（生物化学与分子生物学专业论文）单链胰岛素体外折叠的研究.pdf

中文摘要 蛋白质是细胞。 一起作用的分子。从m r n a 翻译成线性的多肽，要经过平确的折叠和 组装过程j 能形成共有特定空问结构和生物学功能的蛋白质。冈此蛋白质折叠是生命利学 领域中的一个基本问题。1 9 6 0 年a n f i n s e n 旨先提出了一个重要的理论：“蛋白的缴序列 决定了。g - 的高级结构”。这理论促进了蛋白质折叠在理论和实践方而的进步。本论文包 括了两部分工作。第一部分工作研究了猪胰岛素前体体外解折叠路径。猪胰岛素前体体外 再折叠路径已经得到了较好的研究，而其解折叠路径却尚未被报道，所阻通过改变解折叠 条件来研究其解折叠路径。主要从两个方而改变试验条件：一是选择一个合适的氧化还原 体系，而不用之前的含有变性剂的体系；二是我们降低了反应体系的温度，使中间体之问 的转化速度降低，从而可以捕获到更多的中问体。这部分工作主要受到二硫键稳定性实验 的启发存低温条什r 含二硫键的蛋白质在适当的氧化还原体系中反应后，蛋白质的天然 状态会经过一些中间体形式逐渐转变为完全还原状态。因为体系所用的是o ，所阱在这 样的条件f 就会使二硫键之间的交换和二硫键巯基之间的反应变慢，就可以捕获到更多 的中间体。通过对小l 刊氧化还原体系下中问体含量的比较，我们选用的反应体系 f g s h g s s g 的比值为4 0 1 ，p p _ 以o 1 5 m 砂l 的浓度溶丁该体系巾o 反应1 6 小时。用 h p l c 分离纯化在这样的体系rp 口的不同中削体彤式。奉试验中我们捕获并用质谱鉴定 了6 个中f 几j 体，其中何4 个中问体含有两对。硫键，另外2 个巾f 刮体含有对二硫键。通 过分析这些r r _ 间体f 内二硫键连接方式，我们推出了猪胰岛素前体的解折叠路径同时通过 比较解折叠中f 兀j 体与再折叠中间体，我俐发现它俐含有相同的巾问体。凼为捕获到的解折 叠口】体比冉折叠巾间体要多，所以通过对猪胰岛素前体的体外再折叠的研究，川以补允 它的再折叠途轻。透过埘猪胰岛素前体觯折叠途释与再折叠途径的比较，再次证明了胰岛 紊家族的体夕 折叠解折窨通过类似但村 反的途径。本沦文第二部分t 作研究了猪胰岛素 莳体不同的氨基酸何点对它折叠的影响。分别突变猪腴岛素前体b 链的篇1 0 和1 6 位氨 笨酸，得到了两个突变体 b 1 0 d p i p h b 1 6 a p i p 。通过埘它们的c d 分析，二硫键稳定 。i 牛分析及体外再折替广：率利速率的研究发驯二如果蛋白质的绵构和一硫键的稳娃性高，它 的体外冉折叠产率和速率也大；反之也成 。斟此推测蛋白质的结构稳定件与它的体外雨 折叠可能仃在一定的斗h 火性，但是0 ，需更多试验柬证明。 关键诃：胰岛素，猪胰岛素前体，解折叠，折叠，- i i 体 浙江珲l 人。学硕十。了位论文 a b s t r a c t p r o t e i n sa r ew o r k i n gm o l e c u l c si nt h ec e l lk i n g d o m t i l et r a n s l a t e dl i n e a rp o l y p e p t i d ef r o m m r n am u s tu n d e r g oaf o l d i n gp r o c e s s ，t h e nb e c o m e sap r o t e i nm o l e c u l ew i t hs p e c i f i cs t r u c t u r e a n db i o l o g i c a lf u n c t i o n t h e r e f o r e ，p r o t e i nf o l d i n gi saf u n d a m e n t a lp r o b l e mi nl i f es c i e n c e ， w h i c hh a db e e ns t u d y i n gs i n c ea n f i n s e na n dh i sc o w o r k e r sf i r s t l yd e m o n s t r a t e dt h a tt h e t h r e e d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo fag l o b u l a rp r o t e i ni su n i q u e l yd e t e r m i n e db yi t sa m i n oa c i d s e q u e n c ea n dal o to fs i g n i f i c a n ta d v a n c e sh a v eb e e nm a d ei nt h eu n d e r s t a n d i n go fp r o t e i n f o l d i n gt h r o u g he x p e r i m e n t a la n dt h e o r e t i c a la p p r o a c h e