（分析化学专业论文）茶叶1hnmr指纹图谱双指标序列分析及其叶表皮微形态特征的研究.pdf

山东大掌硕士掌位论文 摘要 茶作为健康饮料风靡世界，已成为世界三大饮料之一具有止渴生津， 利尿解毒，清目醒脑，杀菌消炎，抗癌降脂等功效，其保健作用和药效机 理早已引起广大科学工作者的关注和研究，目前的研究主要集中在对茶叶 的某些化学成分的分析和测定上，难以全面系统地评价茶的内在协同作用 的质量、疗效和稳定性。因此，从整体上综合分析茶的质量已经成为必然 的发展趋势。 茶叶是一种天然药物和饮品，所含成分是多样的和复杂的，难以弄清 其全部成分，若仅以已知的某一种或某几种活性成分或有效成分作为控制 质量的指标是远远不够的。随着现代分析技术的发展而诞生的指纹图谱技 术，可以反映天然药物的整体成分信息，不局限于某一成分的含量多少， 被认为是天然药物质量控制走上现代化的标志。整体性和模糊性是天然药 物指纹图谱的基本属性。本论文中1 h n m r 指纹图谱共有峰率和变异峰率 双指标序列分析法利用茶叶自身的信息建立的多指标空间，提高了分析方 法的分辨率，建立了比较科学合理的多鉴别方法，它不但可以反映被鉴别 物质的整体性，又能够反映其个体差异，具有较高的可靠性，它为全面系 统地解决茶叶种类的区分、药效与质量相关性等问题提供了一种方法。 本论文的研究共分为四部分： 论文的第一部分概述了研究茶的重要意义；说明了应用共有峰率和变 异峰率双指标序列分析法研究1 h n m r 指纹图谱在种类区分、质量控制方 面的先进性及应用s e m 观察植物叶表皮微形态特征对品种的分类的鉴别 作用。 论文的第二部分首先说明了选择绿茶和红茶作为研究对象的原因：其 次确定了提取条件：茶叶在室温下超声提取时，用6 0 的乙醇溶液提取 4 5 m i n 为最佳反应浓度和最佳提取时间；最后制备所有样品提取物。 山东大掌硕士掌位论文 论文的第三部分论述了1 h n m r 具有指纹图谱特点及图谱与茶叶品种 之间存在着良好的对应关系，非常适用于品种鉴别和化学成分研究。采用 共有峰率和变异峰率双指标序列分析法分析茶叶样品的1 h n m r 指纹图 谱，从茶叶样品间的相似关系的差异对茶叶的种类进行区分。得出：6 值 在8 6 5 p p m - 4 9 7 p p m 的区间内，无论是以龙井茶为参照样本，还是以其它 绿茶或红茶为参照样本，都能够清楚地看出与其自身品质最相近的就是其 同品种的茶类：同时，还可以看出龙井样品与绿茶始终有着较高的相似度， 但无论龙井还是绿茶都与红茶类的相似度极低，因此可以在整体和局部上 对它们进行区分，龙井茶是绿茶中的一种著名品牌，绿茶与红茶是不同品 种的茶。本文也研究了一种日本绿茶，完全能够从中国绿茶中区分出来。 在1 h n m r 指纹图谱中只有某些化学位移区间可以较好地反映不同茶叶的 品种的品质差异。但当以每一种绿茶为参考样品时，却能始终保持与绿茶 类的相似比例最高，说明在整个区间内鉴别出绿茶、红茶为不同种类的茶 是可行的。 论文的第四部分利用s e m 观察技术对茶叶的叶表皮特征进行研究， 可以观察到：龙井、绿茶的叶表皮较平滑柔顺，不规则隆起延伸，有气孔 器，密度不一，但龙井的叶表面气孔内缘多紧缩或呈平裂状，其余绿茶的 叶表面气孔内缘大多呈两头尖的核状或椭圆状：而红茶的角质膜粗糙，有 凸起发泡状，有气孔器，密度不一，但气孔多平裂且内缘多皲裂状，由此 可将其种类大体分开。由于植物叶表皮特征的多样性曾用在种间，属间的 分类和系统演化关系的探讨方面，具有一定的分类价值，所以为鉴别茶叶 的种类提供了一份新的有价值的佐证。 本论文的主要特点和创新点 1 采用共有峰率和变异峰率双指标序列分析法分析茶叶样品的h n m r 指 纹图谱，不但可以反映被鉴别物质的整体性，又能够反映其个体差异， 具有较高的可靠性。 山东大掌硕士学位论文 2 利用s e m 观察技术研究茶的叶表皮特征，为种类鉴别提供了科学依据， 说明这种方法对茶的分类具有一定的参考价值。结合以上的分析，结 果更具有说服力。 关键词：茶；叶表皮；氢谱指纹图谱：共有峰率：变异峰率：双指标序 列分析法：扫描电镜 山东大掌硕士掌位论文 a b s t r a c t a sak i n do fh e a l t h yb e v e r a g ea n df a s h i o n a b l et h ew o r l d ，t e ai so n eo ft h e t h r e em o s ti m p o r t a n tb e v e r a g e si nt h ew o r l d t e ah a sm a n yf u n c t i o n s ，s u c h a sp r o m o t i n gf l u i dr e l i e v i n gt h i r s t ，d i u r e s i s ，r e m o v i n gt o x i n ，a n t i b a c t e r i a l ， a n t i c a n c e ra n dl i p i d l o w e r i n g i t sh e a l t hf u n c t i o na n dm e d i c