（食品科学专业论文）优先降解乳清蛋白中β乳球蛋白工艺的研究.pdf

摘要 乳清蛋白浓缩物( w p c ) 是生产婴幼儿配方粉的重要原料，牛乳乳清蛋白含有1 8 - 2 4 的a 乳白蛋白( a - l a ) 和5 6 - 6 0 的b - 乳球蛋白( 8 - l g ) 。a - l a 是人乳中的重要蛋白成分，牛乳与人乳 的a - l a 有7 2 的氨基酸序列完全一致；而b l g 是一种重要的过敏原，人乳中不含这种蛋白因 此脱除w p c 中的8 l g 对于生产低过敏、高母乳化的新型要幼儿配方粉具有重要意义本实验研 究了如何利用蛋白酶进行优先降解w i c 中的b - l g 。 确定了用s d s - p a g e 电泳定量分析a l a 和b l g 的方法。- l a 和b l g 的进样量分别为0 4 0 ，倡1 2 q 鸺和o 4 8 旭1 4 4 m g ，在此范围内a h 和b - l g 的含量与电泳条带灰度的线性关系良好 用s d s - p a g e 法测得w p c 8 2 0 0 样品中a h 和b l g 的含量分别为1 8 4 4 和4 5 鹋 选用了f l a v o u r z y m e ( 米曲霉) ，n e u t r a s e ( 枯草杆菌) 、p r o t e a a ( 米曲霉) 、p r o t e a s e n ( 枯 草杆菌) 、p m t e a s es ( 嗜热脂肪芽孢杆菌) 五种蛋白酶水解w ! c 8 2 0 0 ，用t n b s 法测定水解液的 水解度，用s d s - p a g e 电泳法分析水解液中的a - l a 和b l g 的存余率通过比较水解液中的a o l a 和b - l g 的存余率，筛选出p r o t e u e a 具有优先降解w i c 中b l 暑的能力 通过单因素实验和正交实验设计，以水解度、蛋白存余率、水解物溶解性为指标优化了 p r o t e a s ea 优先降解b l g 的工艺，即p r o t e a s ea 在4 0 、p h7 3 、e s 为8 0 0 ( u g 蛋白) ，酶解 时间为3 h 的条件下，优先降解b l g 的效果最佳，水解产物中4 l a 和b l g 的存余率分别为5 3 和1 4 ，蛋白水解度为8 4 ，并且水解产物的溶解性得到了显著改善( p o p a p hs t a t ，p ms t a r 方法测定结果偏低的主要原因是生成的游离 氮基酸使得反应体系具有一定的缓冲能力从而使得p h 值反映的d h 结果偏低o e ) 尤其当所用 的酶为外切酶肘，所测d h 值偏低的现象更为明显0 p a 法与t n b s 法的反应原理类似，但o p a 法所测的d h 要低于t n b s 法，原因主要是乳清蛋白中富含胱氨酸，而o p a 与胱氨酸反应生成 的复合物不稳定综上所述，t n b s 法是测定乳清蛋白水解度的理想方法，虽然t n b s 法所需时 间相对较长。但对于本实验而言，并不需要即时地测定蛋白水解度，最终采用t n b s 法测定乳清 蛋白的水解度 9 中国农业大学硕士论文 绪论 1 6 研究意义 随着中国新一轮生育高峰的出现，预计2 0 0 7 年国内婴幼儿配方粉的市场总颧将达亿元人 民币面对国内高端婴儿奶粉市场长期被国外品牌垄断的局面。生产高质量的婴幼儿配方粉不 仅关系到整个中国乳品行业的发展。同时也是关系着下一代健康成长的大事 w p c 是目前生产要儿配方粉的重要原料，但天然w p c 中的不同蛋白组分在婴幼儿营养中的 作用是不同的，a l 丑是人乳蛋白的主要成分，而b l g 是一种重要的过敏原，因此脱除w l , c 中的 s - l g 对于生产高质量、低过敏且母乳化程度高的婴幼儿配方粉具有重要意义。酶解去除b - l g 是 一种新型的生产工艺，成本低，工艺简单，且水解产物具有低过敏性及富含活性肽等优点，因此 优先降解w p c 中8 l g 的研究对于提高国内要幼儿配方粉生产技术具有深远的意义 另外，乳清蛋白是一种营养价值非常高的蛋白，被广泛地应用在功能食品和运动食品中，酶 解可以有效地改善其营养和功能特性优先降解a - a 的研究将侧重于研究蛋白酶对a - i s 和b - l g 不同的酶解活性，这对于今后研究蛋白酶对乳清蛋白不同组分的酶解具有一定的理论和现实意 义 1 0 中国农业大学硕十论文w p c 8 2 0 0 主要组分含量的测定 2 1 引言 第二章w p c 8 2 0 0 主要组分含量的测定 乳清蛋白浓缩物( w p c ) 的营养与功能特性与蛋白成分的组成密切相关嗍由于原料奶的差 别以及生产工艺的原因w i c 产品的蛋白组成往往会有一定的变化。因此有必要对其主要蛋白组 分的含量进行相应的分析。总蛋白含量是w p c 的一个重要指标，虽然一般w i c 产品都会在其产 品型号中标出蛋白含量。如w p c 8 2 的蛋白含量为8 2 。