（物理电子学专业论文）光纤扫描显微成像技术的研究.pdf

摘要 r 单模光纤激光共焦扫描显微镜是现代光电技术结合的新型扫描显微成像系 统，由于排除了离焦光线对图像造成的模糊和斑点影响，因而具有很高的横向 和纵向分辨率，能够实现对微小物体的三维成像。因此在医疗、生物、物质结 构、微电子等领域均具有广泛的应用前景。， 本文深入研究分析了单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的成像机理，并 对单模光纤在共焦扫描显微成像系统中的作用和影响进行了理论分析；完成了 总体方案的分析论证，确立了系统的总体组成方案和对各分系统的要求；重点 设计研制了采用检流计式光学扫描器( 振镜) 实现的高精度的二维扫描系统，深 入研究解决了检流计式光学扫描器( 振镜) 扫描方案存在的固有非线性问题，采 用以硬件电路实现非线性补偿的扫描和采样方案，获得了信号的线性输出。 关键词；激光共焦扫描显微镜 单模光纤，检流计式光学扫描器( 振镜卜非线性 a b s t r a c t s i n g l e - m o d ef i b e r o p t i c a l c o n f o c a l s c a n n i n g l a s e r m i c r o s c o p y i san e w s c a n n i n gm i c r o s c o p i ci m a g i n gs y s t e m ，w h i c h i sb a s e do nt h em o d e mo p t i c s t e c h n o l o g ya n de l e c t r o n i c st e c h n o l o g y i tr e m o v e st h eo u t o f - f o c u sl i g h tt h a tm a k e s t h ei m a g eb e c o m eb l u r t h e r e f o r e ，i th a sh i g hr e s o l u t i o ni nb o t ha x i a la n dt r a n s v e r s e d i r e c t i o n s ，a n dc a na c h i e v e3 - di m a g i n go fm i c r o o r g a n i s m i th a sab r i g h tp r o s p e c t i nt h ea p p l i e dd o m a i no f m e d i c a l ，b i o l o g y ，p h y s i c a ls t r u c t u r e ，a n dm i c r o e l e c t r o n i c s t h ei m a g i n gt h e o r yo ft h es i n g l e - m o d ef i b e r - o p t i c a lc o n f o c a ls c a n n i n gl a s e r m i c r o s c o p y i sd i s c u s s e di nt h i sp a p e r t h ee f f e c ta n dt h ef u n c t i o no ft h es i n g l e m o d e f i b e ri nt h ei m a g i n gs y s t e ma r e a l s od i s c u s s e d t h e o r e t i c a l l y t h ea n a l y s i s a n d d e m o n s t r a t i o nf o rt h ew h o l ep r o j e c ti sc o m p l e t e d ，a n dt h es y s t e m sc o m p o n e n t sa n d t h er e q u e s to f t h ec o m p o n e n t sa r ee s t a b l i s h e d t h es c h e m e ，w h i c hu s e sg a l v a n o m e t e r s c a n n e rt o c o m p l e t eh i g hp r e c i s i o n s t w o d i m e n s i o ns c a n n i n g ，i sd e s i g n e da n d d e v e l o p e di ne m p h a s i s a n d t h es c a n n i n gn o n l i n e a rw h i c hi sc a u s e db yt h ei n h e r e n t p r o b l e m & t h eg a l v a n o m e t e r s c a n n e ri sr e s o l v e d t oa c h i e v et h el i n e a rs i g