（高分子化学与物理专业论文）非病毒高分子基因载体的合成及其性能研究.pdf

南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，同意如下 各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学 位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、扫描、数字化或其它手段保存 论文；学校有权提供目录检索以及提供本学位论文全文或者部分的阅览服务； 学校有权按有关规定向国家有关部门或者机构送交论文的复印件和电子版：在 不以赢利为目的的前提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术 活动。 学位论文作者签名：孔爿陲差 o 口年歹月2 7 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在夸 年解密后适用 本授权书。 指导教师签名： 扎倦多乏 学位论文作者签名： 解密时间： 汐io 年 歹月力日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) 秘密1 0 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开 发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的 法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：乩慨 如0 6 年y - 其2 e l 中文摘要 中文摘要 随着基因治疗的发展，寻找高效安全可靠的基因转移技术的必要性也在逐 渐增加。其中基因转移载体是关键。阳离子高分子基因传递系统在过去十几年 取得明显进展，结果表明结构简单的高分子很难帮助d n a 穿越体内及细胞内 的所有屏障，针对具体的应用目的，设计多组分、多功能载体将是未来几年高 分子基因治疗研究的方向。 本论文分为两部分，第一部分我们对以乙二胺为核的聚酰胺胺型树状高分 子的表面和内部进行了修饰改性( q p a m a m o h 的合成) 。p a m a m 已被证明 是一种有效的基因载体，但是仍然存在一些问题如水溶性低，毒性相对较大， 限制了它的应用。我们通过在表面引入羟基提高该类聚合物载体的细胞相容性， 而将其内部季铵盐化以提高该类聚合物结合d n a 的能力，希望能够得到细胞 毒性小、转染效率高的基因载体，为基因载体的设计提供新思路。 论文的第二部分为阳离子多肽型基因载体的合成。聚天冬酰胺是近年来研 究较多的一种无毒无免疫反应可生物降解的生物材料，但其作为基因药物载体 的研究目前还很少。我们设计合成了一系列具有不同功能侧基的聚天冬酰胺衍 生物，这些功能侧基可以使聚合物具有不同程度结合d n a 的能力，从而进入 细胞，进行基因转染。我们分别对聚合物的结构进行了表征，并对其结合d n a 的能力、细胞毒性和转染能力进行了评价。 具体实验内容如下： 1 合成了以乙二胺为核的聚酰胺胺型树枝状高分子p a m a m4 5 代和6 5 代， 通过反应将聚合物表面官能团由酯基变为羟基，内部季铵盐化。对其结构进 行了表征，考察了聚合物与d n a 的结合能力、细胞毒性以及基因转染能力。 结果表明，转染效率很低，没有达到预期的目的。 2 通过天冬氨酸热聚反应合成聚丁二酰亚胺( p s i ) ，g p c 结果显示其分子量 ( m n ) 为8 7 7 1 7 ，分子量分布为1 2 7 。p s l 分别与带有伯氨基的试剂反应， 在聚天冬酰胺主链上键合不同的功能侧链，相关内容如下： 1 ) 侧链分别引入氨乙基和咪唑基( r a t i o ：i 0 ，3 1 ，1 1 ，1 3 ) ，咪唑基团可以 增强转染时的内体逃逸能力从而提高转染效率，对h e p g 2 细胞进行了体外 基因转染试验，发现氨基和咪唑比例为1 l 时转染效率最高； 2 ) 侧链分别引入己基氨基和咪唑( r a t i o ：1 1 ) ，发现连接氨基的碳链长度为六 中文摘要 个碳时，对h e p g 2 细胞的转染效率比两个碳的提高了很多。 3 ) 选择侧链氨乙基和咪唑基团比例为1 1 的聚合物进行季铵盐化，季铵盐化以 后转染效率明显降低，与第一部分实验结果相一致 4 ) 侧链分别引入氨乙基和羟基( r a t i o ：9 1 ，7 3 ，1 1 ) ，随着侧链羟基的增加， 聚合物的细胞毒性渐小，但对h e p g 2 细胞的体外基因转染效率都较低； 5 ) 侧链分别引入氨乙基和胆固醇基团( r a t i o ：4 1 ) ，胆固醇的引入大大降低了 聚合物的毒性，并提高了其体外基因转染效率。实验结果表明连接胆固醇 的载体对癌细胞具有选择性。 