a lm e c h a n i s m h a v ea t t r a c t e dm a n ys c i e n t i s t s a t t e n t i o n c u r r e n ts t u d i e so ft e aa r em o s t l y t a r g e t e dc h e m i c a lc o m p o n e n t sa n a l y s e sa n dd e t e r m i n a t i o n s t h er e s u l t sc a n n o tr e f l e c tt h ei n h e r e n tc o o p e r a t i o n ，e f f i c a c ya n ds t a b i l i t yo ft e a t h e r e f o r e ， a n a l y s i so fc o m p r e h e n s i v eq u a l i t yo ft e ai st h ei n e v i t a b l et e n d e n c yi nt h e m o d e m s o c i e t y i ti sd i f f i c u l tt om a k ec l e a ra l lt h ec o m p l i c a t e di n g r e d i e n t so ft h et e a i fo n l yt a k i n gac e r t a i no rs e v e r a la c t i v e ( e f f e c t i v e ) i n g r e d i e n t sa s q u a l i t y c o n t r o l l i n gi n d e x ，i ti sn o te n o u g h f i n g e r p r i n ts p e c t r at e c h n i q u ed e p e n d so n t h ed e v e l o p m e n to ft h em o d e ma n a l y s i s t e c h n o l o g y i tr e f l e c t st h ew h o l e c o m p o n e n t si n f o r m a t i o no ft h en a t u r a ld r u g sb u tn o tc o n f i n e st ot h ec o n t e n to f ac e r t a i ni n g r e d i e n ta n di sc o n s i d e r e dt ob et h es y m b o lo fm o d e r n i z a t i o n o fq u a l i t yc o n t r o lo fn a t u r a ld r u g s ，i n t e g r i t ya n df u z z i n e s sa r et h eb a s i c c h a r a c t e r so ft h ef i n g e r p r i n t s p e c t r ao fn a t u r a ld r u g s 1h n m rf i n g e r p r i n t s p e c t r ai si n v e s t i g a t e db yd u a l i n d e xs e q u e n c ea n a l y s i sm e t h o do fc o m m o n a n dv a r i a n tp e a kr a t i oi nt h i st h e s i s ，u s i n gt h ei n f o r m a t i o no ft h et e at ob u i l d m u l t i v a r i a t es p a c ea n dt oi m p r o v er e s o l u t io n so fa n a l y t i c a lm e t h o da n dt os e t u ps c i e n t i f i c a n dr e a s o n a b l em u l t i i d e n t i f i c a t i o n m e t h o d ，i tr e f l e c t st h e i n t e g r i t ya n di n d i v i d u a ld i f f e r e n c eo fs a m p l e sa n dt h e r e f o r ei t i s h i g h i v 山东大掌硕士掌位论文 r e l i a b i l i t y t h i sm e t h o dc a ns y s t e m a t i c a l l ys o l v ed i s c r i m i n a t et h eg e n u so ft e a ， e f f i c i e n c ya n