（食品科学专业论文）产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用.pdf

学术诚信声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立进行的研究工作及取 得的研究成果。除文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：饔事昏这 时间：妒7 、f 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 作者。蚴：装彳t 弼盎 导师( 时间： 产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 摘要 亚硝酸盐是肉类加工时常用的腌制剂，不仅能使肉制品呈良好色泽，而且还具有防腐 和增强风味的作用。但是，亚硝酸盐具有致癌作用，还会使血红蛋白失去携氧功能，因此 研究食物中的亚硝酸盐残留及其降解情况，对食品工业及人类健康都具有十分重要的意 义。 本课题组前期筛选和鉴定了一株产亚硝酸还原酶的巨大芽孢杆菌b m e g a t e r i u m m p f - 9 0 6 ，但是其产酶活不高。本论文对该菌株进行紫外诱变，筛选高产菌株，并研究其 产亚硝酸盐还原酶的条件，所产亚硝酸盐还原酶的酶学性质和稳定性。另外，还对亚硝酸 盐还原酶降解肉制品中残留亚硝酸钠的情况进行了初步研究。主要研究结果如下： 通过紫外线对巨大芽孢杆菌m p f 9 0 6 进行了诱变处理，提高了产酶能力，获得了变异 株z 8 5 ，其酶活达到2 8 7 6u m l ，与原始菌株的产亚硝酸还原酶的酶活1 6 8 4u m l 相比提高 了7 1 。进一步对其发酵条件进行研究，优化了培养基和培养条件。优化的培养基为：葡 萄糖1 5 ，牛肉膏0 2 ，硫酸铵0 1 ，k h 2 a 0 4 0 0 7 ，k 2 h p 0 4 0 。1 3 5 ，n a c io 1 ： 无机盐1 0m l l ( 即m n s 0 4 h 2 0 浓度为0 0 0 1 、m g s 0 4 7 h 2 0 浓度为0 0 4 、c a c l 2 2 h 2 0 浓 度为0 0 0 2 ) 。发酵条件为：摇床转速1 6 0r m i n ，初始p h 6 5 ，接种量4 ，3 0 发酵2 0h 。 在此最优化条件下，亚硝酸还原酶的酶活达到4 5 9 4u m l 。 对亚硝酸还原酶酶学性质进行研究，酶反应的最适温度为4 0 ，最适p h 为6 5 。热稳 定性良好，在8 0 下保温4h 仍有5 0 的酶活力。p h5 0 9 0 之间较稳定，残余酶活在6 0 以上。c u 2 + 、b a 2 + 提高酶活力，n r 、f e ”、m g + 、a 1 3 + 对其有轻微抑制作用，l v l n 2 + 、p b 2 + 对 酶活力有明显抑制作用，c a 2 + 、z n 2 + 对酶活力影响不大。在亚硝酸还原酶粗酶液中添加一 些醇类物质、增稠剂等可明显提高亚硝酸还原酶的稳定性。利用甘油、黄原胶和c a c l 2 设计 三因素三水平的正交试验，确定了以4 的甘油，0 6 的黄原胶，0 1 5 的c a c l 2 组合的保 护剂，对提高酶的热稳定性具有显著作用。 本试验综合考虑了影响亚硝酸盐还原酶在蒸煮香肠中作用结果的各方面因素，实验得 出应用该酶较为理想的试验条件为：含水量5 0 、酶解反应温度8 5 、酶解反应时间2 0 h 、酶添加量2 0 0 0u k g 、电子供体v c3 5 2g k g 和食盐添加量2 5 。在单因素最优化条件 下测定蒸煮香肠中n 0 2 一残留量为1 5 8 4m g c q ( g ，大大低于国标要求的 3 0m g a c g ，与对照相 比，降解了8 2 5 0 。 关键词：亚硝酸盐，亚硝酸盐还原酶，酶学性质，酶稳定性，蒸煮香肠，亚硝酸盐降解 t h es t u d yo nt h es t r a i nf e r m e n t a t i o no fn i t r i t er e d u c t a s e a n di t sa p p l i c a t i o ni nc o o k i n gsausagpana u s ae a b s t r a c t n i t r i t e ，w h i c hi so n ek i n do ft h ec o l o r i n ga g e n t , n o to n l yc 4 a nm a k et h em e a tt r a n s l u c e n t , b u t a l s oc a np r e v e n tt h em e a tf r o mc o r r u