n a lo u t p u t ， as c h e m et h a tu s eh a r d w a r et oc o m p e n s a t et h en o n l i n e a ro f t h eg a l v a n o m e t e rs c a n n e r i sd e v e l o p e d k e yw o r d s ：l a s e rc o n f o c a l s c a n n i n gm i c r o s c o p y , s i n g l e m o d eo p t i c a l - f i b e r ， g a l v a n o m e t e rs c a n n e r ，n o n l i n e a r 研究生学位论文1 绪论 1 绪论 1 1 课题研究背景 随着科学技术的发展，在许多应用场合，如医疗、生物、生命科学、遗传 基因学、材料科学、精密机械、半导体工业等研究领域，都需要研究微小物体 的三维结构，如生物细胞、集成电路等。这不仅需要高分辨的无前后表面叠加 的断层图像，还必须成清晰的三维图像。普通显微镜的成像特性是物面前后一 定厚度内所有断层图像的叠加，难以达到上述要求。而激光共焦扫描显微镜是 现代光电技术结合的新型成像系统，由于排除了离焦光线造成的图像模糊及斑 点，能够在像面上获得高对比度的高倍率放大图像，加上它所具有的亚微米纵 向分辨能力能够实现光学切片，建立起一系列不同高度上的高分辨率光学断层 图像，配合计算机图像处理技术的使用，便可实现细微结构的三维成像。因此 激光共焦扫描显微镜是研究细微结构的有效技术手段，受到国内外学术界和科 技界工作者的广泛研究和关注。 激光共焦扫描显微镜与传统的光学显微镜相比，它既具有一般光学显微镜 的横向分辨率，又克服了普通显微镜观察景深小的缺点，达到了较高的纵向分 辨率。激光共焦扫描显微镜的独特成像特性来自于点源和点探测器的引入，使 其能抑制共焦点以外的光线进入探测器的感光面上。因此，激光共焦扫描显微 镜共焦平面的图像不会因为来自共焦平面外的扫描反射光线而变坏，能够实现 光学切片，这是普通光学显微镜所办不到的。正因为激光共焦扫描显微镜突破 了普通光学显微镜在观察三维结构时受到的限制，它可以将一系列二维断层图 片通过计算机合成三维立体图像，使其在许多科学领域中都具有重要的现实意 义。例如在生物医学领域方面：以往，科研人员在研究生物组织或样品时通常 是将其割开、切片，然后用普通显微镜观察，这样不可避免地造成一系列问题， 如样品在切片过程中由于变形而破坏了原有结构，造成位置错位、表面形态变 研究生论文专用纸第1 页 研究生学位论文 l 绪论 形等，此外，切制过程极为耗时，而且有些样品是不能切割的。使用激光共焦 扫描显微镜就可避免上述问题。在观察生物活细胞接受药物处理的反应时，激 光共焦扫描显微镜也起到极为重要的作用，它可以在计算机的控制下每隔一定 时间记录下细胞图像，从而使得工作人员可以在实验后从容地观察和研究细胞 受药物作用后的变化情况。 点源和点探测器是激光共焦扫描显微镜系统中的关键元件。在传统的激光 共焦扫描显微镜系统中通常是将一微米量级的针孔放置在光源和光探测器之 前，来构成点光源和点探测器而针孔的使用将带来一些实际操作上的困难。 如果激光束的会聚点与针孔的对准存在偏差将会产生失真和像差，而探测器针 孔的对准更为关键，亚微米的移动都将导致像差及分辨率的下降。如果有灰尘 落到其中的一个针孔上，将会减弱信号光强并引入像差。擦除针孔上的灰尘必 须将它从装置上拆除下来，而后安装时又得进行极为繁琐的重新对准。另外， 由于其扫描结构与点光源和点探测器等测量机构基本上是一体的，因而系统结 构比较复杂、笨重。光纤是现代新技术的光信息传输介质，具有很强的光信号 传输和抗干扰能力，同时光纤还具有很好的柔性等许多优良性质。用单模光纤 来代替针孔作为点光源和点探测器的单模光纤激光共焦扫描显微镜系统，使得 激光器会聚点与光纤输入端对准略有偏差也不会对系统引入像差，因而系统安 装调试过程中只需大致对准即可。而且光纤端面沾染灰尘的可能性大大降低， 光纤端面的清洗也不需要拆卸及重新对准。另外，由于光纤的灵活性，使得激 光、信号探测部分可实现分布式摆放，而不是象传统激光共焦扫描显微镜那样 必须安装在支撑架上一固定的位置，因而简化了系统的结构，提高了抗干扰能 力和可靠性。综上所述，研究单模光纤激光共焦扫描显微镜的成像特性和提高 系统像质有着重要的理论价值和应用意义。 1 2 国内外研究现状的分析 激光共焦扫描显微镜( l c s m ) 系统作为研究细微结构的有效工具，得到 了国内外学术界和科技工作者的广泛关注和研究。1 9 5 1 年，r o b e r t 和y o u n g 最早提出了扫描显微镜。此后，紫外光源的使用和激光的发明，对扫描显微镜 的发展起到了很大的推进作用。1 9 6 1 年，m m i n s k y 首次在扫描显微镜的基础 研究生论文专用纸 第2 页 研究生学位论文1 绪论 上提出了共焦扫描光学显微镜的概念，指出了共焦扫描显微镜具有纵深分辨特 性。之后有许多文献报道了该系统在理论和实践方面的研究工作。