（动物学专业论文）对虾素chp3和chp5的原核与真核重组表达及性质研究.pdf

山东大学硕士学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名鲻日期：2 坚竺三8 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保 存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 做作者签名雄婚毒师躲避睨型。 山东大学硕士学位论文 对虾素c h p 3 和c h p 5 的原核与真核重组表达及性质研究 摘要 抗菌肽是在动物、植物和微生物中广泛存在的一类分子量低、水溶性强、热 稳定性好的广谱抗菌活性物质它是机体受到病原感染后，经过对病原的识别、 信号传导进而被激活的一系列免疫效应物中很重要的一类。对抗菌肽的研究有助 于加深人们对先天免疫系统作用机制的了解。同时由于抗菌肽的多方面特点，也 使得抗菌肽在疾病的预防与治疗、药物的开发、食品的保鲜与储藏以及农业、畜 牧业、水产养殖业生产有着巨大的应用前景 对虾素是一类结构独特的抗菌肽，并在多种对虾中都有发现。目前，将对虾 素分为5 类，不同的对虾素都表现出对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的抗 菌活性。对虾素的研究主要集中在对其表达模式、重组表达和结构与活性研究等 方面。本实验室首先从中国对虾中克隆得到两种中国对虾素( c h p e n a e i d i n - 3 和 5 ，c h p 3 、c h p 5 ) 。本论文将这两种中国对虾素作了重组表达的研究、性质的研究 并制备了多克隆抗血清： 1 c h p 3 ，c h p 5 在大肠杆菌中的重组表达。成功构建了m c h p 3 p g e x 4 t - 1 、m c h p 5 p g e x - 4 t - 1 重组质粒，转化大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) b l 2 1 。g s t - c h p 3 、g s t - c h p 5 得到高表达量的诱导表达用亲和纯化的方法对融合蛋白进行 了纯化凝血酶裂解融合蛋白去除g s t ，用液体抑制的方法对目的蛋白c h p 3 、 c h p 5 进行了抑菌活性检测。c h p 3 表现出一定的抑菌活性而c h p 5 的抑菌活性不 强。 2 用大肠杆菌原核表达纯化得到的融合蛋白g s t - c h p 3 、g s t o c h p 5 免疫家 兔，制各了兔抗c h p 3 和c h p 5 多克隆抗血清，免疫双扩散检测抗血清滴度最高 达到8 倍稀释，w e s t e r nb l o t 显示兔扰c h p 3 多克隆抗血清对大肠杆菌表达的 g s t - c h p 3 以及酵母分泌表达的c h p 3 能较好的识别。兔抗c h p 3 和c h p 5 多克 隆抗血清的制备为进一步研究中国对虾素的表达模式和杀菌机制打下基础 3 对c h p 3 进行了毕赤酵母细胞内表达的研究。构建了带有四个表达框的 4 x m c h p 3 - p a 0 8 1 5 的重组质粒，转化毕赤酵母( y e a s t p i c h i a p a s t o r i s ) k m 7 1 ，筛 山东大学硕士学位论文 选得到转化菌株并进行了诱导表达，但无法检测c h p 3 的表达情况用p g a p r a 载体和p p i c 9 k 载体对c h p 5 进行了毕赤酵母细胞外分泌表达的研究。构建了 c h p 5 - p g a p 旷a 和c h p 5 p p i c 9 k 重组质粒。转化毕赤酵母k m 7 1 ，在培养上清 中检测有表达产物用离子交换层析对表达产物进行了纯化。牛津杯法检测到纯 化产物对大肠杆菌等有一定的抗菌活性，进一步进行了抗菌谱的测定结果表 明，纯化产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有一定的抑菌活性，对革兰氏阳 性菌的抑菌效果较好。通过对c h p 5 在毕赤酵母细胞外分泌表达的表达研究为进 一步大规模发酵生产以及测定c h p 5 的结构打下基础。 关键词：中国对虾素( c h p e n a e i d i n ，c h p ) 重组表达毕赤酵母 多克隆抗血清 2 生奎奎兰堡圭竺笪堡苎 r e c o m b i n a n t e x p r e s s i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fc h p 3 a n d c h p 5 ，t w ok i n d so fa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sf r o mc h i n e s e s h r i m p ( f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s 豇) a b s t r a c t