p t i n g h o w e v e r , i fn i t r i t e c d m e si n t ot h eh u m a nb o d y , i t c o u l di n d u c ec a n c e ra n dl o s e t h ef u n c t i o no fc a r r y i n g o x y g e nb yc h a n g i n gt h e n o r m a l h c m o g l o b i l l f o rt h i sr e a s o n , i ti sv e r yi m p o r t a n tt oi n v e s t i g a t et h ec h a n g i n go ft h en i t r i t ec o n t e n t s i nf o o da n dd e g r a d a t i o nm e c h a n i s mb yb i o l o g yt e c h n o l o g y n i t r i t er e d u e t a s eh a v ea t t r a c t e dc o n s i d e r a b l er e s e a r c hi n t e r e s ti nr e c e n ty e a r sb e c a u s ei t s p o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nt h ef o o di n d u s t r y i nt h ep a p e r , w eu s e db m e g a t e r i u mm p f 9 0 6 ，w h i c h w a si s o l a t e df r o mt o b a c c ow a s t ea n ds o i l sw i mn i c o t i n ea n di d e n t i f i e db e f o r e ，p r o d u c e sn i t r i t e r e d u e t a s e , b u te n z y m ea c t i v i t yi sn o te n o u g ha sw en e e d t h en i t r i t er e d u c t a s ep r o d u c t i o ns t r a i nb m e g a t e r i u mm p f - 9 0 6w a st r e a t e dw i t hu v t h e na g e n e t i cs t a b i l i t ya n dh i 曲n i t r i t er e d u c t a s ea c t i v i t ys t r a i nw a so b t a i n e d ，n a m e dz 8 5 a n di t sn i t r i t e r e d u c t a s ew e r e2 8 7 6u m l ，w h i c hw a si n e e r a s e db y71 弱c o m p a r e dw i t l lt h es t a r t i n gs t a i n t h e e f f e c t so fc o m p o s i t i o n so fc u l t u r em e d i u ma n dc u l t u r a lc o n d i t i o n so l ln i t r i t er e d u c t a s ep r o d u c t i o n w e r ei n v e s t i g a t e d t h eo p t i m a lc u l t u r em e d i aa r c ：g l u c o s e1 5 ，( n h 4 ) 2 8 0 4o 1 ，b e e fe x t r a c t 0 2 ，k h 2 p 0 4o 0 7 ，k 2 h p 0 40 13 5 ，n a c lo 1 ，m n s 0 4 h 2 00 0 0 1 ，m g s 0 4 。