e so u ra p p r o a c ha na t t r a c t i v ea l t e r n a t i v et oo t h e rc o m m o np c r - b a s e ds i g n a la m p l i f i c a t i o ni n u l t r a l o wl e v e lo fp r o t e i nd e t e c t i o n k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i s t r y ；n a n o m a t e r i a l s ；i m m u n o s e n s o r ；a p t a s e n s o r ；p r o t e i n ； s i g n a la m p l i f i c a t i o n i v 在新材料、信息、能源、医学、生物等各个领域。 1 1 2 纳米材料的分类与特性 根据不同的分类标准，纳米材料有不同的分类方法：按三维空间维数可分为 三类：零维、一维、二维纳米材料。根据组成相的数目可以分为纳米相材料和纳米 复合材料，由单相纳米颗粒组成的固体称为纳米相材料；由两相或多相构成，其 中至少有一相为纳米级的固体材料，称为纳米复合材料。 由于纳米材料的表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应 和介电限域效应，导致了纳米材料在光学、电学、力学、热学及磁学等方面与常 见的宏观材料相比较，具有其独特的性质，如良好的生物相容性、大的比表面积、 强电子传输能力、高效催化能力等。 1 1 3 纳米材料在电化学生物传感器方面的应用 由于纳米材料具有良好的稳定性、生物相容性、较大的比表面积、较强的吸 附能力和表面易于功能化等优点，利用纳米材料来构建高灵敏或超灵敏的电化学 生物传感器，来实现对重大疾病标志物的快速、灵敏的检测，已引起了科研工作 者的广泛关注。 j u nw a n g 等【1 】制备了聚鸟嘌呤( p o l y g 】) 功能化二氧化硅纳米颗粒( s i l i c a n p ) ， 并用其作为生物标记物，构建了高灵敏的电化学免疫传感器( 图1 1 ) 。与其他方 法相比，二氧化硅纳米颗粒易于修饰，而且非常稳定，通过对g 的电化学催化氧 化，放大了分析信号。 j ：隧? f i g 1 1e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y b a s e do np o l y l q - f u n c t i o n a l i z e ds i l i c an p so nac a r b o n e l e c t r o d e t h ed i a m o n dr e p r e s e n t sm o u s el g g t h e “y ”s h a p er e p r e s e n t sm o u s ea n t i b o d y , a n d t h er e ds t r i n g sr e p r e s e n tp o l y i g 】f r o mr e f 【1 1 ，c o p y r i g h t2 0 0 6w i l e y x i n a iz h a n g 等【2 】制备了“植物凝集素纳米金硫堇”纳米复合物作为标记，进 行信号放大( 图1 2 ) 。用来检测人的肺、肝脏和唾液中甘露糖和唾液酸的含量。 结果发现，甘露糖在正常人和癌症患者体中的含量几乎是一样的；而唾液酸的含 量，癌症患者比正常人的含量高出很多。所以，唾液酸可作为癌症的一种标志物。 园手幽誊逛蕾睾斟 鼬c t r o c h 嘲le i m e t r o d o l l e p o l t i o n g m t i v a t l o n 隆攀期 f i g 1 2t h ei l l u s t r a t i o no f t h ei e c t i n b a s e db i o s e n s o rf o re l e c t r o c h e m i c a la n a l y s i so fg l y c a n e x p r e s s i o no nl i v i n gc e l l sf r o mr e f 【2 】，c o p y r i g h t2 0 1 0a c s w | e ic h e n g 等t 3 】利用滚环放大( r c a ) 技术和寡核苷酸功能化的量子点( q d s ) ， 通过b i o t i n - s t r e p a v i d i n 的特异性结合，提出了一种超低浓度检测蛋白质目标物的串 联式信号放大策略( 图1 3 ) ，实现对蛋白质的检测。该串联序列可重复性地把量子 点组装到模板上，使每个蛋白质识别元件上连有多个量子点，从而达到信号放大 目的。 