但数据较为粗略，测定总蛋白含量有 利于更精确地把握酶解过程中的实际加酶量可溶性氨含量反应了w p c 蛋白溶解性的大小，溶 解性是w p c 最重要功能特性之一- 吼白蛋白( 1 蝴b - 乳球蛋f l ( e - l g ) 是乳清蛋白中最重要的 两种蛋白，与w p c 的功能特性和营养特性关系密切，也是本实验需要着重研究的蛋白组分所 以在酶解实验进行之前先测定了w p c 8 2 0 0 样品中的总蛋白氮、可溶性蛋白氮、a - l a 、b - l g 等蛋 白含量以及样品中的水分含量，对w p c 8 2 0 0 主要组分的含量有了大致的了解。 水分含量和总蛋白氮的测定采用蒸发法和凯氏定氦法，这两种方法具有容易实现、精确度高 的特点，因而一直被广泛使用。可溶性氮的测定采用改良后的福林酚法，该法结合了双缩脲法和 福林酚法，精确度高、方法简单。a - l a 和b 【g 的测定采用s d s - p a g e 法，将电泳图扫描后用 b a n d s c a n 软件进行蛋白定量分析。 2 2 材料与仪器 2 2 1 材料 2 2 2 试剂 a l 丑标准品( 色谱纯) ：b l g 标准品( 色谱纯) 、低分子量标准蛋白m a r k e r 、t r i r , - b a s e 、甘 氨酸、丙烯酰胺( a c t ) 、n ，n - 甲叉双丙烯酰胺( b i s ) ，t e m e d 、过硫酸铵、考马斯亮蓝r - 2 5 0 、溴 酚蓝、f o l i n - 酚：s i g m a 公司 碳酸钠、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、硫酸、硫酸钾、氢氧化钠、盐酸、十二烷基苯磺酸钠( s d s ) ， 三氯醋酸、甲醇、冰醋酸、乙醇等均为北京化工厂生产，分析纯 牛血清蛋白：北京奥博星 b 巯基乙醇：进口分装 双蒸馏水：实验室自制 中国农业大学硬十论文 w p c 8 2 0 0 主要组分音量的测定 2 2 3 仪器 s a t o f j t l t s 电子分析天平 d h g - 9 啪a 型恒温鼓风干燥箱 控温消煮炉 k x l - 1 0 1 0 全自动凯氏定氮仪 s a l 痂t i t s 硼计 d y ￥1 2 型电泳仪 d y i z 二2 a 电泳槽 w d - 9 4 0 5 b 型水平摇床 u v - 1 7 0 0 分光光度计 h w s 2 4 恒温水浴锅 c o s s 0 0 0u v p 凝胶成像系统 2 3 实验方法 2 3 1 含水量测定( 干燥法) 北京赛多利斯仪器 上海一恒科技 华吴伟业实验器材厂 华吴伟业实验器材厂 北京赛多利斯仪器 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 北京六一仪器厂 日本岛津 上海一恒科技 美国u v p l a n d 称取l _ 3 9 样品置于已干燥冷却的有盖称量瓶中，移至i o i e 烘箱开盖烘2 - 4 h 后取出，加盖 移至干燥器内冷却3 0m i a 后称重，重复此操作直至前后两次质量差不超过2m g ，即视为恒重， 每个样品做三个重复。 水分含量计算公式：水分含量= 苎= 生。1 0 0 a 一坞 m l ：干燥前样品与称量瓶的质量 m 2 干燥后样品与称量瓶的质量 m ，称量瓶的质量 2 3 2 总蛋白氨测定( 凯氏定氮法) 称取待测样品0 5g 于硝化管中，加入2 0 r a lh 2 s 0 4 、0 5 9c u s o , 、5 9k 2 s o , 置于硝化装置 上硝化，先在2 5 0 c v 反应ih 。直到没有炭粒蹦出，然后升高温度，硝化至透明淡蓝色或淡绿色 然后用全自动凯氏定氮仪蒸馏并用h c l 滴定，每个样品做三个重复。 计算公式：蛋白质含量= v x n x 0 0 1 4 x 6 3 8 x l v ：滴定时所消耗的盐酸溶液的毫升数( m l ) n ：标准盐酸溶液的当量浓度( m ) 0 0 1 4 ：1m g 当量氮的克致 6 3 8 ：乳清蛋白氨的蛋白质换算系数 w ：样品克数( g ) 中国农业大学硕卜论文w p c 8 2 0 0 主要组分含量的测定 2 3 3 可溶性蛋白氮含量测定( 福林酚法) z 3 3 1 试剂配制 ( 1 1 碱性铜试剂的翻备 a 液：钾蛾酸钠溶液与0 2m o l l 氢氧化钠溶液等体积混合 b 液；1 五永硫酸锕溶液与2 酒石酸钾钠溶液等体积混合 在使用前将a 液与b 液按5 0 ：l 的比例混合，当天使用此为福林酚试剂甲液 ( 2 ) 将福林酚试剂用蒸馏水稀释2 5 倍。