7 h 2 00 0 2 ，c a c l 2 2 h 2 00 0 0 2 ，n a n 0 20 0138 t h eo p t i m a lc u l t u r a l c o n d i t i o n si n c l u d i n g i n c u b a t i n gt e m p e r a t u r e ，l o a do f s h a k ef l a s k ，r o t a t i o nr a t ea n da m o u n to f i n o c u l a t i o na r e ：3 0 ， 16 0r m i n ，i n i t i a lp h6 5a n d4 ，r e s p e c t i v e l y u n d e rt h i sc o n d i t i o n ，t h en i t r i t er e d u c t a s e r e a c h e d4 5 9 4u m l t h en i t r i t er e d u c t a s ew h i c hc o m e sf r o mz 8 5w a se x t r a c t e d ，a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ea n d p hf o re n z y m er e a c t i v i t yw e r e4 0 a n d6 5r e s p e c t i v e l y a t8 0 ，t h e r es t i l lr e m a i n e da b o u t 5 0 e n z y m ea c t i v i t y ( g o o dt h e r m a ls t a b i l i t y ) i tw a si ns t a b l es t a t eu n d e rt h ec o n d i t i o no fp h v a l u eb e t w e e n5 0a n d9 0a n dt h e a c t i v i t yo fr e s i d u a lr e d u c ew a sa b o v e5 0 o n a v e r a g e b e s i d e s ，t h en i t r i t er e d u c t a s ew a ss t r o n g l yi n h i b i t e db ym n 2 十，p b z 十a n dm o d e r a t e l y i n h i b i t e db ys a + ，f e 3 + ，m g + ，a 1 3 + ( o t h e ri o n sh a dn oe v i d e n te l e c t so ni tw i t h i nt h er a n g eo f e x p e r i m e n t a lc o n c e n t r a t i o n ) a d d i n gs o m ea l c o h o l i c m a t e r i a l sa n dt h i c k e n i n ga g e n te t c i n t ot h e l l i t r i t er e d u c t a s es o l u t i o n , t h es t a b i l i t yo fn i t r i t er e d u c t a s ec o u l db ei n c r e a s e d u s i n gg l y c e r o l 、 x a n t h i cp a s t e r na n dc a c l 2t h o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t so ff o u re l e m e n t sa n dt h r e el e v e l s ，a s a t i s f y i n gpr o t e c t i v ea g e n t , w h i c hi n c l u d e dg l y c e r i n ( 4 ) ，x a n t h a ng u m ( 0 6 ) a n dc a c l 2 ( o 15 ) a n dh a das i g n i f i c a n te f f e c to nt h ee n h a n c e m e n to ft h ei n u l i n a s es t a b i l i t y t h e r ei sal o w e rn i t r i t er e s i d u a lb ya d d i n gn i t r i t er e d u c t a s eo ft h es i t u a t i o n ：w a t e rc o n t e n t 5 0 、e n z y m a t i ct r e a t i n gt e m p e r a t u r e8 5 、r e a c t i n gt i m e2 h 、n i t r i t er e d u c t a s ec o n c e n t r a t i o n 2 0 