a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s ( a m p s ) a r ew i d e s p r e a di np l a n t s ，a n i m a l sa n dm i c r o o r g a n i s m s ， t h e yh a v el o wm o l e c u l a rw e i g h t ，g o o dw a t e r - s o l u b i l i t y , r e s i s t a n c et oh e a ta n dw i d e a n t i m i c r o b i a ls p e c t r u m 1 r h e ya r e s y n t h e s i z e d a f t e rt h er e c o g n i t i o no fa l l i n v a d i n g o r g a n i s ma sf o r e i g na n dt h et r a n s d u c t i o no ft h es i g n a l s t h ee x p r e s s i o no fa m p si s a n i m p o r t a n tr e a c t i o no fi n n a t ei m m u n i t y t od or e s e a r c ho na m p sh e l p sp e o p l et op e r c e i v e t h ef u n c t i o no fi n n a t ei m m u n i t ym o r ed e e p l ya n d m o r ec l e a r l y d u et ot h e i rt r a i t s ，a m p s a r ec o n s i d e r e dt oh a v ea p p l i c a t i o ni n t h e r a p i e s ，p r e v e n t i n ga n dc u r i n go fd i s e a s e s ， d e v e l o p i n g n e wm e d i c i n e s ，f o o db i o p r e s e r v a t i v e sa n df a r m i n g p e n a e i d i n s ，b e l o n g e dt oau n i q u ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d ef a m i l y , h a v eb e e ni s o l a t e df r o m s e v e r a ls p e c i e ss h r i m pa n dh a v eb e e nd i v i d e di n t of i v eg r o u p sb a s e do nt h e i rs t r u c t u r e p e n a e i d i n sa l ef o u n dt op r e s e n tg r a m n e g a t i v ea n t i b a c t e r i a l ，g r a m p o s i t i v ea n t i b a c t e r i a l a n da n t i f u n g a la c t i v i t i e s t h er e s e a r c ha b o u tp e n a e i d i n si sm a i n l yc o n c e n t r a t e do nt h e f u n c t i o n a le x p r e s s i o no fp e n a e i d i n su s i n gb i o e n g i n e e r i n gm e t h o d s ，t h es t u d ya b o u tt h e i r s t r u c t u r e ，t h em e c h a n i s ma n dt h ed i s t r i b u t i o no fp e n a e i d i n si nt h es h r i m pu n d e ra l lk i n d s o fc i r c u m s t a n c e o u rl a b o r a t o r yf i r s t l yc l o n e dt w ok i n d so fp e n a e i d i n s ( c h - p e n a e i d i n 3 5 ) f r o mc h i n e s es h r i m p ，f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s i s t h i sd i s s e r t a t i o nm a i n l yc o n t a i n st w o p a r t s ，o n ei st h ee x p r e s s i