即为福林酚试剂乙液 2 3 3 2 样品测定 将所测样品溶液稀释1 0 3 倍后段l m l 样品于试管中，加入5 m l 甲液，混匀，3 0 放置1 0 r a i n 向试管中喷射加入0 5m l 乙液，立即振荡混匀，3 0 反应3 0m i a 后，在5 0 0n n l 下测定其吸光 值以牛血清白蛋白溶液为标准蛋白质溶液，以未加蛋白质的溶液为空白溶液每个样品测三个 重复 计算公式：可溶性氰含量；c x s 0 0 x 1 0 0 c ：蛋白浓度( r a g r o l l ，由标准曲线上读出 5 0 0 ：样品稀释倍数 c w r c ：w p c 溶液浓度( m g m l ) 2 3 4a 一工丑和8 - l g 含量的测定( s d s - p a g e 法) 2 3 4 1 试剂配镧： ( 1 ) 电极缓冲液( p h 8 3 ) ：称取3 0 3 9 t r i s - b a s e 、1 4 4 2 9 甘氨酸，1 g s d s 溶于蒸馏水 并定容至1 0 0 m l ，使用时稀释1 0 倍 ( 2 ) 丙烯酰胺单体贮液：称取1 4 5 5g 丙烯酰胺( a c t ) 和0 4 5gn ，n - 甲叉厩丙烯酰胺( b i s 用4 0m l 蒸馏水溶解、搅拌、直至透明，用双蒸水稀释至5 0m l 棕色瓶4 c 保存，一个月内使 用。 ( 3 ) 浓缩胶缓冲液( 1 0 0 m o l l t r i s - h c l , p h 6 8 ：称取6 0 6 9 t r i s - b a s e 溶于4 0 m l 双蒸水 中。用4 m o l l 的h c l 调节p h 至6 名，定容至5 0 m l ，4 c 保存。 ( 4 ) 分离胶缓冲液( 1 5 0 m o l l t r i s - h c l , p h 8 8 ) ：称取9 吣g t r i s - b a s e 溶于4 0 m l 双蒸水 中，用4 m o l l 的h c l 调节p h 至8 8 ，定容至5 0 m l 。4 c 保存 ( 5 ) 样品缓冲液( 0 0 8 m o l l t r i s - h c l , , p t x 6 ) ：取2 0 0 m l 浓缩胶缓冲液、8 0 0 m l l 0 s d s 、 1 2 0 m l 明e 基乙醇、6 0 0 m l 甘油、6 0 0 m g 溴酚蓝，用双蒸水稀释至2 0 m l ，4 c 保存。 ( 6 ) l o s d s ：双蒸水配制，室温保存。 ( 7 11 0 1 1 咀d ；双蒸水配制，4 保存 ( 8 ) 1 0 过硫酸铵：双蒸水配制，现用现配 ( 9 ) 固定液：2 0 三氯醋酸，蒸馏水配制，室温保存。 中国农业大学硕卜论文 w p c 8 2 0 0 主要组分音量的测定 ( 1 0 ) 染色液：称取1 2 5 9 考马斯亮蓝r - 2 5 0 与2 3 0 m l 甲醇和2 3 0 m l 蒸馏水混合，搅拌1 h 后加入柏m l 冰醋酸，过滤，室温保存 ( 1 1 ) 脱色液：量取5 0 m l 冰醋酸和1 5 0 m l 9 5 乙醇，用蒸馏水稀释至5 0 0 m l 2 3 4 2 凝胶配方 寰z l 。s 碳灌峨凝胶配方 t a b l ez l zt i l em a k e - 叩o f s d s - p a g e g e l s 苎堕壁q 塑坌蔓墼! ! ! 塑 丙烯酰胺单体贮液( m l ) 2 61 5 浓缩胶缓冲液 分离胶缓冲液( m l ) 双蒸水( m l ) 1 吩s ；( m l ) l 瞩1 l 狲吲) “l ) 1 0 过硫酸铵“l ) 2 4 一 1 4 8 配 7 5 l 一 7 j 7 2 ” 5 5 8 0 2 3 4 3 标准蛋白和样品的处理 精确称取1 o m g a - h 标准品和1 2 m g e - l g 标准品溶于样品缓冲液配成含0 2 0 , u g * l a l a 和 o 2 4 腭加l 雎【g 的标准溶液；w p c 8 2 0 0 样品溶于样品缓冲液配成样品浓度为2 0 0u g u l 的溶液 2 3 4 4 电泳条件 预电泳条件为2 5m a ，2 0m i n ，样品进入分离胶后电流调为3 5 m a ，整个电泳过程保持恒流 2 3 a 5b a n d s c a n 软件分析 电泳条带的灰度值大小与蛋白质的含量呈线性关系，因此可以用b a n d s c a n 软件分析电泳条 带的灰度值来定量或半定量地分析蛋白含量本实验用标准a - l a 和e - l g 绘制灰度值与蛋白含量 的标准曲线。然后根据标准曲线和样品灰度测定w p c 8 2 0 0 中a - h 和b l g 的含量 2 4 结果分析 2 4 1 含水量及总蛋白氮的测定 w p c 8 2 0 0 样品的含水量为6 4 1 _ - * 0 1 2 ；总蛋白含量为7 9 8 8 + - 2 1 1 2 4 2 可溶性氮含量的测定 2 4 2 1 牛血清白蛋白( b s a ) 标准曲线的绘制 标准曲线：a - 2 9 9 6 c + 0 0 1 6 ，r 2 - o 9 9 2 3 a ：吸光值 c ：标准蛋白浓度 1 4 中国农业大学硕十论文 w p c 8 2 0 0 主要组分含量的测定 昌e 璺詈曼曼| 皇置量量一i 皇曼曼曼量| 曼皇詈置目鼍量曼曼曹一 标准曲线图见图2 1 划 装 娶 00 0 0 50 0 10 0 1 50 0 2 b s a 浓度( m e m t ) 田z l ；牛血清白蛋白( b s a ) 的标准曲线 f 砸z 1 ：t h e 出础硼c q f o f b s a 注t 豳中歌掘为三次重复宴齄的平均值若耐f 纛谚啊奉实验的所有蠹据均为三次重复的平均值 2 4 2 2w p c 8 2 0 0 可溶性氮的测定 根据标准曲线得w p c 8 2 0 0 可溶性氮含量为6 5 0 0 o 7 9 。 