0 0u k g 、e l e c t r o nd o n o rv c3 5 2g k ga n ds a l t2 5 ，1 5 8 4m g k g ，w h i c hi sm u c hl o w e rt h a n g b ( 3 0 m g k g ) yw o r d s ；：n i t r i t e ，n i t r i t er e d u c t a s e ，e n z y m ec h a r a c t e r i z a t i o n , o n z y m es t a b i l i t y , c o o k i n g c a u s a g e ，n i t r i t ed e g r a d a t i o n l i l 目录 第一章引言1 1 1 亚硝酸盐在肉制品中的作用和危害1 1 1 1 亚硝酸盐在肉制品中的作用1 1 1 2 过量亚硝酸盐对人体的危害2 1 1 3 各国标准对亚硝酸盐残留量规定3 1 2 降低肉制品中亚硝酸盐残留量的研究进展3 1 2 1 化学方法降解肉制品中残留的亚硝酸盐进展4 1 2 2 生物方法降解肉制品中残留的亚硝酸盐进展6 1 3 亚硝酸盐还原酶研究进展8 1 3 1 亚硝酸还原酶的发酵规律研究现状8 1 3 2 亚硝酸还原酶反应特性及应用研究现状8 1 4 课题研究的意义和内容9 1 4 1 研究意义9 1 4 2 研究内容9 第二章高产亚硝酸还原酶菌株选育及其发酵条件优化1 1 2 1 引言1l 2 2 材料和方法ll 2 2 1 材料11 2 2 2 亚硝酸还原酶粗酶液的提取及酶活测定1 2 2 2 3 诱变方法1 4 2 2 4 培养基组成及发酵条件优化1 5 2 3 结果与讨论1 6 2 3 1b m e g a t e r i u mm p f 一9 0 6 的生长和产酶曲线1 6 2 3 2 紫外线处理菌体致死率曲线1 7 2 3 3 诱变后的复筛发酵试验17 2 3 4 培养基组成及发酵条件优化1 8 2 4 本章小结2 6 第三章亚硝酸还原酶的酶学性质及保存研究2 7 3 1 前言2 7 3 2 材料和方法2 7 3 2 1 材料2 7 3 2 2 亚硝酸还原酶粗酶液的提取及酶活测定2 8 3 2 3 亚硝酸还原酶的酶学性质一2 8 3 2 4 亚硝酸还原酶的保存2 9 3 3 结果与讨论3 0 3 3 1 亚硝酸还原酶的酶学性质3 0 3 3 2 亚硝酸还原酶的保存3 5 3 4 本章小结4 0 第四章亚硝酸还原酶在蒸煮香肠中应用4 2 4 1 引言4 2 4 2 实验材料和仪器4 2 4 2 1 实验材料4 2 4 2 2 仪器及试剂4 2 4 3 方法4 4 4 3 1 蒸煮香肠的制备4 4 4 3 2 香肠中亚硝酸盐残留量的检测一4 5 4 3 3 亚硝酸还原酶添加量及作用条件对降解亚硝酸盐的影响4 6 4 4 结果与讨论4 7 4 4 1 含水量对亚硝酸钠降解的影响4 7 4 4 2 酶解反应温度对亚硝酸钠降解的影响一4 8 4 4 3 酶解反应时间对亚硝酸钠降解的影响4 9 4 4 4 亚硝酸还原酶的添加量对亚硝酸钠降解的影响4 9 4 4 5 电子供体v c 的添加量对亚硝酸钠降解的影响5 0 v 4 4 6 食盐添加量对对亚硝酸钠降解的影响j 5 1 4 4 7 单因素最优化条件下n 0 2 。残留量51 4 4 8 亚硝酸还原酶对香肠的颜色影响5 1 4 4 9 最优化工艺条件下亚硝酸还原酶应用研究5 2 4 5 小结5 3 第五章结论与展望5 4 5 1 结论5 4 5 2 展望5 5 墅| 【谢5 6 参考文献5 7 附j 录6 ：! 在学期间发表的学术论文6 4 v i 集美大学硕士毕业论文产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 第一章引言 亚硝酸盐是国家食品卫生法允许使用的食品添加剂，在肉制品工业中有广泛的应用。 亚硝酸盐不仅能使肉制品呈现出良好的色泽，而且还有防腐和增强产品风味的作用i j 4 j 。亚 硝酸盐是唯一能同时起上述几个作用的物质，目前还没有发现有一种物质能完全取代它【6 j 。 但是，肉制品中亚硝酸盐用量超过一定的标准( 1 5 0 m g ) 时，会产生大量的n 0 2 。残留，由 于亚硝酸盐的急性中毒作用和致癌性，对人体造成很大的危害。因此，食品中亚硝酸盐含 量超标一直是产生食物安全问题的焦点之一。世界许多国家都呼吁严格控制亚硝酸用量， 并且积极研究利用可降解亚硝酸盐的微生物或其产生的亚硝酸盐还原酶，采用化学和生物 处理的方法，来降低肉制品中亚硝酸盐残留量【7 声j 。 1 1 亚硝酸盐在肉制品中的作用及危害 1 1 1 亚硝酸盐在肉制品中的作用 ( 1 ) 亚硝酸盐发色作用 原料肉的红色是由肌红蛋白及少量血红蛋白所呈现的一种感官性状。