s t h i st h e s i sc o n s i s t so ft w op a r t s t h e f i r s tp a r ti st h ei n v e s t i g a t i o no ft h eu n f o l d i n gp a t h w a yo fp o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o r t h e r e f o r e ， x , v et r i e dt od e d u c et h eu n f o l d i n gp a t h w a yo fp o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o rt h r o u g hc h a n g i n gt h e u n f o l d i n gc o n d i t i o ni nt w os i d e s w eu s e dt h er e d o xc o n d i t i o ni n s t e a do fd e n a t u r a n ts ot h a tt h e i n t e r m e d i a t e sc o u l dn o tt a k eo n h a v eo rn o n e i na d d i t i o n ，w ec h o s e nt h el o wt e m p e r a t u r ef o r u n f o l d i n gr e a c t i o no fp o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o r b a s e do no u rp r e v i o u sw o r k o f d e t e r m i n i n gt h e d i s u l f i d es t a b i l i t yo fp o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o ra n di t sa n a l o g u e s ，w es t u d i e di nv i t r ou n f o l d i n g p a t h w a y so ft h ed i s u l f i d e c o n t a i n i n gp r o t e i n sb yt h i sa p p r o a c h t h ea p p r o a c hw a st h a ta d i s u l f i d e c o n t a i n i n gp r o t e i nw a sd i s s o l v e di nar e d o xs y s t e mc o n t a i n i n gas t d t a b l er a t i o no f r e d u c e dg l u t a t h i o n et oo x i d i z e dg l u t a t h i o n ec h o s e nf o rt h ep r o t e i n t h er e a c t i o nw a sc a r r i e do u t a t0 。cf o rl6 h r t h ei nv i t r ou n f o l d i n gp a t h w a y so ft h ep r o t e i nc a nb ed e d u c e dt h r o u g h p u r i f y i n gm i da n a l y z i n gt h ec a p t u r e di n t e r m e d i a t e s w eu s e dt h em e t h o dt os t u d yt h ei nv i t r o u n f o l d i n gp a t h w a y so fp o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o r ，a n ds i xe q u i l i b r i u mi n t e r m e d i a t e s ，i nw h i c h f o u ro ft h e mc o n t a i n e dt w od i s u l f i d e sa n d t w oc o n t a i n e do n ed i s u l f i d e ，w e r eo b t a i n e dt h r o u g h p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n ，a n da n a l y s i so f t h es i xe q u i l i b r i u mi n t e r m e d i a t e s ，w ed e d u c e dt h e i nv i t r ou n f o