2 靠誓 虢霄赫案d 两南人学硕士学伊论文 第一章 陪h 苦b 毒 f i g 1 3s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ec a s c a d es i g n a la m p l i f i c a t i o ns t r a t e g yf o rp r o t e i n d e t e c t i o nf r o mr e f 1 3 1 ，c o p y r i g h t2 0 1 0a c s w e n j u a nl i 等【4 】利用碳纳米管( c n t s ) 、核壳型的有机硅壳聚糖纳米球和铂纳 米簇三种纳米材料构建了无试剂型的电化学免疫传感器( 图1 4 ) 。铂纳米簇的存在， 有利于传感器传递电子，同时使得传感器界面具有良好的生物相容性和大的表面 自由能，易于吸附第一层葡萄糖氧化酶。在传感器的构建过程中，示踪剂双层葡 萄糖氧化酶的引入，避免了媒介体分子对传感器的污染。该传感器对c a l 5 3 的检 测范围为0 1 1 6 0u m l 。 吾一熹垒燃音警降鱼糊e 磊溷脯赢萧磊磊舷= ：二= 潮i 磊夏一_ 驻= 一，二二弦翻 膏豢谚蔑务蒋嚷 弋矿畿黧幡鬻磊蔽一嵫警乏翻 y _ _ - _ _ _ - - - - - - - - - _ _ _ 。 ) “i , z k l s - $ 拦篷邋古鍪连 f i g 1 4i l l u s t r a t i o no ft h ep r e p a r a t i o np r o c e s so fm o d i f i e de l e c t r o d ef r o mr e f 【4 l ，c o p y r i g h t 2 0 1 0e l s e v i e rb v 1 2 生物传感器概述 “生物传感器是一种精致的分析器件，它结合一种生物的或生物衍生的敏感 元件与一只理化换能器，能够产生间断或连续的数字电信号，信号强度与被分析 物成比例。”这是t u r n e r 教授对生物传感器所做的定义，这种说法如今已被科技 工作者广泛接受1 5 j 。生物传感器由两部分组成：生物识别元件( 感受器) 和信号转换 器( 换能器) ；感受器包括抗原( 或抗体) 、酶、细胞、微生物、细胞器、d n a 、动 植物组织切片等具有分子识别能力的生物活性物质，换能器即基础电极或内敏感 器，是一个电化学或光化学检测元件1 6 j 。其检测原理如图1 5 所示。 两南大学硕十学位论文第一章 曼；物识别元件信号转换器 酶电化学测量装置 组织热敏电阻器 细胞 f e m s f e t 抗体光敏二板管 核酸光纤 激素 压电元件 f i g 1 5s c h e m eo fb i o s e n s o r s 1 3 电化学生物传感器概述 自从1 9 6 7 年u p d i k e 制成了第一支葡萄糖传感器以来，电化学生物传感器便 为人们所熟知，随着生物、化学、医学、物理电子等相关学科的迅猛发展，以及 生物技术和传感技术的逐渐成熟，具有检测快速、方便、价廉的电化学生物传感 器也得到了迅速发展【7 】o 1 3 1 电化学免疫传感器 1 3 1 1 概述 与测定抗原、抗体反应有关的电化学传感器称为电化学免疫传感器。其原理 是检测通过生成的免疫复合物引起电化学信号变化的免疫分析方法；由于抗原和 抗体的特异性反应，免疫传感器较其他生物和化学传感器有更好的灵敏性、专一 性和选择性，是生物传感器中较为成熟、应用最为广泛的一种传感器【8 1 。根据产生 电化学信号的不同，电化学免疫传感器可以分为：电位型免疫传感器、电流型免 疫传感器、电导型免疫传感器、电容型免疫传感器和阻抗型免疫传感器 9 1 。 1 3 1 2 电流型免疫传感器检测原理 电流型免疫传感器的测定是在恒定电压下，由于抗原、抗体特异性反应引起 了电流信号的变化，通过电流信号与待测样品中抗原的特定关系，来实现对抗原 浓度的检测，通常有直接法和间接法，现在人们普遍运用间接法进行检测。间接 法的主要检测原理如下：人们运用特殊的方法把抗体固定在电极表面上，而后与 对应的抗原进行反应，再与酶( 或者是具有电活性的物质) 标记的信号抗体反应， 根据电流信号的变化，就可测得抗原浓度的大小。 1 3 1 3 信号增强的电流型免疫传感器的应用 随着经济的发展，人们的生活水平越来越高，但是，人们的健康问题却令人 西南大学硕十学位论文第一章 担忧，许多新型疾病越来越多，在发病早期常无明显症状，难发现，不易检测， 往往导致患者错过最佳治疗时机。所以人们对痕量、快速、准确检测疾病的要求 越来越迫切。因此，具有高灵敏度信号增强的电化学免疫传感器成为人们关注的 焦点，接下来介绍几种电化学响应信号增强的电流型免疫传感器。 y u nx i a n g 等【1 0 运用层层自组装技术，在单壁碳纳米管( s w c n t ) 上修饰了 多层碱性磷酸酯酶，最终制备成了“s i g n a la n t i c e a e n z y m e l b l s w c n t 生物藕 合物( 图1 6 ) 。该藕合物与固载在电极表面的固定抗体、抗原形成了夹心型的电流 型免疫传感器。碳纳米管上的多酶，加上酶产物发生的氧化还原循环反应( 在心 肌黄酶与辅酶的协同作用下进行) ，形成了超灵敏双信号放大策略，大大降低了检 测限，利用该方法检测癌胚抗原的检测限为o 0 4p e d m l 。 o 苦毒告 b c m 棚目慨 b i o ) - c 删o n j u g 咖a t e sl 瓤 i 满i 。 