特别是在8 0 年代和9 0 年代，它引起了人们的高度重视，美国、日本、英国、德国都投入 了大量的人力和财力进行研究，在理论上和实践上都取得了巨大的发展。在理 论上，更加全面地研究了系统的各种特性，提出了许多改进成像质量、提高成 像分辨率的方案。在应用实践方面，现国外已有正式产品投入市场。如美国 m e r i d i a n 公司制造的用于遗传工程研究的大功率l c s m 系统，价格为5 0 万 美元；德国l e i c a 公司生产的t s 4 d 型l c s m ，价格为3 0 万美元；德国c a i s i 公司生产的o p t o n l s m l 型l c s m ，价格在2 5 万美元以上。这些产品设备 档次高、系统庞大，价格昂贵。目前国内仅有上海医科大学、中科院生命科学 中心、广州第一医科大学等几家国家重点科研单位购买了国外的l c s m 系统。 国内激光共焦扫描显微技术的起步较晚，近几年才有几个单位开始研究。而在 利用光纤作为激光共焦扫描显微镜系统中的点光源和点探测器方面的研究，国 外是八十年代末、九十年代初才开始的，这方面的研究工作已有文献报道，并 在分析研究光纤激光共焦扫描显微系统的成像特性方面，获得了初步的研究成 果。在国内尚无有关方面的正式文献报道。 课题正是在这样的背景下提出的，并且得到了高等学校博士学科点专项科 研基金资助项目的支持。于1 9 9 7 年1 月批准立项，于1 9 9 7 年9 月正式开题。 1 3 课题研究的主要内容、目的和意义 本课题采取理论分析和实验研究相结合的方法开展对单模光纤激光共焦扫 描显微镜成像技术的研究工作。 ( 1 ) 通过调研和检索大量国内外有关的资料及文献，在理论上对传统的激 光共焦扫描显微镜的成像机理进行研究和分析，进而探讨在激光共焦扫描显微 成像系统中用单模光纤代替针孔构成点光源和点探测器对成像特性的影响，找 出理论依据，确定实现激光共焦扫描显微成像的光纤和系统有关参数。 ( 2 ) 在深入分析和探讨单模光纤激光共焦扫描显微成像原理的基础上，完 成单模光纤激光共焦扫描显微成像系统总体方案的论证和具体实现方案的研究 和设计。 研究生论文专用纸 第3 页 研究生学位论文1 绪论 ( 3 ) 通过理论分析单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的成像特性，计算 出横向和纵向分辨率，进而根据分辨率的要求，研制出适用于单模光纤激光共 焦扫描显微成像系统的高精度二维扫描和采样实验装置。 ( 4 ) 重点对高精度二维扫描和采样系统中存在的非线性问题进行分析，设 计出利用硬件电路进行非线性补偿的扫描和采样实验装置。 本课题研究的目的旨在跟踪国际学术前沿的研究工作，根据现有的条件， 探索单模光纤激光共焦扫描显微镜系统的各种成像机理和特性，并借鉴国外己 取得的研究成果，开展我国在这一领域的研究工作。 露强， 研究生学位论文2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的 基本原理 2 1 引言 扫描成像是把图像信息用一定的取样孔径，按一定的扫描方式来获取和记 录，然后以同样的扫描方式重现图像。扫描成像虽是一种最基本的获取图像信 息的方式，但它往往需要比较完美的取样扫描和重现扫描技术才能得到成功的 应用。现代电子、激光、航天等技术的发展，大大促进了扫描成像技术的应用 和发展。 扫描成像在近代成像技术中占有非常重要的地位，最突出的是电视的广泛 应用。下面几种情况扫描成像方式： 1 把二维的图像信号转化为一维的时间信号。如常规的通信系统是一时间 信息通道，为了传输二维空间的图像信号，就必须用扫描方式实现这种转化。 又如目前的计算机，本质上也是一时间通道。图像信号对计算机的输入和输出 也都需要这种转化。 2 对成像媒介没有一定空间分辨率的二维图像接收器。红外辐射、微波、 声波等都没有二维接收器，只能用单一接收器进行扫描接收。如遥感相机、光 声显微镜、微波全息、声全息等。 3 有时为了提高接收灵敏度或显示亮度也采用扫描成像方式。如荧光显微 镜、激光大屏幕显示、外差干涉显微镜等。 1 9 5 1 年，r o b e r t s 和y o n g 最早提出了扫描显微镜，之后激光的发明对扫描 显微镜的应用起了极大的推动作用，各种扫描显微镜应运而生。这些扫描显微 镜包括：扫描光学显微镜、扫描电子显微镜、扫描声学显微镜、扫描隧道显微 镜、扫描力显微镜、近场扫描光学显微镜和共焦扫描光学显微镜。共焦扫描光 学显微镜是m m i n k e y 在1 9 6 1 年首次提出的，它与普通光学显微镜的光学系统 实质上是相同的，其主要的差别在于光照射法和光探测法。共焦扫描光学显微 研究生学位论文2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 镜的共焦特性可以由图2 1 ( a ) 来说明。在图2 1 ( a ) 中，样品位于与光源针 孔共轭的物面上。当系统被精密校准时，由光源通过针孔射出的光，经物镜形 成受衍射限制的光点。此光点照射在样品上的一点，由该点反射回来的光线再 次通过物镜及其后的探测针孔被探测器所探测，即可获得共焦图像。被光源照 射的针孔，起点光源的作用；探测针孔及其后的探测器起点探测器的作用。