关键词：非病毒基因载体聚酰胺胺型树枝状高分子聚天冬酰胺基因传递 a b s t r a c t a b s t r a c t t h en e e dt od e v e l o pe f f i c i e n t ，r e l i a b l e ，a n ds a f eg e n ed e l i v e r yt e c h n i q u e s c o n t i n u e st oi n c r e a s ew i t ht h ed e v e l o p m e n to fa p p l i c a t i o n sf o rg e n et h e r a p y o n eo f t h ek e yt e c h n i q u e si sg e n e d e l i v e r yv e c t o r s c a t i o n i cp o l y m e r sh a v e b e e ni n t r o d u c e d a n dt e s t e df o rt h e i rp o t e n t i a la p p l i c a b i l i t yt ot h ef i e l do fg e n et h e r a p y h o w e v e r r e s e a r c ho v e rt h ep a s td e c a d ed e m o n s t r a t e st h a tp o l y m e r s 谢t 1 1s i m p l es t r u c t u r ea r e n o tc o m p e t e n tf o rd e l i v e r i n gd n a t h r o u g ha l lb a r r i e r si nv i v oa n di nc e l l s p o l y m e r s y n t h e s i s s h o u l da i ma t s p e c i f i c a l l yu s e s ，d e s i g n i n gm u l t i - c o m p o n e n t sa n d m u l t i f u n c t i o n si nf u t u r er e s e a r c h an o v e lq u a t e m i z e dp a m a m - o h ( q p a m a m - 0 1 4 ) w a ss y n t h e s i z e da n d a p p l i e da sag e n ec a r r i e r p a m a md e n d r i m e ri sp r o v e nt ob ea ne f f i c i e n tg e n ec a r r i e r i t s e l f ，b u ti ti sa s s o c i a t e d 、i t l lc e r t a i np r o b l e m ss u c ha sl o ww a t e rs o l u b i l i t ya n d c o n s i d e r a b l ec y t o t o x i c i t y t h e r e f o r e ，w ei n t r o d u c e dh y d r o x y lo nt h es u r f a c et o i m p r o v et h ep o l y m e r sb i o c o m p a t i b i l i t y , a n dt h e ni n t e r i o rt e r t i a r ya m i n eg r o u p sw e r e m o d i f i e db ym e t h y l a t i o nt op r o v i d eb i n d i n gs i t e sf o rn e g a t i v e l yc h a r g e dp l a s m i d d n a am e t h y l a t i o nr e a c t i o nw a sd o s e d e p e n d e n t i ti se x p e c t e dt h a tt h i sm e t h o db e e f f i c i e n tf o rg e n ec a r r i e rd e s i g n i n g n es e c o n dp a r to fo u rr e s e a r c hi st h es y n t h e s i so fc a t i o n i cp e p t i d e sg e n e c a r r i e r s p o l y a s p a r t i ca c i d i sak i n d o fn e w l yb i o d e g r a d a b l e ，i n n o c u o u sa n d e n v i r o n m e n t a lf i i e n d l yb i o - o r g