2 4 3s d s p a g e 电泳法测定w p c 8 2 0 0 中a l a 和昏l g 含量 2 4 3 1a - l a 和a - l g 进样量的确定以及标准曲线的绘钼 蛋白进样量对电泳条带灰度和蛋白质含量的线性关系影响非常大，进样量过大或过小都会影 响灰度与蛋白含量的线性关系，因此必须先确定a h 和b - l g 合适的进样量范围 g 0 40 81 21 622 4 0 40 81 21 62 圈2 2 z l g ( 左) 和a - i a ( 右) 蠹自含量与息灰度的关系 f i 9 2 2 ：t i ka e b e l o n o f p e a k i l m 柚扭a n d l o u d 窖r 町v - h 翳o f l g ( k 矗) 和a - 1 a ( r i g h t ) 注：围中直线表示a h l a 和k 进样量在线性狂围内的线性目归直线 g 将配好的标准a - l a 和b - l g 溶液，梯度进样2 - 1 0 ”l 。用b a n d s c a n 软件分析电泳条带总灰度 与蛋白含量的关系，分析结果见图2 2 。由图2 2 中可以看出，当进样量增加到一定程度时。总灰 1 业 挖n 撙9 8 7 6 5 4 3 2 中国农业大学硕卜论文w p c 8 2 0 0 主要组分古鼍的测定 度与蛋白含量线性相关性减弱。利用回归分析分别计算b k 和a - l a 的在不同进样范围内蛋白含 量与总灰度的线性相关系数当b 工g 的迸样量在0 4 8 - 1 锋曙时，相关系数r t 以9 9 6 4 ；当进样量 在o a & 1 卿g ，r 2 = 0 9 8 9 9 t 当进样量增至1 9 2 一g 时，r 2 - - - - 0 9 7 9 5 。同理，对a - l a 而言，当进样 量在0 4 0 腭 1 2 q u g 时。r t 乱9 9 2 3 ，随着进样量增至1 4 0 z g 和1 6 0 “g 时r z 分别降至0 9 8 8 6 和0 9 8 2 5 因此只有控制进样量在一定范围内总灰度与蛋白含量才能较好的呈线性关系，随着 进样量的增大。总灰度与蛋白含量的线性相关系数将不断减小 综上所述，垂l g 和a - l a 的进样量应分别控制在0 4 8 - 1 4 4 l g 和0 4 0 z g 1 2 q 喀的范围之内， 此时这两种蛋白的线性相关系数酽分别为0 9 9 6 4 和0 9 9 2 3 8 - l g 和a l 丑含量与总灰度的线性方 程见表z 2 ，线性范围内的b - l g 和a - l a 电泳图见图2 3 囊2 2 ：_ 一l a 和b - l g 的含量与灰度的线性范围和线性关系 t a b k 2 , 2 si j 细曲训n 学o f 峨t o t a l o a y v a l u e sa k i c o n t e n h o f a - l a m i d b - i 暑 lx 为蛋自古量，y 为条带总袭度 圈2 3 ：标准a - h 和s - c s 的电泳田f 从左至右进样量分别为2 , 3 , 4 5 , 6 p l ) f i 9 2 3 ：t h e s d s - p a g e p r o f i l e o f a l aa n d s - l s ( f m m l 以t o 啦址t k t t m p l i m g v o l u m e i s 2 ，3 4 5 肆l l 豫科蜥d y ) 2 a 3 2w p c 8 2 0 0 的电泳分析及w 1 8 2 0 0 中a - 1 j 和b - l g 含量的测定 将预先配好的w p c 8 2 0 0 样品溶液进行梯度进样，结果显示当进样量为犁l 时，电泳条带清 晰且各蛋白组分离良好，a l a 和b l g 的进样量也在线性范围之内。w p c 8 2 0 0 和低分子标准蛋白 的电泳图如图2 4 所示。用b a n d s c a n 软件分析得，样品w i ，c _ 8 2 0 0 中a - h 的含量为1 8 4 4 4 - 1 1 2 ， b l g 的含量为4 5 6 8 1 6 7 中国农业大学硕十论文w p c 8 2 0 0 主要组分含量的测定 2 5 讨论 圈2 4 w p c 8 2 0 0 和低分子标准蛋白( 删的电溶田 f j 9 2 4 1t h e s d s - p a g e 雕o i w p c 8 2 0 0 t a d t h e m a r k * 含水量测定结果略有些偏大，这可能是w p c 8 2 0 0 在储藏过程吸收了少量水分造成的，总蛋 白含量略低于w p c 8 2 0 0 应有的8 2 ，但仍在正常范围之内可溶性氮含量6 5 0 0 ，低于总蛋白 氮含量近1 5 ，这可能是由于w p c 在生产加工过程中不可避免地会有一部分蛋白变性或者聚集， 使这部分蛋白的疏水基团暴露从而导致溶解性下降。