l d i n gp a t h w a yo fp o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o r c o m p a r i n gt h eu n f o l d i n gi n t e m a e d i a t e s t ot h ef o l d i n gi n t e r m e d i a t e s ，w ef o u n dt h e r ew e r et h es a m ei n t e r m e d i a t e si n f o l d i n ga n d u n f o l d i n gp a t h w a yt h e r e f o r e ，i tc e r t i f i e dt h ei nv i t r of o l d i n g u n f o l d i n gp a t h w a ym a yb es i m i l a r a n ds h a r e ds o m ec o m m o ni n t e m m d i a t e sb u tr e v e r s e t h es e c o n dp a r ti st h ei n v e s t i g a t i o no ft h e c o n t r i b u t i o no f d i f f e r e n ta m i n oa c i d st ot h ef o l d i n go f p i p h e r e i n ，t w op o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o r n m t a n t s ， b i o d p i pa n d b 1 6 a p i pw e r eu s e di n t h i ss t u d i e sw es t u d i e dt h e i rs t r u c t u r a l s t a b i l i t y , d i s u l f i d es t a b i l i t y , a n di n v i t r or c f o l d i n ge f f i c i e n c y b10 d m u t a n ti n c r e a s e dt h e 浙江理上人1 、浮硕十。学位论文 s t r u c t u r a ls t a b i l i t ya n dr e f o l d i n gy i e l d s ；w h i l e b16 a m u t a n tw a so nt h ec o n t r a r y s ow e d e d u c es t r u c t u r a ls t a b i l i t yo fp r o t e i nm a yb er e l e v a n tt oi t st b l d i n gi nv i t r o k e yw o r d s ：i n s u l i n ，p o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o r ，u n f o l d i n g ，f o l d i n g ，i n t e r m e d i a t e 浙江理1 大学硕十学位论文 缩略表 b p t i b o v i n ep a n c r e a t i ct r y p s i ni n h i b i t o r 牛胰蛋白酶抑制剂 g s h r e d u c e dg l u t a t h i o n e 还原型谷胱甘肽 g s s g o x i d i z e dg l u t a t h i o n e 氧化型谷胱甘肽 d t t r e d u c e dd i t h i o t h r e i t o l 巯基乙醇 p i p p o r c i n ei n s u l i np r e c u r s o r 猪胰岛素前体 h p i h u m a np r o i n s u l i n 人胰岛素原 r ai l p r e c o m b i n a n ta m p h i o x u si n s u l i n l i k ep e p t i d e 重组文昌鱼类胰岛素肽段 i 从一i o d o a c e t i ca c i ds o d i u ms a l t 碘乙酸钠 h p l c r e v e r s e d p h a s eh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 m s m a s ss p e c t r o m e t r y 质谱 神口一f u l l y r e d u c e dp m 完全还原p 礤 s s d i s u l f i d eb o n d 二硫键 ”s s p i p i n t e r m e d i a t e s o f p i p c o n