a n i cp o l y m e r , b u ts e l d o mi ng e n et h e r a p yf i e l d h e r e p o l y a s p a r t i ca c i dd e r i v a t i v e s 、析t l ld i f f e r e n tc h a i ne n dw e r es y n t h e s i z e da n da p p l i e d a sag e n ec a r r i e r r e s e a r c hw o r ka sf o l l o w i n g ： 1 b a s e do ne s t e rt e r m i n a t e d p a m a m ，w es y n t h e s i z e dq p a m a m o h c o n s t r u c t i o n sa l ea f f i r m e db yt h es p e c t r ao fi ra n dn m r m t ta s s a y ss h o w e d t h a tt h ec y t o t o x i c i t yo fq p a m a m - o hw e r em u c hl o w e rt h a np e i t h es t u d yo f t h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nq p a m a m o ha n d p l a s m i dd n ai n d i c a t e d t h a t q p a m a m - o hc o u l d i n t e r a c t e l e c t r o s t a t i c a l l yw i t l ld n at o f o r mc o m p a c t c o m p l e x e sa tl o ww e i g h tr a t i o w ea l s oi n v e s t i g a t e dt h eg e n et r a n s f e c t i o n a b s t r a c t e f f i c i e n c i e so fq p a m a m - o hi nh e p g 2 c e l l s ，b u tw ed i dn o tg o tt h er e s u l t 嬲w e e x p e c t e d 2 p o l y s u c c i n i m i d e ( p s i ) w a ss y n t h e s i z e db yt h e r m a lp o l y m e r i z a t i o no fa s p a r t i c a c i di nt h ep r e s e n c eo fp h o s p h o r i ca c i d g p cr e s u l ts h o w e dt h a tt h em o l e c u l a r w e i g h t ( m n ) i s8 7 7 17a n dp o l y d i s p e r s i t yi s1 2 7 p s ih a st h es t r u c t u r eo ft h e i m i d er i n ga n dc a nb eg r a f t e dw i mt h ef u n c t i o n a ls i d ec h a i n so f c o n d e n s i n gd n a b yr i n g - o p e n i n gw i t l la l k a l i n er e g m e n t s r e l a t i v ec o n t e n t 嬲f o l l o w i n g ： 1 ) i m i d a z o l ea n d ( c h 2 ) 2 n h 2a ss i d ec h a i n s ( r a t i o ：o 1 ，1 3 ，1 1 ，3 1 ) i m i d a z o l ew a s i n 仃o d u c e dt o i m p r o v eb u f f e rc a p a c i t y i n e n d o s o m e s e x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o w e dt h a tp o l y m e ro fr a t i o1 1c o u l do f f e rh i g h e s tt r a n s f e c t i o na m o n gt h ef o u r 2 ) i m i d a z o l ea n d - ( c h 2 ) 6 n h 2a ss i d ec h a i n s ( r a t i o ：1 1 ) l o n g e rc a r b o nc h a i no f p r i m a r ya m i n e ，m o r et r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y 3 ) i m i d a z o l ea n dq u a t e r n a r ya m m o n i u m a ss i d ec h a i n s ( r a t i o ：1 1 ) w eg o tt h es a m e n e g l i g i b l et r a n s f e c t i o nr e s u l t s 嬲t h ef i r s tp a r t 4 ) h y d r o x y la n d ( c h 2 ) 2 n h 2a s s i d ec h a i n s ( r a t i o ：1 9 ，3 7 ，1 1 ) t h ec e l l c y t o t o x i c i t y d e c r e a s e d 、析t i lt h eh y d r o x y lr a t i oi n c r e a s i n g 5 ) c h o l e s t e r o la n d - ( c h 2 ) 2 n h 2 嬲s i d ec h a i n s ( r a t i o ：1 4 ) c h o l e s t e r o li sat a r g e t i n g g r o u pf o rc a n c e rc e l l s e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dc h o l e s t e r o l b a s e dp o l y m e r g o th i g h e r t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c yi nh e p g 2c e l l st h a ni nn i h 3 t 3 k e y w o r d s ：n o n v i r a lg e n ec a r r i e r s p a m a md e n d r i m e r p o l y a s p a r t i ca c i dg e n e t r a n s f e c t i o n i v 目录 目录 第一章绪论1 第一节基因治疗概述1 1 1 1 引言1 1 1 2 基因治疗的方法1 1 1 3 基因治疗的载体2 第二节阳离子高分子基因治疗载体4 1 2 1 阳离子高分子聚合物d n a 复合物的物理化学性质4 1 2 2 影响基因转染效率的因素5 1 2 3 用于基因传递的阳离子高分子载体6 第三节研究课题的提出及实验设计1 0 1 3 1 研究课题的提出：1 0 1 3 2 拟定的实验内容：1 2 参考文献1 2 第二章季铵盐化树枝状高分子基因载体的合成及其性能研究1 7 第一节引言1 7 第二节实验材料与方法1 8 2 2 1 实验材料与试剂1 8 2 2 2 实验仪器与设备1 8 2 2 3 实验方法1 8 第三节结果与讨论2 2 2 3 1q u a r t e r n i z e dp a m a m - o h 树枝状高分子化学结构的表征2 2 2 3 2树枝状高分子介导外源基因转染细胞性能的研究2 3 本章小结2 7 参考文献2 7 第三章聚天冬酰胺衍生物类基因载体的合成及性能研究2 9 v 目录 第一节引言2 9 第二节实验材料与方法3 0 3 2 1 实验材料与试剂3 0 3 2 2 实验仪器与设备3 0 3 2 3 实验方法3 0 第三节结果与讨论3 6 3 3 1 聚天冬酰胺衍生物的化学合成与结构表征3 6 3 3 2 聚天冬酰胺衍生物介导外源基因转染细胞性能的研究4 6 本章小节5 5 参考文献5 6 第四章全文总结5 7 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果5 9 致谢6 0 v 1 第一章绪论 1 1 1 引言 第一章绪论 第一节基因治疗概述 基因治疗作为一种新的治疗手段和研究方法，越来越多的被研究和实践。 随着人类基因谱的逐步阐明，大批基因的发现以及新技术的发展，治疗的范围 大大拓宽。基因治疗已从对单基因缺陷性遗传病的基因替代治疗，拓展至对致 病基因的修正和基因增强治疗，以及采用外源调理性细胞因子基因、核酶类及 反义核酸类基因药物进行治疗。因此有理由认为基因治疗会成为医疗领域的一 场新革命，对现有的疾病治疗模式和未来制药业产生深刻的影响和变革。 1 1 2 基因治疗的方法 美国f d a 在1 9 9 3 年给人类基因治疗下的定义为：“基于对活细胞遗传物质 的改变而进行的医学治疗，这种改变可在活体外进行，然后应用于人体，或者 直接在人体内进行 。从该定义可知，存在两种基因治疗方式，即间接体内法( e x v i v o ) 和体内法( i nv i v o ) 。