（分析化学专业论文）溶液中单个量子点的示踪研究.pdf

硕上学位论文 摘要 单分子示踪能获取单个分子或粒子的运动轨迹，实时监控生物分子之间的相 互作用和信号传递过程。量子点高量子产率、连续的宽的激发光谱、窄而对称的 发射光谱、量子尺寸效应等优势使其成为分子生物学、生物医学工程中一种有力 的工具。但是，它的眨眼现象却影响着单分子示踪结果的真实性。微流控芯片其 高度平行化、集成化、自动化、微型化的特点己广泛应用到基因诊断、蛋白质分 析、细胞分析等领域。本文主要研究了溶液中单个量子点的示踪，并初步探索了 基于微流控芯片的单分子成像。具体工作内容包括： 1 、利用通用型的荧光显微镜，研究了单个量子点在载玻片和脱水琼脂糖表 面光学性质的差异性。与吸附在载玻片上的量子点相比，观察到吸附在脱水琼脂 糖表面的量子点荧光强度增强了。在4 和8 脱水琼脂糖表面量子点的荧光强度 分别是载玻片上的2 3 倍。单分子成像也揭示了吸附在脱水琼脂糖基底上量子点 的眨眼被抑制了。 2 、选用不同浓度的琼脂糖修饰载玻片来调控粒子的扩散系数，完成了对自 由溶液中单个量子点的示踪。1 2n m 量子点的平均扩散系数在5 和8 脱水琼脂 糖修饰的表面比本体溶液中量子点的理论扩散系数小1 1 6 和1l8 7 倍。显微镜电 感耦合器件c c d 前面安装一个透射光栅，我们还成功地追踪到了脱水琼脂糖修饰 的表面与盖玻片之间溶液中的单个动态量子点的光谱。这对探究生物分子之间的 相互作用有远大的前景。 3 、本文采用环氧亲水聚合物共价吸附的方法对p d m s 芯片表面进行了修 饰，在3 0m i n 内可以完成表面修饰过程。这种修饰方法的稳定性可以保持一个月 左右。微通道较大程度地保持着亲水性和抗蛋白吸附性。最后用玻璃微流控芯片 对脂质体包裹与未包裹的量子点进行了单分子成像，并观察了二者与九一d n a 的反 应。 关键词：量子点；单分子示踪；微流控芯片；脱水琼脂糖 i l 溶液中单个量子点的示踪研究 a b s t r a c t s i n g l em o l e c u l et r a c k i n gc a n r e c o r dt h et r a j e c t o r i e so fs i n g l ed y n a m i cm o l e c u l e so r p a r t i c l e sa n dr e a l t i m em o n i t o rt h eb i o m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n sp r o c e s sa n dt h es i g n a l t r a n s d u c t i o np r o c e s s h i g hl u m i n e s c e n c e ，w i d ee x c i t a t i o n ，u l t r a - n a r r o wa n ds y m m e t r i c e m i s s i o n ，as i z e d e p e n d e n tt u n a b l es p e c t r u mo ft h eq u a n t u md o t ( q d s ) m a k ei t b ea v a l u a b l et o o li nm o l e c u l a rb i o l o g ya n db i o e n g i n e e r i n g h o w e v e r ，t h e f l u o r e s c e n c e i n t e r m i t t e n c yo fq d sa f f e c t st h ea u t h e n t i c i t yo fs i n g l e - m o l e c u l et r a c k i n g m i c r o f l u i d i c c h i pc a n b eu s e df o rl o w c o s t ，h i g h f l u x ，l a r g e s c a l es t u d i e sw i t ht h ec h a r a c t e r i s t i c so f t h eh i g h l yp a r a l l e l ，a n di n t e g r a t e d ，a u t o m a t i o n ，m i n i a t u r i z a t i o n ，a n dp l a y sm o r ea n d m o r ei m p o r t a n tr o l e si nt h ef i e l d so fg e n e t i cd i a g n o s i s ，p r o t e i na n a l y s i s ，c e l lb i o l o g y ， m e d i c i n e ，e ta 1 i nt h i sp a p e r ，w ea c h i e v e dt h es i n g l eq d st r a c k i n gi nt h ef r e