（遗传学专业论文）成年小鼠睾丸间质细胞功能异质性研究.pdf

首都师范大学硕士学位论文 摘要 ( 雄性动物睾丸间质细胞的主要功能是分泌睾酮，而睾酮是维持精予发生和 雄性性征所不可或缺的类固醇激素。在类固醇激素的合成过程中，胆固醇由线粒 体外膜到内膜转运的过程是类固醇激素合成的限速步骤，这一步骤必需有类固醇 激素灵敏调节蛋白( s t a r ) 的从头合成才能完成。形态学和内分泌学研究表明： 睾丸间质细胞并不是一个匀质的群体，间质细胞这种分泌功能的异质性与s t a r 之间的关系是深入理解睾丸功能所不可缺少的重要环节。上 本研究首先采用逆向溶血斑法，鉴定单个间质细胞睾酮分泌上的差异， 然后，在被鉴定的同一问质细胞上进行原位杂交( f i s h ) ，以便在单个细胞水 平上确定间质细胞是否存在功能及s t a r 基因表达的异质性。结果显示：一类 间质细胞形成溶血斑，而且这类间质细胞经l h 刺激后，溶血斑的面积增大， 并且都能够检测到s t a rm r n a 及其蛋白信号，其s t a r 信号强弱与溶血斑的 面积成正比；另一类间质细胞不能够形成溶血斑，经l h 刺激后，这类间质细 胞周围仍无明变化，在间质细胞中未能检测到s t a r 信号的表达。因此可以说 明，按照间质细胞对l h 刺激的反应，至少可以将其分为两类，一类间质细胞 睾酮的分泌量显著增加，其睾酮合成需要s t a r 的参与，即所谓的灵敏调节途 径，是睾酮分泌的主要途径：另一类间质细胞没有明显的睾酮分泌或者其分泌 量低于本试验的探测灵敏度，若有睾酮分泌，其分泌途径与s t a r 的表达无关。 因此可以得出结论，机体睾丸间质细胞在睾酮分泌上并非均匀一致，其中有一 类并不参与l h 所调控的睾酮分泌，而可能与睾丸内细胞调节有关，然而，由 于本实验未就l h 受体作进一步的研究，还不能肯定这是由于该类细胞缺乏l h 受体还是由于他们缺乏s t a r 的表达，仍需要作进一步的研究ef 无疑，本研究 结果以及进一步的研究可为睾丸间质细胞调控的详细机制提供一个新的窗口， 对于深入理解雄性生殖生物学基础问题以及生殖生物学临床现象具有重要的 立义 关键词：睾丸间质细胞，、类固醇激素灵敏调节蛋白il h ，逆向溶血斑法? 免疫 组化j 原位杂交 i i l 首都师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h em a i nf u n c t i o no f l e y d i g sc e l l si ss e c r e t i n gt e s t o s t e r o n et h a ti sa n i n d i s p e n s a b l es t e r o i dh o r m o n e f o rb o t hs p e r m a t o g e n e s i sa n ds e xc h a r a c t e r i s t i ci n m a l e t h et r a n s l o c a t i o no fc h o l e s t e r o lf r o mt h eo u tt ot h ei n n e rm i t o c h o n d r i a l m e m b r a n ei sar a t e - l i m i t i n gs t e pt h a tr e q u i r e ss t e r o i d o g e n i ca c u t er e g u l a t o rp r o t e i n ( s t a r ) s y n t h e s i s d en o v oi ns t e r o i d o g e n e s i s m o r p h o l o g i c a la n d e n d o c m 0 1 0 9 i c a l e v i d e n c e sh a v ei n d i c a t e dt h a tt h ep o p u l a t i o no f l e y d i g sc e l l sa r en o t a h o m o g e n e i t y p r e s e n tw o r kf o c u so nw h e t h e rt h eh e t e r o g e n e i t yo f l e y d i gc e l l sh a sa n yr e l a t i o nw i t h e x p r e s s i o no f s t a rw h i c hi sv i r t u a l l yi m p o r t a n tt ou n d e r s t a n dt e s t i sf u n c t i o n f i r s t l y , a r e v e r s eh e m o l y t i c p l a q u ea s s a y ( r h p a ) w a s u s e dt os c a l e t e s t o s t e r o n es e c r e t i o no f l e y d i g sc e l l si ns i n