前者是通过选择适当的靶细胞，在体外进行基因转移， 筛选可表达外源基因的细胞，再将这些细胞转移至体内。这是基因治疗前期最 常用的方法，其优点在于在将细胞移植回体内前，可以对细胞进行检查和优化。 但该方法仅局限于可移植细胞，如淋巴细胞和骨髓细胞等，同时仍需对可能发 生的免疫反应进行检查。该方法的另一缺陷是细胞移植回体内后其基因表达关 闭，必需开发和寻找合适的启动子。另外，该法还面临着如何长期保持移植细 胞功效的问题。体内法则是直接在体内改变与修复遗传物质，目前对其研究日 益增多，可能将成为基因治疗最有前途的方法。 用于基因治疗的靶细胞可以分为两大类：体细胞和生殖细胞。从理论上讲， 以受精卵或早期胚胎细胞作为治疗目标，不但能使遗传疾病在当代得到治疗， 而且还能将校正基因传给患者的下一代，最终根治遗传疾病。然而，因为生殖 细胞的基因治疗涉及到一系列的伦理问题，所以不易为人们所接受，同时，生 第一章绪论 殖细胞系统十分复杂，一旦发生错误，将会给后代造成非常严重的后果。而在 体细胞中，造血细胞具有长期分化和自我更新能力，是基因治疗理想的靶细胞。 成纤维细胞、肝细胞、内皮细胞、角化细胞、上皮细胞等也均可作为基因治疗 的靶细胞。所以体细胞基因治疗是目前唯一在技术上可行而且伦理上可以接受 的，也可以治疗遗传疾病，但只影响一代，而生殖系细胞基因治疗，只能用于 动物。 基因药物有三个组成部分：治疗基因、基因表达调控系统和基因传递系统。 治疗基因和基因表达调控系统构成质粒，控制治疗基因在靶细胞中的功能；基 因传递系统负责将治疗基因运送到目标部位，是基因药物的重要组成部分，也 是目前基因治疗的瓶颈。基因传递系统主要包括病毒载体、非病毒载体和物理 方法( 如基因枪、电穿孔等) 。 1 1 3 基因治疗的载体 理想的基因治疗载体应具备：( 1 ) 靶向特异性，并且可被免疫系统识别；( 2 ) 高度稳定，容易制备，可浓缩和纯化；( 3 ) 无毒性，对病人及环境安全无害：( 4 ) 有利于基因高效转移和长期表达。目前，在基因载体的设计上，大致可分为两 大类：病毒类和非病毒类。 病毒具有感染细胞的能力，其中应用最广泛的病毒载体主要是逆转录病毒 载体( r e t r o v i r u s ，r v ) 、腺病毒( a d e n o v i r u s ，a d ) 、腺相关病毒( a d e n o a s s o c i a t e d v i r u s ，a a v ) 等【3 】。病毒型载体的转染效率高，目前依然是研究最多也是最有 效的基因传递载体系统，正在进行临床研究的基因治疗方案中病毒载体也占大 多数。病毒载体的不足主要包括携带的d n a 大小受限制，有免疫原性反应， 如在载体中可能产生有传染性，野型或辅助型病毒；可能随机整合于宿主基因 组中，从而活化癌基因或使抑制癌基因失活；其自身或编码的基因产物过度表 达等不安全因素。正是由于安全性问题及大量获得重组病毒载体相对困难等原 因，科学家正在寻找更安全，高效又易识别的非病毒载体。 相对于病毒载体，非病毒载体毒性小，安全性高，易于制造，携带的遗传 物质从2 0 b p 的寡聚核苷酸到1 0 0 k b p 的质粒d n a ，甚至还包括更大的d n a 。 过去十多年人们已在设计非病毒基因治疗载体方面作过很多努力，并取得了许 多进展。非病毒载体主要包括：裸d n a ( n a k e dd n a ) l l j 、阳离子脂质体【2 】和 2 第一章绪论 高分子载体系统【3 1 。 裸d n a 就是将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接注射而不依赖 其他物质的介导，是最简单的非病毒载体系统。已知皮肤细胞、某些肿瘤细胞 及免疫细胞对裸d n a 较为敏感，肌肉注射后可直接诱导相应的免疫反应，也 可检测到d n a 的明显表达。电穿孔和基因枪技术的出现，大大提高了裸d n a 的转染效率，而且使d n a 可直接到达细胞核，避免了各种酶对d n a 的降解。 目前使用的d n a 疫苗，就是用编码病毒抗原的质粒直接肌肉注射，可获得有 效的抗病毒免疫。虽然将裸d n a 直接用于病变组织是可行的基因转移策略， 但是，对于解剖学上不能进入的部位如器官里的实体瘤，显然直接给予裸d n a 治疗是无效的。综合来说，裸d n a 的稳定性和转染效率均不高，而且很难有 靶向性。 阳离子脂质体在过去二十年得到了系统研究，已被广泛用于药物的控制释 放。早在1 9 8 3 年，n i c o l a u 等利用含乳糖的脂质体选择性转移基因至大鼠的肝 脏。虽然转染的效率不高，但是开辟了阳离子脂质体基因治疗研究的新领域【4 l 。 阳离子脂质体载体的细胞转染效率和基因表达程度的高低在很大程度上取决于 阳离子化合物的结构、电荷密度以及阳离子化合物在脂质体中的含量1 5 】。目前 已经有几十种脂质体基因治疗方案正在进行临床研究。