新鲜肉中存在的 肌红蛋白是还原型的亚铁肌红蛋白，呈暗的紫红色，其很不稳定，易被氧化。在空气中， 还原型亚铁肌红蛋白中的二价铁易被氧化成三价铁，变成高铁血红蛋白，从而颜色变暗， 若继续氧化，则变为绿色或黄色，严重影响肉制品的外观性状。 亚硝酸盐可以与肉制品中还原型肌红蛋白反应，生成亚硝基肌红蛋白，赋予肉制品诱 人的鲜红色泽【”】。肉制品( 如蒸煮香肠、午餐肉、红烧肉制品、罐头等) 在加工过程中往往 加入发色剂亚硝酸盐或硝酸盐进行腌制，其中硝酸盐在肉中细菌的作用下，还原成亚硝酸 盐。亚硝酸盐在肉中乳酸形成的酸性条样下，形成亚硝酸。亚硝酸与肌红蛋白或血红蛋白 反应，生成鲜红的亚硝基肌红蛋白或亚硝基血红蛋白。亚硝基肌红蛋白或血红蛋白在受热 后，放出疏基，成为鲜红色的亚硝基血色原，起到固定和增强肉的红色的作用。具体反应 如下( 以亚硝酸钠为例) ： 亚硝酸盐被乳酸还原： n a n 0 2 + c h 3 c h o h c o o h 一h n 0 2 + c h 3 c h o h c o o n a h n 0 2 性质不稳定，常温下分解为亚硝基 3i - i n o r 2 n o + h n 0 3 + h 2 0 2h n o 广制o + n 0 2 + 2 h 2 0 ( 在还原性物质作用下) 亚硝基与肌红蛋白反应生成鲜红色一氧化氮肌红蛋白 m b ( h b ) + n q _ m b ( h b ) n o 亚硝基肌红蛋白遇热后放出琉基 m b ( i - i b ) n q _ s h + 亚硝基血色原( 红色) 集美大学硕士毕业论文产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 ( 2 ) 亚硝酸盐的防腐作用 硝酸盐和亚硝酸盐除作为腌制发色剂，还能抑制肉制品中微生物的生长繁殖，起抑菌 防腐的作用，在p h 4 5 6 0 的范围内，尤其是对肉毒梭状芽抱杆菌有特殊抑制作用【2 一，对 金黄色葡萄球菌也有一定的抑制作用。其作用机理在于亚硝酸盐与蛋白质生成铁h i t r o y 复合物，阻止了丙酮降解和产生a t p 的过程，从而抑制了菌体的生长繁殖；而且硝酸盐及 亚硝酸盐在肉制品中形成h n 0 2 ，h n 0 2 分解产生n 0 2 ，进而再分解成n o 和0 2 。0 2 可抑制深 层肉中厌氧的肉毒梭状芽抱杆菌的繁殖，从而防止肉毒梭状芽抱杆菌产生肉毒毒素而引起 的食物中毒，起到了防腐的作用，延长了肉制品的货架期。 ( 3 ) 亚硝酸盐的增强风味作用 亚硝酸盐还具有增强肉制品风味的作用，即在香肠加工过程中添加亚硝酸盐比不添加 亚硝酸盐在风味上有明显的增强。这可能是由于添加的亚硝酸盐与食盐的作用改变了肌红 细胞的渗透压，增加肉制品体系的渗透作用，促进肉制品成熟风味的形成，可以使肉制品 具有很好的弹性，良好的口感，提高肉制品品质。 ( 4 ) 亚硝酸盐的稳定和螯合作用 亚硝酸盐在肉制品中还具有稳定和螯合作用。即亚硝酸盐能使肉制品中泡胀的胶原蛋 白的数量增多，增加肉制品的粘弹性，是良好的鳌合剂。亚硝酸盐还能防止脂肪氧化，产 生不良风味，从而提高肉制品的稳定性，延长货架期。 1 1 2 过量亚硝酸盐对人体的危害 由于肉制品生产企业规模不一，从业人员素质良蔫不齐，造成亚硝酸盐的添加量超标， 同时由于工艺过程中的一些问题，如搅拌不均、腌制时间不够等，导致单位重量的肉制品 中亚硝酸盐残留量超标，人食用后会发生中毒，因此因为亚硝酸盐含量超标而引起食物中 毒事件也就时有发生。肉制品中亚硝酸盐使用量超过1 5 0 m g 时，会导致n 0 2 。大量的残留。 过量的亚硝酸盐作为氧化剂，进人人体后，可使血中亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白， 失去运氧的功能，导致组织缺氧，具有一定毒性，因此使用时的用量必须充分注意。具体 表现如下： ( 1 ) 过量亚硝酸盐的急性中毒作用 亚硝酸盐引起的中毒，潜伏期很短，一般1 0r a i n 。亚硝酸被吸收进入血液，将亚铁血 红蛋白中二价铁氧化为三价的，使正常的亚铁血红蛋白转变成高铁血红蛋白，失去携氧功 能，使皮肤青紫。若血液中2 0 的亚铁血红蛋白转变成高铁血红蛋白，则形成缺氧症状， 引起呼吸困难、循环系统衰竭以及中枢神经系统损害、血管扩张、血压下降等。亚硝酸盐 中毒症状如下：早期出现头痛头晕、呕吐恶心、心跳加速，伴有胸闷、呼吸困难急促、烦 躁不安等，后期严重者伴有心跳减退、惊厥昏迷、全身呈青紫色、血压下降、呼吸循环衰 竭等，若口唇紫后3 0r a i n 不及时抢救，可能导致很快昏迷死亡【1 7 , 1 8 】。对人的中毒剂量为 o 3 0 5g ，致死量为0 5 2 0g 。 