dq u a l i t yo fd r u g sa n d s oo n t h et h e s i sc o n s i s t so ff o u rp a r t s ： t h ef i r s ts e c t i o ni n t r o d u c e st h ei m p o r t a n c eo ft h es t u d yo ft e a ，a n d e x p l a i n st h ea d v a n c e m e n to fd u a l i n d e xs e q u e n c ea n a l y s i sm e t h o do fc o m m o n a n dv a r i a n tp e a kr a t i os t u d yo n1 h n m r f i n g e r p r i n ts p e c t r ai nd i s c r i m i n a t et h e g e n u so ft e aa n dt h eq u a l i t yc o n t r o la n dd i f f e r e n t i a t i n gf u n c t i o nb yu s i n gs e m i nt h eo b s e r v a t i o no fl e a fe p i d e r m a lc h a r a c t e r st oc l a s s i f i c a t i o no ft h eg e n u s t h es e c o n ds e c t i o ne x p l a i n st h er e a s o nw h yc h o o s eg r e e nt e a a n db l a c k t e at os t u d ya n dt h ed i s t i l l i n gc o n d i t i o n ：u n d e rr o o mt e m p e r a t u r ew h e nd i s t i l l b ys u p e r s o n i cw i t h6 0 e t h a n o lf o r4 5m i n u t e sa n dt h ep r e p a r a t i o no ft e a e x t r a c t s t h et h i r ds e c t i o nd i s c u s s e st h a tt h e 1h n m r h a st h ec h a r a c t e r i s t i c so f t h e f i n g e r p r i n ts p e c t r a i th a saw e l l c o r r e s p o n d i n gr e l a t i o nb e t w e e nt h e f i n g e r p r i n ts p e c t r aa n dt h eg e n u so ft e a i h n m rc a nb eu s e di nt h eg e n u s d i f f e r e n t i a t i o na n dt h es t u d yo nc h e m i c a lc o n s t i t u e n t s d u a l i n d e xs e q u e n c e a n a l y s i sm e t h o do fc o m m o na n dv a r i a n tp e a kr a t i oh a db e e nu s e di n 1h n m r f i n g e r p r i n ts p e c t r ao ft e ae x t r a c t st od i s t i n g u i s hg e n u sf r o mt h es i m i l a r i t y d i s c r e p a n c y i ti sc o n c l u d e dt h a ti nt h er a n g eo f8 6 5 p p m 一4 9 7 p p m ，w h e t h e r t a k i n gl o n g j i n go ro t h e rg r e e no rb l a c kt e aa sr e f e r e n ts a m p l e s ，i ti sc l e a rt h a t t h es a m eg e n u so ft e ah a ss i m i l a r q u a l i t y a n dl o n g j i n gt e ah a sh i g h l y s i m i l a r i t yw i t hg r e e nt e a l o n g ji n ga n do t h e rg r e e nt e ah a v el o ws i m i l a r i t y v 山东大学硕士掌位论文 w i t hb l a c kt e a t h e r e f o r et h