g l ec e l l sl e v e l s e q u e n t i a l l y , s t a r m r n a e x p r e s s i o n w a sd e t e c t e d 弼t 1 1f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ( f i s h ) a tt h e s a m ec e l l s t h er e s u l t ss h o wt h a tak i n do f l e y d i g sc e l l sf o r mh e m o l y t i cp l a q u e s o b v i o u s l y t h ep l a q u e a r e ai n c r e a s e si nr e s p o n s et ol hs t i m u l ii nd o s e - d e p e n d e n t m e a n e ra n dt h es i g n a l so fs t a rm r n aa n dp r o t e i nw e r eo n l ys h o w ni nl e y d i gc e l l s w i t hh e m o l y t i cp l a q u ea n di n t e n s i t yo f t h es i g n a l sw a si np r o p o r t i o nt ot h ep l a q u e a r e a ( a m o u n to f t e s t o s t e r o n e ) ；i no t h e r k i n d o f l e y d i g sc e l l sn e i t h e rh e m o l y t i cp l a q u e n o rt h ef l u o r e s c e n ts i g n a lc o u l db es e e ne v e na f t e rs t i m u l a t i o no f l h a c c o r d i n gt o t h et e s t o s t e r o n es e c r e t i o nc o r r e s p o n d e n tt ol h s t i m u l i ，l e y d i g sc e l l sc o u l d b e d i v i d e d ，a tl e a s t ，i n t ot w op o p u l a t i o n s ：o n e c a l ls e c r e t et e s t o s t e r o n ei n c r e m e n t a l l y a f t e rl h s t i m u l i ，i nw h i c h s t a r p r o t e i ns y n t h e s i s i sn e c e s s a r y b y t h ew a ys o c a l l e d a na c u t er e g u l a t o r yp a t h w a y ；i na n o t h e rt e s t o s t e r o n es e c r e t i o nd i dn o to c c u ra ta l l w i t ho rw i t h o u tl h s t i m u l i ，i f a n y , i tw a sb e y o n d t h es e n s i t i v eo f r h p a t e c h n i c a l l y s ow ec a nc o n c l u d et h a tl e y d i g c e l l sa r eh e t e r o g e n e o u si nt e s t o s t e r o n es e c r e t i o n ，o n e o f t h e mi sr e g u l a t e db yl h t h r o u g ht h ea c u t er e g u l a t i o np a t h w a y , a n o t h e rm a y h a v e s o m ef u n c t i o ni nt e s t i so t h e rt h a nt e s t o s t e r o n es e c r e t i o nr e g u l a t e db yl h u n f o r t u n a t e l y , l hr e c e p t o r w a sn o ts t u d i e di np r e s e n tw o r k w h e t h e rl a c ko fl h r e c e p t o r o rl a c ko fs t a r e x p r e s s i o n i nt h o s ec e l l si ss t i l lu n k n o w n n e v e r t h e l e s s ，t h i s 