t a i n i n g 月d i s u l f i d e b o n d s 含n 个二硫键的中间体 c d c i r c u l a rd i e h r o i s m 圆二色性 f r d p i p f u l l yr e d u c e d d e n a t u r e dp i p 完全还原变性p i p p a g e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 浙江理工大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：五生碴 日期：叼年3 月j 7 同 浙江理工大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权浙江理工 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 保密口，在 不保密团 。 学位论文作者签名：赵点 日期：川年5 月1 7 日 年解密后使用本版权书。 指导教师签名：蟛必睫 日期；0 7 年歹月矽日 浙江理丁1 人学硕+ 学位论文 第一章胰岛素体外折叠与解折叠的研究进展 1 研究蛋白质折叠的意义 对生物大分子结构与功能之间关系的研究一直是结构生物学研究的核心。蛋白质的生 物活性首先决定于其要有特定的化学结构。如果蛋白质的化学结构发生改变，蛋白质生物 功能将会受到影响，就会导致其功能降低或丧失。具有完整一级结构的多肽或蛋白质只有 当其折叠成j 下确的空日j 构象时，才能发挥正常的生物学功能。如果这些蛋白质在体内进行 了错误的折叠，就会引起人类疾病。蛋白质折叠的研究是生命科学领域前沿的研究课题之 一。近年来，随着基因工程的飞速发展，许多有价值的蛋白质都可以在原核与真核生物中 高表达，但其中许多蛋白质都以无活性的包涵体的形式存在，对包涵体的复性处理往往成 为基因工程中不可逾越的一个障碍。因此，蛋白质折叠机制的研究不仅具有重大的科学意 义，而且在医学和生物工程领域的研究中具有极大的应用价值。 2 0 世纪6 0 年代，a n f i n s e n 首先提出了每种蛋白质都有其特定的氨基酸组成和排列顺 序，并且正是这一特定的氨基酸排列顺序决定了它特定的空间结构，这一理论在很大程 度上推动了蛋白质折叠的分子机制研究。但是蛋白质到底是怎样由一级结构折叠成高级结 构的呢? 这个问题还有待于进一步的探索和研究。 2 国内外蛋白质折叠的研究 2 1 蛋白质折叠的热力学研究 蛋白质折叠的研究，比较狭义的定义就是研究蛋白质特定三维空问结构形成的规律、 稳定性与其生物活性的关系。这里最根本的科学问题就是多肽链的一级结构到底如何决定 它的空间结构? x 一射线晶体衍射是迄今为止研究蛋白质结构最有效的方法，所能达到的精 度是其它任何方法所不能比拟的。但是，蛋白质分离纯化技术要求高，蛋白质晶体难以培 养，晶体结构测定的周期较长，从而制约了蛋白质工程的进展。随着近代物理学、数学和 分子生物学的发展特别是计算机技术的进步，人们开始用理论计算的方法，利用计算机来 预测蛋白质的结构。同源模建方法是最常用、最有效的蛋白质结构预测方法。但是利用同 源模建方法预测蛋白质结构时，需用同源蛋白质的已知结构作为模板。当缺乏这种模板结 l 浙江理r = 大学硕十学何论文 构时预测则很难奏效，这是该方法的天生缺陷。 在蛋白质折叠的研究中有一个普遍的模型是漏斗模型。从能量的角度看，漏斗表面上 的每一个点代表蛋白质的一种可能的构象，变性状态的蛋白质构象位于漏斗顶面，漏斗最 底部的点表示用x 一射线单晶衍射或n m r 澳j 定的蛋白质天然构象，而漏斗侧面的斜率用来说 明蛋白质折叠路径如图1 1 所示。在折叠过程中，蛋白质肽链可能存在的构象似乎是无穷 无尽的，事实上肽链寻求的是能量最低的构象。 溅徽怒黧燃僦：? ! 黧。“。“。“ 2 2 蛋白质折叠的动力学研究 图1 1 漏斗模型 蛋白质折叠第二个根本的科学问题是具有完整一级结构的多肽链又是如何折叠成为 它特定的高级结构? 这是一个折叠的动力学的问题，长期以来主要用体外实验的方法来研 究。虽然已有四五十年的历史，但至今尚未解决。我们知道多数蛋白质在体外是不稳定的， 外界环境如温度、酸度等变化都可以导致其空间结构的破坏和生物活性的丧失，但却并不 破坏它的一级结构，这就是所谓的蛋白质的变性。对蛋白质变性作用的认识是我国科学家 吴宪在三十年代首先提出来的，长期以来已经为国际上广泛接受。变性的蛋白质往往成为 一条伸展的肽链，由于一级结构仍然完整，根据a n f i n s e n 原理它应该可以在一定的条件下 重新折叠成原有的空间结构并恢复原有的活性。这就是长时i 、日j 以束在体外研究蛋白质折叠 的基本模型，目i ； f 的实验和理论研究多以小分子量、单链蛋白质为模拟体系。实际上，研 究者所采用的蛋白质体系为简单体系，其折叠过程机理和动力学与实际体系相差甚远。绝 2 浙江理工大学硕士学位论文 大多数蛋白质从一条伸展的肽链，折叠成具有其特定结构的、有活性的蛋白质并不是一步 完成的，而要经过许多折叠的中间状态。含有多个亚基的蛋白质分子，亚基间的相互作用 使之组装成复杂蛋白分子。 