e yc a nb ed i s c r i m i n a t e di n t e g r a ll ya n dp a r t i a l l y l o n g j i n gi s af a m o u sb r a n di ng r e e nt e a a n dt h e ya r ed i f f e r e n tg e n u sw i t h b l a c kt e a j a p a n e s eg r e e nt e ac o u l db ed i s t i n g u i s h e dw i t hc h i n at e a t h ee n t i r e s p e c t r ac o u l dn o tb eu s e dt or e f l e c tq u a l i t yd i f f e r e n c eo ft h eg e n u so ft e ai n 1h n m rf i n g e r p r i n t s p e c t r a w h e ng r e e nt e aa sr e f e r e n ts a m p l e ，i tk e e p s g r e a t e s tp r o p o r t i o ni ns i m i l a r i t y i ni t sg e n u s i ti ss h o w st h a ti tc a nb e d i s c r i m i n a t e dt h a tg r e e nt e aa n db l a c kt e ab e l o n g st od i f f e r e n tg e n u si nt h e e n t i r es p e c t r a t h ef o u r t hs e c t i o ns h o w st h a tl e a fe p i d e r m a la n ds t o m a t ac h a r a c t e r so f t e aa r eo b s e r v e dw i t hs c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) t h er e s u l t ss h o w t h a tt h el e a fe p i d e r m i so fl o n g ji n g ，g r e e na n db l a n kt e al o o kl i k es m o o t h ， i r r e g u l a rr e g u l a t e - r i p p l eo rr o u g ha n dt h es t o m a t ad e n s i t ya r ed i f f e r e n c e b u t t h es h a p e so fi n n e rm a r g i no fo u t e rs t o m a t al e d g ea r ec o n t r a c t i l e ，r o u n d ， e l l i p t i c o rs i n u a t e t h ed i f f e r e n c e so nl e a fe p i d e r m a ls t o m a t ac h a r a c t e r s p r o v i d ean e w e v i d e n c ef o r t h ei d e n t i f i c a t i o no ft h eg e n u s t h ec h i e fc h a r a c t e r i s t i c so ft h i st h e s i sa r ea sf o i l o w s ： 1 1 h n m rf i n g e r p r i n ts p e c t r ao ft e ai si n v e s t i g a t e db yd u a l i n d e xs e q u e n c e v i a n a l y s i sm e t h o do fc o m m o na n dv a r i a n tp e a kr a t i oi nt h i st h e s i s i tc a nn o t o n l yr e f l e c tt h ei n t e g r i t yo ft h es a m p l eb u ta l s ot h ei n d i v i d u a ld i f f e r e n c e a n dt h e r e f o r ei ti sh i g hr e l i a b i l i t y 山东大学硕士掌位论文 2 t h el e a fe p i d e r m a la n ds t o m a t ac h a r a c t e r so ft e aa r eo b s e r v e db yu s i n g s e m ，a n di no r d e rt op r o v i d en