es o l u t i o n a n dt h ep r e l i m i n a r ye x p l o r a t i o no fs i n g - m o l e c u l ei m a g i n gb a s e do nt h em i c r o f l u i d i c c h i p t h em a i nw o r k sw e r ea sf o l l o w s ： 1 s i n g l e m o l e c u l ei m a g i n gw i t h ar o u t i n em i c r o s c o p ys t u d i e d t h ee m is s i o n b e h a v i o r so fs i n g l eq d so nt h eg l a s sa n dt h ed r i e da g a r o s es u r f a c e f o rt h eq u a n t u m d o t so nt h ed e h y d r a t e da g a r o s e - m o d i f i e dg l a s ss l i d e s ，i th a sb e e no b s e r v e dt h a tt h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yi se n h a n c e da sc o m p a r e dt ot h a to nt h eg l a s ss l i d e s t h ea v e r a g e v a l u e so ft h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fq d s0 1 1t h es u r f a c eo f4a n d8 a g a r o s e e n h a n c e d2a n d3t i m e st h a nt h a to nt h eg l a s s ，r e s p e c t i v e l y s i n g l e m o l e c u l ei m a g i n g a l s or e v e a l e dt h a tt h eb l i n k i n gs u p p r e s s i o no fq u a n t u md o t s a b s o r b e do n t ot h e d e h y d r a t e da g a r o s e - m o d i f i e dg l a s s 2 t h ed i f f u s i o nc o e f f i c i e n t s ( d ) c a nb ec o n t r o l l e da c c o r d i n gt or e s e a r c hn e e d sb y m o d i f y i n gt h eg l a s ss l i d ew i t hd i f f e r e n ta g a r o s ec o n c e n t r a t i o n s w er e a l - t i m er e c o r d e d t h ed i f f u s i o np r o c e s so fs i n g l eq d si nl o w v i s c o s i t ys o l u t i o n t h ea v e r a g ed o f12n m q d so nt h em o d i f i e ds u r f a c e sm a d ew i t ha g a r o s es o l u t i o no f 5a n d8 c o n c e n t r a t i o n s a r e11 6a n d1 18 7t i m e ss m a l l e rt h a nt h et h e o r e t i c a lv a l u e so fd i nb u l ks o l u t i o n ， r e s p e c t i v e l y w es u c c e s s f u l l yt r a c k e dt h es p e c t r a li m a g e so fs i n g l ed y n a m i cq d s i n t h ea q u e o u ss o l u t i o nb e t w e e nt h ed r i e da g a r o s e - m o d i f i e ds u r f a c ea n dt h ec o v e rs l i d e b yt h es t a n d a r de p i f l u o r e s c e n c em i c r o s c o p yw i t hat r a n s m i s s i o ng r a t i n gi n s t a l l e di n f r o n to ft h ec h a r g