p u s h p a 在用同样的蛋白酶在相同的条件下水 解天然乳清蛋白溶液和w p c 溶液时。发现w p c 溶液更易被蛋白酶水解。这也说明了w p c 中的 部分蛋白已经发生变性，因为相对于天然蛋白，变性蛋白由于某些位点外露因而更易被酶攻击l 舒， 蛋白的变性再加之w p c 中本身存在的一些不溶性含氮化合物，所以使得了可溶性氮含量低于总 蛋白氨 由于w p c 8 2 0 0 中含有约1 5 的不溶性氮，因此在接下来测定a - l a 和b - l g 含量时，宜选用 s d s - p a g e 法，因为与h p l c 法只能测定可溶性蛋白的含量。相比之下s d s - p a g e 法能测定乳清 蛋白中包括可溶性和不溶性的组分，更能全面地反应乳清蛋白中的各蛋白组分的含量i 髑， k i m 在1 9 8 7 年比较不同方法测定a l 工和b l 暮含量时发现，用s d s - p a g e 法测定a - l a 的含 量比其他方法测定的值要低3 0 左右在本实验中也遇到了类似的情况，由a - l a 和b l g 的线 性方程可以计算出，当a - l a 和b - l g 的灰度值相同时，a - l a 的含量要比b l g 大约高2 4 。这可 能是由于a h 与考马斯亮蓝结合的能力要低于e - l g ，从而造成相同蛋白含量时的灰度值偏低 因此在用s d s - p a g e 定量分析t h 和b l g 时，不能直接根据各蛋白组分的灰度之比来计算含量 之比，必需通过标准蛋白绘制灰度与含量的标准曲线，这样才可以抵消由于显色能力的大小而造 成的系统误差 s d s - p a g e 法测定的a - l a 和剀l g 的含量分别占w p c 8 2 0 0 蛋白干料的2 3 3 4 和5 7 8 2 ，占 w p c 8 2 0 0 样品总质量的1 8 4 4 和4 5 6 8 ，与文献记载的结果非常相符，因此在本实验条件下， 该方法是可行的，并且国标法也是用电泳来测定乳清蛋白和酪蛋白的含量的【辨 用s d s - p a g e 法测定蛋白含量时，由于染色和脱色的程度不同，若蛋白样品不能在同一板进行电泳，则需要采 用内标法进行校正c 丌 。所以在分析样品时应尽量安摔在同一次电泳完成，这样可以有效地避免板 1 7 中国农业大学硕卜论文 w p c 8 2 0 0 主要组分含量的测定 i ! _ w l l 舅| 曼曼曼墨皇曼量量墨曼葺| 量量置置曩! 量曼量皇孽鲁曩 间误差的产生 2 6 小结 本章实验主要测定了w i , c 8 2 0 0 的含水量和主要蛋白组分的含量，着重研究了s d s - p a g e 法 定量分析a - l a 和b - l g 的条件与方法，得出如下结论： 1 s d s - p a g e 电泳的条件为浓缩胶3 。分离胶1 5 ，预电泳电流2 0 m a 。样品进入分离胶 后的电流为3 5 m a a - l a 和e - l g 的线性范围分别是0 4 0 # g 1 勰鸭和0 4 8 u g 1 4 4 # g ，在此范 围内，h 和e t a 的含量与电泳条带灰度的线性关系良好，r 2 分别为0 9 9 6 0 和o 9 9 8 3 。 2 w i , c 8 2 0 0 主要组分含量为：水分含量6 4 1 _ - - o o 1 2 ，总蛋白氮含量7 9 8 8 z 1 1 ，可溶性 氮含量6 5 7 9 ，a - l a 含量1 8 4 4 1 1 2 ，斛l g 含量4 5 6 8 1 6 7 1 8 i i ：国窑当奎茎鐾：耋銮 量至彗耋璧墼! ；呈堡圣鬈耋蒌星：! 蝥 i ! ! ! ! | ! 一 3 1 引言 第三章具有优先降解b - l g 能力的蛋白酶的筛选 要达到优先降解b l g 的目的。酶的选择是关键，这要求所选蛋白酶对b - l g 位点的特异性高 于a - i j 蛋白酶根据来源主要分为三大类：动物蛋白酶、植物蛋白酶、徽生物蛋白酶一般情况 下，动物蛋白酶价格高且副反应多；植物蛋白酶水解效率低，反应时间长，而且成本也较高；相 对面言，徽生物酶具有易商品化、专一性强，反应效率高的特点，因而在工业化生产中被广泛 使用。本实验选用的f l a v o m z y m c 1 0 时也只有1 - 3 的b s a 被水解，并且随着d h 值进一步增大，这一比例基本仍保持恒定f 7 6 j n e u t r a s e 、p m t e a s e n 、p r o t e a s e s 对酪蛋白的活力大于对w p c 的活力，其中p t o t e a s e n 对酪蛋白 的活力是w p c 的2 9 8 倍，因此可以用来酶解全乳蛋白以调节全乳蛋白中的酪蛋白和乳清蛋白的 比例。 