研究人员用实验方法，特别是近年来发展的快速测定方法去追踪蛋白质重折叠的全过 程，尽可能捕捉折叠过程中的每一个中间状念。不同阶段的折叠速度不同，有的比较慢， 比较容易发现和捕捉中间状态；但有的非常快，必须要有特殊的设备配合各种测试技术去 进行研究。最近有人尝试大幅度降低温度使折叠速度减慢而得以追踪，最终人们要定量地 描述整个折叠的动态过程。 2 3 z 硫键在蛋白质折叠研究中的作用 二硫键是研究蛋白质结构、热力学稳定性和蛋白质折叠路径的有力工具，二硫键的形 成与解离可以作为追踪多肽链折叠的一个非常实用的探针，因此，含有二硫键的蛋白质可 以作为蛋白质折叠研究的一个非常好的模型。其优点在于：首先，巯基二硫键的交换反 应是一个机理清楚、易于控制的化学反应【2 。3 】。其次，二硫键的形成和打开及其稳定性能 反映出蛋白质构象在引导每一对半胱氨酸残基至l 临近位置并使之固定的过程中所起的作 用。再次，通过修饰没有形成二硫键的自由巯基或者终止二硫键的交换反应，可以捕获到 二硫键部分缺失的稳定存在的中问体，进而详细研究二硫键中间体的构象【“】；最后，通 过研究二硫键中问体在不同时间点的分布和解析中i b j 体的结构，可以十分准确的推测出蛋 白质折叠过程中二硫键的形成途径，因此可以选用二硫键的形成过程作为研究手段，对蛋 白质折叠进行研究。这一方法在许多蛋白质中如牛胰蛋白酶抑制剂7 。、r n a s e a 1 2 - 1 4 年1 i g f i 1 5 4 6 1 中都得到了证实，此外胰岛素超家族中的一些成员也验证了这一方法的可靠 性。由此可见，多肽链的折叠和二硫键的形成是蛋白质折叠中密切相关、协同运作的过程。 在二硫键的形成途径中，由于微观可逆性的存在【1 ”，研究蛋白质还原解折叠途径中二硫 键打丌顺序往往可以给氧化再折叠的研究以新的观点。但遗憾的是，许多蛋白质的解折叠 过程并不象再折叠途径那样易于控制，所以其研究难度也较大【1 8 1 。 3 胰岛素家族体外折叠的研究进展 3 1 胰岛素的结构 浙江理工大学硕十学位论文 胰岛素是人体内唯一可以降低血糖的激素，7 0 多年来一直是治疗糖尿病最有效的药 物。胰岛素由a 和b 两条链组成的，共含有5 1 个氨基酸，分子量约6 k d 。较小的a 链 由2 1 个氨基酸组成，较大的b 链由3 0 个氨基酸组成。a 链由于不含碱性氨基酸而称之 为酸性链，b 链由于不含酸性氨基酸而称之为碱性链。胰岛素是由胰岛素原切除c 链转 变而成的，c 链是一个含有3 1 个氨基酸的多肽，c 肽两端分别通过两个碱性氨基酸( r r 和k r ) 连接a 链和b 链。x r a y 晶体衍射1 1 9 。2 和n m r 技术1 2 1 2 2 】已经解析出其三维结 构成球形，有一个疏水核心。进一步的研究表明胰岛素的a 链中有两个螺旋区：h e l i x 2 区( i l e a 2 - t h r a 8 ) 和h e l i x 3 区( l e u a l 3 - t h e a l 9 ) ；b 链中含有一个很重要h e l i x l 区 ( s e r b 9 一c y s b l 9 ) ( 图1 2 ) 。天然的胰岛素含有三个二硫键( s s ) ，其中两个为链间二硫键， 它们的形成部位分别在a 7 一b 7 和a 2 0 ，b 1 9 ；另外一个二硫键为链内二硫键a 6 a l l ，靠近 三级结构的核心部位。把完整的胰岛素与缺失二硫键的非天然胰岛素做比较，发现s s 对维持胰岛素的结构稳定性及其生物活性都有很重要的作用。 图1 2 胰岛素的三级结构 4 浙江理 大学硕士学位论文 3 2 胰岛素家族体外折叠的研究进展 3 2 1 双链胰岛素的体外折叠解折叠 通过对双链胰岛素体外再折叠研究发现，分开的a 链和b 链能够重新组合再次生成 胰岛素，这就说明了胰岛素的a 、b 链含有足够的折叠信息1 2 3 埘1 。进一步研究证实了b 链在再折叠过程中起到模板作用，指导着a 链的i f 确折叠【2 5 】。w e i s s 等通过试验提出了胰 岛素a 链n 端和c 端的。螺旋对胰岛素的生物活力和折叠的影响程度不同1 2 6 1 。胰岛素a 、 b 链的氧化再折叠实质上与配体和受体之间的相互识别和作用有类似的特点。首先是a 链和b 链要相互识别，然后通过非共价键相互作用( 比如疏水作用) ，然后再进一步形成 二硫键或者进行二硫键之间互相重排，直至胰岛素折叠的完成。 在不同的条件下，对双链胰岛素解折叠的研究也取得了一些进展：在使用变性剂或还 原剂的条件，发现胰岛素的稳定性和解折叠途径有所不同 2 7 - 2 9 1 。胰岛素的六聚体在加热的 条件下也会发生解聚和解折叠等现象【3 ”。总体来说，胰岛素的解折叠主要是通过c d 和 荧光等方法在不同的变性条件下来检测其结构的改变。 然而也发现一些折叠方面的问题用双链胰岛素难以解释3 2 1 ，比如胰岛素的折叠解折 叠过程、再折叠过程中二硫键的形成途径、c 肽在折叠中发挥什么样的作用、折叠的起始 位点以及折叠信息是怎样由起始位点传到整个蛋白质分子的等等，这些问题都很难用双链 胰岛素进行解释。