因 为光源针孔与物面、物面与探测针孔( 即像面) 都是共轭的，所以称它们为“共 焦关系”，此时的物面与探测针孔面称为共焦面，简称焦平面。这里的“焦平 面”与几何光学中定义的“焦平面”是不同的。 光源 ( a ) 光源 焦3 z i l i i ( b ) 孔 光探 测器 厂 光探 u 测器 图2 1 共焦扫描光学显微镜光路示意图 ( a )扫描对象位于共焦面上( b ) 扫描对象位于共焦面外 、 如果样品移出物平面，其反射光线来自物平面的上方或下方物体的反射， 研究生论文专用纸第6 页 研究生学位论文2单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 即观察物上的大部分反射光线经物镜后不能被聚焦到探测睾1 孔罩去，而被散射 到针孔之外，如刚21 ( b ) 所示。使观察针孔后面探测器接收的光信号的幅度 迅速地减少，即对准面前后的物面不能成像。而在普通的显微镜t h 来自物平 面之外的反射光线也将进入目镜而被观察和记录，使得位于物平面上的物体图 像变得模糊。因而，共焦扫描显微镜与普通显微镜相比，所获得的图像具有更 好的对比度和更高的分辨率。故用共焦扫描光学显微镜观察一个透明的生物标 本，这个“分立”的物平面可以被前后移动，从而得到标本中的许多薄层的图 像，实现了光学切片，这是普通显微镜所办不到的。在这种结构中，显微镜是 共焦的，因为物镜被两次使用，即照明和成像，如图21 所示。在某一时刻样 品上仅一点被照明，所以样品或光束必须进行扫描，整个图像是由一个像元接 着一个像元形成的，象电视图像一样。因此共焦扫描光学显微镜的三个基本要 求是点光源照射、点探测和共焦成像。 2 2 激光共焦扫描显微镜与普通扫描显微镜成像原理 的比较 普遍的扫描光学显微镜的成像原理图( 以透射型为例) 如下图2 2 所示。 扫掐 s 原 。l n l 、 一卜 一 d !j。 出 i 出 ! d ， 。 图2 2 普通扫描显徽镜成像原理图 假设面光源是非相干的，s ( x ，y ) 是面光源的光强分布函数；p ，( 、 研究生。学位论文2单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 n 1 ) 利p ：( z ，nz ) 分别为透镜l - 和透镜l z 的孔径函数：样【吊的复振幅透 射率为t ( x 。，y 。) ；探测器的空间滤波孔径函数为d ( x ：，y ，) 。于是，面光源 上任一点光源( x 卜川y ) 透过物体的光场复振幅分和u 可以写成： u 1 ( x o ，y o ；x j ，y ，) = h ix o m x l ，y o m y l ，( x s x 0 , y 。一y o ) ( 2 1 ) 式中( x ，y ) 为光源面坐标；( x 0 ，y o ) 为物面坐标；( x 。，y ：) 代表扫描位置： m 为成像放大倍数；h 是透镜l 。的点扩散函数： 一。x o , y ) = + 尸+ 尸p l h ) 唧【尝y 沁咖 z ， 经过透镜l ：，在探测器接收面上的光场复振幅分布u ：为： u z ( x 2 , y 2 ；x s , y , ) = ! 一g o , y o ；x s , y s ) 一z m 告扣砒 = h ix o m x l ，y o m y l ，g 。一x 0y 。一y o ) 妯z 【鲁叫。，告咄j 出。咖。 ( 2 3 ) 式中( x ：，y 2 ) 为探测器坐标；h 2 是透镜l 2 的点分布函数： 一：x o , y = + + f p 2 皓：，”：) e x i 考 e ：x 。+ ”：y 。) l 嘶。d 叩 ( z 。) 最后探测器探测到光强可以表示为： ，g s ) ：了+ f + 了s ( ：( 。：，。，。1 2。咖。：砂：( 2 5 ，b , y s ) = f s ( x i , y 1 ) l u 2 ( 。，。1 2 d ( x 2 , y 2 l 咖l d x yy ) l u y 2 ；xyd ( x zy 22 砂2 。 = f f s ( x y ) h l ( 一尬y m y - ) 。 。+ ( x 。一 盘l ，y 。一m y ，g 。- - x o , y s 一y o ，f x 。- x o , y s - y o ( 鲁一孙告一蜘 f ( 裔一x 。，鲁一y 。 xd ( x 2 ，y 2 l a y l d x o , 4 y o d x o 咖od x 2 咖2( 2 6 ) 上式代表了普通的扫描光学显微镜的光强分布情况。在特殊情况下，即物 的复振幅透射率为6 函数时，上式可化简为： 研究生学位论文2单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 l ( x ，y 。) = f s ( x y ) h t 一m x 。，y 。一m y 。) l+fx。&ix】，omvl(_-xo,yso弦+fkh，-yo)h & i x ym vx o , yyyy l + ix o 】，o l 占( x ，一。扮+ fx ，一r 。，j x k ( 鲁一孙面y 2 一y 。】k ( 鲁一x 。 ，y 万2 一y 。) d ( x 2 ，y 2 皿l 方l d r o 咖o d r od y o 出2 方2 = jf s ( x m yh 。一m x 。，y 。一m y 。) + ( x 。一m x 。，y 。一m y ) n z ( 嵩b 面y 2 儿j k ( 音一b 告一y 。j 。o z 执陋- 咖t 出z 咖： f 。 2 1 = f s ( x 。川概o ，一坛，_ y 一m y 】出。咖。 l j 啦陋y ：飞，扣卜咖： 汜， 在扫描显微成像系统中，一方面通过计算机控制扫描方向、扫描角度，另 一方面通过计算机实时采集样品扫描点信息，进行图像处理，并将结果显示在 显示器上。取样扫描基本上可归纳为以下三种方式：( a ) 点源面接收方式； ( b ) 面源一点接收方式；( c ) 点源一点接收方式。下面将对这三种扫描成像 方式的成像原理分别进行分析。 2 2 1 点源一面接收方式的成像原理 为了便于研究，选用如图2 3 所示的透射型点源面接收方式成像系统。图 中透镜l ，的孔径函数为p ，( e ，n ，) ，它使入射光聚焦在复振幅透过率为t ( x o ， y o ) 的物体上，透射光被孔径函数为p 2 ( 2 ，i 、。) 的透镜l 2 收集，再由面探 测器d ( x ，y ，) 接收。对物体的扫描是通过点光源的移动来实现的。 图2 3 与图22 的差别就在于，图2 2 中的面光源被图2 3 的点光源所替代， 即s ( x ，y 。) = 6 ( x 。，y 。) ，把它代入等式( 2 5 ) ，可以得到点源- 面接收扫描 成像方式探测到的光强： 研究生论文专用纸第9 页 研究生学位论文2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 扫拙 占爿鼷 p l ( 1 ，n 1 ) t ( x ：x o ，y ：y o ) 图2 3 点源面接收方式成像光路图 器 y 2 ) ”f ”i ”i ”ia ( x 1 ，_ y 1 ) l u 2 ( x 2 ，y 2 ；x 。，儿】2 d ( x 2 ，j ，：) 出】d y l 出2 咖2 ( 2 8 ) + o o + + + + o o + o o 栅栅 jj f p ( y ) h ix 。一尬。，y 。一m y 。) 一- - o o - - 0 0 一0 0 一- - 0 0 呐+ ( 一尬- ，y 。一坶。) ，b 。咱，儿咄 + ( 砘，儿- y o n ：( 鲁一孙鲁一y 。 h 1 * ( m x 2x 。 ，y 万2 y 。j d ( x 2 ，y 2 皿l d y l d r o d y o 出o d y o 出2 砂2 ：”“f ”f ”f ”l ”f ”1 ”1 6 ( x ，乃) l l 。g 。，。奶? x o , y o ，( - x o , y s y 。) = z ，y - ) l l l ( x o ，o 奶?) ，( x ，一。) x , - x o , y s - y o 一z ( 吾一鲁一卜( 詈一，鲁y 。1 d g 2 ，_ y 2 ) d x l 咖l d x 。d y o 出。d y o 出2 d y 2 ：”5 ”i ”f ”f ”f h g。，。弘玎。，。1。-xo,yshi yyt ( xx 0 , y y 。) = ，。弘刊，。】。 一。) ，x s - x o , y , - y o ) 一：( 鲁告一y 。) e ( 吾一，鲁y 。1 j 9 ( x ，h1 炳n d y o d x o 咖n 出，d y ， = i i d ( x 2 , y 2 】0 2 ，y 2 ；b y 。】2 d x 2 d y 2 ( 2 9 ) 研究生学位论文2单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 其中u ：表示为 + o o + u 3 e 2 ，y 2 ；_ j 1 。) = f h i ( x o ) f b 。一x 0 , y 。一y 。) 一 咄【 y ol d x o d y o ( 21 0 ) 。2 2 2 面源一点接收方式的成像原理 图2 4 为透射型面源一点接收方式成像系统。对物体的扫描是通过点探测器 的移动来实现的。 光 源 s ( x j 。 针 7孓跏j 念钭j i ) 1 dd r i 孔 探测器 ，口 p i ( - ，n 1 ) t ( x x 0 y s - y o ) p 2 ( t z ，n2 ) 图24 面源- 点接收方式成像光路图 同理比较图2 4 与图2 2 的差别，就是图2 2 中的面探测器被图2 4 的点探 测器所替代，即d ( x ：，y 2 ) = 8 ( x ：，y 2 ) ，把它代入等式( 2 5 ) ，可以得到点 源面接收扫描成像方式探测到的光强为： s,ys)：了十了(xl，1)f(，2g2，2；-，。j2万g2，2)出1ayldx2dy2(211)i(x yyyyy a yd xd y) = s ( x m ) f ( ，2 ( x 2 ，2 ；- ，。j 2 万g 2 ，2 1 l22 ( 2 = j j jjp ( y 。) 啊( 一m x y 一坶。) 