o no fc h p 3 5i ne s c h e r i c h i ac o l ia n dy e a s tp i c h i ap a s t o r i s ， a n o t h e ri st h ea c q u i s i t i o no f p o l y c l o n a la n t i s e r i u mt oc h p 3a n dc h p 5 - 1 m c h p 3 m c h p 5w e r ec l o n e di n t ot h ep l a s m i dp g e x 一4 r 1a n dt h ef u s i o np r o t e i ng s t - c h p 3 ，g s t c h p 5w e r ee x p r e s s e di ne c o h b l 2 1 t h ea n t i m i c r o b i a la c t i v i t i e so fc h p 3 ， c h p 5w e r et e s t e da f t e rg s t - c h p 3 ，g s t c h p 5w e r ep u r i f i e db ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h a n dc l e a v e db yt h r o m b i n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h er e c o m b i n a n tc h p 3 d i s p l a y e da l o w a n t i m i c r o b i a la c t i v i t yb u tt h er e c o m b i n a n tc h p 5d i dn o t 3 山东大学硕士学位论文 2 u s i n gt h ef u s i o np r o t e i ng s t - c h p 3 ，g s t - c h p 5a sa n t i g e n st os t i m u l a t et h er a b b i t , t h ep o l y c l o n a la n t i s e r i u mt oc h i t 3a n dc h p 5w e r co b t a i n e d t h e s ep o l y c l o n a la n t i s e d u m w i l lb eu s e dt os t u d yt h el o c a l i z a t i o na n dd i s t r i b u t i o no fc h p 3 3 t h ep l a s m i dp a 0 815w a su s e dt oe x p r e s sc h p 3 t h i sp l a s m i dw a sd e s i g n e dt o e x p r e s sf o r e i g np r o t e i n nv i v ob u ti tw a sd i f f i c u l tt od e c i d ew h e t h e rc h p 3w a se x p r e s s e d o rn o td u et os o m er e a s o n s a n o t h e rt w or e c o m b i n a n tp l a s m i d sc h p 5 一p p i c 9 ka n d c h p 5 一p g a p r aw e r ec o n s t r u c t e da n dt h e yw e r ei n t r o d u c e di n t op i c h i ap a s t o r i sk m 7 1 t o o c t l p 5w a ss e c r e t e db yt h et r a n s f o r m e dc e l l st h e np u r i f i e db yc a t i o ni o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h t h em i n i m a lg r o w t hi n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) o fc h p 5w a s s t u d i e d w h i c hr e v e a l e dt h a tc h p 5e x h i b i t e da c t i v i t i e sa g a i n s tb o l l lg r a m - n e g a t i v ea n d g r a m p o s i t i v eb a c t e r i a t h ee x p r e s s i o no fc h p 5i ny e a s tw a st h ef u n d a m e n tt oi l l u s t r a t e