e ws c i e n t i f i cb a s i sf o ri d e n t i f y i n gs p e c i e s i t i so fh i g hr e f e r e n c ev a l u ef o rt h ec l a s s i f i c a t i o no ft h et e ai nt h eg e n u s a n dc o m b i n i n gt h ea b o v ea n a l y s i s t h er e s u l t sa r em o r ep e r s u a s i o n k e y w o r d s ：t e a ；l e a fe p i d e r m i s ；ih n m rf i n g e r p r i n ts p e c t r a ：c o m m o n p e a kr a t i o ；v a r i a n tp e a kr a t i o ；d u a l - i n d e xs e q u e n c ea n a l y s i s m e t h o d ； s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o c o p y v i l 山东大掌硕士掌位论文 i r ： u v ： m s ： f s ： 符号与缩写 s y m b o ia n da b br e via tio n 红外光谱h s c c c ：高速逆流色谱 紫外光谱 质谱 s f c ： s e m ： 超临界流体色谱 扫描电镜 荧光光谱1 h n m r ：核磁共振氢谱 h p t l c ： 高效薄层色谱 n m r ： 核磁共振波谱 g c ： 气相色谱 h p l c ： 高效液相色谱 6 ： d 2 0 ： a ： h p c e ： 化学位移 重水 吸光度 高效毛细管电泳 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：聋查堕垫 日期： 即8 f 。硼 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：气圭叠垒导师签名：挫日期：。幽 山东大掌硕士掌位论文 第一章前言 1 1 茶的药用功效的研究价值 i a 1 茶的认识 茶作为健康饮料风靡世界，已成为世界三大饮料之一随着国际贸易 的发展和人民饮食结构的调整，尤其是对健康状况及食品安全的重视日益 加强，对茶叶质量的要求也越来越高，其药用价值和保健作用已经引起科 学工作者的关注。经研究得知：茶所含化学成分复杂，近5 0 0 余种，主要 有茶多酚( 其化学物质组成包括：儿茶素类、黄酮苷类、酚、酸等3 0 多 种成分) 、咖啡碱、茶碱、黄酮类、黄嘌呤、茶鞣质、酚类、醇类、醛类、 酸类、酯类、碳水化合物、多种维生素( a 、bl 、b 2 、c 、p 、k 等) 、萜 烯类、蛋白质、氨基酸( 约含有2 5 种氨基酸，其中茶氨酸约占6 0 - 7 0 ) 、 茶多糖、茶皂素、叶绿素、胡萝卜素、色素、芳香性物质及微量元素( 包 括k 、n a 、m n 、f e 、z n 、c a 、m o 、m g 、s r 、s e 、c u 、a i 、f 、i 等多种 矿物质) ，它们是人体内许多生化酶的组成部分，且参与生物体氨基酸、 蛋白质、激素、维生素的合成与代谢，对生物体免疫功能的维护起着关键 作用，对人体的营养保健、防病治病有着重要意义【卜引。但其中任何单一 成分不可能反映其内在质量，而且也绝对不是多种成分活性的简单叠加， 尤其茶叶中复杂的成分不可能全部分析清楚，因此基于多成分的综合协 调、互补或制约的特点，需要寻找一个可行的、全面的、宏观的分析理念 和质量控制模式来适应【引。 我国既是茶的发源地，也是最早认识、种植茶树和使用、饮用茶叶的 国家。世界很多国家和地区的饮茶习惯、茶叶种植都是直接或间接地从中 国传过去的。世界上公认的、最早的、最完整的、最全面的一部有关茶的 专著就是我国唐代陆羽的茶经。神农百草经( 公元前2 7 3 7 - - 2 6 9 7 ) 中曾记载：“神农尝百草，日遇七十二毒，得荼( 茶) 而解之”，并说“茶味 苦，饮之使人益思，少卧，轻身明目”，也可以说茶最早被发现和利用是 山东大掌硕士掌位论文 从药用开始的1 4 】。茶历经数千年而不衰，人们对茶的认识，也是慢慢由最 初的药用发展到食用，进而作为饮品来饮用，如今已经被许多人所接受和 喜爱。科学研究已经证明了茶的许多药用功效，如：具有止渴生津、利尿 解毒、清目醒脑、杀菌消炎、化痰祛火、防龋固牙、防止动脉硬化、减轻 辐射损伤、增强抗癌抗突变能力：延缓衰老、降脂减肥及清热保肝等诸多 有益于维护身体机能的功效外，还具有预防人体高胆固醇、高血压、心脏 病、冠心病、动脉硬化等作用。李时珍本草纲目中记载，茶叶主治“瘘 疮、去痰热、止渴，令人少睡，有力悦志”等【5 j 。 有专家预言：“茶将成为2 l 世纪世界饮料之王”。但与全球市场和世 界同类产品相比较，我国虽进入产茶大国行列，但不是产茶强国，主要表 现在：出口价格低，企业规模小，单位面积产出低，产品质量不稳定。