所有这些阳离子脂质体 的一端皆拥有1 2 条由1 2 1 8 个碳原子组成的疏水链，使其在水性介质中形成 双层结构，并包裹d n a ；而另一端为亲水性的盯头部，通过静电力与d n a 结 合以形成脂质复合物。虽然脂质体基因治疗取得了某些成功，但也有一些不足， 如体内外转染条件差别大、重复使用毒性高、诱导抗炎作用、结合血浆蛋白等。 由于病毒、裸d n a 以及脂质体载体的这些不足，引起了人们对于高分子 基因治疗载体的研究兴趣。高分子基因载体就是利用人工合成的或天然的高分 子与d n a 形成复合物，通过细胞吞噬作用将这些复合物导入细胞内，形成的 复合物也可以保护d n a 不被体内各种酶类降解。与脂质体及其它非病毒载体 相比，阳离子高分子载体比较稳定，结构灵活，易调整其分子量、合成条件以 及形状( 线形、星形、无规网状、嵌段、接枝等) ，而且高分子基因载体毒性小、 安全性高，具有大量的活性官能基团、易于修饰，所以可以通过与细胞特异结 合的受体分子或蛋白相偶联的方式，赋予基因载体细胞靶向传递的能力。基于 这些优点，高分子基因载体的研究目前已成为生物医用材料的国际前沿热点之 一，具有很大的发展空间。 3 第一章绪论 第二节阳离子高分子基因治疗载体 按照高分子与d n a 的相互作用方式，高分子基因治疗载体可分为阳离子 高分子、水溶性双亲型非离子高分子和高分子基质【6 7 】这三大类。其中以阳离子 高分子为代表，研究最多，效果最好。 1 2 1阳离子高分子聚合物d n a 复合物的物理化学性质 在生理条件下，d n a 是带负电荷的柔性大分子，它的负电荷来自于主链的 磷酸根离子。d n a 分子是一个很长的链，没有外力或载体的作用很难穿过细胞 膜进入细胞。水溶性阳离子高分子可以通过电荷的相互作用与带负电的d n a 分子形成聚电解质复合物( p o l y e l e c t r o l y t ec o m p l e x e s ) ，复合物通过细胞的内吞 或吞噬作用进入细胞，从内体中逃逸后扩散到细胞核的表面，然后渗入其内部 从而实现了将基因导入细胞的目的。图1 1 是阳离子高分子介导的体外d n a 转 染的一般过程。 图1 1阳离子高分子介导的体外基因转移的一般过程 形成的阳离子高分子d n a 复合物有独特的微粒特性，它们与所用阳离子 高分子载体的性质、高分子d n a 电荷比等有关。复合物的性质对d n a 的转染 效率有重要的影响【8 捌。 4 第一章绪论 1 2 2 影响基因转染效率的因素 1 2 2 1 细胞外屏障 1 与血液成分的相互作用 用体内方法进行基因治疗，d n a 阳离子高分子复合物通过血液循环分布到 各组织。当复合物和血清蛋白、血细胞接触后，其生物分布依赖于它最新获得 的生理化学性能。 在血液中含有大量的带有负电荷的蛋白质，它们很容易和阳离子载体静电 结合，这种行为会导致复合物表面正电荷的减少，复合物粒径的变大，降低基 因表达效率10 1 。阳离子高分子的p e g 化或在其中加入亲水片断形成共聚阳离子 高分子可以减少这种相互静电作用【1 1 1 6 1 。 2 免疫系统的识别 d n a 阳离子高分子复合物作为外来材料被免疫细胞( 特别是单核的吞噬细 胞系统) 识别和吞噬，产生免疫反应。这种免疫反应不仅会引起毒性，而且降 低了基因的转染效率【1 7 1 引。 3 血管渗透性 在许多情况下，d n 阳离子高分子复合物需要渗透过毛细管壁才能与靶细 胞接触。毛细血管壁的构造与其所在的组织有关，一般分为三种类型：连续的、 有孔的和非连续的【1 9 l 。在正常情况下，只有粒径相对比较小的d n a 复合物能 渗透过由非连续的内皮细胞组成的血管壁。 1 2 2 2 细胞内屏障 1 细胞膜屏障 d n a 阳离子高分子复合物可以与细胞膜通过电荷相互作用及胞吞作用穿 过细胞膜屏障，被细胞摄取。 2 内体逃逸 d n a 阳离子高分子复合物穿过细胞膜进入细胞中形成内体( e n d o s o m e ) ， 内体中含有能降解d n a 的酶，从而导致d n a 降解和失活，因此复合物必须尽 快从内体中逃出。 加入氯喹( c h l o r o q u i n e ) 等具备高的缓冲能力( b u f f e rc a p a c i t y ) 的成分可 以帮助d n m 阳离子高分子复合物在内体中结合更多的质子，导致内体的渗透 5 第一章绪论 压升高，内体膜更容易破裂，有助于复合物的内体逃逸【2 0 1 。 3 细胞核屏障 d n 阳离子高分子复合物从内体中逃出后，在细胞质中迁移，通过细胞核 上的孔进入细胞核才能进行基因表达。复合物的粒径超过2 8 n m 就不能有效穿 过核膜孔【2 1 1 ，目前尚不清楚复合物是如何进入细胞核的。 1 2 2 3 基因转染中的载体因素 载体因素主要有以下四个方面： 1 z e t a 电位：z e t a 电位与载体所带的电荷量密切相关，带电量高则z e t a 电位 高，带电量低则z e t a 电位低。对于阳离子载体而言，z e t a 电位高一般能起到与 d n a 结合牢固的作用。 2 n p 比值：n p 比值就是载体氨基上的氮原子与d n a 磷酸根上磷原子的比 值。