i t ss t r u c t u r ea n d w a st h ep r e p a r a t i o nt of e r m e n tt h i sa n t i m i c r o b i a lc a n d i d a t eo nal a r g e s c a l e k e yw o r d s ：c h i n e s es h f i m p ( f e n n e r o p e n a e u sc h i n e n s 如) r e c o m b i n a n te x p r e s s i o n p i c h i ap a s t o r 缸p o l y c l o n a la n t i s e r i u m 4 山东大学硕士学位论文 s u m m a r y t a b l e g e n e sm c h p 3m c h p 5 v e c t o r s p a 0 8 1 5p g e x 一4 1 二lp p i c 9 kp g a p c t a h o s t s y e a s tp i c h i ae s c h e r i c h i ac o l iy e a s tp i c h i a y e a s tp i c h f n p a s t o r i s b l 2 1 p a s t o r i sk m 7 1 p a s t o r i sk m 7 1 k m 7 1 w a y s o f p r o t e i nc h p 3f u s i o np r o t e i ng s t -t h ee x p r e s s i o no fc h p 5 w a s e x p r e s s i o n w a si n d u c e db yc h p 3a n dg s c h pc h p 5 w a s c o n s t i t u t i v e l y m e t h a n o la n d5w e r ei n d u c e db yi n d u c e db y e x p r e s s e d 加 e x p r e s s e d n i p t ga n de x p r e s s e dm e t h a n o la n dv i t r o v i y o 加v y o e x p r e s s e d nv i t r o e x p r e s s i o n t h ea m o u n to f a p p r o x i m a t e l ya p p r o x i m a t e l ya p p r o x i m a t e l y l e v e l c h p 3c a nn o t3 0 - 3 5 o ft h e1 0 - 1 5 o ft h e1 5 一2 0 o ft h e b et e s t e d t o t a lp r o t e i na l et h et o t a ls e c r e t e dt o t a ls e c r e t e d f u s i o np r o t e i n s p r o t e i ni sc h p 5 p r o t e i ni sc h p 5 p u r i f i c i t i o n g l u t a t h i o n e h i p r e p _ 1 6 1 0 _ s pc m - s e p h a r o s e - m e t h o d s s e p h a r o s e - 4 ba n d受 c l 6 b b o i l e d a n t i t e s t e db yl i q u i dt e s t e db yp l a t e s m i c r o b i a l g o w t hi n h i b i t i o n a n d m i c i s m e a s u r e d a c t i v i t i e s t h ep o l y c l o n a l a n t i b o d i e sa g a i n s t g s t - c h p 3a n d g s t - c h p5w e r e o b t a i n e d 5 一 山东大学硕士学位论文 第一章综述 任何一个真正意义上的免疫防御系统必须具备以下几点：1 能够识别病原；2 能将识别的病原清除；3 能识别宿主组织即对宿主没有毒性1 1 先天免疫作为一 种古老的防御体系也具有以上的功能。虽然没有适应性免疫的特异性，记忆性等 特点，但同样可以通过细胞免疫反应和体液免疫反应将病原清除。