e c o u p l e dd e v i c e t r a c k i n gt h ed y n a m i cq ds p e c t r a li m a g ei sa p r o m i s i n g m e t h o dt o e x p l o r et h ep r o c e s so ft h e m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n si nt h e p h y s i o l o g i c a lb u f f e r i i i 硕七学位论文 3 i nt h i sw o r k ，e p o x y m o d i f i e dh y d r o p h i l i cp o l y m e r sh a db e e nc o v a l e n t l yl i n k e dt o t h ep d m ss u r f a c et op r o d u c et h eh y d r o p h i l i cs u r f a c e t h es u r f a c ec o a t i n gp r o c e s sc a n b ec o m p l e t e dw i t h i n3 0m i na n dt h es t a b i l i t yc a nb ek e p tf o r - 30d a y s t h e m i c r o c h a n n e lb e c o m e sh y d r o p h i l i ca n dr e s i s t sp r o t e i na d s o r p t i o nt oah i g he x t e n t s i n g l e - - m o l e c u l ei m a g i n go fq u a n t u md o t sc o a t e da n dn o n - c o a t e dw i t hl i p o s o m eb a s e d o nt h eg l a s sm i c r o f l u i d i cc h i po b s e r v e dt h er e a c t i o no ft h e ma n d 九- d n a k e yw o r d s ：q u a n t u md o t s ；s i n g l em o l e c u l et r a c k i n g ；m i c r o f l u i d i cc h i p ； d e h y d r a t e da g a r o s e i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其 它个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 孝群日期：劢罗年多月客日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密瓯 ( 请在以上相应方框内打“ ”) 作者签名： 导师签名： 夸张日期：动吵 罄疗飙刁 年多月舅日 年月皲日 u 硕一卜学位论文 第1 章绪论 1 1 单分子示踪的原理及意义 单分子检测( s i n g l em o l e c u l ed e t e c t i o n ，s m d ) 即在单分子水平上对物质的 性质进行检测，能获得单个分子的信息，是目前认为最灵敏的检测手段。传统的 分析方法都是以大量分子的整体为研究对象，对这个集合体的平均性质进行分析， 但这样往往掩盖了许多特殊的重要信息。只有在单分子水平上的研究，才能揭示 复杂体系中个体的性质分布。生物、化学、医学等领域的各种反应过程往往是不 同步的，对大量分子的整体研究还会掩盖个别反应途径。因此，近十年来，使用 单分子检测的方法，来监测单个分子在各种环境中运动行为、观测分子间化学反 应途径、检测反应中间状态等的研究逐渐成为单分子检测领域的热点问题。这种 检测手段即单分子示踪( s i n g l em o l e c u l et r a c k i n g ，s m t ) 。在分子生物学、细胞 学、医学各领域还存在许多未知的问题，如蛋白质的结构与功能有什么联系? 生 物分子如何起生理作用的? 细胞信号是怎样传递的? 病毒如何入侵有机体的? 药 物如何作用病体的? 要解决这些问题，单分子示踪是一个非常有力的工具。 目前文献中单分子示踪技术多指以单分子荧光成像为手段，实时监测单个分 子的运动轨迹，获取单个目标分子与其他分子的相互作用信息的技术。传统的整 体平均分析方法仅能提供体系的平均性质，获得研究过程中某些静态节点的信息。 单分子示踪可以给出分子运动形式的细节，如定向运动、受限运动、布朗运动等； 可以全程追踪分子间及分子与所处环境相互作用的过程包括引发、终止步骤。单 分子示踪技术能在单分子水平对生命现象进行探索，目前在这一领域已经取得了 一些成绩。