在生理条件下一个氮原子由于结合质子而带一个正电荷，d n a 中一个磷酸 根带一个负电荷，所以n p 比值也可以理解为正负电比值，n p 比值最终关系 到基因转染载体系统带负电还是带正电。 3 毒性：载体的毒性能直接影响到转染效率。脂质体的毒性普遍比阳离子高 分子载体高，这就是其转染效率低的限制性因素。但是毒性低并不意味着转染 效率高。 4 粒径：载体的粒径是转染的主要影响因素【2 2 j ，粒径小的载体转染效率高 2 3 - 2 4 。但这也不完全正确，因为粒径是决定转染系统进入溶酶体的主要因素。 粒径小就容易使转染系统快速进入溶酶体而被降解，粒径稍大进入溶酶体就慢， 这样就延长了d n a 在细胞内的时间，增加了其从内涵体逃逸的机会【2 引。关于 最大粒径问题，有的研究指出粒径在1 0 0 2 0 0 n m 的颗粒仍可通过受体介导的内 吞途径进入细胞，但再大的颗粒就不得不经过吞噬作用进入细胞了【z 6 j 。所以要 获得高的转染效率，基因转染系统的粒径应该在2 0 0 n m 以下。 1 2 3 用于基因传递的阳离子高分子载体 1 阳离子多肽 多聚赖氨酸p l l ( p o l y ( l - l y s i n e ) ) 是较早用于基因导入的阳离子聚合物纳米 材料，许多研究已成功地将p l l d n a 形成的聚电解质纳米颗粒用于基因导入。 p l l 的一个显著优势在于它易于化学修饰，能与配体结合而用于受体介导的特 6 第一章绪论 异性基因导入，如p l l 与无唾液酸血清粘蛋白或表皮生长因子等连接而增加特 异性的基因转导效率。但由于p l l 与d n a 形成的复合物在体内易与带负电荷 的非特异性细胞和血浆蛋白等结合，以及在溶酶体内易于水解失活等因素的影 响，以p l l 为骨架的基因导入系统在体内的表达效率较低，目前的研究趋势是 将p l l 与其他材料耦合而改善其性能。 叶 j h 2 n t e r m i n a li m i d a z o l eg r o u p c o n t a i n i n gp l l 图1 2 多聚赖氨酸咪唑改性结构示意图 用于修饰p l l 的材料应用较多的是聚乙二醇( p o l y c t h y l c n c g l y c o l ，p e g ) 。 p e g 是一种可降解的高分子材料，具有经济、易得、独特的端基反应性和可修 饰性以及很好的稳定性和无免疫原性等优点。p e g 修饰p l l 后屏蔽p l l d n a 复合物的部分表面电荷，并增加复合物的水溶性，使复合物更适宜用于体内基 因转导。 聚乳酸一羟基乙酸共聚物( p o l y l a c t i c p o l y g l y c o l i c a c i d ，p l g a ) ，p l g a 不仅具 有可降解性和安全无毒性，而且还具有保护生物大分子活性的作用。p l g a 自身 亦可作为基因载体【2 7 1 ，p l g a 与p l l 结合后能明显改善p l l 的性能。j e o n g 等【2 8 j 以p l l 作为阳离子聚合物骨架，与可生物降解的p l g a 通过化学结合形成p l l p l g a 复合物，复合物的粒径因p l g a 的百分比不同而波动在6 9 4 1 4 9 6 n m 之 间，复合物粒子独立稳定，呈球形几何体，且水溶性好，这些特性适合作为基 因导入纳米载体。另外，o k u d a 等【2 9 】将第六代树枝状p l l ( k g 6 ) 的末端氨基酸 分别用精氨酸和组氨酸取代，合成了k g r 6 和k g h 6 。实验结果显示，k g r 6 结 合质粒d n a 的能力和k g 6 十分接近，转染效率l e k g 6 高3 - 1 2 倍，k g h 6 在酸 性条件下( p n5 o ) 与d n a 混合形成d n a 复合物，在中性条件下相对稳定，并 且转染效率l 匕k g 6 高。k g h 6 的这个特殊性质有利于在体内外构建功能性的基 因传递系统。 2 聚乙烯亚胺( p o l y e t h y l e n e i m i n e ，p e i ) 7 尹 h h 第一章绪论 p e i 也属阳离子聚合物，p e i 的结构有两种类型：线型p e i 和支化p e i 。 其中线型p e i 通过2 取代嗯唑啉开环聚合后水解得到，而支化p e i 则通过氮丙 啶( a z i r i d i n e ) 的开环聚合得到。用于基因传递的p e i 大多是支化结构，最常用 的支化p e l 分子量为2 5 0 0 0 。p e l 分子由c h 2 c h 2 n 结构单元组成，是已知的电 荷密度最大的阳离子有机高分子。支化p e l 分子中有一级胺、二级胺、三级胺， 在生理条件下能部分质子化从而使p e l 分子带有正电荷，所以p e i 与d n a 可 通过电荷相互作用形成紧密的聚电解质复合物，p e i d n a 复合物的粒径用原子 力显微镜观察为2 0 4 0 n m t 3 0 1 ，用电镜观察为5 5 1 2 n m ，用动态光散射方法测定 为9 0 1 3 0 n m t 3 1 j 。