这一过程一般 要经过以下几个步骤：首先，识别外来异物，称为感染的非己识别( r e c o g n i t i o n o fi n f e c t i o u sn o n s e l f ) ；随后，激活丝氨酸蛋白酶和解除丝氨酸蛋白酶抑制剂的细 胞外级联反应，从而将受到感染的信号放大为更强的“危险”信号或解除错误警 报，这个过程称为信号的调整和放大( s i g n a lm o d u l a t i o na n da m p l i f i c a t i o n ) ；然后 引发信号转导途径( s i n a it r a n s d u c t i o np a t h w a y ) ，而导致目的基因的转录活性； 最后，激活了效应物反应系统包括抗菌肽、酚氧化物酶依赖性黑化系统和凋亡相 关系统等f 2 j 1 感染的非己识别 在病原中存在一些结构性分子被称为病原相关分子模式( p a t h o g e n a s s o c i a t e d m o l e c u l a rp a t t e r n s ，p a m p s ) 。p a m p s 是一类病原中保守而在宿主体内缺少的一 些分子，如脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ，l p s ) 、肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n s ， p g n ) 、甘露糖( m a n n a n s ) 、脂磷壁质( 1 i p o t e i c h o i c ，l t a ) 、细菌的c p gd n a 和病毒中的d s r n a s s r n a 等( 3 l 。在宿主体内存在一些模式识别受体( p a t t e r n r e c o g n i t i o nr e c e p t o r s ，p r r s ) 它们分布于胞外和一些组织的细胞膜上，可以识 别或结合p a m p s 进而激活抗病效应物的合成以及其它一些免疫反应目前，对 p r r s 有多种分类方法，如c h r i s t o p h i d e s 等1 4 将在果蝇和按蚊中发现的p r r s 分为 六个家族：肽聚糖识别蛋白( p e p t i d o g l y c a nr e c o g n i t i o np r o t e i n s ，p g r p s ) ，含硫 脂键蛋白( t h i o e s t e r - c o n t a i n i n gp r o t e i n s ，t e p s ) ，革兰氏阴性菌结合蛋白 ( g r a m n e g a t i v eb i n d i n gp r o t e i n s ，g n b p s ) ，清除受体( t h em u l t i d o m a i n s c a v e n g e rr e c e p t o r ，s c r s ) ，c 型凝集素( c t y p el e c t i n s ，c t l ) 和硫依赖型凝集 素( g a l e c t i n s ，g a l e ) 在p r r s 中，p g r p s 和g n b p s 在引起抗菌肽的合成的 6 一 山东大学硕士学位论文 过程中起重要作用，下文将做简要介绍。同时，t o l l 受体( t o l ll i k er e c e p t o r ， t l r ) 在脊椎动物中作为模式识别受体与p a m p s 直接作用，而在无脊椎动物中并 不直接与p a m p s 发生相互作用，因此c h r i s t o p h i d e s 等将t l r 归为信号传导分 子，但h u l t m a r k 认为t l r 属于模式识别受体峭】鉴于t l r 在无脊椎动物先天免 疫的多种免疫效应物的产生起关键的调控作用，下文将一并作简要介绍。 1 1 肽聚糖识别蛋白( p e p t i d o g l y c a nr e c o g n i t i o np r o t e i n s ，p g r p s ) n - 乙酰葡萄糖胺( n - a c e t y l g l u c o s a m i n e ) 与n - 乙酰胞壁酸( n - a c e t y l m u r a m i c a c i d ) 通过p l - 4 糖苷键连接成 单体，多个单体串联，再由短 肽链将两个这样的串联体连接 就构成了肽聚糖 ( p e p f i d o g l y c a n s ，p g n ) ( 图 1 - 1 ) 肽聚糖分为d a p 型p g n 和l y s 型p g n 。两者的区别在 于：d a p 型p g n 肽链第三位为二 劁例 图1 - 1 l y s 型和d a p 型p g n 的结构悯 氨基庚二酸( m d i a m i n o p i m e l i ca c i d ) 并且对称的肽链直接连接，而l y s 型p g n 肽 链第三位为l 赖氨酸( l 1 y s i n e ) 对称的肽链由第三条肽链连接d a p 型p g n 为 g 菌、芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌细胞膜的组成成分。l y s 型p g n 为g + 菌所含有的 1 6 1 p g n 作为一种典型的p a m p s 能够被肽聚糖识别蛋白p g r p s 所识别。