应用这一技术，d rh a 研究组实时观察了大肠杆菌单链结合蛋白 ( s i n g l e s t r a n d e dd n a b i n d i n gp r o t e i n ，s s b ) 在d n a 上的扩散，揭示了这种蛋白 结构与功能的关系；d rz h u a n g 研究组研究了核糖核酸与蛋白质的反应机理，揭 示了核糖核酸一蛋白质复合体结构动态变化与其功能之间的关系比1 ；还有一些研 究小组研究了单个流感病毒在细胞内的传输过程口1 、细胞表面受体分子与其他分 子的相互作用过程咱】、药物对病变分子的影响等口1 。单分子示踪在临床诊断方面 的应用研究将是生命科学领域下一个发展目标。 1 2 单分子示踪技术 单分子荧光成像是单分子检测技术的一种，以其实时追踪的特点逐渐成为主 流的单分子检测技术，尤其在单分子示踪研究中得到广泛的应用，常用成像方式 溶液中单个量子点的示踪研究 包括宽场成像和扫描成像。 1 2 1 宽场成像 所谓宽场成像是指在某一时刻数据采集区域尺寸远大于光衍射极限大小，与 点检测扫描成像方法相区别。宽场成像方式能在较长时间、以高空间分辨率在较 大面积内追踪多个单分子阳1 。这样的成像方式可以在多种显微镜上实现，常用于 单分子示踪的成像方法，由于激发方式不同分为落射式( e p i i l l u m i n a t i o n ) 宽场 成像和全内反射式( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o n ，t i r ) 宽场成像。 1 2 1 1 落射式荧光显微成像 落射式荧光显微镜是生物实验室常用荧光显微镜，在配置了i c c d ( i n t e n s i n e d c h a r g ec o u p l e dd e v i c e ) 或e m c c d ( e l e c t r o nm u l t i p l y i n gc h a r g ec o u p l e dd e v i c e ) 以及恰当的滤光块组和物镜后，就可以实现单分子水平上的成像，是最直接的单 分子成像方式。如图1 1 所示落射式荧光成像光路图阳3 。由高亮度的汞灯( 或氙灯) 发出的激发光( 图中主要为绿色) 由双色反射镜( 二向色分镜) 反射后，通过物 镜照射到样品上激发荧光，荧光再由物镜收集传到双色反射镜上。一部分激发光 在盖玻片和物镜表面反射回去，由阻挡滤色片吸收，这样就只让样品荧光( 图中 为橙色) 传到目镜中。二向色分光镜将光源发出的光分为两段，一段反射作为激 发光，一段透过荧光。如果二向色分光光谱段太宽，就要激发滤色片和阻挡滤色 片辅助去除背景杂光，尽量提高荧光检测的信噪比。荧光信号采集装置i c c d 是 普通c c d 与像增强器组合，能在超短曝光时间内成像，适用于荧光信号不强的单 分子成像。e m c c d 能以较高的成像速率进行高灵敏的检测。透射式荧光显微成 像广泛用于研究人造双层膜内脂质的不规则扩散n0 j ，单个流感病毒在细胞内的传 输过程，揭示流感病毒进入细胞的内吞机理3 。落射式荧光成像的不足是检测体 积大，信噪比低，一般用于多染料标记生物大分子( d n a 、藻红蛋白) 或高量子 效率探针标记的单分子检测。 荧光摄 线 图1 1 落射式荧光成像光路图阳1 屯 灯 发 引 墩 掰 、 修ll氙 硕上学位论文 1 2 1 2 全内反射荧光显微成像 全内反射荧光显微镜( t o t a li n t e r n a lr e f l e c t i o nf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ， t i r f m ) ，利用在界面处以指数形式衰减的隐失场激发界面附近百纳米深度以内的 荧光分子，与普通荧光显微镜相比，激发体积小，信噪比高。见图1 2 ，当光从光 密介质( 折射率n 1 ) 传播到光疏介质( n 2 ) 时，入射光在光密介质( 如玻璃) 表 面上一部分发生反射，另一部分则折射进光疏介质( 如溶液) 。入射角臼l 和折射 角岛之间满足关系式： n l s i n o l = n 2 s i n 0 2 ( 1 1 ) 当入射角增大到临界角鼠时，折射角为9 0 。，当入射角继续增大到大于临界 角时，光不再折射进光疏介质，也就是发生了全反射。由于波动效应，有一部分 光的能量会穿过界面渗透到溶液中，平行于界面传播。这部分光就是所谓的隐失 波。 y 娟嚏 ，_ _ ：_ _ 垒冉笈魅一_ ，。，j 图1 2 光发生全内反射的示意图 隐失波场的强度与入射光强度关系如下式： i ( z ) = i ( 0 ) e x p ( 一z d ) ( 1 2 ) ，。一 d = x 0 ( 4 nn s i n 20 一聆；) ( 1 3 ) 式中，i ( z ) 为隐失场的强度，i ( 0 ) 为界面处入射光强度，z 为距界面处的 距离，d 为激发深度，九。为入射光波长，口为入射光角度。场的强度随着距离界面 处的距离z 呈指数衰减。除了激发方式不同，落射激发成像和全内反射成像在设备 上的配置基本相似，隐失场激发深度在约1 0 0n m 左右，其背景噪声较落射激发更 低。