同时我们也知道在体内胰岛素是以单链的形式( 胰岛素原) 进行正确折 叠的，所以在体外我们用单链胰岛素来研究折叠过程更接近体内的胰岛素折叠。 3 2 2 单链胰岛素体外折叠解折叠 在胰岛素体外折叠解折叠研究中，本实验室拟用单链胰岛素如重组猪的胰岛素原 ( p i p ) 、人胰岛素原( h p i ) 和文昌鱼胰岛素类似肽( a i l p ) 来代替双链胰岛素进行体外 折叠解折叠的研究。下面就对p 口、h p i 和a i l p 的体外折叠解折叠的研究进展分别做介 绍。通过对体外折叠和解折叠过程中捕获到的中间体的研究，发现它们体外折叠解折叠 路径既有相同点又有区别。 3 2 2 1p i p 和h p i 的体外折叠解折叠 浙江理r i - 人学硕十学付论文 对于p i p 和h p i 来说，它们有着相似的分子折叠机制：在h p ! 和p i p 体外折叠过程 中，h e l i x l 区的保守性很高，这就暗示了折叠的起始位点可能都位于b 链的h e l i x l 区或者 都跟该区有关，所以折叠信息可能从b 链传给未装配的a 链，由此也可以推知折叠的起 始位点位于b 链的n 端。虽然他们的分子折叠机制相似，但是它们的折叠过程存在一定 的差异。 在p 口的体外再折叠过程中捕获并鉴定了三个中间体：两个2 s s 中间体和一个1 s s 中间体”】，其中捕获的1 s s 中间体所含的二硫键是a 6 一a l l ，并不是a 2 0 一b 1 9 ，这就与之 前提出的一些理论不相符，因此乔志松等人提出了p 口再折叠过程可能有两种途径：“直 接折叠途径”和“可选折叠途径”。对p i p 的体外解折叠途径的研究中只捕获到一个主要 的中间体，它保留了三个二硫键，但均为链内的二硫键3 4 】，因此没法提出p m 的解折叠 途径。 2 盛嗣朗h 图1 3p i p 体外折叠时二硫键形成途径的示意图 中间体以二硫键的配对模式表示，含有加粗黑方框的中间体表示在再折叠过程中乔志松等人捕获 到的中间体。 在h p i 和p i p 体外折叠和解折叠过程的研究中，只是对实验中出现的中间体加以研 究并推测折叠和解折叠的过程。然而一些在理论上也应存在的中间体，在实验中却未捕捉 到。一方面可能由于它们不稳定，不可能出现；也有可能现在的技术水平达不到要求，不 能检测它们是否存在。鉴于这些原因，我们通过蛋白质工程的方法可得到我们认为理应存 6 浙江理 大学硕士学何论文 在的中| 日j 体。在对p i p 的研究中已经应用了此方法，并且取得了一些进展。郭占云等人通 过对4 个含a 2 0 b 1 9 二硫键的2 s s p i p 模型肽的研究表明它们都具有部分折叠构象，并且 它们的体外折叠速率相似，但是折叠产率却不相同。其中 a 2 0 - b 1 9 ，a 7 一a 1 l 】模型肽体外 再折叠效率最低【3 5 1 ，因此再折叠过程中形成该中间体的可能性很小。所以证实了这四个 2 s s 模型肽在折叠过程中都可能存在，但是对折叠的贡献却不相同。研究发现它们在c 8 柱上保留时间不同，这一方面可能跟疏水基团的暴露程度和其在洗脱液中的变性程度不 同；另一方面可能由于其结构与天然状态相比疏水基团暴露的很多，以致在分泌的过程中 在内质网被滞留，从而被降解在分泌过程中。由此应该注意到任何体外的实验都不可能完 全脱离体内环境来进行研究，两者在一定程度上也要有相应的切合点。 在对h p i 的再折叠过程研究时，乔志松等人捕获到了四个明显的中间体，它们都是 含有三个二硫键的异构体分别是：p 1 、p 2 、p 3 和p 4 3 6 1 。通过分析显示了p 1 、p 2 、p 3 都 含有链间二硫键，p 4 仅含有链内二硫键。在研究h p i 的解折叠途径时捕获到了一个主要 的解折叠中间体，通过对它的分析鉴定发现它与再折叠过程的p 4 相同，这就说明h p i 的 解折叠途径和再折叠途径具有相似的机, d t ”j 。 l l t 耔d h 挚l 争l 碡唾 l l l 图1 4 职i 在体外折叠时的折叠途径 。 # t i i 2 , , m p - , - h p l 。童j 般箭头表示在两个组分之问存在平衡，其中平衡倾向丁箭头较大的一方。i 、i i 和1 1 1 分别代表含 有一个，两个和二个- 二硫键的中间体混合物。r 代表还原的h p i ，n 代表天然的h p i 。 以上的研究结果明确显示了h p i 和p 口的折叠过程有所不同：h p i 折叠过程中的四个 中间体均含有三对二硫键，它的含有一个二硫键和两个二硫键的中间体均未捕获到。因此 7 浙江理t 大学硕十学位论文 对于h p i 来说，它的体外折叠的限速步骤就在于3 s s 异构体二硫键的重排；而p i p 的三 个中间体中，只有一个中问体含有一个二硫键，另外两个中间体含有两个二硫键，因此推 断p i p 折叠过程的限速步骤在于2 s s 异构体中二硫键的形成。通过两者中间体的稳定性 比较得出h p i 的中日j 体较容易形成，以致h p i 能以很快的速度形成含三个二硫键的中间 体，而含一个二硫键和两个二硫键的中日j 体不能及时捕捉到，由此可以推出h p i 形成二 硫键的能障要小于p i p 。 