y o s h i d a 首先从家蚕血淋巴中发现p g r p s l 7 1 随后在人，小鼠和按蚊中都发现有 p g r p s l 4 】根据结构p g r p s 可以分为长型亚家族( p g r p - l ) 和短型亚家族 ( p g r p s ) ( 图1 2 ) p g r p l 一般为跨膜蛋白或存在于胞内。p g r p - s 一般位 于胞外，分子量约为1 9 2 0 k d a 。果蝇中发现有1 3 个p g r p s 基因，通过不同的剪 切方式转录为至少1 7 种p g r p s 蛋白嗍，其中包括l o 种p g r p - l 昆虫中的 p g r p - s 主要由脂肪体细胞，少部分由上皮细胞、肠和血细胞组成或诱导表达并存 在于血淋巴和表皮中；p g r p - l 则主要由血细胞表达。目前发现昆虫p g r p s 的功 能主要包括激活酚氧化物酶系统，激活t o l l f l m d 信号通路、诱导吞噬反应和降解 7 山东大学硕士学位论文 肽聚糖。 z 点三三三三三b 搿3 1 7 描 似锄 封1 2 1 91 1 72 7 5401棚2 ：绚酬呻由in 斜m i r i 蛳脚 图l - 2 p g r p l p g r p - s 和g i 呷b p s 的结构和功能域 1 2 革兰氏阴性菌结合蛋白( g r a m n e g a t i v eb i n d i n gp r o t e i n s ，g n b p s ) 革兰氏阴性菌结合蛋白是l e e 等首先从家蚕中分离得到了的1 9 】它与脂多糖和 昏l ，3 - 葡聚糖有很高的亲和性，对肽聚糖和几丁质没有亲和性。一些学者还发现 另外一些受体也能特异性的结合p - 1 ，3 - 葡聚糖，并将其称为p 1 ，3 - 葡聚糖结合蛋 白( p 1 ，3 - g l u c a nb i n d i n gp r o t e i n ，p g b p ) 。但从结构上，i i g b p $ f u g n b p s 有高度 的相似性，都具有与细菌的葡萄糖酶相似的结构域，但都不具备葡萄糖酶的活 性；从功能上，p g b p 和g n b p s 都能与p 1 ，3 - 葡聚糖结合激活酚氧化物酶系统和 黑化包被作用。因此，p g b p 和g n b p s 属于同一类受体目前，在烟草天蛾 ( m a n d u c as e x t a ) ，螯虾( p a c i f a s t a c u sl e n i u s c u l u s ) ，黄粉虫( t e n e b r i om o l i t o r ) ， 印度谷螟( p l o d i ai n t e r p u n c t e l l a ) ，兰对虾( p e n a e u ss t y l i r o s t r i s ) 中都发现了 g n b p s 在迄今所研究的所有甲壳类中都发现有i b g b p ，并且高度保守【1 川 f a b r i c k 对印度谷螟的p g b p 进行了结构和功能的分析发现，它的1 3 g b p 分为两个结 构域。其中n 端结构域具有螺旋结构，能够结合c u r d l a n ( - - 种不溶的b 1 ，3 - 葡 聚糖) 并能激活酚氧化物酶系统而c 端与葡萄糖酶相似的结构域能够结合 i a m i n a r i n ( 一种可溶的p 1 ，3 葡聚糖) ，c u r d l a n 与l a m i n a r i n 的区别在于 l a m i n a r i n 带有p 1 ，6 键构成的侧链，而c u r d l a n 为不带侧链的线型i l ”烟草天蛾和 印度谷螟的g n b p s 是由脂肪体合成然后分泌到血淋巴中 1 2 1 1 d i h 4 1 ，而蚊子 ( a r m i g e r e ss u b a l b a t u s ) 的g n b p s 则是由血细胞合成并迅速分泌到血淋巴中的 8 一 山东大学硕士学位论文 【1 5 】在果蝇中，一些种类的g n b p s 被分泌到胞外，另外一些则通过糖基磷脂酰肌 糖( g p i ) 锚定在细胞膜上，不同的g n b p s 识别 g p a m p s 也不同l j 研。 1 3t o l l 样受体( t o l ll i k er e c e p t o r ，t l r ) 在线虫动物、节肢动物，棘皮动物和脊索动物中都发现存在t o l l 样受体，而 在无体腔动物中还未发现”7 1 果蝇的t l r 是a n d e r s o n 在研究果蝇背腹分化过程 中发现的“，随后发现果蝇的t l r 在先天免疫中抗真菌f 1 9 1 和g + 菌1 感染中发挥 重要作用。目前从哺乳动物中发现有1 0 种t l r l 2 i i 果蝇中已经发现9 种t l r 基 因，其中三种( t l r l 、t l r 5 和t l r 9 ) 被证明与免疫系统有关果蝇的t o l l 样 受体都为膜蛋白，带有一个胞外的亮氨酸重复的结构域，一个跨膜结构域和胞内 的类白介一l 结构域。果蝇的t l r 虽然并不像脊椎动物的t l r 那样与p a m p s 直 接作用，但在将信号由胞外传至胞内的过程中发挥了重要的作用。 2 信号的调整和传导 先天免疫系统中通过对病原的识别而激发一系列免疫反应，在这一过程中危 险信号被调整传递。