2 集美大学硕士毕业论文产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 ( 2 ) 亚硝酸盐的致癌和致畸作用 亚硝酸盐在人体的酸性条件下，和各种主要来自蛋白质的分解产物的氨基化合物反 应，产生致癌的n 亚硝基态化合物，如亚硝胺等。据国内外研究显示，亚硝胺是一种很强 的致癌物。它可以诱发各种癌症，而且不分剂量的大小，一次给予大的剂量或长期小剂量 累积皆可诱发癌症。亚硝胺不仅对成年动物致癌，对妊娠动物同样如此，而且妊娠动物摄 入一定量后还通过胎盘使子代致癌。研究显示，妊娠大鼠投喂n 乙基亚硝( 姗，母鼠 5 m g , k g 的饲喂量即导致6 3 的仔鼠发生癌症( 肿瘤) 【1 3 】。多年来的研究资料也证明，人类的 肝癌、胃癌等癌症也都与亚硝胺有关1 2 。 ( 3 ) 亚硝酸盐有松弛平滑肌的作用，会造成小血管扩张，血压下降。 ( 4 ) 摄入过量的亚硝酸盐还会干扰人体的碘代谢，造成甲状腺肿大。 ( 5 ) 还有其他的一些病症，如黄疽、腹水及出血以致小叶性坏死、肝实质性病变等， 还可能引起肺病变乃至出血【1 4 1 。 1 1 3 各国标准对亚硝酸盐残留量规定 亚硝酸盐的添加量在0 0 2 4 酢g 以下发色效果不好，在0 0 2 4 - 0 0 4g l 【g 可以发色，发 色程度随添加量的增加而增加，发色较好的添加量约为0 1 3 0 1 5g l 【g ，其中亚硝酸盐的残 留量为o o a g k g ，该残留量远远高于美国和我国卫生标准中的亚硝酸盐残留量 6 1 。 联合国粮农组织( f a o ) 和世界卫生组织( w h o ) 规定【1 9 。2 1 】，每日硝酸钾或硝酸钠的 允许摄入量为0 5m g k g ，亚硝酸钾或钠成为0 2m g k g 。 同时，美国农业部规定，硝酸盐和亚硝酸盐可以应用到除了婴儿、少年食品、绞碎的 禽肉之外的肉制品加工中，其中腌制剂硝酸盐、亚硝酸盐或其混合物的应用，终产品中亚 硝酸盐残留量不超过2 0m g k g ( j 以亚硝酸钠计) 。 日本规定肉制品中亚硝酸盐的残留量 4 5 ) ，杆菌与球菌降解亚硝酸盐并无差别。除了 6 集美大学硕士毕业论文产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 乳酸菌，葡萄球菌和微球菌是发酵香肠中降解亚硝酸盐的主要微生物，它们会产生硝酸盐 和亚硝酸盐降解酶，这两种酶都可以消除残留的硝酸盐【7 】。何煌波等利用乳杆菌属中的清 酒乳杆菌、双发酵乳杆菌、嗜酸乳杆菌等混合菌种用于香肠发酵，在菌种接种量为1 0 7 c f u g ， 发酵温度为3 6 ，发酵时间为2 0 2 4h ，经过发酵，产品p h 值很快降低，抑制了腐败菌的 生长，且产生乳酸菌特有的发酵香味，产品中亚硝酸盐的残留量和挥发性盐基氮的含量均 比对照组有所降低，其机理为多菌种发酵产生了大量的乳酸，亚硝酸钠在乳酸存在的情况 下产生出游离亚硝酸，接着分解生成- n o ，- n o 与肌红蛋白结合，形成对热稳定的亚硝基肌 红蛋白( 呈玫瑰红色) 。因此，经多菌种发酵，有利于降低n 0 2 的残留，提高产品质量和安 全性。王立梅等【4 7 】把乳酸菌接种到原料肉中使肉发色，抑制其他菌类生成，降低亚硝酸盐 的残留量，利用乳酸茵加入香肠中，发酵7d 后，香肠的亚硝酸盐含量明显降低。 微球菌和凝固酶阴性葡萄球菌中的许多菌株能还原亚硝酸盐。在需氧条件下，葡萄球 菌生长得快而多，将硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐一般再由凝固酶阴性茵还原。许多 霉菌能把硝酸盐还原成亚硝酸盐，促进肠表面颜色的生成【3 8 , 3 9 】。 1 2 2 2 添加乳酸链球菌素降低肉制品中亚硝酸盐残留 研究表明，在不影响肉制品色泽和防腐效果的情况下，加入一定量的由微生物产生的 乳酸链球菌素( n i s i n ) ，可使亚硝酸盐的含量由原来的1 5 0m g k g 降到4 0m g n c g ，又能有效地 延长香肠的货架期。若添加o 2g k g n i s i n ，亚硝酸盐的添加量减少到o 0 4g k g ，香肠中的菌 落总数降低到3 2 0 0 个克，抑菌效果明显。在西式火腿切片中添加o 0 4 2g k gn i s i n 和2 1 9 k g 乳酸钠，再加亚硝酸盐0 0 0 8g l ( g ，4 下贮存，货架期则延长到7 0d ，比对照组提高5 倍。 较好地解决了西式火腿切片货架期短的问题【3 9 , 4 0 。同时，通过实践证实，n i s i n 还可以有效 地防止肉毒梭菌a 、b 型孢子发芽。 1 2 2 3 应用微生物产生的亚硝酸还原酶降低肉制品中亚硝酸盐残留 在发酵香肠中应用的肉糖葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sc a r n o s u s ) 由于能还原亚硝酸盐已 被广泛关注。