但从p i p 和h p i 的一级结构上束看，它们之间的区别仅在于：前者的c 肽是由3 1 个 氨基酸组成的，而后者仅由两个氨基酸a k 连接，这就揭示了c 肽在胰岛素折叠过程中 发挥着重要的作用，是不容忽视的。因此推测c 肽不仅参与了胰岛素的折叠过程，而且 还起着促进作用1 3 7 1 。 图1 5p i p 和i q p | 的氨基酸序列示意图 氨基酸h j 单字母简写表示。残基在肽链上位置参照胰岛素的命名方法。但是h p i 的b 链和a 链由 c 肽的3 1 个氨基酸连接，而p i p 的b 2 9 k 和a i g 却是由k a a 这三个氨基酸连接的。注意：h p i 的 b 3 0 是1 1 l r 而p i p 的该位置却是a l a 。 浙江理l ：人学硕士学位论文 3 2 2 2r a i l p 折叠解折叠 r a i l p 是胰岛素家族成员之- - 1 3 8 】，胰岛素家族成员具有共同的结构模体及相同的二硫 键配对方式。从e d n a 序列推测出来的a i l p 多肽链具有哺乳动物胰岛素和i g f 一1 的共同 特点：它类似于i g f - 1 ，具有b 一，c 一，a - ，d 一四个结构域：又类似胰岛素原，在其c 结 构域的两端具有潜在的前激素原转换酶的酶切位点；其a ，b 一结构域和胰岛素、i g f 1 的a 一，b 一链结构域的序列具有同源性。因此a i l p 被认为是胰岛素和i g f 1 共同的祖先。 通过对a i l p 的体外氧化折叠还原解折叠的研究发现：在再折叠过程中，除了含有三 对二硫键错配a i l p 中间体外，还捕获到了四个主要中间体p l 、p 2 、p 3 和p 4 ，这些中间 体与还原解折叠过程中所捕获到的中间体u i 、u 2 、u 3 和u 4 完全相同【3 ”。p 4 ( u 4 ) 为 含有天然二硫键a 2 0 一b 1 9 的单二硫键中间体，p 1 ( u 1 ) 、p 2 ( u 2 ) 和p 3 ( u 3 ) 为含有 a 2 0 一b 1 9 的双二硫键中间体。基于中间体在再折叠解折叠过程中的时间分布，解折叠过 程是由天然状态开始，经过2 s s 、i s s 中间体逐渐到完全还原状态；折叠过程恰好相反， 由完全还原状态到1 s s 、2 s s 和3 s s 中间体直至最后形成天然状态。它的氧化折叠途径和 还原解折叠途径如图1 6 所示。 a i l p 作为胰岛素家族的祖先蛋白，通过对其折叠行为的研究可以推断出胰岛素家族 成员的折叠行为可能有以下三个特点：( 1 ) a 2 0 一b 1 9 二硫键是在折叠起始阶段形成的最为 重要的二硫键。( 2 ) 第二对二硫键的形成是比较随机的。( 3 ) 体外折叠解折叠通过类似 但相反的途径。 9 浙江理j - 人学硕十学伊论文 图1 6 【g l y r a i l p 的主要氧化折叠与还原解折叠途径 r ，完全还原的 g i y r a i l pn ，天然i f 3 o l y r a i l ps ，错配的 g i y r a i l p 。p i - p 4 与u 1 - u 4 完全 一致，只不过p 1 p 4 为氧化折叠过程中捕获到的中问体，而u 1 u 4 为还原折蒋过程中捕获剑的中间体。 l o 幽鹾；剀 浙江理工人学硕士学伊论文 第二章猪胰岛素前体的体外解折叠途径的研究 摘要 尽管对猪胰岛素前体的体外再折叠途径的研究已经较为清楚，但是它的体外解折叠 过程仍不清楚。在猪胰岛素前体的二硫键稳定性试验的基础上，我们发现在不同的氧化 还原体系下胰岛素前体被还原的程度不同。在不同的氧化还原体系中反应相同时间，猪 胰岛素前体被还原的程度各不相同。我们选择中间体含量较多的体系来制备中问体。本 工作中我们选用 g s h g s s g ( m m m m ) l e 值为4 0 1 的体系( o 1 mt r i s h c l ，l m me d t a ， p h 8 7 ) ，p 口以0 1 5 m g m l 的浓度溶于该体系中o * c 反应，分别在不同的时i 日j 点观察中间 体的分布。我们选择1 6 小时这个时间点的体系来制备中问体。本试验中我们捕获到了6 个中间体，其中有四个中间体含有两个二硫键，另外两个中间体只含有一个二硫键。通 过对这些中间体的分析，我们可以推出它的解折叠路径。同时对解折叠和再折叠过程所 捕获到的中间体的比较，发现这两个途径有相同的中间体，因此推测猪胰岛素前体的体 外折叠解折叠通过类似但相反的途径。 关键词：胰岛素，猪胰岛素前体，蛋白质解折叠，含二硫键蛋白质 浙江理_ 大学硕+ 学位论文 前言 蛋白质是细胞中起作用的分子 3 9 】。从m r n a 翻译成线性的多肽，要经过正确折叠和 组装过程4 能形成具有特定空间结构和生物学功能的蛋白质。因此蛋白质折叠是生命科学 领域中的一个基本问题。1 9 6 0 年a n f i n s e n 首先提出了一个重要的理论：“蛋白质的一级序 列决定了它的高级结构”【”，这一理论促进了蛋白质折叠在理论和实践方面的进步。 