蚋+ k m x l ，y 。一蜘1 1 f g 。- x o , y s y 。h k x 。，虬- - y o 1 ， x 2 ( _ 孙一如2 吖一x 。，一蜘 a ( x 2 幽1 a y i d x 。a y 。出。c l y o d x 2 a y 2 研究生。 位论文2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 当采用反射坐标，即h ：( - x 。，一y o ) = h ：( x o ，y o ) 时，上式可| j 成 = f f j s ( x t ，k b 。一m x y 一蛳。) i ( x o m x l ，y o 一坳l1 f ( x 。一o ，y 。一y o ，+ ( 、一x o h 2 ( x 。，y 。跳f x 。，y 。1 出。咖。出。咖。出。咖。7 ：了墨( 扎m 】u 。b 。，y ；b y ，】2 d x l 咖l 2 1 2 ) 上式中u 。表示为： u 4 b 2 ，y 2 ；t ，y 。) = jj h i g o m x l ，y o m y l 0 ，一x 0y 。y o ) 吃( x oy o 胁。咖o ( 2 ，1 3 ) 比较等式( 29 ) 和等式( 2 1 2 ) ，可以看出点源一面探测扫描成像方式和面 源一点探测扫描成像方式具有相似的成像特性，c j r s h e p p e r 等把上述两种扫 描成像方式的显微镜称之为第一类型扫描光学显微镜。第二类型扫描光学显微 镜，即共焦扫描显微镜，它实质上就是点源一点探测扫描成像方式的显微镜。 下面将对它进行讨论。 2 2 3 点源点接收方式的成像原理 透射型点源一点接收方式成像系统原理光路图如图2 5 所示。 扫描1 光源 。 ”q q l 几 ，彳卜 d i 1 ! d ， 山 d ， 、! 出 p l ( 1 1 ，q i ) t ( k ) ( 0 ，y , - y o ) p 2 ( i2 ，q2 ) 图2 5 点源- 点接收方式成像光路图 研究生论文专用纸 第1 2 页 研究生学位论文2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 从点光源发m 的光线，经系统之后成像在接收面上，在接收面上由点探测 器进行探测，点探测器的作用相当于在探测面上放置一空f h j 滤波器d 。( x v 。) s , 代表样品上扫描点的位置；( x ，y ，) 代表点光源在光源面上的位置；( x ，v ，) 代表点探测器在探测面上的位置。对样品的扫描是通过点光源和点探测器的同 步移动来实现的。 当点光源和点探测器均为理想情况时，它们应为6 函数，即s ( x ，y ) = 6 ( x 1 ，y 1 ) ，d ( x 2 ，y 2 ) = 8 ( x 2 ，y 2 ) 。把它代入式( 2 5 ) ，得到点源点探测 器扫描成像方式可探测到的光强： 了+ f + _ ( 】) m 珏：；b ，m 2 地d y y yyy d y ，d x 2 咖2 ( 2 1 4 )占( 一，】) l u 2 ( x 2 慨t ，】2 占( x 2 ，2 皿j j2 咖2 “h ) = 噩! ! ! ! ! h 。枷? x o , y o y y y ) t ( x 。一x o , y o o ；= f f f p g ，。h g 。，。如?l 。一； 一m 一一 ， x s - x o , y s - y o ) h ：执) h ( 也。) 6 ( x 2 ，y 2 炳l 砂l d x 。砂。d x 。d y 。7 d x 2 咖2 y o ) 。m m + ，、 = f ，y 。如。+ h ，y 。) t ( x 。一x 0 , y ，一y 。) f + x s - x o , y s - y o ) h z g 。，y 。如：f x 。，y 。d x 。咖。出。咖。( 21 5 ) 即： ，。= i h l h 2 f 1 2 ( 2 1 6 ) 其中符号“o ”表示卷积运算。从以上推导可以看出，共焦扫描显微成像 系统是普通扫描光学显微成像系统的一个特例。它不同于其他扫描成像系统就 在于，点源和点探测器的同时引入，使得共焦扫描成像系统的点扩散函数是照 明系统和接收系统的点扩散函数的乘积，而不是象串级系统那样是两点扩散函 数的卷积。点扩散函数相乘可以改善总的点扩散特性。这也是共焦扫描成像系 统的最大优点。 在普通的共焦扫描显微成像系统中，点光源和点探测器的实现，是靠在光 源( 般为激光器) 和探测器前面放置一微米量级的针孔。而细微针孔的使用 将带来一些实际操作上的困难。如果激光束的会聚点与针孔的对准存在偏差将 研究生论文专用纸第1 3 页 研究生学位论文2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 会产生失真和像筹，而探测器针孔的对准更为关键，亚微米的移动都将导致像 差及分辨率的下降。如果有灰尘落到其中的一个针孔上，将会减弱信号光强并 引入像差。擦除引孔上的灰尘必须将它从装置上拆除卜来，而后安装时又得进 行极为繁琐的重对准。另外，由于其扫描结构与点源和点探测器等测量机构基 本上都是一体的，因而系统结构比较复杂、笨重。