一个p e i d n a 复合物粒子中含有的d n a 个数尚不知道，但脂 质多胺复合物中含有约1 0 0 个质粒d n a a 2 】。 陟hr i d i ! 一s u b s t i t u t 甜 b r a n c h e dpeiazlrldineb r a n c h e dp e i j i z - o x a z 0 11 n e tc h 2 c h 2 n h 守 图1 3 聚乙烯亚胺合成单体及聚合物结构示意图 p e i 的高转导效率与它的缓冲能力强大有关，p e i 可抑制溶酶体在吞噬泡 酸性环境中的质子化，对d n a 提供更大的保护作用，p e i 还能促发一股巨大 的c l 流而引起吞噬泡膨胀并破裂，进而将d n a 释放到细胞质中，并能进一步 进行核定向进入细胞核【3 3 泓】。 然而，因为p e i 是有机聚合物，不容易被细胞内的酶代谢，易于在核内聚集 而引起细胞毒性。研究发现小分子量p e i ( _ 、埘一 芝 ) ， ，z n ：oa渖)；啦 第三章聚天冬酰胺衍生物类基因载体的合成及性能研究 4 0 0 03 5 0 0 3 0 0 02 5 0 02 0 0 01 5 0 01 0 ( ) 05 0 0 w a v e n u m b e r ( c m ) ( b ) a j h 8765432 d ( p p m ) f i 9 3 7 i ra n d1 h n m rs p e c t r ao fp h m a c o - p p e a ( 5 ) 3 3 1 4 季胺盐化聚天冬酰胺衍生物q p a e a c o p p e a ( 6 ) 的化学结构表征 季铵盐化聚天冬酰胺衍生物的合成路线如f i 9 3 8 所示。 4 l 为 加 8c#毛c巴卜 第三章聚天冬酰胺衍生物类基因载体的合成及性能研究 p a e a c o p p e a ( 3 ) + c 1 。n c o h 呈里竺 - 6h 2 0 d m s o 0 【一n n g - o p e n i n g ( x + y ) ( i n + n ) = 1 1 j n h l y 卜r i n g - o p e n i n g f i 9 3 8 p r e p a r a t i o no f q p a e a - c o - p p e a ( 6 ) i n h + _ | n f i 9 3 9 是聚合物的表征图谱，根据聚合物的结构给出峰归属。 f i 9 3 9 ( a ) 是i r ( k b r ) ：3 2 9 5 ，3 0 4 5 ，2 9 3 3 ，1 6 5 3 ，1 5 3 8 ，1 4 5 5 ，1 3 6 0 。 f i 9 3 9 ( b ) 是1 h n m r ( d 2 0 ) ，8 ( p p m ) ：1 6 , - - 1 8 ( m ，2 h ，c i - b c h 2 n ) ，2 0 ( s ，9 h ， c h 3 ) ，2 5 - - 2 8 ( m ，2 h ，c h 2 c o ) ，2 8 - 3 0 ( r i i 2 h ，c h e n h ) ，3 0 3 1 ( s ，2 h ，c n ( c h 3 ) 3 ) ，3 2 3 ( s ，2 h ，c h 2 n h c o ) ，3 7 - - 3 9 ( m ，2 h ，c h 2 n ) ，4 5 4 6 ( m ，h ，c h c o ) ， 6 7 ( s ，1h ，c h ) ，6 9 ( s ，1h ，c h ) ，7 4 ( s ，1h ，c h ) 4 0 0 03 5 3 0 0 02 5 0 02 0 0 01 5 0 01 0 0 0 5 0 0 w 目、舟州删f ) 4 2 、埘一 芝 8cm鲁磊c毋jj 第三章聚天冬酰胺衍生物类基因载体的合成及性能研究 j 87654321 d ( p p m ) f i 9 3 9 i ra n d1 h n m rs p e c t r ao fp a e a - c o - c h o l e s t e r o l ( 6 ) 3 3 1 5 p a e a c o p h e a ( 7 9 ) 的化学结构表征 侧链含有氨乙基和羟基的聚l 天冬酰胺衍生物的合成路线如f i 9 3 1 0 所示。 ? n h 2 o p s i o o 足r 乏 n h ，n h c o c 冬n h o h 二= - - - - - - 二= - - - - - - ? o h 0 【一n n g o p e n i n g 7 n h l 了 ? o h 卜r i n g - o p e n i n g f i 酪10 p r e p a r a t i o no fp a e a c o - p h e a ( 7 9 ) 4 3 7 n h l j n 2 h、，n 第三章聚天冬酰胺衍生物类基因载体的合成及性能研究 以p