由于纯b k 和a - l a 的价格非常昂贵，所以在本实验中未采用8 l g 和a h 作为底物来比较 各种酶对这两种蛋白的活力，而是通过分析w p c 水解物中e - l g 和a - l a 的存余率来比较的相 比之下，后者更能体现在实际生产中酶对8 - l g 和a 【丑的酶解情况由于酶活力定义是以酪蛋白 为底物的，所以在后面的计算中均采用以酪蛋白为底物测得的酶活力数据 3 3 2 酶解对反应体系p h 的影响 6 9 6 8 6 7 6 6 暑：薯 6 3 6 2 6 1 6 03 06 09 01 2 01 5 01 8 0 时问( i i n ) 围3 2 ：不同蛋白酶处理液的p h 变化图 f i 9 3 2 c h a n g e s o f p h o f t h es o l u t i o n s t r e a t e d b y d i f f e r e n t e n z y m e s 中国农业大学硕士论文 具有优先降解6 1 1 名能力的虽白酶的筛选 蛋白质在水解过程中随着自由氨基酸的释放，同时也会释放出一个质子，使得整个反应体系 的p h 值下降，溶液中的磷酸盐缓冲体系能够在一定范围内缓解溶液p h 的波动p ”当溶液p h 的 变化超出了磷酸盐的缓冲能力时。磷酸盐将不再起到缓冲的效果。这样反应体系的p h 就会下降 表3 2 为不同蛋白酶处理液的p h 变化情况。 由图中可以看出f l a v o r z y m e 造成体系p h 的下降最小，这是因为f l a v o r z y m e 是蛋白外切酶 相对于内切酶，外切酶的作用位点较少，且释放的大多为游离氨基酸，游离氨基酸自身具有一定 的缓冲能力，因此造成p h 的下降相对较小而其他酶均是蛋白内切酶，作用位点相对多，所 以p h 下降也较快当酶解1 h 后。p h 的变化变缓，这是因为一方面由于产物抑止的作用，酶解 速率的下降，另一方面是酶解产生的氨基酸增强了体系的缓冲能力 3 3 3t n b s 法测定d h 的标准曲线的绘制 田3 3 z 亮氯酸标准曲线 f i 9 3 3 f t h es u m d a z d o f l e u c i m e 以亮氨酸为标准氨基酸绘制标准曲线，亮氨酸标准曲线见图3 3 亮氨酸浓度与吸光值的关系为：y 。1 7 4 1 x c + o 0 2 2 , r 2 0 9 9 8 7 y 吸光值 c ：亮氨酸浓度( 1 0 3 m ) 3 3 4 a - l a 和b l 晷的酶解 3 3 4 1n e u t r a s e 酶解a - l a 和e - l g 的情况 n e u t r a s e 在4 0 ，p h 6 8 ，e ，s 为4 0 0 u ( g 蛋白1 的条件下酶解乳清蛋白，酶解时间为0 3 8 h 图3 4 为乳清蛋白水解物的s d s - p a g e 图。 圈3 a ：n e u t r a s e 酶解w p c 产物的电泳田 f i 9 3 4 ：t h e s d s - p a g e p r o f i l e o f t h e w p c i r y d r o l y s a t e s p r e d u c e d b y n e t t t r a s e 中国农业大学硕t 论文 具有优先降解b - l g 能力的蛋白酶的筛选 霉 簪 鼬 鼹 皿 哿 蟹3 5 , n e u t r a s e 处理液中a h 和b l 軎的存余辜变化 f i 9 3 j ：q 衄窖瞄m p a c e m a g e m r e s i d 岫l a - l 工a a db l 毒u e a e d b ，n t r m e 用b a n d s c 软件进行a - h 和b k 的定量分析，乳清蛋白水解液中a l a 和b - l 窖的存余率变 化如图3 5 所示。由图中可以看出在1 h 内，1 h 和b - 【g 的降解速率较快，之后这两种蛋白的降 解速率趋缓b - l g 的存余率恒定在1 0 左右，而a l a 在3 h 时就基本全部水解。此时对应的d h 为7 2 5 整个水解过程中a l l 存余率一直低于b l g ，可见在本实验条件下n e u t f a 并不具有 优先酶解b - l g 的能力 3 a t 2f l a v o r z y m e 酶解a l a 和b - l g 的情况 r a v m z y m e 在4 0 ，p h6 8 ，e s 为4 0 0 u g 蛋白的条件下酶解乳清蛋白，酶解时间为o 5 孙。