如果用光纤来代替针孔形成 点光源和点探测器，将使得激光器会聚点与光纤输入端对准略有偏差也不会对 系统引入像差，i 天i 而系统安装调试过程中只需大致对准即可。而且光纤端面沾 染灰尘的可能性人大降低，光纤端面的清洗不需要拆卸及重对准。另外，由于 光纤的灵活性，使得激光、信号探测部分可分布式摆放，而不是象传统激光共 焦扫描显微镜那样必须安装在支撑架上一固定的位置，可实现分布式摆放，简 化了系统的结构，提高了抗干扰能力和可靠性。因此，新型的单模光纤激光共 焦扫描显微镜具有更高的可靠性、更强的生命力。下面就对单模光纤激光共焦 扫描显微成像系统的成像原理进行分析。 2 3 单模光纤激光共焦扫描显微镜 为了研究简便，选用如图2 6 反射型单模光纤激光共焦扫描显微成像系统。 透镜l 半透半反镜物镜o 物体 图2 6 反射型单模光纤激光共焦扫描显微成像系统原理图 研究生学位论文2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 存这反射型单模光纤激光共焦扫描显微成像系统中，光源是光纤f 的木端。光 线被透镜l ，准直后照射到物镜0 ，物镜的孔径函数为p 。振幅反射率为r 的 物体是放在物镜的焦平面上。从扫描点反射回的代表物体信息的信号通过同一 物镜收集，并被透镜l ：聚焦到另一根光纤f ，的端面上，然后光纤把信号传输 到探测器d 的中一l 、，探测器的尺寸和光纤童径相比要大得多。在实际的应用中， 一般采用相同的光纤进行照明和收集，通过在光纤的远末端使用光线分离器或 使用一四通道的光纤耦合器来实现光线分离。 为了方便起见，这里先只分析一维情况的系统图像信息。假设x 代表垂直 于光纤的平面上的变量，z 代表轴向变化。实际的显微成像系统是圆柱型对称 的，因为透镜和光纤都是圆形的，所以坐标x 可以看成是径向方向，就可以用 ，、1 x 来代替径向坐标r ，= ( x 2 + y 2 乒。另外，光纤f ，和f ：都假设为单模光纤。 用u ，( x ，) 代表光纤f ，出射端的电场振幅分布。通过成像系统后，根据前面 讨论过的成像原理，在光纤入射端面上点x ，的复振幅可以表示为： + 啪、 u ：g ，x ：) = j f u l g l 舅- g o m x t p g 。x 。协：【x 万2 一x 。l d x 。d x 。 ( 2 1 7 ) 一 o ” 这里x 。表示物体上的扫描位置：x 。表示物面坐标；x 和x ：分别表示光源面和探 测面上的坐标位置；参数m 为成像放大倍数，即m = d f , 其中f 和d 分别表示 物镜的共焦长度和透镜与光纤端面的距离：h 和h ：则分别是物镜和收集透镜的 点扩散函数，它们对应的傅立叶变换为孔径函数p 和p ，。 为了得到光纤b 出射端的复振幅，现在考虑复振幅u ：( x 。，x ：) 通过光纤 f ，的传播情况。根据a w s n y d e r 和j d l o v e 的光波导理论，一个绝对的电场 复振幅u ( x ，z ) 可以在光纤中展开成一系列正交模的叠加，即： u ( x ，办：a j y , ( x ) o x p ，z ) ( 2 1 8 ) 上式中f g ( x ) e x p ( i f l ，z ) 表示特定光纤中一系列的正交模，它有一定的解，并且 沿着z 方向传播没有损耗。a j 叫做模态幅，它由正交关系来确定。函数，。b ) 是 垂直于z 轴的平面上光纤的模分布。如果光纤是单模光纤，则j 只有第一项产1 ， 因此等式( 2 1 8 ) 变为： 【，( x ，z ) = o l 一( x ) e 硪i p l z ) ( 2 1 9 ) 其中： 研究生论文专用纸 第1 5 页 研究生。、 位论文! 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 一+ 0 妙b ，z = o 皿 ：!：一 十 川i i ( q 2 出 ( 2 2 0 ) 这样就可推导出在第二根光纤f z 的出射端面j 点x ，的复振幅u 3 ( ，b ) 为 。x ，) e x p ，z 。) ；+ ( ，：) ，：b ：k ： j z bi d x ( 2 2 1 ) 其中z 。表示光纤f ：的长度。假设大面积探测器d 具有均匀的强度灵敏度，则 此探测器探测到的光强为： + 1 s ( x 。) = u 3x 3 1 2 d x 3 + = 一 + l + l flm + b ：妙：x s , x 2 皿：ld x ， 型兰i l ( 2 2 2 ) + 、一 l f d x ，】2 d x ， 上式中f j 沁】2 d x 3 是一常数，因为g 3 ) 的分布对于特定的光纤是固定的。 所以把等式( 2 1 7 ) 代入上式，可得： t g s ) = 川胼g z 妙- ( - 妊- 一胁- 飞m z ( 斋飞 一( z z u ，+ k 如，h 一胁。) r + ( 矿x 。1 一：+ f 备一f 出。出。出。出。出：出： c zz ， 研究生论文专用纸第1 6 页 研究七j + 位论文2 单模光纤激光共焦扫描显微成像系统的基本原理 ，。( x ，) ：+ f + f 譬。( x o ) g 。