首都师范大学硕士学位论文 w o r ka n df u r t h e rr e s e a r c h p r o v i d ean e ww a y t ol e a r nt h er e g u l a t o r ym e c h a n i s mo f l e y d i g sc e l l ，a n da r ev e r yi m p o r t a n tt ou n d e r s t a n da n d r o l o g i c a lq u e s t i o na n d c l i n i c a l s y m p t o mo f r e p r o d u c t i v eb i o l o g y k e yw o r d s ：l e y d i g sc e l l ，s t a r ，l h ，r h p a ，i m m u n o c y t o c h e m i s t r y f i s h v 首都师范大学硕士学位论文 名词缩写 r h p a ( r e v e r s eh e m o l y t i cp l a q u ea s s a y ) l h ( 1 u t e i n i z i n gh o r m o n e ) h c g ( h u m a n c h o r i o n i cg o n a d o t r o p i n ) a c t h ( a d r e n o c o r t i c o t r o p i ch o r m o n e ) s t a r ( s t e r o i d o g e n i ca c u t er e g u l a t o rp r o t e i n ) a m p ( a m p l i c i l l i n ) g n r h ( g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n gh o r m o n e ) f s h ( f o l l i c l es t i m u l a t i n gh o r m o n e ) p 4 5 0 s c c p k a ( p r o t e i nk i n a s ea ) c l a h ( c o n g e n i t a ll i p i da d r e n a lh y p e r p l a s i 小 f i s h ( f l u o r e s c e n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 逆向溶血斑法 促黄体素 人绒毛膜促性腺激素 促肾上腺皮质激素 类固醇激素灵敏调节蛋白 氨苄青霉素 促性腺激素释放激素 卵泡刺激素促滤泡成熟激素 侧链裂解酶 蛋白激酶a 先天性肾上腺皮质脂质增生症 荧光原位杂交 v 1 首都师范大学硕士学位论文 第一部分引言 雄性动物的睾丸问质细胞是类固醇激素合成细胞，它的主要功能就是分泌 雄性激素睾酮。在问质细胞密度大小( m e i s h a n d a g 锄as me ta l1 9 9 2 ) 、3 b 羟甾体脱氢酶的活性和调节方式( c o n 仃e f a s he t d l 9 9 4 ) 等方面的研究中，人们发现 间质细胞存在不同的亚型。所以，间质细胞并不是一个匀质的群体。 长期以来，人们认为类固醇激素合成的调节作用是指垂体促激素对侧链裂 解酶( p 4 5 0 s c c ) 活性调控的生化过程删o y a sg ce t 耐1 9 6 5 ) 。然而近年来随 着研究的进一步深入，人们却发现真正的限速步骤是胆固醇转运到线粒体内膜 的生物过程( b l a c ks m e ta l1 9 9 4 ) 。亲水性胆固醇通过简单扩散不易穿过线粒体 内外膜之间的水化层，因此胆固醇的转运速度直接就影响到了类固醇激素的合 成。研究证实在类固醇激素合成过程中，胆固醇由线粒体外膜到内膜的转运过 程需要类固醇激素灵敏调节蛋白( s t a r ) 的从头合成。 间质细胞中s t a r 负责将胆固醇由线粒体外膜转运到内膜，因此，s t a r 是 否表达也将影响睾丸间质细胞之间的功能差异。然而长期以来人们对睾丸间质 细胞异质性的研究仅局限在整体水平上对形态学和细胞化学的研究，而在单个 间质细胞水平上对分子基础的研究尚无一个明确的认识。 一睾丸间质细胞的研究 1 、雄性生殖基础 雄性动物的生殖器官包括外生殖器和内生殖器两个部分。它们在中枢神经 系统、下丘脑、垂体、睾丸性腺轴的内分泌调控下，完成雄性生殖过程。 睾丸既是产生精子的器官，又是分泌雄性激素的内分泌器官。这两种功能均接受 下丘脑垂体高级生殖中心的调节控制。显微镜下观察( 图1 ) ，睾丸实质被分为 1 0 0 2 0 0 个锥形小叶，每个小叶内有2 4 条长约3 0 - 8 0 厘米，直径1 5 0 2 5 0 微米细 而弯曲能产生精予的小管，称为曲细精管。曲细精管间的疏松结缔组织称为睾丸 间质。各叶的曲细精管向睾丸后缘汇集成直细精管，进而相互吻合为睾丸网，再 汇合成8 1 5 条输出小管，从睾丸后上缘穿出与附睾头部连接。 