低等无脊椎动物中，不同的物种可能存在不同的信号通路， 如在果蝇中，t o l l 和l m d 途径研究得比较深入，而在蚊子中发现存在一条s t a t 途径作为模式生物的果蝇，它的先天免疫系统中抗菌肽的产生主要是由t o l l 和 i m d 途径通路控制的。 2 1t 0 n 信号通路1 2 2 1 g + 菌和真菌的感染能激活t o l l 信号通路。首先，p g r p s a 和g n b p l 共同识 别g + 菌引起的感染，然后激活蛋白酶系统将s p a e t z l e 蛋白裂解为1 2 k d a 的活性形 式真菌感染引起p e r s e p h o n e 基因编码的一种丝氨酸蛋白酶将s p a e t z l e 蛋白裂解 为活性形式活化的s p a e t z l e 蛋白与t o l l 受体有很高的结合能力( k d = 0 4 n m ) 。 信号由t o l l 受体传导到胞内目前发现胞内有三个蛋i ! l ：m y d 8 8 、t h b e 和p e l l e 依 次相互作用对信号进行传递。最终磷酸化一种带有锚蛋白重复序列的抑制蛋白 c a c t u s 。磷酸化的c a c t u s 与细胞因子分离，解除对细胞因子的抑制作用。在果蝇 不同的发育阶段，被激活的细胞因子是不同的，在蛹期t o l l 途径激活d o e s a l 9 一 山东大学硕士学位论文 d i f ，在成虫激活d i f 细胞因子启动多种抗菌肽的表达同时也使上百种基因的表 达量提高。但是这一信号通路还没有完全研究清楚：受g + 菌感染后是哪种蛋白酶 将s p a e t z l e 蛋白裂解还不清楚；信号传导过程中，p e l l e 并不是直接作用于c a c t u s 使其磷酸化，这中问还有哪些蛋白参与还有待进一步研究( 图1 - 3 ) 。 罐翌驯一，l i茎 黜，i i 麓黼l i 黼。 渊。器e m o oll4 ” i i g i p o 惫“盘 2 k 1 l譬 矗噌 土 v “紫二ol l 必亳p 善彩霞警曼亳言 - 一。鼍= ：恕，l h - _ 。m _ 图1 3 果蝇中的t o l l 信号通路和i m d 信号通路8 “ 2 2l i n d 信号通路 g 。菌的感染能激活i m d 信号通路细胞膜上的受体p g r p - l c 直接将g 菌感 染的信号传至胞内，胞内i m d 、f a d d 和d r e d d 依次相互作用进行信号传递。 同时还激活t a k i 蛋白，由t a k l 蛋白再激活一个由i k k p k k q 的复合体，并 由它直接作用于r e l i s h 蛋白。完整的r e l i s h 蛋白的c 末端带有一段锚蛋白重复序 列，这段序列抑制的r e l i s h 蛋白的活性，信号传导的结果就是将这一段从r e l i s h 蛋白上切除，从而活化的r e l i s h 蛋白启动上百个基因的表达以及果蝇的多种抗菌 肽的合成，如：d i p t e r i c i n 、d r o s o c i n 、c e c r o p i n s 和a t t a c i n s 等。推测这一过程中 也有可能是d r e d d 直接作用于r e l i s h 蛋白使其活化( 图i - 3 ) 近期的研究还发现，i m d 信号通路在激活抗菌肽的表达等免疫反应的同时还 激活, i n k ( c - j u nn t e r m i n a lk i n a s e ) ，引起细胞骨架蛋白的表达。这说明i m d 信 1 0 山东大学硕士学t ：7 = 论文 号通路在先天免疫反应和组织修复中都起作用阎 g 菌中的p g n 除了能与p g r p o l c 结合引起抗菌肽的表达，与p g r p - l e 结 合引发抗菌肽的表达和黑化反应外 2 3 1 ，还能被p g r p s c l 降解，因为p g r p - s c i b 具有n 乙酰胞壁酰l 丙氨酸酰胺酶活性刚 3 抗菌肽反应系统 先天免疫系统经过对病原的识别和信号传递后激活一系列体液免疫与细胞免 疫反应，如包括吞噬外来物质或包围大的入侵物，酚氧化酶系统导致局部黑化和 凝集，血细胞合成抗菌物质( 抗菌肽或多肽) 并释放到血淋巴等。对虾素是一类 结构独特的抗菌肽，属于抗菌肽效应系统，因此，下文将从抗菌肽的分类，功能 及作用机制等方面作一介绍。 3 1 抗菌肽的分类及功能 1 9 8 0 年b a m a n 首先发现了抗菌肽。随后从植物、动物以及一些微生物中都发 现有抗菌肽。在h t t p ：w w w b b c m u n i v t r i e s t e i t 中收录的抗菌肽已超过8 0 0 种，在 h t t p ：r e s e a r c h i 2 r a - s t a r e d u s g t e m p l a r d b a n t i m i c 中更是收录了多达1 7 0 0 中 已知的和推测的抗菌肽序列瞵1 同时还有许多其它的抗菌肽数据库，如能够提供 抗菌肽的序列查询、结构分析与预测的a p d 数据库 ( h f l p ： a p s u l t i m o e d u a p m a i n h t m i ) 1 2 6 1 * 抗菌肽具有分子量低、热稳定好和广 谱抗菌等特点。