图3 6 为其蛋白水解液的s d s - p a g e 图 豳3 6 f l a v o r z y m e 酶解w p c 产物的电溶融 向9 3 6 t h e s d s - p a g e p 矗k0 f n 哺w p c h y 击o l y s a t e s p m d e c e d b y l q a v o r z y m e 拿 鲁 船 蕾l 皿 嘲 0i2345678 圈3 j ：m “m z y m e 处理液中的a 山和b l g 的存余辜变化 f 置g3 7 ：a 瑚萨so f p c 嗍恤萨m l c s i d u a ia h 柚db - l gt r e a t e db ym v o r z y m e s；m柏加m o 舯钟m o 中国农业大学硕仁论文具有优先降解e - l g 能力的蛋白酶的筛选 a - l a 和b - k 的存余率变化见图3 7 与n e u t r a s e 处理液一样，在1 h 内a - l a 和b - l g 的水解 速率较大，1 h 后这两种蛋白的存余率变化趋缓。在整个水解过程中- - h 的存余率一直小于参l g ， e - i g 的存余率最终保持在1 0 - 1 5 左右。a - l a 的存余率保持在3 左右，而可见f l a v o r z y m e 降 解a - l a 的能力要高于e - l g ，因此不适宜用于优先降解s - l g 3 3 4 3p r o t e a s e a 酶解a - l a 和e - l g 的情况 p r o t e a s e a 在柏，p h 6 8 ，e s 为4 0 0 u g 蛋白的条件下酶解乳清蛋白，酶解时间为0 5 8 h 图3 8 为p r o t e a s e a 酶解乳清蛋白的电泳图。 田3 8 ：p r o t e u e a 麓解w i c 产物豹电泳图 f ；9 3 8 ：t h e s d s - p a g e l , m i n e o f t h e w p c h y d m l y s m e s 呻嘣e d b y l m t e a s e a l 0 0 窑芜 墓： 础 嚣 0 0 l23s678 田3 9 zp m t e a s e a 处理液中的a - l a 和b _ i 暑的存余率变化 f i g 强a m 辨o f p e r c e n t a g e o f r e s k l u a l a - l a 副s - l s u e a t e d b y p l o t e a s e a 图3 9 是a - l a 的存余率变化图，从图中可以看出，在反应不到1 h 时a - l a 的存余率低于e - l g ， 此后a - l a 的存余率高于b - l g ，- l 丑和b l g 的酶解速率均在2 h 后变缓，a - l a 的存余率保持在 1 0 左右，b - l g 的存余率保持在6 左右。在8 h 时，a - l a 和b - l g 被完全水解p r o t e a s ea 处理液 在本实验条件下，当反应进行到2 h 后a - l a 的存余率一直高于b - l g 的存余率，可见p r o t e a s e a 对 b - l g 的活性要大于a - l a ，因此可以作为优先b l g 的酶解用酶。 3 3 4 4p r o t e a s en 酶解a - l a 和b - l g 的情况 p r o t e a s e n 在4 0 ，p h 6 卫，e s 为4 0 0 u g 蛋白的条件下酶解乳清蛋白，酶解时间为0 5 8 h 。 图3 1 0 为p r o t e a s en 酶解乳清蛋白产物的电泳图。 田3 1 0 ：p r o t e a s e n 酶解w i c 产物的电泳图 f i 9 3 1 0 ：t h e s d s - p a g e p r o f i l e o f e e w p c h y d r o l y s a p r o d u c e d b y p r o t e a s e n 中目农业大学硕卜论文 具有优先降解b l g 能力的蛋白酶的筛选 奢 鼍 班 鼷 皿 嘲 0l2345678 圈3 1 1 ：p m m a s e n 处理液中的_ h 和b l g 的存余率变化 f i 9 3 1 1 ：c l u m g e s o f p a c e a t a s e o f r m i d u a l a - l a s a d e - l s u e m e d b y p “o n 由图3 1 l 可以看出，p m t e a s en 对a l a 和b - l g 的酶解效率比较高在1 h 时，- l 丑就已经 被完全水解，此时b k 的存余率为1 0 1 ；此后b l g 的酶解效率趋缓，直到4 h 时e - l g 完全水 解，此时，乳清蛋白水解物的d h 为7 9 5 。在整个酶解过程中。a - l a 的存余率一直低于b - 【g ， 所以p r o t e a s e a 在本实验条件下不适合作为优先酶解b l g 的酶。 3 3 4 5p r o t e a s es 酶解a - l a 和b _ l g 的情况 p r o t e a s e s 在4 0 c ，p h 6 8 ，e s 为4 0 0 u g 蛋白的条件下酶解乳清蛋白，酶解时间为0 5 8 h 图3 1 2 为其蛋白水解物的电泳图 囝3 1 2 。