n e u b a u e r , h 【4 l 】研究该菌中亚硝酸还原系统的分子特性，结果表明，厌氧和亚 硝酸盐是亚硝酸还原酶的诱导因素，尽管检测到转录，但在亚硝酸盐存在时细胞在好氧条 件下未表现出亚硝酸还原，表明在转录水平上存在额外氧控制步骤，亚硝酸还原酶在厌氧 条件下表达，但在氧增加时快速消失，很有可能由于在好氧呼吸链竞争了电子。s o l o v e vv i 掣4 2 】用超声破碎和高速离心从无色杆菌( a c h r o m o b a c t e rg u t t a t u s ) 中分离获得亚硝酸还原 酶，对该酶的酶学特性进行研究，发现该酶最适反应条件为p n7 4 ，3 0 - 4 0 ，还原型n a d p 和f a d 增加酶活。主要反硝化产物为n o ，因此该酶有可能应用于香肠加工。s o l o v e vv i 等研究在香肠加工中应用亚硝酸还原酶以降低产品中残留的亚硝酸盐，通过比色法测定香 肠颜色的强度和稳定性。结果表明应用亚硝酸还原酶在煮熟香肠中降低残留亚硝酸盐至原 来的3 0 4 0 ，结果依赖于的亚硝酸还原酶酶学特性，由于该酶高于5 0 后酶活完全损 失，因此对亚硝酸盐的残留不完全控制。p f e i le 等【4 3 】研究微球菌活菌及粗酶在营养肉汤和 7 集美大学硕士毕业论文产噩硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 香肠中硝酸盐还原酶的活性，结果表明，硝酸盐还原酶的活性依赖于p h ( 适宜p n6 7 ) 并 需要n a d h ，酶活性在p h 低于5 时急速下降，表明该酶是严格p h 依赖酶，并在低p h 时 抑制n a d h 合成。我国学者张庆芳等】利用乳酸菌发酵生产亚硝酸还原酶，但还未见该 酶的酶学性质报道，不知该酶是否可以耐受肉制品的加工条件。 1 3 亚硝酸盐还原酶研究进展 1 3 1 亚硝酸还原酶的发酵规律研究现状 传统研究认为，进行亚硝酸盐降解成n o 的细菌都是兼性厌氧微生物，因为只有在无 氧条件下，才能诱导出亚硝酸还原酶 4 5 删。j a c o bg e t t e r u p 等【4 9 】从发酵香肠、烟熏烤肠和 腌肉中，筛选出9 种可以发酵产生亚硝酸还原酶的s t a p h y l o c o c c u s ，这些葡萄球菌生长速率 和生长周期不同，在3 0 、p h7 0 、转速1 5 0r m i n 的条件下进行厌氧发酵，其最终亚硝 酸还原酶酶活在6 4 2u ( 每分钟还原l n m o l 亚硝酸盐所需酶量定义为一个活力单位) 。 p a g eg v 掣5 0 】研究发现s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 在厌氧条件下以亚硝酸盐作为唯一氮源发 酵后从细胞质中可分离到亚硝酸还原酶，该酶需要n a d h 作为辅酶并且在该物质存在时具 有最大酶活，在p h8 0 、厌氧、限制葡萄糖但含有蛋白胨和亚硝酸盐时，亚硝酸还原酶产 生时间更短，亚硝酸还原酶可能的作用是以n a d h 的形式从细胞中移走过量还原力，以增 加厌氧发酵葡萄糖时a t p 的生成量。n e u b a u e rh 【5 1 】研究从发酵香肠中分离的s t a p h y i o c o c c u s c a r n o s u s 中亚硝酸还原系统的分子特性，结果表明，厌氧和亚硝酸盐是亚硝酸还原酶产生 的诱导因素，尽管检测到转录，但在亚硝酸盐存在时细胞在好氧条件下未表现出亚硝酸还 原，表明在转录水平上存在额外氧控制步骤，亚硝酸还原酶在厌氧条件下表达，但在氧 增加时快速消失，很有可能是由于好氧呼吸链竞争了电子。然而，近几年人们不断地发现 好氧条件下发生也会发生亚硝酸盐的降解，如g i o v a n n iv i g l i o t t a 等【5 2 】研究发现一种酵母 d e b a r y o m y c e sh a n s e n i it o b - y 7 能够在纯化学合成培养基中、在微需氧条件下利用亚硝酸 盐作为唯一氮源，降解亚硝酸盐的能力伴随y n l l 基因的表达，该基因为编码同化 n a d ( p ) h ：亚硝酸还原酶，电子传递体的添加有助于亚硝酸还原酶的产生。 1 3 2 亚硝酸还原酶反应特性及应用研究现状 亚硝酸还原酶有两种，即含铜型和细胞色素e d ! 型，到目前为止，国外对亚硝酸盐还 原酶的分离纯化、基因，特别是植物亚硝酸还原酶基因的表达和调控、结构研究有诸多报 道，并从多种微生物中分离纯化得到亚硝酸还原酶【5 3 7 l 】。相同亚硝酸还原酶在不同的电子 供体作为辅酶时不仅影响酶的活性，也影响酶的其它性质。