首都师范大学硕士学位论文 图l ：睾丸结构图 ( 1 b 中l 示问质细胞) 睾丸内主要有3 种特殊功能的细胞，包括曲细精管壁的生精细胞和支持细胞 以及睾丸间质中的间质细胞。精子产生于睾丸中盘曲的曲细精管生精细胞中，而 雄性激素睾酮就产生于睾丸间质细胞中。 2 、雄性激素的调节 睾丸的内分泌功能受上级生殖轴系激素的调节，调节睾丸生精功能的垂体 激素主要是由腺垂体分泌的黄体生成素( u d 和卵泡刺激素伊s 固。l h 主要作用 于睾丸间质细胞，而f s h 主要作用于生精细胞和支持细胞，因此就存在垂体。 间质细胞轴和垂体曲细精管轴两种调节机制。 卵泡刺激素f i s h ) ，又州促滤泡成熟激素：促进睾丸曲细精管产生精子。f s h 作用于生精细胞和支持细胞，可启动生精过程；f s h 可刺激支持细胞分泌a b p ， a b p 可与睾酮和双氨皋酮结合，从而提高二者在皋丸微环境中的局部浓度，有 利于生精过程：另外，f s h 还可使支持细胞中的睾丸酮经芳香化酶的作用而转 变为雌二醇，雌激素可能对睾酮的分泌有反馈调节作用，使睾酮分泌控制在一 定水平。直接注射睾酮并不能反馈性控制f s h 的分泌，反馈性控制f s h 主要 是靠睾丸分泌的抑制素( i n h i b i n ) ，抑制素可使垂体失去对下丘脑分泌的c m r h 的 反应性，从而反馈性地抑制垂体f s h 的分泌。 黄体生成素( l ) ，又叫间质细胞刺激素( i c s h ) ：主要作用于间质细胞的腺 苷酸环化酶系统，促进睾丸的间质细胞分泌雄性激素( 图2 ) 。由垂体分泌的l h 经血液循环到达睾丸后，与问质细胞膜上的l h 受体相结合，从而引发问质细 2 首都师范大学硕士学位论文 胞合成睾酮。睾酮经分泌进入血液循环后，主要从三个方面起作用：一是直接 与靶器官的睾酮受体结合，促进蛋白质合成；二是经5 2 还原酶作用而转化为双 氢睾酮；三是经芳香化酶作用而转化为雌激素。另外还有其他一些作用途径。 如果垂体分泌l h 不足，则睾丸间质细胞萎缩，睾酮合成减少。反之，血液中 的睾酮和雌激素水平可反馈性地控制腺垂体分泌l h 的能力和下丘脑分泌 g n r h 的能力。因此存在垂体一间质细胞轴和垂体曲细精管轴两种调节机制。当 垂体有病变，或受到药物影响而抑制，或切除垂体而缺乏促性腺激素时，就影 响了睾丸的生精及内分泌功能，使曲细精管和间质细胞发生萎缩。研究表明， 垂体前叶活动又受下丘脑的神经细胞控制。下丘脑的神经细胞还可以分泌一些 特殊的化学递质来控制垂体前叶细胞的活动，这些化学递质称为释放因子( r f ) 。 当然睾丸本身的活动对垂体和下丘脑也有反馈作用( 图3 ) ，在正常时三者达到 一种动态平衡。 卑至，擘婆要竺登耋寞成 图3 ：雄性生殖活动 此图引自( 薛社普论文集) 。 3 、睾丸间质细胞的形态特征 睾丸间质细胞也称睾丸间隙细胞，是l e y d i g 于1 8 5 0 年首先命名并加以描 首都师范大学硕士学位论文 述的( 王建辰主编1 9 9 3 ) ，直到本世纪6 0 年代才肯定了其主要功能是分泌睾酮， 其分泌活动受丘脑下部、垂体以及自身的调节。睾丸间质细胞分泌的睾酮和少 量的雌二醇对促进精子的产生和维持雄性的第二性征具有重要作用。哺乳动物 体内的雄激素9 5 由睾丸l e y a i g 细胞分泌的。 3 1 形态结构 成熟型间质细胞呈圆形或多边 形( 图4 ) ，核圆居中，核仁明显，异 染色质位于核边缘，细胞质嗜酸性。 间质细胞具有分泌类固醇激素的细 胞结构特点。滑面内质网较多且有丰 富的合成胆固醇的酶，因而滑面内质 网的发达程度往往反映间质细胞合 成胆固醇的能力，也反映间质细胞合 成雄激素的功能状态。 图4 ：间质细胞超微结构模式图 滑面内质网在胞质中可从一处移向另一处，这种现象可能与转运胆固醇有 关。细胞的高尔基复合体发达，虽然在高尔基体区未见分泌颗粒，但细胞受脑垂 体促性腺激素刺激后，可见高尔基复合体囊泡膨胀，因而推测高尔基复合体与类 固醇激素的合成分泌有关。间质细胞内的线粒体大而丰富，呈多边形，主要是管 状嵴线粒体，线粒体基质中富于脂肪酸1 3 氧化酶系。细胞质中常有脂滴。一般认 为，细胞本身合成的胆固醇或细胞从外界摄取的胆固醇很快被酯化，并以脂滴形 式积聚在胞质中。在脂滴周围的胞质中，有可溶性脂肪酸存在。在脂肪酶作用下， 脂滴中的胆固醇酯可释放出游离的胆固醇。睾丸间质细胞中的脂滴分布、大小和 数量不一，脂滴中含有合成类固醇激素所需的基本物质。因此，合成功能活跃的 间质细胞利用脂滴中的物质比较快，脂滴较少，体积也小；反之，合成功能不活 跃的间质细胞，脂滴较多，体积也大。脂滴含量的多少，在一定程度上可作为衡 量问质细胞功能的一个形态学指标，但不能仅依据个别或少量细胞中脂滴增多而 得出间质细胞功能障碍的结论。间质细胞表面有微绒毛。相邻间质细胞间有缝隙 连接和桥粒。缝隙连接有利于细胞间某些离子和小分子物质的交换，如c n p 就 易于通过。滑面内质网与缝隙连接关系密切，在滑面内质网上富含合成类固醇激 4 首都师范大学硕士学位论文 素的酶，而c a m p 则能刺激问质细胞合成类固醇激素。因此，缝隙连接不仅是间 质细胞物质运输的重要通道，而且也是对类固醇激素合成起局部调节作用的信号 传递部位。 