n o 妇s 酶解w i c 产物的电泳圈 田3 1 2 ：t h e s d s - p a g e p m m e o f t h e w p c h y d r o l y s a t e s p m e u c e d b y p m t e a s e s 主 静 瓢 皿 嘲 ol234567 8 图3 1 3 p i o 把罄cs 处理液中的i l | 和b _ l g 的存余率变化 f i 9 3 1 3 ：c h a s e s e f p e r c e m a 辨o f t , e s i d u a l a - l a a n d s - l s u e m e d b y l m t e a s e s 帅衙加0 帅阳的蚰m o 中国农业大学硕t 论文 具有优先降解b - 1 名能力的蛋白酶的筛选 利用b a n d s c a a 分析电泳图的结果见图3 1 3 由图中可以看出p r o t e a s es 水解a - l a 的速率要 远远高于e - l g ，在0 s h 时a - l a 的存余率为2 1 3 而e - l g 的存余率为1 ；随后a l i 的含 量缓慢下降，在3 h 时a - l a 的存余率为o ，b - l g 的存余率为4 5 7 ，此时乳清蛋白的水解度是 5 5 9 直到曲时b l g 的存余率变化才趋缓；髓时，s - l g 的存余率为9 8 d h 为9 5 6 在 本实验条件下，p m t e a s es 对8 - l g 的酶解活性远低于a - l a ，因此也不适宜用于优先酶解b l g 3 4 讨论 本实验所用的五种蛋白酶都是中性蛋白酶，最适反应温度也都在4 0 5 0 c 左右，因此将蛋白 酶筛选的酶解条件定为p x6 8 ( w p c 8 2 0 0 溶液天然p h ) 、温度4 0 在加酶量方面，加酶量过 大会增加生产成本，加酶量过小又会延长生产周期，最终确定加酶量均为4 0 0 u g 蛋白，在这样 的加酶量条件下当酶解时间为2 - 5 h 时，乳清蛋白就能得到充分的酶解。控制所有蛋白酶在相同条 件下进行酶解，这样不仅方便实验的进行，而且也便于比较各蛋白酶降解a - l a 和b - l g 的差异 簟 v 趟 譬 * 0 1234g678 酶解时间( h ) 圈3 1 4 ：鲁警自奠处理液的d h 变化 f i 9 3 1 4 ：q m g e s o f d h o f t h e w i c s o l u t i o n s 船h y c k o l y s i s w i t h v i i r i o w t e l l z y m 图3 1 4 为各蛋白酶水解液的d h 变化，从图中可以看出p r o t e a s e n 对乳清蛋白的酶解能力最 强，p r o t e a s es 对乳清蛋白的酶解能力最弱。其余3 种酶在4 h 后d h 的差别不大 t n b s 法是测定w p c 水解度非常有效和准确的方法，由于w p c 中富含胱氨酸胱氨酸与硫 醇基团反应的产物非常不稳定，所以用o p a 法测定的d h 值偏小，而t n b s 与w i c 中的氨基反 应形成非常稳定的产物。d h 变化反映的只是蛋白酶对包括a - l a 和b l g 在内的全乳清蛋白的 酶解能力，本实验的关键是要比较各蛋白酶对a - l a 和b - 【g 的酶解能力图3 - 1 5 和3 - 1 6 反映的 就是各蛋白酶分别对a l a 和e - t g 的活力。在对a - l a 的活力中 4 h 后除了p r o t e a s es 之外的所有蛋白酶处理液中的b - l g 残留量随时问的变化不显著( p 0 1 1 5 ) ol2345678 囝3 1 5 各蛋白酶处理液中- k 的存余率变化 f l 蓦3 ：a i a 略曙o f p e ；c e n t a g e 删l i n i n g o f - - l | u e t t e d b y d i f f e t 州脚m 瞄 士 v 簪 砸 曩i ol2345678 酶解时甸( h ) 田3 1 & 各蛋白酶处理液中b - l 瘩的存余率变化 f j 寥3 1 6 c t t a a g e s o f p e r c e a t a p m i 柚i 岵岫e e a t e d b y d 谶e r e a te n z y m a 在3 3 4 的分析中，我们已经得知在这五种酶中，只有p 删 c a a 具有优先酶解的雎l g 的能 力为了在统一的标准下评价5 种酶酶解a h 和b - k 的能力我们比较了当d h 为8 左右时 各蛋白酶解液中的a l 丑和b l g 的存余率的大小( 表3 2 ) 。 d h 是评价蛋白水解程度的一个重要指标不仅关系到蛋白质被吸收利用的能力，而且还影 响蛋白酶解液的营养特性和功能特性( 9 l ，因此选择合适的d h 对于蛋白水解来说非常重要。对本 实验而言，若d h 过低，b k 的过敏性不能消除；若d h 过高，会使