二硫键可以看作是研究蛋白质折叠和解折叠的探针【砌3 1 ，因为二硫键可以作为研究蛋 白质结构、二硫键稳定性和蛋白质折叠的有力工具，因此含二硫键的蛋白质可以作为折叠 和解折叠研究中的模型蛋白例如b p t i 7 1 m 1 1 4 4 - 4 5 1 ，r n a s e a 1 2 - 1 4 和i g f i 【1 鼻16 1 。因为含二 硫键的蛋白质的折叠解折叠过程通常伴随着二硫键的形成和还原【3 t1 2 4 6 。4 7 1 ，而且巯基二 硫键之i 日j 的交换反应机理非常清楚，这个反应易于控制。通过修饰自由巯基或者酸终止折 叠反应，可以捕获到含不同数目二硫键的中间体，从而可以进一步研究该蛋白质的折叠 解折叠。 胰岛素是一个结构和功能都得到较好研究的小分子球蛋白，我们实验室使用重组单链 胰岛素前体来研究胰岛素体外折叠和解折叠。目前已经对p i p 3 3 - 3 4 1 、h p i 3 6 。3 7 】和a i l p 3 8 1 的 体外折叠解折叠途径进行了研究。在p i p 的体外再折叠过程研究中，捕获并鉴定了三个 中间体：两个2 s s 中间体和一个1 s s 中间体，其中捕获的1 s s 中间体所含的二硫键是 a 6 a l l 并不是a 2 0 一b 1 9 ，这就与之l i 提出的一些理论不相符。因此乔志松等人提出了p i p 再折叠过程可能有两种途径：“直接折叠途径”和“可选折叠途径” 3 3 1 ，如图1 3 所示。 在p 妒的体外解折叠的研究中只捕获到一个主要的中问体，它保留了三个链内二硫键【3 4 1 ， 因此也没法提出p i p 的解折叠途径。研究h p i 的再折叠过程时，乔志松等人捕获到了四 个明显的中间体，它们都是含有三个二硫键的异构体p ”。在研究h p i 的解折叠途径时捕 获到了一个主要的解折叠中间体，通过对它的分析鉴定发现它与再折叠过程的一个中间体 相同，这就说明h p i 的解折叠途径和再折叠途径具有相似的机制3 7 1 。随后陈衍等人又对 a i l p 体外氧化再折叠和还原解折叠路径分别进行了研究，发现这两个过程捕获到的中间 体完全相同，也就说明了体外折叠解折叠途径拥有相同的中间体，这两个途径是类似但 相反的过程【”j 。 p i p 是重组猪的胰岛素前体，它的a 、b 链由二肽a l a - l y s ( a k ) 连接，如图2 1 所示【4 8 - 4 9 。 1 2 浙江理工大学硕士学位论文 本工作受到二硫键稳定性实验的启发3 57 趾”l ，在低温条件下含二硫键的蛋白质在氧化还 原体系中反应，理论上蛋白质的天然状态会经过一些中间体形式逐渐转变为完全还原状 态。因此我们选择中间体含量较多的体系来捕获解折叠中问体。在本试验中我们选用 f g s h g s s g ( m m m m ) 为4 0 1 ( 0 1 m o l m l i r i s h c i ，l m me d t a ，p h 8 7 ) 的体系来捕获 解折叠中间体，共捕获了6 个中间体。通过对这些中j - b j 体的鉴定发现其中有4 个中间体是 2 s s 中日j 体，2 个中间体是1 s s 中间体。通过对这些中间体的研究，不仅提出了p 口解折 叠途径，还发现了它的折叠和解折叠途径有共用的中j 日j 体。 浙江理工大学颐十学位论文 a 强 c 甄受) ( 躲 一 图2 1 ( a ) p i p 的氮基酸序列和二硫键示意图( b ) 天然p i p 在v 8 酶切之后的各个肽段 氨基酸以单字母简写的方式标记。在正方形的两个残基a k 代表胰岛素b 链( 圆圈中加黑的氨 基酸对应的肽段) 和胰岛素a 链之间的连接肽( 在连接肽之后) 。箭头所示为v 8 蛋白酶的酶切位点。 v 8 酶切后的p i p 的5 个肽段从氨基端剑羧基端依次表示为a e 。由于二硫键的存在，p i p 在v 8 酶切 后肽段a 和d ，肽段b 和e 被分别连接在一起。所以p i p 酶切后共有三个片段，分别为a + d ，b + e 和c 。 4 浙江理工大学硕士学位论文 材料和方法 l 材料和装置 重组p i p 的纯化方法如文献【4 8 】所述 测序级的蛋白内切酶v 8 来自b o e h r i n g e rm a n n h e i m 公司 i a a 来自f l u k a ( s w i t z e r l a n d ) g s h ，g s s g 为日本进口分装 t f a 和乙腈均为h p l c 纯 g i l s o n3 0 6h p l c 系统 g i l s o n1 15u vd e t e c t o r b e c k m a ns y s t e mg o m a b i 公司m a l d i t o f m s 其他试剂至少为分析纯 2 p h 8 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2 1 贮备液 a 胶贮液：( 3 0 a c r - 0 8 b i s ) 丙烯酰胺 3 0 9 甲叉双丙烯酰胺o 8 9 加水至l o o m l b 分离胶缓冲液( s b ) ( 3 0 mt r i s ， t r i s 3 6 3 9 l m h c l4 8 m 1 加水至1 0 0 m l c 浓缩胶缓冲液( c b )