3 2 不同时期睾丸间质细胞的变化 根据间质细胞的年龄变化，一般将间质细胞归纳为以下几个发育阶段：胚 胎期间质细胞，婴幼儿期间质细胞，青春期前间质细胞，青春期间质细胞，成 年期间质细胞以及老年期间质细胞。某些动物的细胞还存在季节性变化。人胚 胎第8 周，可见分化前胚胎期间质细胞，里长梭形。以后逐步变为圆形或多边 形，细胞结构也呈现出合成类固醇激素的活跃状态。胚胎第9 1 4 周其转化为 分化型间质细胞。在胚胎第1 4 1 8 周，睾丸间质细胞发育为胚胎成熟型，形成 雄激素分泌的第一次高峰。随后，间质细胞并行退化。至第7 个月，间质细胞 己十分稀少，表现为一种去分化倾向，呈成纤维细胞样状态。出生后，间质细 胞进一步退化，称为婴幼儿期间质细胞。青春期前( 2 1 2 岁) 睾丸间质细胞 中又开始出现未成熟型间质细胞，这是一种静止型间质细胞，无合成、分泌雄 激素的能力。至青春期，大量成熟型间质细胞出现，这些间质细胞不仅具有成 年期细胞的形态结构特点，而且细胞内出现丰富的与类固醇激素合成有关的酶， 表明睾丸间质细胞已进入合成和分泌类固醇激素的功能时期。此时，体内出现 了雄激素分泌的第二次高峰期。在成年期，睾丸间质细胞的数量、结构和功能 保持相对稳定。对于老年期睾丸间质细胞的变化，虽然有不同的说法，但一般 情况下，随着年龄增长，睾丸间质细胞发生退行性变，表现为空泡增多，脂滴 和色素积聚，细胞数量也逐步减少。成熟型间质细胞不再分裂，但l h 能促进间 质细胞数量增多。增加的细胞可能由其他前体细胞分化而来。成熟型间质细胞 和胚胎型间质细胞存在功能差异，后者胞内5 a - - 还原酶、芳香化酶活性低，膜 l h 受体无l h 所致的下调现象，故能生成更多的雄激素。 4 、间质细胞中睾酮合成调节 近年来的研究表明，间质细胞的分泌活动主要受丘脑下部一垂体一性腺轴 的不同水平所分泌的一系列物质的调控。下丘脑分泌的g n r h 经垂体门脉到达 腺垂体，促进腺垂体促性腺激素细胞合成和分泌精子生成素( f s h ) 和间质细 首都师范大学硕士学位论文 胞雌激素( l h ) 。l h 与间质细胞上的l h 受体结合后，激活腺苷酸环化酶，促进 细胞内c a m p 的生成。c a m p 在激活c a m p 的蛋白激酶，促进蛋白质的磷酸化 过程，产生磷酸蛋白，从而使胆固醇经过一系列中间过程最终生成睾酮。在胆 固醇到睾酮的转化过程中，主要涉及到下列几个步骤：( 1 ) 胆固醇必须从线粒 体外膜转运到内膜才能参加类固醇合成，转运过程中需要类固醇激素灵敏调节 蛋白( s t a r ) 参加才能完成，而s t a r 还可加速胆固醇向胆固醇侧链裂解酶 p 4 5 0 s c c 的传递，这是睾酮合成的限速步骤。( 2 ) 胆固醇转运到线粒体内膜后， 在胆固醇侧链裂解酶p 4 5 0 s c c 催化下变成孕烯醇酮，p 4 5 0 s c c 是类固醇合成的一 个限速酶。( 3 ) 孕烯醇酮可直接变为孕酮，两者在1 7 羟化酶1 7 2 0 羟孕烯醇酮 ( 1 7 羟孕酮) 作用下依次转变为1 7 羟孕酮和去氢表雄酮( 雄烯二酮) ，p 4 5 0 c 1 7 是另一个限速酶。( 4 ) 去氢表雄酮在1 71 3 羟甾脱氢酶( 31 3 一h s d ) 催化下可转 变为雄烯二酮。( 5 ) 3b 羟甾体脱氢酶( 3b h s d ) 可催化雄烯二酮变为睾酮， 31 3 一h s d 也是类固醇合成的限速酶。对于间质细胞分泌活动的研究就主要是围 绕这些调节因子而展开的。 4 1 非支持细胞分泌物对间质细胞的调控 ( 1 ) l i i h c g 对间质细胞的调控 l h 和h c g 对间质细胞的作用是直接的，间质细胞上的l h 受体既可以和 l h 结合，又可以和h c g 结合。l h h c g 与间质细胞上的受体结合后，可使细 胞膜上c a m p 产生增加，蛋白激酶活性升高，进而影响到特殊蛋白的磷酸化、 胆固醇酯的水解增加、线粒体膜对胆固醇的通透性增高、胆固醇侧链活性增强 等一系列过程，从而使睾酮分泌增加。 间质细胞对l h h c g 的反应决定于l h h c g 的剂量、l h 受体数目和结合能 力。给成熟的大鼠一次生理剂量的l h h c g 处理，可产生一个缓慢但很稳定的 调节作用，使间质细胞上的l h 受体数目以及睾酮的合成和分泌都增加；一次 大剂量的l h h c g 注射可使间质细胞上的l h 受体数目迅速增加( 3 6 小时) ， 如果紧接着再注射一次大剂量的l h h c g ，问质细胞上的l h 受体数目则明显减 少，对l i - i h c g 的反应性降低，甚至消失。 问质细胞膜上的l h 受体( l h r ) 属于g 蛋白偶联型受体，当l h 与其结合后， 激活腺苷酸环化酶，使间质细胞内c a m p 水平升高，触发了细胞内的级联反应， 首都师范大学硕士学位论文 最终导致间质细胞合成、分泌睾酮。在生理条件下，l h 对间质细胞合成和分泌 睾酮有即时效应、营养效应二种调节方式。前者指在短时间内，l h 促使间质细 胞合成和分泌睾酮量增加，其主要机制是：在l h 作用下，间质细胞骨架发生了 有利于胆固醇从贮存部位快速转运至线粒体外膜的变化：胆固醇转运蛋白s t a r 、 p b r 快速合成，使胆周醇加速转运至线粒体内膜上的胆固醇侧链裂解酶，提高 了胆固醇转化为孕烯醇酮的速度；同时，睾酮合成过程中的一些重要蛋白质也 发生磷酸化。