y e u n g 等应用这种全内反射成像方式研究了单分子扩散、光降解、蛋白分子 固液表面的吸附等1 ；y a s u s h is a k o 等观察了活细胞膜表面单个e g f r 介导的信号 传导过程，表面生长因子e g f 与细胞膜上受体的结合过程，e g f 与e g f r 复合物二 聚化以及e g f r 自身磷酸化h 1 。全内反射荧光显微术还广泛用于实时观察 c y 3 一c a m p 与受体的作用叩1 、磷脂双分子层内脂质的扩散n 2 】、等离子体膜附近的 济液中单个量了点的示踪研究 神经分泌腺的颗粒运动n3 l 、聚合物内单个分子的结构变化n 屯3 、a t p 酶的翻转n 6 i 。 全内反射荧光成像可以不受到来自于细胞内深层区域信号的干扰，对细胞表面现 象进行示踪具有极大的优势。 1 2 2 扫描成像 1 2 2 1 共聚焦荧光显微成像 共聚焦荧光显微镜检测的是焦平面处的荧光信号，能有效地减少非探测区散 射光及无用荧光信号的影响，提高分析灵敏度、信噪比等，沿样品垂直方向移动 样品或物镜的位置，就可获得样品不同层面的信息，无需破坏样品，突破了普通 显微镜只能观察平面图像的限制，能实现扫描三维成像，构成的三维图像具有对 比度高、成像清晰和信息量大等优点，能对活细胞和组织成像n7 1 。 采用共聚焦荧光成像技术首次实现了自由溶液中单个荧光素和罗丹明分子的 示踪n 乳3 ；结合激光旋转激发的方式，追踪了细胞膜内荧光分子的扩散乜引；对三 维体系内自由扩散和定向运动的单个荧光分子进行实时追踪心；观察了c y 3 染色 的b g l o b i nm r n a 在x e n o p u sa 6 细胞内的运动情况引；实时监测了单分子与纳 米材料的相互作用心3 2 钔。这种技术己成为生物科学、细胞学、医学、新型材料的 开发等研究领域的重要工具。 1 2 2 2 双光子荧光显微成像 双光子荧光显微镜是指采用双光子激发样品，与通常的单光子激发相比，其 激发波长处在比发射波长更长的波长位置，减小了光漂白和光毒化的可能性，能 长时间地对样品进行更深层次的检测，能对生物分子执行生理功能的全过程进行 实时追踪，突破了只是对样品表面单分子进行示踪的局限性。双光子荧光显微术 在近红外处激发、对生物样品的光损伤小、穿透深度深和荧光收集率高等特点心朝 使得它在生命科学上具有特别重要的意义，已成功地研究了荧光微球在甘油溶液 中的运动以及荧光粒子进入纤维原细胞机理乜6 l ，可在不伤害或杀死细胞的情况下 观察各种分子与细胞的相互作用，为生物学家探索活细胞内各种分子的实时动态 提供了有效工具。 1 3 单分子示踪结果分析 1 3 1 单分子扩散系数的计算 单分子示踪主要是通过荧光成像手段，获取目标分子的运动位移随时间的变 化信息，由此产生单分子的二维或三维轨迹，再用各种数学统计方法对分子轨迹 进行分析，获取能反应分子运动形式的各种参数，再根据这些参数分析分子运动 模式、分子间相互作用机理等。大多数生物分子在细胞内都是在运动过程中完成 硕七学位论文 其生理功能的，单分子示踪有助于研究细胞内分子信号传导以及探测细胞结构等。 单分子示踪结果分析，首先要用宽场显微镜成像检测单分子的运动轨迹，落 射荧光显微镜用来观测细胞内或溶液中的单分子，全内反射荧光显微镜用来观测 细胞膜或分子膜上的单分子，用i c c d 或e m c c d 进行成像。以一定频率用c c d 进行连续拍照，就可以得到某个运动分子的一系列的照片。先直接观察就可以粗 略了解分子的运动方式，这种直观分析法形象，但只能是对分子的运动作定性的 分析，还无法将静止与由于受某种作用力而在某一点作趋于静止的运动区分开来， 也无法准确定义分子是作布朗运动还是受限运动，也无法对分子运动速率、运动 机理作分析。因此，要采用各种数学的方法根据分子轨迹进行较为准确的定量分 析，来获取分子运动的相关信息。借助各种分析软件如i m a g ej 等，标出每帧照 片中分子的坐标( x ，y ) ，给分子精确定位。通过分析相邻两帧照片中分子的位置， 就可以得出分子在这段时间内的位移r ，再根据均方位移( m e a ns q u a r e d i s p l a c e m e n t ，m s d ) 公式计算出扩散系数( d i f f u s i o n ，d ) 心7 。3 2 l ： r = 4 ( x 。+ l - x 。) 2 + ( y 。+ l y 。) 2 ( 1 4 ) r 2 = = 2 d a t ( 1 5 ) a x = x n + i x n ，a y = y n + 1 一y n ( 1 6 ) x n 、y n 分别为追踪的单分子在某祯照片中的横坐标和纵坐标，x n + l 、y n + l 为这 个分子在t 时间后所拍的照片中的横坐标和纵坐标，a t 为拍摄相邻两张照片的时 间间隔。 迄今为止，单分子示踪获得的数据大都是根据上述公式，获得m s d 与d 的 关系，然后再作进一步的分析，获得分子动力学信息。 1 3 2 单分子扩散模式的分析 分子的布朗运动是最简单的运动形式，布朗运动表现出位移与时间呈较好的 线型关系。因此，在单分子示踪中，所得轨迹一般以布朗运动作为参考，分析分 子d 的大小、分布以及分子的扩散方向，分析分子的运动与布朗运动的偏离程度， 确定分子是布朗运动、定向运动、受限运动等。