对抗菌肽的分类有很多种方法”一种根据其结构的分类方法将 抗菌肽分为五类1 2 8 1 ：1 具有螺旋的抗菌肽，如m a g a i n i 璐，c e c r o p i n s 等；2 具有p 折叠的抗菌肽，如d e f e 琳i 砸和p r o t e g r i n s 等；3 富含某一种氨基酸，如p r o ，t r p ， a r g 和h i s 的抗菌肽，如p r o p h e n i n s 。i n d o l i c i d i n s 和h i s t a t i n s 等；4 富含c y s 的抗菌 肽，如d r o s o m y c i n 、h n p - i 等；5 氨基酸被修饰的抗菌肽，这类抗菌肽大多数是从 微生物中发现的，如格氏乳球菌( l a c t o c o c c u si a c t i s ) 中的n i s i n 、串珠菌 ( l e u c o n o s t o cg e l i d u m ) 中的l e u c o c i na 等。这类抗菌肽的一些氨基酸经过特殊的 修饰，如3 甲基一羊毛硫氨酸，脱氢丙氨酸和脱氢丁酸甘油酯等。 山东大学硕士学位论文 抗菌肽具有广谱性，能够对g + 、g 和真菌表现出抗菌活性一些抗菌肽还有 抗病毒、抗肿瘤的活性。随着抗菌肽研究的深入，发现许多抗菌肽除了作为效应 物参加免疫反应外，还有刺激细胞增殖、刺激细胞因子表达等其它一些功能( 表 1 - 1 ) 。 表1 - 1 抗菌肽的功能但9 1 硒n do f a c t i v i t y p e p l l d e ，r e f e r e n c e s i 吐l b l n o fm e m b r a n ep r o t e i ns y n l h e s l s i n h i b i t i o no fd n a 蛰- n t h e s i s 锄t i t u m o u rs c t i v i t y s t i m u l a t i o no f c e l tp r o l i f e r a t i o n m t e r f e ”n c ew i t hs i g n a l l i n gp m h 州s s t i n “a t i o no f q - t o k i r mc x p r a s s i o s t i m u l a t i o no f a d h e s i o nm o l e c u l ee x p r e s s i o n a n g i o g e n e s i s c i d o d d es e c r e l i o n a t t a i n “：a f l 胬“以，1 9 9 9 ) p r - 3 9 ( n o m a ne f 以1 9 9 3 ) m a g a i n i n s ( j a c o b z s s l o 眶l 饼h ) d e f e , s i n s m i c h t e n s l e m e t 卅19 1 1 6 c e c r o p l mf m g o r e b t f 以。1 9 9 4 ) d e _ f e n s i n s m u f p l 嗲掰以，t 9 9 3 ) d e f e n s i n s 犯h a r p “, 1 1 9 8 8 ) c a p3 7 ( p e t e i r a e t 以，1 9 9 6 ) p r - 3 9c r a n a k a e r 碱2 0 0 0 e c a p ( | o b t 4 e t a l2 0 0 1 ) d e f e n s i n s ( t e r r i t o e t a l ，1 9 9 9 ) p r - 3 90 1 u 越嵋“a 。1 9 9 7 d e f e n s i n s 畦h a y 烈她，2 0 0 0 、 ( 、狮w e t e r i n g 鲋a l 1 冁9 ) d e f e n s i n s c h 出“卅。2 0 0 0 ) p r a l i n e - r i c hp e p t i d e s ( g 朗n a ，o 酐耐，2 0 0 2 ) c r y 撕d i n s ( l c e fe j 靠，1 9 9 7 ) 3 2 抗菌肽的作用机制 3 2 1 决定抗菌肽杀菌活性的因素 尽管一些抗菌肽对细菌和哺乳动物细胞都具有毒性。如p a r d a x i n l 3 町，但大多 数抗菌肽依然表现出抗病原微生物的广谱性和选择毒性病原微生物的一些特性 对于抗菌肽的选择毒性有一定的决定作用3 1 1 这些特性包括：1 膜的结构许多病 原微生物细胞膜组成中磷酯酰甘油( p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ，p g ) 、二磷酯酰甘油 ( e a r d i o l i p i n ，c l ) 和磷脂酰丝氨酸( p h o s p h a t i d y i s e n e ，p s ) 占有很大比