在即时效应之后，l h 对间质细胞表现为营养效应。研究表明，生 理浓度的l h 对维持间质细胞数量有重要作用，并能调节睾酮合成相关酶的基因 表达和其活力，如l h 能增加p 4 5 0 s c c 、3 b h s d 的表达量，而p 4 5 01 7 a 一羟化 酶依赖于l h 刺激后的c a m p 生成等，从而增强间质细胞合成睾酮的能力。然而， 超生理剂量的l h ，则会导致问质细胞合成和分泌睾酮障碍。其原因是使l h r 数 量减少或失活，致使睾酮合成发生障碍。有报道称，大剂量l h 能引起胆固醇侧 链裂解酶和细胞色素p 4 5 0 系统活力下降，并激活芳香化酶活性，刺激雌二醇生 成；雌二醇通过雌激素受体，除能抑制p 4 5 01 7 a 一羟化酶表达外，还合成一种 能抑制p 4 5 01 7 a 一羟化酶活性的新蛋白质。 ( 2 ) 糖皮质激素对间质细胞的调控 s a n k a rb r 等通过实验发现，糖皮质激素能够引起睾丸间质细胞睾酮分泌减 少，但血清l h 水平无明显变化，明显降低了类固醇生成酶如3 b - h s d 的活性， 给睾丸间质细胞l h 刺激不能补偿已降低的类固醇生成能力。此外许多研究已 表明间质细胞上存在糖皮质激素受体。因此，我们认为糖皮质激素，能经胞内 受体介导，直接抑制睾丸间质细胞睾酮的合成，并且是一个不依赖于l h 的过 程，而是一个经糖皮质激素受体介导的对睾丸间质细胞直接作用的过程，其结 果是导致睾酮生物合成中1 个或几个酶活性降低，睾酮的合成量减少。 g a oh b 等研究不同发育阶段睾丸间质细胞对糖皮质激素的敏感性时发现， 糖皮质激素还能够促进睾丸间质细胞凋亡，从而抑制睾酮产生。 4 2 支持细胞分泌物对间质细胞的调控 l e j e n u eh 等发现人睾丸间质细胞与人睾丸支持细胞共同培养，4 8 小时后， 睾酮分泌量与单独培养人睾丸间质细胞时睾酮分泌量显著升高。同时观察到 3 b h s d 异构酶、p 4 5 0 s c c 、细胞色素p 4 5 0 c 1 7m r n a 水平升高，i g f 1m r n a 首都师范大学硕士学位论文 水平也高于单独的睾丸间质细胞和单独的支持细胞培养时产生的总量。表明成 年人睾丸间质细胞与支持细胞共同培养时i g f 1 产生增加，介导几种类固醇生 成酶m r n a 表达增加，从而使睾酮分泌明显升高。许多实验表明，i g f 1 能增 加睾丸间质细胞睾酮产生，除通过增加几种类固醇生成酶m r n a 表达外，还提 高l h h c g 受体m r n a 水平( l e j e n u e he ta l1 9 9 8 、l e r o y ce ta l1 9 9 9 ) 。 总之，间质细胞的睾酮生物合成调节机理是相当复杂的。支持细胞与间质 细胞紧密相邻，在睾酮合成的旁分泌调节中起着重要的作用，它可以通过所分泌 的各种物质对睾酮的生物合成起着正负调控。除i h l 】c g 、睾酮、支持细胞分泌 物外，g n r h 及其拮抗物( 向红丁1 9 8 4 ) 、钙离子( 童建新1 9 9 0 ) 、表皮生长 因子( 王明伦译1 9 8 7 ) 等也能调节间质细胞的分泌活动，但是直到目前为止， 它们的具体作用机制还有待于人们进一步探讨。 二s t a r 研究 j o h n s o n 等首先观察到，小鼠的肾上腺细胞在促肾上腺皮质激素( a c t h ) 的刺激下产生类固醇皮质激素的过程中，有一个3 0 k d a 蛋白的合成( s t o n e de ta l 1 9 5 4 ) ，而且3 0 k d a 蛋白的表达与类固醇激素的合成有着密切的时效和时空关 系( t o w n s o n d he t a l l 9 9 6 ) 。除3 0 k d a 外，s t a r 还有两种前体蛋白，大小为3 7 k d a 和3 2 k d a 。3 7 k d a 前体蛋白在细胞质中合成，在通过线粒体内、外膜运输胆固 醇的过程中，经过两次裂解生成3 0 k d a 的成熟蛋自( s t o e e od m e ta l1 9 9 1 ) 该蛋 白于1 9 9 4 年被纯化、克隆并在体外获得表达，1 9 9 6 年命名为s t a r 蛋白( s t o e c o d me ta l1 9 9 6 ) ，或者按照其功能称为类固醇激素灵敏( 或急性) 调节蛋白。 1 、s t a r 的结构 对3 7 k d a 的s t a r 前体蛋白结构及其基因的研究发现，它的e d n a 核苷酸 序列及其表达的氨基酸序列都是唯一的( c l a r k b je ta l1 9 9 4 ) ，这也证明它是一种 新型的蛋白质。大鼠和人的s t a r 基因位于第8 号染色体上，有7 个外显子和6 个内含子，其假基因位于第1 3 号染色体上。s t a r 在不同的物种问具有很高的 同源性，一致性约为8 5 0 一9 0 。 3 7 k d a 的s t a r 前体蛋白有2 8 5 个氨基酸( s t o c c o d m e t a l l 9 9 1 、c l a r k b je t d ，1 9 9 4 、s u g a w a r a t e t a l1 9 9 5 ) 。