f i g 1 6s c h e m a t i c i l l u s t r a t i o no ft h ed u a la m p l i f i e dp r o t o c o lf o ru l t r a s e n s i t i v ec e ad e t e c t i o n f r o mr e f 【l o l ，c o p y r i g h t2 0 1 0e l s e v i e rb v 固 7 a 一 b t 一， k 誉 y 峡 g r a p h e n e s h e e t i nc h t t o u na b , 乒pa b 州r p o磷 c a d ) o n s p h e r e 囊如羽r p 啪内呻s p h e r e f i g 1 7 s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f t h ed e t e c t i o n p r i n c i p l e s o fh r p - a b 2 a f p a b l g s - c h i s p c e ( a ) a n dh r p - a b 2 - c n s s a f p i a b l l g s - c h i s p c e ( b ) u s i n gas i g n a la m p l i f i c a t i o n s t r a t e g ya tt h eg r a p h e n es h e e t ss e n s o rp l a t f o r mf r o mr e f 1 1 1 ，c o p y r i g h t2 0 1 0a c s 甾喾 两南大学硕士学何论文第一章 d a nd u 等【l l 】用功能化的碳纳米球作为载体( 用辣根过氧化物酶和二抗作标记 物) 和石墨烯构建了灵敏检测甲胎蛋白( a f p ) 的电流型电化学免疫传感器( 图1 7 ) 。 该生物传感器有双重信号放大策略：( 1 ) 新合成的碳纳米球具有质地均匀、尺寸 小的特点，在一个碳纳米球表面能同时结合多个h r p a b 2 生物藕合物；( 2 ) 功能 化石墨烯的运用，大大增强了生物传感器的表面积，从而提高了一抗的固载量。 运用多酶标记和石墨烯的双信号放大策略与常规的单酶标记方法相比，检测信号 提高了七倍。 t h a n g a v e l us e l v a r a j u 等【1 2 j 用磁珠和纳米金作催化剂制成了超灵敏的电化学免 疫传感器( 如图1 8 ) 。a n t i i g g - m b 和a n t i i g g - a u 两种生物藕合物与目标物i g g 形 成了夹心型免疫复合物。该夹心复合物在外界磁铁的作用下，被牢牢地固定在修 饰有二茂铁基的i t o 电极上，在n a b i - h 存在下，纳米金把对硝基苯酚( p - n p ) 催化 还原成了对氨基苯酚( p a p ) 。对氨基苯酚在二茂铁基存在下又被氧化成了对醌亚 胺( p q i ) 。氧化产物p q i x 被n a b h 4 还原回p a p 。该氧化还原循环反应大大地放 大了电化学信号。该免疫传感器的检测限达到了1f g m l 。 f i g 1 8 ( a ) s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t h ep r e p a r a t i o no fa nf c d - m o d i f i e de l e c t r o d e ( b ) s c h e m a t i cv i e wo ft h ep r e p a r a t i o no fa ni m m u n o s e n s i n gc o m p l e x ( c ) s c h e m a t i cv i e wo ft h e a t t r a c t i o no ft h ei m m u n o s e n s i n gc o m p l e xt oa nf c - d m o d i f i e di t oe l e c t r o d ea n dt h e e l e c t r o c h e m i c a ld e t e c t i o no fm o u s ei g gf r o mr e l 【1 2 1 ，c o p y r i g h t2 0 0 8e l s e v i e rb v 1 3 2 基于核酸适配体的电化学传感器 1 3 2 1 适体概述 核酸适配体( a p t a m e r ) 是一段由2 5 8 0 个碱基组成的单链寡核苷酸片段，可以 是r n a ，也可以是d n a 。它是通过一种新的体外筛选技术一指数富集配体系统进 化( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no fl i g a n d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n t , s e l e x ) ，从人工构 建的随机单链寡核苷酸文库里筛选得来的，核酸适配体可以特异性地结合如蛋白 质、氨基酸、有机染料、肽类、无机离子或整个细胞等【1 3 1 。 