因 此，在满足加大科技投入要求的同时，加强质量控制手段，建立一种快速、 准确、，全面反映茶的种类差异性、品质真伪性和质量稳定性的指纹图谱， 为更好的鉴定和评价茶的品质，提供一种有效的、先进的、切实可行的方 法，是具有深远的理论意义和现实意义的。 1 1 2 茶的药用价值 茶是自然界中预防疾病的天然药用植物之一，而我国是一个茶叶大 国，资源丰富，其保健作用和药用机理早已引起广大科学工作者的关注和 研究。已经证明，茶叶中的茶多酚( 多酚类的总称) ，具有很强的抗氧化 性和生理活性，能清除机体过量的自由基，抑制和杀死病原菌，抑制心血 管疾病，阻断亚硝酸铵等多种致癌物质在体内合成等，具有抗氧化、抗肿 瘤、抗衰老、抗龋齿、抗菌、抗病毒、抗辐射；降血压、降血脂、降血糖 等显著的生物活性，被誉为“将是二十一世纪对人类健康产生巨大影响的 化合物”。已发现绿茶中茶多酚、维生素c 、叶绿素、胡萝卜素、氨基酸等 物质是所有茶类中含量最丰富的，抗癌效果最佳【6 。l 。而茶红素、茶黄素 是茶叶中多酚类在酶促氧化或非酶性氧化作用下氧化聚合的缩合产物，也 具有生物活性，其抗氧化和清除自由基的能力也很强，在保护细胞免受自 由基损害方面，比维生素c 和维生素e 更有效。另外，红茶的咖啡碱含量 山东大掌硕士学位论文 最多，其强心、利尿、兴奋中枢等药理功效比绿茶好得多，特别适合肠胃 较弱的人；并且所含茶黄素类是其品质的关键因子之一，也具有抗肿瘤、 抗氧化、抗心血管疾病等作用1 8 9 1 。茶多糖是生物活性高分子化合物，是 一种无细胞毒的免疫促进荆，由果类、果胶、蛋白质组成，均有降血糖、 降血脂、抗凝血、增强免疫力等作用，如白茶是所有茶类中含茶多糖最高 的，茶多糖对治疗糖尿病有一定功效【1 0 】。茶皂素除具有溶血、杀菌、化痰、 镇痛、抗癌等作用外，还是很好的表面活性剂。维生素c 有活血化瘀、 防止动脉硬化等作用j 。 任何事物都是一分为二，茶也不例外，如果使用不当也会对人体造成 伤害。如对缺铁性贫血患者而言，茶中的鞣酸可使食物中的铁离子形成一 种不被人体吸收的沉淀物，会加重病情；对便秘和患有泌尿系统结石病的 人，茶叶中的多酚类物质对胃肠黏膜具有一定的刺激和收敛作用，加重病 情：对神经衰弱或失眠症的人，茶叶中大量的咖啡因、茶碱等，引起基础 代谢增高，对中枢神经刺激性很强，加重病情；对缺钙和骨质疏松的人， 茶叶中的生物碱类物质会抑制十二指肠对钙质的吸收；有溃疡病的人不宜 饮茶，茶叶中的茶碱会降低磷酸二酯酶的活性，使胃壁细胞分泌大量胃酸， 胃酸过多必然会影响到溃疡面的愈合；对孕妇，儿童，因为浓的茶水中过 量的咖啡因会使孕妇心动过速，对胎儿也会带来过分的刺激，对儿童宜是 如此，等等，因此如何针对不同体质的人指导性的说明其药效和品质也是 至关重要的【1 2 】。 茶作为天然药用植物，其成分是多样的和复杂的，难以弄清其全部成 分，仅以已知的某一种或某几种活性成分或有效成分作为控制质量的指标 是远远不够的，难以了解诸多成分之间的协同作用，真正控制茶的药用疗 效。因此，为了深入了解和揭示茶的药效物质基础( 有效成分) 和作用机 理，有益于人体的健康，就要有完善的茶叶种类的鉴别方法，完备的分析 数据，有高质量和稳定可靠的茶叶来源，建立现代化的工艺流程，严格的 质量分析、控制手段，保证其质量稳定、可控，能够被国际市场接受、具 有国际竞争力，就显得尤为重要【13 1 。 山东大掌硕士掌位论文 1 2 天然药物指纹图谱的产生 天然药物指纹图谱质量控制技术是随着现代分析技术的发展而诞生 的。它主要的目标是达到控制和判断天然药物中主要有效成分的质与量的 问题，特别是对于含有不同成分，尤其是含有有毒成分的天然药物应当控 制其有毒成分的量。但这项技术的形成和发展却经历了一个漫长的历史时 期。 古代天然药物质量控制的特点是感官审评，以观察药材的形状、大小、 颜色、气味、质地等特征鉴别真伪。这种方法在使用过程中不断加以完善 丰富，沿用至今。它又分为外貌的鉴别和内质的鉴别。外貌的鉴别就是用 肉日艮或借助放大镜观察茶叶的外形、色泽、嫩度和净度；内质的鉴别是待 茶泡好后识别其汤色、香气、滋味和叶底的品质【1 4 】。但这种质量控制方法 是运用正常的视觉、嗅觉、味觉、触觉的辨别能力和积累的评审经验，来 评定茶叶外形、汤色、香气、滋味和叶底5 个方面的品质，达到鉴别茶叶 的目的。由于受科技水平的限制，人为因素的干扰，准确性不高，缺乏系 统性，无法形成一个系统的鉴别体系【1 5 16 1 。 近代天然药物质量控制发展的特点是出现了显微鉴别和初期的理化 鉴别。显微鉴别的先决条件：一是定义了“细胞是植物体构造的基本单位”； 二是发明了显微镜，并将显微镜应用于研究和鉴定植物内部细微结构方 面，在此基础上，再深入到近微观层次上观察植物的相似性和差异性，增 加了鉴别指标，但无论感官审评还是显微鉴别都对相似的结构不能很好地 加以分辨，有明显的局限性。理化鉴别法就是通过物理和化学的方法进行 分析与测定。可以直接测定天然药物的一些有效成分来辨别真伪和优劣， 但由于天然药物的成分极其复杂多样，无法一一鉴别出来，只能将此方法 作为一种辅助手段，与显微鉴别相结合来加强整体的鉴别能力【 】。 