在m a 1 0 、c o s 1 细胞中s t a r n - 末端6 2 个 8 首都师范大学硕士学位论文 氨基酸的缺失对胆固醇的转运没有影响，但是这种s t a r 蛋白不能进入线粒体。 然而，当c - 末端2 8 个氨基酸缺失时，类固醇激素的合成将停j j z ( a r a k a n e fp td ， 1 9 9 6 、w a n g xe ta l1 9 9 8 、a v d l g a n efe ta l1 9 9 8 ) 。这表明s t a r 蛋白的n 末 端与其自身穿越线粒体膜有关，而s t a r 蛋白的c 末端才是转运胆固醇所必需 的。 与s t a r 蛋白c 一末端同源的蛋白有m l n 6 4 、s t a r d 4 、s t a r d 5 、s t a r d 6 等， 它们在c o s - 1 细胞中的表达也能够增加类固醇激素的合成。这些蛋白都有一段 与脂类转运相关的区域( s t a r t ) ，通过对s t a r t 纯化结晶，人们比较发现， 它们之间s t a r t 的四级结构非常相似，而且都有一个疏水通道，大小为2 6 1 2 1l 埃，足够容纳一个胆固醇分子( t s u j i s h i t aye ta l2 0 0 0 、r a y m o n ds ee ta 1 2 0 0 2 ) ，这可能与s t a r 蛋白的作用机制有密切关系。 2 、s t a r 蛋白的作用机制 s t a r 蛋白是如何将胆固醇由线粒体外膜转运到内膜的，至今还不完全清 楚。早期的推测是：s t a r 蛋白在细胞质中合成，在转入线粒体内膜的过程中， 线粒体内外膜之间形成接触点作为疏水通道，胆固醇由此进入内膜( s t o c c od m e ta l1 9 9 6 ) 。不久，这种假说就被证明有缺陷，因为n 末端6 2 个氨基酸缺失的 s t a r 蛋白不能进入线粒体，但是对胆固醇的转运没有影响( a r a k a n efe t a l 1 9 9 6 、w a n g x e t a l1 9 9 8 ) 。可能胆固醇的转运仅与s t a r 蛋白c 末端区域的氨 基酸有关。 k a l l e r 等认为s t a r 作为胆固醇转运蛋白，增强了线粒体内外膜的通透性， 胆固醇从外膜到线粒体内膜更容易被转运( k a l l e nc b e ta l1 9 9 8 ) 。s t a r 通过n 末端直接作用于线粒体外膜，利用c 末端在线粒体外膜产生某种“载体”物质， 它能够使胆固醇由外膜转运到内膜。这种推测比较合理，因为s t a r 作为胆固 醇转运蛋白是特异性的，当用磷脂酰胆碱代替胆固醇时，这种转运就不能进行。 然而，至今还没有人检测出这种“载体”物质，可能是s t a r 蛋白转运胆固醇 时产生的载体物质太少或者该物质的生存时间太短而难以检钡d ( k a l l e nc be ta l 1 9 9 8 、m a r t i n e z fe t a l l 9 9 7 、a r a k a n e fe t a l l 9 9 8 ) 。 最近m i l l e r 等研究发现( b o s e h se la l1 9 9 9 ) ，当线粒体p h 值微环境发生变 9 首都师范大学硕士学位论文 化时，s t a r 蛋白的分子构相也随之改变。他们推测胆固醇是通过s t a r 构相的 变化进入线粒体内膜的。但这一假说也不能圆满的解释所有问题。 3 、s t a r 的表达调控 垂体促激素对类固醇激素生成细胞的作用是通过第二信使系统介导的， c a m p 依赖的蛋白激酶a ( p k a ) 促使s t a r 磷酸化，该磷酸化是s t a r 发挥正 常功能的重要步骤，当然，这一过程还需要由蛋白激酶c ( p k c ) 的协同参与。 随着研究的进一步深入，人们对s t a r 的表达调控有了更深入的了解。 3 1 调节因子对s t a r 基因的调控 s t a r 基因除受l h ( s e k a rn e ta l2 0 0 0 ) 、f s h ( l a v o i eh ae ta l1 9 9 9 ) 等这些 调节因子调控外，最近发现类固醇激素的合成还需要花生四烯酸的参与( c o o k e b ae t a l1 9 9 1 ) 。花生四烯酸作用于蛋白激酶a ( p k a ) 之后、p 4 5 0 s c c 之前。通 过抑制磷脂酶a 2 的活性，花生四烯酸代谢受阻，使s t a r 蛋白表达受到抑制， 从而，进一步影响到类固醇激素的合成( w a n g xe ta l1 9 9 9 ) 。更深入的研究发现， s t a r 蛋白表达受阻出现在转录水平上，花生四烯酸的代谢参与了s t a r 基因的 表达( w a n g xe t a l 2 0 0 0 ) 。这些结果表明，除c a m p 第二信使外，花生四烯酸或 其代谢产物之一也是s t a r 基因表达和类固醇激素合成所必需的。 此外，s t a r 基因还受一些调节因子的负调控。