自由布朗运动表现出d 的分布较 窄，不规则扩散表现出d 分布较宽，根据一段时间内扩散方向不变，说明分子作 定向运动。根据最后的分析结果，可以确定分子在特定体系内运动快慢程度引、 根据分子的运动识别不同分子种群4 i 、揭示分子运动机理n 们、分子运动与环境的 关系3 引。 溶液中学个量了点的示踪研究 1 4 单分子示踪的应用 1 4 1 自由溶液中单分子的示踪 单分子示踪用于自由溶液中的研究，将会对活体内体液中单分子的行为研究 打下坚实的基础。已经有研究表明是能用单分子示踪实时追踪水溶液中链霉抗生 物素蛋白和免疫球蛋白的运动的，所的结果与荧光相关光谱、理论推测是相近的 口6 l 。基于一些生物分子在水溶液中的扩散速度比细胞内的快很多，分子的快速扩 散是导致追踪、监测单个分子运动行为相对困难的原因之一。用单分子示踪来追 踪自由溶液中的单分子还有待于从技术手段上加以改进。 1 4 2 粘性介质中单分子的示踪 当现有的仪器时间、空间分辨率不足以实时追踪单个分子的运动行为时，增 加体系的粘度来降低分子的扩散速度，是单分子示踪为了追踪到快速运动的分子 采用的一种手段。单分子示踪已经成功地用于研究甘油溶液中聚苯乙烯微球的运 动阳7 1 、蔗糖溶液中m r n a 的扩散心引、聚丙烯酰胺凝胶中单个分子的运动口8 。 1 4 3 人造磷脂膜内单分子的示踪 人造磷脂双层膜的结构与细胞膜的结构相似，细胞膜是由多种脂质体和蛋白 质组成的复杂体系，它可以控制各种物质进出细胞，执行生理功能和新陈代谢。 人造磷脂双层膜内单分子的示踪可以为活体细胞膜内分子的研究打下基础，能实 时监测分子跨膜机理，控制以及调控分子的跨膜运动模式，在生物医学领域有较 大应用前景。识别质膜复杂体系中单个蛋白分子的不规则运动，能揭示膜的骨架 结构对分子的跨膜运动的影响，并了解其运动机理。单分子示踪的方法比整体平 均分析更为有效，用于研究分子的跨膜运动和分子的侧向扩散方式时比光漂白后 荧光恢复更真实更清楚阳9 4 引。 1 4 4 活细胞内单分子的示踪 此前介绍的s m t 方法均应用于体外检测，而我们的最终目标是应用于实际体 系，如细胞中。与体外干净环境相比，细胞内有许多生物分子和荧光物质( 叶琳、 四经酮醇等) ，环境更复杂，检测更困难。有三种方式可以解决这个问题，一是荧 光染料的优化，采用高吸光系数、高量子产率、长的吸收波长和发射波长的荧光 染料，如藻红蛋白、量子点等，有利于与细胞中的自发荧光信号分离，提高检测 的灵敏度。还可以在一个蛋白分子上标记多个荧光分子来增强荧光，但这样会影 响蛋白分子本身的性质，改变它的运动；二是研究体系的选择，可以直接选择荧 光背景较低的细胞或者细胞内某个区域( 如细胞核) 来进行单分子研究；三是检 测仪器的选择，如观察细胞膜上的单分子时，可以选择用全内反射荧光显微镜。 硕士学位论文 b y a s s e e 等分别将转铁蛋白、罗丹明6 g ( r 6 g ) 和寡核苷酸导入宫颈癌细胞中， 在活细胞的细胞质中检测到了它们的单分子h 。结果表明细胞内稳定的连续的荧 光背景虽然比缓冲溶液中的高，但是不会对检测细胞内单分子的光子爆发产生太 大的影响。但即便如此，用c c d 作检测器，追踪细胞内扩散系数较大的小分子， 对分子精确定位，还需进一步提高检测的灵敏度。对细胞体系实现单分子示踪， 必将大大推动我们对生命活动、细胞活动的认识。这也是生命科学的研究热点。 本部分将介绍一些单分子水平上观测的发生在细胞膜、细胞内的生理现象。 追踪细胞内外单分子运动轨迹时最易获取的参数是扩散系数，它能大致反映 分子在细胞内不同区域的运动差异。因此，各种研究都集中在对细胞内荧光分子 的相关检测以及扩散系数的测量上。s c h u t z 等对肌细胞膜上荧光标记的单个饱和 油脂分子( d m p e ) 和不饱和油脂分子( d o p e ) 的运动进行了研究h2 1 。结果发现 饱和的油脂分子的运动限制在细胞膜的某些部位，位置精度有5 0n m ，其空间分 辨率比荧光漂白后恢复实验至少要高一个数量级。每个d m p e 分子在此区域内快 速往复运动8 0 多次才离开。这些微小的区域形状各异，覆盖了细胞膜约l3 的面 积，或者静止或者定向运动。而不饱和的d o p e 分子可以在整个细胞膜上自由扩 散。通过用t i r f m 对单个绿色荧光蛋白的运动进行追踪，i i n o 等发现绿色荧光蛋 白在纤维原细胞膜上运动时，易形成低聚物，并且由于粒子尺度增大，扩散系数 能下降到4 0 1 。s a k o 等在单分子水平上观察了表皮生长因子e g f 与a 4 31 癌细 胞细胞膜上表面受体e g f r 的结合过程h 1 。对c y 3 标记的e g f 分子进行追踪，发 现在少数情况下，两个沿质膜侧面运动的单体e g f r 相遇后合二为一；多数情况 下，观察到一个e g f r 的荧光强度突增到原来的2 倍，这表明e g f r 二聚体在与 e g f 结合前就已经形成。k u e s 等研究了a l e x a 荧光染料标记的p k 4 分子与单个富 含鸟昔酸的核蛋白颗粒( u s n r n p ) 在3 t 3 细胞核内的扩散3 ，44 j 。