现代天然药物质量控制的特点是随着现代分析技术的发展而发展，将 强有力的分离技术、反映不同分子结构的波谱技术引入到天然药物质量控 制中，鉴别技术真正深入到成分层次，能够全面准确地控制天然药物的质 量，克服了仅仅依赖一种或几种有效成分的理化性质鉴别天然药物质量的 4 山东大掌硕士掌位论文 局限，经过许多科学工作者的努力，逐渐向建立各种分析技术的指纹图谱 的方向发展，天然药物质量控制也向着本质的、全面的、系统的方向发展。 分子生物学技术在天然药物品种鉴别方面具有样品量少，不受条件和 发育阶段的影响，多态性极丰富，操作简单，分析速度快，无放射性污染 等优越性，但对反应条件非常敏感，稳定性和重现性差。不适用于成分鉴 别，对天然药物质量控制的潜在优势有待进一步探索i i 引。 1 3 天然药物指纹图谱的建立 指纹的概念来源于法医学，依照每个人的指纹结构上的细微差别来鉴 别人的各异，法医学的指纹分析强调的是个体的绝对唯一性，而近代指纹 图谱的应用范围不仅强调个体的唯一性，而且侧重于整个物种的唯一性。 天然药用植物，既有其遗传的相似性，也有其后天的变异性，这就是其分 析的依据。指纹图谱反映的是天然药物的整体成分信息，整体性和模糊性 是天然药物指纹图谱的基本属性。整体性是强调完整地比较指纹图谱的特 征“面貌”，而不是将其“肢解”；模糊性是强调对照样品与待测样品指纹图 谱的相似性，而不是完全相同。使用相似度来描述指纹图谱之间的相似情 况，是指纹图谱作为一个整体考虑，而不局限于某一成分的含量多少【i 9 1 。 1 3 1 天然药物指纹图谱的概念 指纹图谱就是利用现代分析仪器如色谱，光谱或波谱测定样品的完整 图谱。天然药物指纹图谱是指某种( 或某产地) 天然药物或天然药物制剂 经适当的处理，采用一定的现代分析技术，得到能够表示其特征的某类或 数类成分的色谱、光谱或波谱的谱图，它既具有共性又具有个性。共性是 指不周产地、不同采收时间的同种药材( 或不同批号的同种药材) 共同具 有的某些特征( 如图谱中的共有峰) ；个性是指既可以反映不同种类也可 以反映同一种类不同产地不同采收时间的差异。差异越小说明药材的稳定 性越好，通过指纹图谱我们可以有效地鉴别样品的真伪或产地，有效地控 制其的质量。 5 山东大学硕士掌位论文 1 3 2天然药物指纹图谱鉴别的理论依据 天然药物指纹图谱技术鉴别需要解决两个关键问题：一是用于指纹图 谱鉴别的天然药物所含化学成分的选定以及提取工艺；二是这些化学成分 的表征方法。既要求选取适合的溶剂，工艺进行提取分离，最大限度的提 取其特征性化学成分，并且其特征性化学成分应具有含量相对稳定，特征 具体，重现性好的特点，又要求指纹图谱的研究必须建立在现代化的分析 仪器上，结合所分析天然药物的特点，寻找合适的分析仪器和分析方法， 快速准确地进行测定：利用先进的分析技术，如i r 、u v 、f s 、n m r 、m s 、 t l c 、g c 、h p l c 、h p c e 、h s c c c 、s f c 等来定性和定量地获得相对全 面的指纹性数据，表征这些特征性成分，再利用强大的计算机功能和化学 信息技术对图谱“解码”，同时结合化学成分与其药效的相关性，建立高水 平的天然药物质量标准，实现天然药物指纹图谱技术鉴别【2 们。 1 4天然药物指纹图谱技术的应用 天然药物指纹图谱技术被认为是目前天然药物质量控制的一种有效方 法。对一些有效成分尚不明确，或即使已知其成分，但仍无法与构效致 时，天然药物指纹图谱是目前最能反映其性质，并得到国际上认可的方法 之一。许多现代分析技术在指纹图谱测定中都有应用，以下根据近几年实 际情况，介绍几种常用技术的特点【2 1 2 2 2 3 1 。 i r 和u v 分析已成为常规的分析方法。i r 是以研究物质对红外辐射的 吸收特性而建立起来的一种定性、定量分析方法，可反映分子主要骨架类 型，具有高度的特征性、重现性和可比性，对单一化合物来说，没有两个 化合物的红外光谱是完全一致的；u v 是由分子中电子能级的跃迁而产生 的，当单色光照射被测物质后，物质对光线产生吸收，记录仪记录下吸收 度波长曲线。由于物质结构不同，其u v 光谱亦不同。 h p t l c 具有快速，经济，可靠，操作简单，适应范围广，重现性好的 特点，能提供直观形象的可见光或荧光图像。用固定波长对薄层展开的各 斑点作薄层扫描的扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确，因而具有更 6 山东大掌硕士掌位论文 佳的指纹图谱鉴定上的意义。如：丁阳平等利用h p t l c 分离方法，应用 聚酰胺薄板为分离材料，以不同溶剂，同一溶剂不同比例及不同预饱和时 间分别对茶黄素类的分离度进行研究，达到理想效果【2 4 1 。但它是一种开放 系统色谱，外界影响因素较多，误差较大，效能低，灵敏度低。 h p l c 具有高灵敏度，高选择性，高效，快速的特点，它给出的是高 分辨率的轮廓图谱，重现性好，操作相对容易，是封闭系统色谱，外界影 响因素小，稳定性好，如运用二极管阵列检测器，可得到三维图谱，因而 适用于成分比较复杂紫外光区有吸收的药物的分析，是较常用的分析手 段。但是，它要求必须在进样之前对提取液进行去杂质处理，以免损伤层 析柱。