6 两南大学硕十学位论文 第一苹 由于适体的发现，与适体有关的技术在科技界也受到了日益强烈的关注。适 体之所以能够在短时间内成为引入注目的分子诊断工具，是由其自身如下特点决 定的：( 1 ) 化学稳定性好；( 2 ) 分子所占空间小，便于构建传感器；( 3 ) 配体范围 广，可与适体进行结合的，既有小分子( 如金属离子、抗生素、氨基酸等) ，又 有大分子( 如蛋白质、酶、核酸、抗体等) ，甚至细胞；( 4 ) 相对于抗体来说，具 有更强的特异性和亲和性；( 5 ) 许多适体与目标物结合时，会发生结构的变化。 1 3 2 2 适体电化学传感器 根据检测信号的不同，电化学适体传感器可分为电压型、电流型和阻抗型三 种适体传感器。其中，电流型电化学适体传感器由于其检测灵敏度高、特异性好、 操作方便等特点，越来越受到人们的重视。根据适体是否被标记，又可分为标记 型和非标记型电化学适体传感器。标记型电化学适体传感器又可分为如下三类：( 1 ) 电活性物质( m b 、f c 等) 做标记的适体传感器；( 2 ) 纳米粒子( n a n o p t 、l l a n o a u 、 q d s 等) 做标记的适体传感器；( 3 ) 酶( h r p 、g o d 、a l p 等) 做标记的适体传感 器。把标记过的适体，运用适当的方法固定在电极表面，再运用电化学方法，通 过检测修饰物或其催化底物的电流信号，来实现对目标物的检测。 1 3 2 3 电化学适体传感器的应用 x i a o q i n gq i a l l 等【1 4 】报道了一种策略，该实验以适体一纳米粒子为标记，溶菌酶 和三磷酸腺苷( a r p ) 为目标模型分子，同时检测蛋白质和生物小分子( 如图1 9 ) 。 在灵敏的电极表面，引入目标物之后，从d n a 双链体释放出了适体链，接着，填 充用不同量子点标记过的适体与形成的单链d n a 进行杂化反应。酸溶解标记后的 量子点，在不同的电位产生不同的电信号，信号的大小对应于溶菌酶和三磷酸腺 苷浓度的大小。 。售三啦 嘲n 州瞄叠；墨，￥”， - _ _ _ _ _ _ 。_ i h h w # 孵 ? 荫c n 伊 l 殳一 ，v eo f i g 1 9s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no f t h ea p t a m e r n a n o p a r t i c l e b a s e db a c k - f i l l i n gp r o t o c o lf o r o n e s p o ts i m u l t a n e o u se l e c t r o n i cd e t e c t i o no fl y s o z y m ea n da t pf r o mr e f 【1 4 ，c o p y r i g h t 2 0 1 0w i l e y 7 西南大学硕+ 学位论文第一章 c a i f e n gd i n g 等【l5 j 以磁珠作分离工具，高亲和性的d n a 适配体作为生物识别 元件，用电化学和电致发光两种方法对细胞进行了检测( 图1 1 0 是其中的电化学 检测方法) 。他们把纳米金用适体和量子点c d s 功能化之后，用来作为标记进行电 信号的放大。用阳极溶出伏安法分析c d s 溶解后释放出来的c d 2 + 浓度，从而得到 待测目标物的浓度。 ：出一啪三誓。： o 二二- ”口二0 q n m “善o 譬一粘 粹：垒势 。一。肼垡删 “锄”w ”i l l d 二，埘ih 一_ h 州i 1 - f i g 1 1 0a s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no fa ) t h ep r e p a r a t i o no ft h em b - a u - - c d sb i o c o m p l e xa n db ) t h ee l e c t r o c h e m i c a ld e t e r m i n a t i o no fc a n c e rc e i l sf r o mr e f 1 1 5 1 ，c o p y r i g h t2 0 1 0w i l e y f i g 1 1 1s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no ft h ep r o t o c o lf o rm u l t i p l e x e dd e t e r m i n a t i o no ft h r o m b i na n d a t pf r o mr e f 1 1 6 c o p y r i g h t2 0 1 1e l s e v i e rb v y u nx i a n g 等u6 j 构建了同时检测蛋白质与小分子的无试剂型、灵敏、多组分同 时检测适配体生物传感器( 如图1 1 1 ) 。实验将d n a 链自组装到纳米金修饰的印 刷电极( s p c e ) 表面；