他们的结果表明 a l e x a 染料标记的p k 4 分子有的扩散，有的静止，扩散的分子有的不受限制，扩 散范围比较大，有的在一个微小区域内运动，与周围组织时而结合时而分离。而 单个富含鸟昔酸的核蛋白颗粒表现出至少三种不同的扩散动力学，出现了高、中、 低三种不同的扩散系数。g o u l i a n 等对非洲绿猴肾表皮细胞中的藻红蛋白分子的运 动进行了单分子示踪，观察了单个蛋白分子在细胞质、细胞核中的扩散行为h 引。 根据分子的二维运动轨迹计算了分子的扩散系数，并统计了扩散系数的分布，其 分布比简单的布朗运动理论分布和在甘油溶液中的扩散分布都要宽。由此说明， 分子在细胞内的运动不能用简单的扩散模式来说明，复杂的细胞环境使分子可能 时而静止，时而运动，也可能作定向运动、布朗运动、不规则运动等。单分子示 踪技术在细胞内的研究在2 0 0 1 年取得突破性的进展。s e i s e n b e r g e r 等首次实时监 测了单个病毒对细胞的感染过程h 引。他们发现c y 5 标记的单个腺体病毒( a v v ) 在h e l a 细胞外的运动为自由扩散，在细胞膜上碰撞几次后，有l3 的病毒穿透质 溶液中单个量子点的示踪研究 膜进入细胞，在6 0m s 内完成进入细胞的过程。进入细胞后，病毒的运动分为定 向运动、受阻运动和自由扩散三种方式。1 0 的病毒通过管状结构物质或马达蛋 白作定向运动，有的病毒包含在内涵体中，运动较慢，有的自由扩散，运动较快。 在细胞被病毒感染1 5m i n 内，5 0 的细胞核内即可发现一个以上的病毒，比群体 研究要节省时间。2 0 0 3 年，z h u a n g 等用落射式荧光显微镜研究了单个流感病毒对 细胞的感染以及与内涵体融合的过程口1 。他们发现，流感病毒在与核内体融合之 前要经过三个主动运输阶段：先是在细胞外周由肌动蛋白介导的运动，接着是由 动力蛋白控制快速运动到细胞核周围，最后在核周围区域微管上的运动。这一发 现揭示了细胞内吞途径的机理。2 0 0 7 年，报道了量子点标记的单克隆a n t i h e r 2 进入活的老鼠体内，从血管内流动，到外露到细胞间隙中，然后接触到细胞膜， 沿细胞膜定向运动，再被内吞，在细胞内运动并与进入细胞质的过程h 7 1 。 单分子示踪技术对细胞中的单分子动力学行为的研究提供了一个非常有力的 工具。在人体内部，各种功能的运行，都离不开细胞和细胞间的信号联系，这种 联系是依赖化学分子即胞间信号分子来实现的。因此，单分子示踪可以为我们揭 示分子的跨膜运动机理以及分子在细胞内的信号传导过程8 咱3 1 、细胞内不同微域 处分子的扩散行为哺钔、监测病毒分子感染细胞的全过程53 j 、药物的靶向性哺副等。 1 5 量子点的基本特性与应用 1 5 1 量子点的光学特性 诱导荧光检测是单分子检测中的常用方法，除了少数自发荧光的分子外，大 部分生物分子需要荧光标记。合适的荧光探针应对所研究生物分子、细胞的干扰 最小，无毒性、有较长的荧光寿命、高量子产率、大的消光系数、特异性好、专 一性高等特点。常用于单分子示踪的荧光染料包括自发荧光蛋白、有机染料、量 子点( q u a n t u md o t s ，q d s ) 三大类。在特定的生化反应中，荧光蛋白有可能会 参与检测体系中的某些反应，因此其应用范围不广泛。荧光染料探针具有化学稳 定性差、易光漂白、激发光谱窄和发射光谱宽等特点，在单分子示踪分析研究中 有很大局限性。特别是较宽的发射光谱容易造成光谱重叠，使得同时分析同一样 品中多种荧光分子非常困难。然而，量子点的出现使得这一难题迎刃而解。量子 点是一种半导体荧光纳米晶体( s e m i c o n d u c t o rn a n o c r y s t a l ) ，由i i 一族或者i i i v 族元素组成，目前研究较多的主要是c d x ( x = s 、s e 、t e ) ，外面包裹z n s 。量子 点由于粒径小，电子和空穴被量子限域，连续能带变成分立能级结构，具有分子 特性，其光学行为与一些大分子( 例：多环芳香烃) 很相似，可以发射荧光。量 子点的尺寸效应控制着它的吸收和发射光谱特性。改变量子点的大小尺寸，在同 一激发光源激发时，它的发射光谱可由蓝光调到近红外。单个量子点的荧光强度 硕十学位论文 是罗丹名6 g 的至少2 0 倍，其耐光漂白性( t l 2 = 9 6 0 s ) 比罗丹名6 g ( r 6 g ) ( t l ，2 = l0 s ) 至少稳定1 0 0 倍晦引。 1 5 2 量子点的在生命科学中的应用 量子点的可调控的荧光光谱、耐光漂白性、化学稳定性好等这些独特特性使 其在细胞生物学、分子生物学、生物医学等领域得到广泛应用7 咱引。1 9 9 8 年，c h a n 和b r u c h e z 两个研究小组研究了量子点是可以作为生物探针应用于活细胞体系的 拍6 5 引。继此之后，c o u r t y 等人将链酶亲合素化的量子点标记到生物素化的驱动蛋 白上，研究了驱动蛋白在h e l a 细胞中的运动状态畸2 | 。g r u n w a l d 等人对量子点标 记的单个蛋白质分子进行了示踪引。将药物与q d s 偶联起来，对其与体内特定肿 瘤细胞的相互作用进行追踪口1 ，能监测到q d s 标记的特定药物摧毁癌细胞的过程， 给疾病的早期诊断注入了新的活力。