+ f 。7 ，g 。 一， = l g ，( _ ) o ，b ，】2 x o 陋。出【】 ( 2 2 4 ) 式中 表示卷积运算。等式( 2 2 4 ) 表示上面讨论的单模光纤激光共焦扫描显 微镜是一相干成像系统，它的有效点扩散函数为： g ，( x s ) = 一! u l ( x t 弘- ( x o - m x i 阢+ ( x 2 ) h 2 l 鲁飞卜d x z ( 2 2 5 ) 若光纤f 和f ：有相同的横截面，即u 。( x ) = ( x 。) ，则上式就可表示为： g t x s ) = 一”f l ( x l 如t ( x o - m x i m + o z 扭z l 詈砘户一d r z ( 2 2 6 ) 如果光纤是单模的，f 是8 函数，上式就可转化为： g ，g 。) = h i ( h ) 2 g 。) ( 2 2 7 ) 代入式( 2 2 4 ) 可以得到探测器可探测到的光强为： ，。= l h i h 2o ，1 ( 2 2 8 ) 比较等式( 2 2 8 ) 和( 2 1 6 ) ，发现它们是等价的。由此可见，引入单模光纤， 并不改变激光共焦扫描显微镜独特的成像特性。因此，用单模光纤代替针孔来 实现激光共焦扫描成像是完全可行的。 从式( 2 2 2 ) 可以得到，对于多模光纤激光共焦显微系统探测到的光强为： l ( x 。) = f 1 u 2 ( b x 2 玩g 2 枉2 ( 2 2 9 ) 。 从上式可以看出，探测器可探测到的光场是由光纤表面处场分布和光纤模型的 重积分所决定的。这样就可保证，如果光纤模之间可以相互分离，那么得到的 图像就始终是相干的，而不管光纤的尺寸。因此光纤从本质上说是一相干探测 器。对于普通的带有d , - t t , 探测器d ( x ) 的激光共焦扫描显微系统，可探测到的光 强为： ，。g 。)p ：( x s , x 2 ) f 2 d ( x ) a ： ( 2 3 0 ) 可以看出探测器探测到的光强是在探测器孔径上积分。由此可推出，对于那些 t ：l n 想点探测器孔径大一些的实际激光共焦扫描显微系统只是部分相干成像系 研究生论文专用纸第1 7 页 研究t 。# 何论文2 单模光纤激光共焦 j 描显微成像系统的基本原理 统，而理想的激光共焦扫描显微系统和光纤激光共焦扫描成像系统都是真限意 义上的相干成像系统。这对应用于定量检测的显微镜，或t l j 作共焦干涉显微镜， 光纤激光共焦扫描成像系统的相干成像性能就具有优越性。 正是因为光纤本质上是一相干探测器，葫一理论上就可以刚多模光纤代替单 模光纤。可以把光纤中每一个模式想象成个分立的相干探测器，它的振幅探 测灵敏度与相应的光纤模式成正比。例如，存采用双模光纤作为点光源和点探 测器的双模光纤激光共焦扫描显微系统中，通过探测最低阶模l p n 就可得到标 准的共焦图像，探测二阶模l p 。可以得到差分图像。上面这种方法是分立探测 光纤模式的方法。也可以采用如图2 7 所示的方法一把两种不同光纤模式的图 像信号同时投射到两个分立的探测器上。 透镜l 】半透半反镜 物镜o l 物体 图2 7 采用分立探测器的光纤共焦扫描显微成像系统原理图 当把上图中两个分立的两个探测器所得的图像信号相加，可以得到真正的 共焦图像；当把分立的两个探测器所得的图像信号相减，通过简单地改变光纤 的长度，就可获得振幅差分模式图像和相位差分模式图像。对比单模光纤激光 共焦扫描显微系统和双模光纤激光共焦扫描显微系统，后者具有更强大的功 能，但它也需要更复杂的探测和处理技术，如两个探测面要紧靠着，探测器的 探测性能应该完全一致等。随着模式的增多，不难发现相应的探测手段和处理 技术会变得非常复杂。目前，国外只有关于双模光纤激光共焦扫描显微镜成像 研究生论文专用纸第1 8 页 ，塑! ! 竺兰丝堡塞! 兰塑垄堑堂垄苎竺塑塑星垡堕堡墨竺塑苎查垦些 技术的报道。考虑到现有的条件和设备，丌展对单模光纤激光共焦扫描显微成 像系统的分析和研究是适宜的。 2 4 单模光纤激光共焦扫描显微镜的平面分辨率 2 4 1 普通扫描显微镜的平面分辨率 为了简便，f 面以点源- 面探测成像方式的扫描显微镜为例进行分析。理 想像点是由无像差的会聚球面波形成。设透镜为圆形透镜，其孔径函数为： p “) = c r e f 量l ( 2 3 1 ) “ 这时有入射会聚球面波： “) p 【一j 告1 2 ) ( 2 3 2 ) 其中f 为会聚球面波的焦距。利用菲涅耳衍射近似式f 2 0 l ，可求得与孔径平面相 距r 的平面上的场分布为( 见图2 8 ) ： 图2 8 会聚球面波的衍射 比，= 去唧+ 蠢屹2 汕唧m 一舶2 一知忙 旺s s ， 对在焦点附近，有r 丝f ，于是： t 寸 塑兰苎皇兰! ! 姿! 兰堡堂竺堂堂! ! 竺塑塑星丝些堡墨竺塑苎奎坚些 1lf r z rf2 1 厂兰一f 2 ( 2 3 4 ) 其中z = f r 表示离焦量。 对于z 2 - 0 ，也就是在焦面上，等式( 2 3 3 ) 中的积分n i 是孔径函数的傅立 叶变换，即： 巩) = 去唧+ 蠢也2 小矧 ，s ， 其中h 是孔径函数的傅立叶变换。虽然上式中有r ：的二次位相因子( 说明焦面 上的波面是球面) ，