前列腺素f 2 a ( j u e n g e l 儿e t a l 2 0 0 0 ) 、防线菌素d ( c l a r k b j e t a l l 9 9 7 ) 过量表达的d a x - 1 蛋! l ( z a z o p o u l o s e e t a 1 9 9 7 、l a l l iee ta l1 9 9 8 ) 等通过抑制s t a r 基因转录使类固醇激素合成水平下降。 3 2s t a r 基因的启动子 s t a r 基因的表达受许多调节因子的正负调控，这些调节因子与s t a r 启动 子上的调控元件是相互作用的。促垂体激素刺激s t a r 蛋白表达和类固醇激素合 成的同时，细胞内c a m p 含量也增加。但是s t a r 基因的启动子区域没有c a m p 识别元件，c a m p 结合蛋白也不能直接作用于s t a r 启动子区。然而，c a m p 结 合蛋白间接作用于s t a r 启动子的可能性是存在的。因此，s t a r 启动子与c a m p 结合蛋白的相互作用需要进一步研究。 类固醇激素合成因子( s f 1 ) 是s t a r 基因的重要调控元件之一。s f 一1 已 经定位，大鼠有5 个s f 1 位点，不同物种的大多数s f - l 在s t a r 启动子的结合 1 0 首都师范大学硕士学位论文 区域是一致的，位于- 9 7 与- 4 2 之间，这段序列高度保守- ( s a n d h o f f t w “盯，1 9 9 8 ) 。 s f 一1 剔除的小鼠在其胚胎的泌尿生殖脊中没有检测到s t a rm r n a ( c a r o nk me t a l1 9 9 7 ) ，说明s f 1 在s t a r 基因转录中起重要的作用。 除s f - 1 参与s t a r 基因的调控外，c c a a t 增强子结合蛋白( c e b p s ) 作 为细胞分化调控因子也参与了s t a r 在特定时空的表达( s i l v e r m a ne “口，1 9 9 外。 研究发现c e b p s 在间质细胞和卵巢的颗粒细胞中有c e b p c t 和c e b p l 3 两种表 达，c e b p l 3 i 够激活s t a r 启动子，并且s f l 的激活取决于有功能c e b p 结 合位点的存在，表明s f - 1 和c e b p l 5 在启动子上以复合体的形式存在。 除正调控元件外，s t a r 启动子还含有负调控元件抑制s t a r 的转录。 d a x - l 蛋白就是一个不寻常的调节因子，它的d n a 结合区域没有锌指结构， 蛋白质n - 末端是由6 5 - 6 7 个氨基酸组成的重复序列。在小鼠的肾上腺瘤细胞中， 过量表达的d a x - 1 蛋白通过发夹结构与s t a r 启动子区域的d n a 单链结合， 从而抑制类固醇激素的合成( z a z o p o u l o se e ta l1 9 9 7 ) 。研究发现，d a x - i 蛋白 直接作用于s f 1 ，抑制了s t a r 的转录，最终抑制了类固醇激素的合成。 总之，s t a r 基因的转录需要转录调控元件，这些位点的突变将抑制s t a r 转录，但是这些调控元件和转录因子的相互作用还不清楚，尚需要进一步研究。 4 、s t a r 蛋白与生殖发育 如前所述，s t a r 蛋白的表达与类固醇激素的合成在时空上有密切关系。 首先，s t a r 蛋白的表达仅限于肾上腺、睾丸、卵巢等与类固醇激素生成有关的 细胞和组织中。其次，s t a r 蛋白在不同的生理发育阶段，表达的水平是不一样 的，如牛黄体早期，s t a r 蛋白的表达水平低，黄体中期，s t a r 蛋白的表达水 平升高，而黄体晚期，s t a r 蛋白的表达水平又下降，并且，s t a r 的表达与孕 酮形成的水平是一致的。可见，s 俄r 的表达可作为黄体功能的可靠指标。 先天性肾上腺皮质脂质增生症( c l a h ) 是一种致死的疾病。早些时候人们 认为，c l a h 病人肾上腺中含有大量的胆固醇、胆固醇脂，睾丸间质细胞中含 有大量的脂滴是因为线粒体内膜上酶p 4 5 0 s c e 的基因发生突变导致这些底物不 能转化为孕烯醇酮。后来证明并非如此，因为c l a h 病人的p 4 5 0 s e c 基因是正 常的，而s t a r 基因却发生了突变。c a r o n 等通过s t a r 敲除的办法，培育出s t a r 首都师范大学硕士学位论文 基因缺失的小鼠( t o m o n o b uh e ta l2 0 0 0 ) 。观察发现，所有的小鼠都不能正常的 发育，在较短时间内死亡，小鼠血清中皮质酮和醛固酮含量下降，而a c t h 、 c r h 的含量上升，这表明肾上腺类固醇激素合成途径被破坏，而使下丘脑和垂 体失去了负反馈调控。而且s t a r 敲除的小鼠表现的生理症状与c l a h 病人症 状非常相似，这为s t a r 蛋白是胆固醇转运过程中必不可少的理论提供了强有力 的证据。 目前的研究已经证实胆固醇到孕烯醇酮的转化是类固醇激素生物合成的必 经途径，已经有证据表明s t a r 蛋白可能的作用机理( 图5 ) ，该反应的底物胆 固醇由线粒体外膜到内膜的转运过程需要依赖于类固醇激素灵敏调节蛋白 ( s t a r ) 的合