例如：对茶多酚的研究以往大多停留在理化鉴别的层次上，其质量 控制除对茶叶的形状、水分、重金属、灰分、微生物检测等一般常规分析 外，就是经过复杂的分析工艺去提取其中的几个主要单体成分，而如今浙 江中医学院的何昱等已经采用h p l c 指纹图谱研究茶多酚的组成，他们选 择茶多酚样品的相对保留时间和相对峰面积两，个指标进行指纹图谱的相 似程度的比较，以两两重叠率、特征指纹检出率和总差异率等参数从样品 的内在化学成分上作了基本比较，通过对特征指纹峰群的控制，以达到对 其内在品质量的控制【2 5 1 。 g c 适用于各种富含挥发性成分药物的定性和定量分析测定，其检测 限已达到p g 级水平，可以对痕量物质进行分析，多于质谱联用，以气体 为流动相，具有高分离效率、高选择性、高灵敏度、样品用量少、分析速 度快等特点，在研究天然药用植物化学成分的应用中发挥着非常重要的作 用。但仅对具有挥发性成分的样品发挥独特的优势。 h p c e 是从传统电泳发展而来的，是电泳技术与色谱技术的结合。依 据植物中的一些带电荷的成分如有机酸、蛋白质、多肽、氨基酸、生物碱 和酶等在一定强度的电场中，在相同的时间内，其所含成分的电荷性质、 电荷量和分子量的不同，造成各成分的泳动方向，速度，和距离等的不同， 结合谱带条数和染色结果的不同，从而达到鉴别的目的。具有灵敏度高， 柱效高，分析速度快，检测进样量少等特点，但仍存在重现性较差，线性 7 山东大掌硕士掌位论文 范围窄等不足。如：王钢力等采用h p c e 对l8 个卷柏属植物样品的乙酸 乙酯提取物进行鉴别，以槲皮素为内标，以相对迁移时间和相对峰面积为 参数，建立i8 个样品的毛细管电泳的指纹图谱，研究发现：被测样品的 黄酮类成分既有共性，亦有差异，这种差异对其品种的鉴别有着一定的意 义【2 6 1 。 x 射线衍射是研究物质的物相和晶体结构的主要方法，分为单晶x 衍射法和粉末x 衍射法。当对某一物质进行衍射分析时，该物质被x 射 线照射而产生不同程度的衍射现象。它反映了物质的组成、晶形、分子内 成键方式、分子构型等多方面信息。而这些信息将决定物质产生特有的衍 射图谱，如该物质为混合物，则所得图谱为各混合物各组成成分衍射效应 的叠加。具有样品量小、操作简单、信息量大、指纹性强、稳定可靠且可 以记录的特点，可以作为植物品质品种鉴别的可靠依据。 n m r 是一种吸收光谱，可以检测的核素很多，如1 h 、1 3 c 、1 5 n 、1 9 f 、 2 3 n a 、3 1 p 等，可以根据谱图上吸收峰的位置，强度和精细结构研究分子中 氢的类型、数量和周围化学环境，因为大多数物质都含有1 h ，所以最常用 的就是1 h 的检测。1 h n m r 指纹图谱也是鉴定植物类中药的一种新方法。 具有灵敏、可靠、简便的特点，它的谱峰可以与每一个1 h 在理论上严格 对应，且谱峰的信号强弱反映着各组分之间的相对含量，除具有单一性、 全面性、定量性、易辨性，还具有信息多及高度的重现性和特征性。当以 一定的程序获得天然药用植物的特征性化学成分的总提取物，同时这些特 征性的化学成分的含量是相对固定的，则其1 h 与中药品种间存在严格的 对应关系，不易混淆，可以达到快速准确的鉴别天然药用植物品种的目的。 本论文就侧重于茶提取物的1 h n m r 指纹图谱研究。 1 5 指纹图谱的几种分析方法 构建指纹图谱的方法有很多都是互补的。选择何种方法应视研究对 象的理化特点、实际需要和可能性，按照不同方法的技术特点及优势而定。 最终目的是保证该方法却能反映并控制该对象的质量。 8 山东大掌硕士掌位论文 聚类分析是使模式识别中的一种，其战略思想是所有对象多少都有差 异，根据样本的指标，找出一些能够量度样本间差异程度的统计量，据此， 将样品分为不同分类单位，最后用图形直观地( 谱系图或称分群图、聚类 图等) 把它们表示出来，以清楚地反映出样本或变量的差异关系。一般选 用某种相似性测度计算色谱指纹图谱中各谱峰的相似度，将相似的归为一 类，不相似的归为一类。在聚类分析中，一般采用聚类中心的距离评价聚 类效果，距离越大，表示类与类之间的差异越明显，以达到了鉴别样品产 地、品种，识别真伪的目地【2 7 蕊1 阵列相关系数法根据“物以类聚”的原则，可将性质、特征或变量相似 的样本聚为一类，样本相似性的大小可用夹角余弦和相关系数等来表示。 对特定谱段范围内设置较高相关系数阈值进行比对。这样在两个图谱比对 时，既可获得整体相关系数的信息，又可获得各波段相关系数的信息，凭 借各波段和总体相关系数的差异对样品进行快速鉴别和分类f 2 纠。但聚类分 析和阵列相关系数法采用单一指标在一维空间中鉴别样品，无法对两个指 纹图谱进行鉴别： 非线性映射分析法就是将高维空间点集映射到低维空间中，而且在映 射后仍然近似地保持着数据的固有结构。因为人们很容易对二维或三维的 映射结果做出直观地评价，有助于识别数据点的构型，同时还能够根据数 据点的不连贯性自然地进行分类。但是需要采用两种不同类的样品为参 照，对不同样品进行鉴别，它是利用了样品的整体信息，而不是直接利用 各种样品都含有的特征信息来建立多维指标空间鉴别样品，所以分析鉴别 能力较差 3 0 1 ； 图谱直接比对就是在测量未知样品时，使用正品物质的图谱作为标 准，通过比较正品物质与未知样品的图