例如，高祖明等 2 j 研究发现从 。大麦芽根部提取的亚硝酸还原酶利用n a d h 、n a d p h 、m v 作为电子供体时m v - 亚硝酸 还原酶的酶活力为n a d h 、n a d p h 的7 倍以上( 分别为6 6 0i u 、9 6i u 和8 8 砌) ，m v - - 亚硝酸还原酶经5 0 处理1 0m i n 处理完全失活，而n a d h 亚硝酸还原酶和n a d p h 亚硝 酸还原酶在此温度下分别有9 0 和6 9 的活性，但温度升至7 0 ，则不管哪一部分的 集美大学硕士毕业论文 产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 亚硝酸还原酶均丧失活力。m o i r 掣4 8 】人提纯了一种含铜蛋白，即假天青蛋白能在体外将电 子传递给e x t i 型亚硝酸还原酶，且这种蛋白的c u 2 + 中心被二乙基硫氨基甲酸酯螯合，而亚 硝酸还原酶被二乙基硫氨基甲酸酯抑制，所以认为假天青蛋白在体内将电子传递给了亚硝 酸还原酶。r o s a 等【7 3 】从h a l o f e r a xm e d i t e r r a n e i 中分离出亚硝酸还原酶，该酶在最适p h 7 5 和6 0 。c 时为最适反应条件，还原型甲基紫精( m e t h y lv i o l o g e n ，m v ) 和铁氧化还原蛋白具 有相同的电子供体效果。s o l o v e v v i 等【4 2 】用超声破碎和高速离心从a e h r g u t t a t u s ( s t r a i n9 2 1 ) 分离获得亚硝酸还原酶，该酶最适反应条件为p h7 4 、3 0 - 4 0 、还原型n a d p 和f a d 增 加酶活，降解亚硝酸盐产物为n o ，由于该酶高于5 0 后酶活完全损失，因此对亚硝酸盐 的残留无显著影响。刘萍等【体7 5 】从巨大芽胞杆菌中分离纯化得到亚硝酸还原酶，酶反应的 最适温度和p h 分别为4 0 和6 5 ，热稳定性较好，8 0 下保温4h 后仍有7 0 8 0 的酶活 力，将该酶和特异性辅酶组成的复合酶制剂，在肉的腌制过程中加入复合酶制剂，在不改 变蒸煮香肠的常规加工工艺条件下，使得亚硝酸盐的残留量比原来降低7 0 以上i 的j 。 1 4 课题研究的意义和内容 1 4 1 研究意义 亚硝酸盐作为国家食品卫生法允许使用的食品添加剂，在肉类加工中作为发色剂，不 仅能使制品呈良好色泽，而且还具有防腐和增强风味的作用。但是，亚硝酸盐进入人体后， 可形成具有致癌作用的亚硝胺，还会引起正常血红蛋白( 二价铁) 转变成正铁血红蛋白( 三 价铁) 而失去携氧功能，所以世界上许多国家呼吁严格控制亚硝酸或硝酸盐使用量，并积 极地研究利用可降解亚硝酸盐的微生物或其产生的亚硝酸盐还原酶，采用生物处理的方 法，来降低食品中亚硝酸盐含量。一般来说，对于亚硝酸盐问题的解决可以归结为两类： ( 1 ) 寻找一种添加剂可以全部或部分替代亚硝酸盐；( 2 ) 寻找一种添加物可以阻断产物 中亚硝酸盐的形成。对于前者而言，目前还没有找到可以替代亚硝酸盐的添加剂；对于后 者，人们采用了一些化学和生物的方法，但效果都不是很理想。 本课题组筛选出降解亚硝酸盐的微生物并利用其产生的亚硝酸盐还原酶，采用生物处 理的方法，来降低食品中亚硝酸盐含量。微生物降解亚硝酸盐菌株筛选方面的研究很少见， 有关亚硝酸盐还原酶的研究国内几乎没有，国外有关其应用的研究也几乎没有。所以本课 题的研究为解决亚硝酸盐问题提供了一个新思路，既有理论意义，又有现实指导价值。 1 4 2 研究内容 本课题组前期筛选和鉴定了一株产巨大芽孢杆菌b m e g a t e r i u mm p f 9 0 6 ，该菌产生的 亚硝酸还原酶具有耐高温、耐高盐的特性，但是其产酶活不高。 ( 1 ) 本论文利用该菌株作为出发菌株，进行紫外诱变育种，筛选高产菌株；同时研 究诱变菌株发酵生产亚硝酸还原酶的产酶优化培养基( 碳源、氮源和无机盐) 和培养条件 ( 温度、p h 值、接种量、摇床转速等) ； 9 集美大学硕士毕业论文 产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 ( 2 ) 提取亚硝酸还原酶粗酶液，研究亚硝酸还原酶的酶学性质，包括酶的温度、p h 稳定性，金属离子稳定性和电子供体等，同时还研究了酶制剂的保存方法； ( 3 ) 探究亚硝酸盐还原酶在肉制品中降低亚硝酸钠残留量的应用工艺，探究粗酶液 的添加量、添加时机、电子供体以及反应时间等对亚硝酸盐降解的影响。 1 0 集美大学硕士毕业论文产亚硝酸还原酶菌株发酵特性及酶在肉制品中的应用 第二章高产亚硝酸还原酶菌株选育及其发酵条件优化 2 1 引言 利用亚硝酸盐还原酶降解亚硝酸盐具有其他