将量子点与特异性抗体交联，再利用这些抗 体与细胞内不同的细胞器和骨架系统的特异性结合，可以分辨不同的细胞器或骨 架系统。量子点还有可能成为药物筛选的有利工具。将不同颜色的量子点与药物 的不同靶分子结合，可检测药物中含有的有效成分。还可将在红外区发光的量子 点标记到细胞内或组织中特定组分上，用杀伤性较小的红外光激发，就可以通过 荧光成像来研究组织内部情况效成分的含量，从而确定药效。红外光穿透能力较 强，达到诊断的目的。在蛋白质芯片中，可将各种蛋白质用一系列不同大小、不 同材料、不同光谱特性的量子点进行标记，用同一波长的光激发，就能同时检测 所有标记的蛋白质与芯片上的蛋白质之间的相互作用。 1 6 微流控芯片的研究进展 微流控芯片( m i c r o f l u i d i c ) 是在一块数平方厘米( 甚至更小) 的硅片、玻璃、 石英等材质上将常规化学和生物实验室的各种功能进行集成化的技术平台。在这 种小型化的平台上，可以完成生物化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、 检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作哺引。依托于发展中的微加工技术，在硅 片、玻璃、石英等材质中构造出微米甚至纳米级的流路网络以及多样化的流控元 件和功能单元，这种微流控系统具备了对微尺度流体中的物理化学过程调控的能 力，从而可用于生物、化学、物理、材料等领域中的研究与应用哺6 。76 l 。减少样品 消耗量、缩短样品分析时间及提高样品分析通量是目前单分子研究所面临的一个 重要挑战，而微流控芯片在微型化、集成化、自动化、高通量方面的优势使其在 单分子检测的应用研究领域有非常光明的发展。 1 7 本研究论文的构想 在单分子水平上完成对生命现象的示踪，分子的快速扩散是导致追踪、监测 溶液中单个量子点的示踪研究 单个分子运动行为相对困难的原因之一。解决这个问题的常用方法有：一是将目 标分子固定或部分固定。如将蛋白质分子包埋到聚丙烯酰胺凝胶中n 钔，将胆固醇 氧化酶分子包埋到琼脂糖凝胶中 7 1 等；二是将单分子置于高粘度溶液中。如甘油 水溶液引、用膜联蛋白a 5 将单个磷脂分子和通道蛋白分子限制在人造磷脂双分 子膜内扩散引。三是提高检测仪器的性能。如采用追踪控制器将扩散粒子限制在 共聚焦显微镜的检测区盯引，采用快速旋转的激光束绕着分子运动的圆形区扫描 们 等。以上方法要么使分子的运动受到较大的空间位阻，要么成本高、操作复杂等。 本研究论文用脱水琼脂糖凝胶修饰载玻片为基底研究单分子的动态光谱行 为。琼脂糖凝胶因具有特殊的物理化学特性，成为免疫固定和电泳的理想材料。与 聚丙烯酰胺凝胶相比，脱水琼脂糖凝胶加水溶液后，微孔不会较大程度膨胀，不 会给目标分子的运动造成大的空间位阻。量子点因具有化学稳定性好、耐光漂白、 激发光谱宽和发射光谱窄、量子尺寸效应等优势成为目前材料科学、化学、生物 医学等领域的研究热点，本论文也将首先选用量子点为研究对象，然后再扩展到 其它分子的研究。量子点所处环境会影响其发光量子产率及眨眼行为，如量子点 周围溶液中的含水量瞳2 49 | 、所处介质的介电常数乜6 1 、膜基底2 3 等。因此，我们在 对脱水琼脂糖表面量子点的光谱进行示踪前，也有必要研究以此为基底时，量子 点光学性质有无变化。单分子示踪的最终目的是能在单分子水平上实时监测多种 分子间的相互作用。如何识别复杂体系中的多种分子，可以用多染料多通道检测 的方法，也可以根据量子点的尺寸效应，选择不同大小的量子点在同一激发光照 射下同时发出不同颜色的荧光来区分不同分子。若采用单通道检测，我们设想选 用长通滤波片，在同一激发光照射下，不同量子点发出的荧光能通过同一滤光片 被吸收。透射光栅相当于一组数目众多的等宽、等距和平行排列的狭缝，通过这 些狭缝将入射光波分成不同级数，被广泛地用在单色仪、摄谱仪等光学仪器中测 定样品发射光波长。在显微镜c c d 前面安装一个透射光栅，根据光栅对不同分子 发射荧光的分光性可以区分它们。 单分子示踪能做到高精度、高分辨率检测，如果能结合微流控芯片高平行性、 高通量、微型化、自动化等优势，则将是生物医学研究领域的一个重大突破。因 此，我们还将初步尝试微流控芯片的单分子成像。 随着高灵敏检测设备的完善、新型荧光探针的开发、全新检测方法的提出， 单分子示踪将会由研究简单体系内分子的运动越来越多的拓展到研究复杂的非均 相生物体系内分子的运动以及与周围环境的相互作用，如疾病的诊断及其治疗过 程的实时追踪、对药物靶向性的研究、转基因的表达、揭示生理和病理机制。基 于微流控芯片和量子点的单分子示踪具有低成本、小型化、集成化、自动化、高 通量等特点，在生物医学、生物化学等领域也将有远大前景。 硕卜学位论文 第2 章量子点荧光增强与抗眨眼效应的研究 2 1 引言 q d s 具有连续的宽的激发光谱，窄而对称的发射光谱，量子尺寸效应和光稳 定性等特殊的光化学性质，可作为传统有机染料良好的替代物，广泛用于生物、 化学、医学、材料等领域，用于分子细胞生物成像哺6 5 8 ，6 引、荧光共振能量转移生 物传感器哺0 。、医学诊断等。 然而，不同的合成方法与生成环境都会影响