（材料学专业论文）组织工程支架用ε聚赖氨酸的改性及复合.pdf

天津大学硕士学位论文 组织工程支架用一聚赖氨酸的改性及复合 m o d i f i c a t i o na n d c o m p o u n d o f p o l y 一一l y s i n eu s e d a st i s s u ee n g i n e e r i n g s c a f f o l d s 学科专业：材料学 研究生：王睿 指导教师：黄远副教授 天津大学材料学院 二零零八年八月 中文摘要 随着组织工程学的发展，支架材料的研究日益重要，开发性能优越的复合材 料支架是目前的研究热点。聚赖氨酸( 简称p l ) 具有无毒性、抗菌性、生物 可降解性，促进细胞生长和粘附以及促进细胞发挥正常功能等作用。但其强度低、 脆性大的特点限制了其做为组织工程支架材料的应用。壳聚糖( 简称c s ) 具有 韧性强、粘度大、无毒、促进伤口愈合及极小的异体排斥作用，是一种常用的生 物材料。细菌纤维素( 简称b c ) 是一种具有较好力学性能和生物相容性的天然 有机高分子。羟基磷灰石( 简称h a ) 是生物相容性良好的骨组织替代材料。它 们都是可作为支架材料的良好的生物材料。 本文采用化学交联以及与壳聚糖复合的方法对聚赖氨酸进行了改性研究。 制备了交联改性的聚赖氨酸材料和聚赖氨酸壳聚糖( p l c s ) 复合材料， 并且采用冷冻干燥法对所制备的材料进行了造孔实验。采用f t i r 、x r d 、s e m 等检测手段对材料的形貌和结构进行了表征。f t i r 结果表明，复合材料中的两 种组分不是简单的机械混合，而是存在化学相互作用。x r d 结果表明，复合材 料的晶体结构、结晶度较反应前都发生了明显的变化。s e m 结果表明，复合材 料具有微观孔隙结构，孔径的大小可以通过改变戊二醛的加入量进行调节。 此外，本文采用表面改性的方法将b c 表面羟基氧化为羧基，并使用氧化后 的b c 制备了e - p l b c 复合材料，采用在模拟体液( s b f ) 中仿生沉积的方法制 备了e - p l b c h a 复合材料。采用x r d 、f t i r 、s e m 等对复合材料的形貌和结 构进行了表征。s e m 观察表明，复合材料中h a 的沉积颗粒呈圆球状，并且随 着沉积时间的延长沉积量逐渐增加。 关键词：聚赖氨酸交联聚赖氨酸壳聚糖聚赖氨酸细菌纤维素 复合材料一羟基磷灰石一 a b s t r a c t w i t ht h ed e v e l o p m e n to ft i s s u ee n g i n e e r i n g ，r e s e a r c ho ns c a f f o l dm a t e r i a l s b e c o m e sm o r ea n dm o r ei m p o r t a n t t h ee x p l o i t a t i o no fc o m p o s i t es c a f f o l d sw i t h s u p e r i o rp r o p e r t i e si sn o wt h eh o t s p o ti nt h i sf i e l d p o l y 吨- l y s i n e ( - p l ) h a st h e c h a r a c t e r i s t i c so fn o n t o x i c ，v i r u s - r e s i s t a n c e ，b i o d e g r a d a b i l i t y , a n dc a na l s oa c c e l e r a t e t h eg r o w t ha n da d h e s i o no fc e l l sa sw e l la sp r o m o t e st h ec e l l st op e r f o r m a n c ei t s n o r m a lf u n c t i o n b u tt h ed i s a d v a n t a g e so fl o ws t r e n g t ha n db r i a l e n e s sr e s t r a i nt h e a p p l i c a t i o n s a ss c a f f o l dm a t e r i a l si nt i s s u ee n g i n e e r i n g a sac o m m o n l yu s e d b i o m a t e r i a l ，c h i t o s a n ( c s ) h a ss t r o n gt o u g h n e s s ，g o o dg l u t i n o s i t ya n dn o n t o x i c ，i tc a n a l s os p e e d u pw o u n dc o n c r e s c e n c ew i t hm i n i m a lf o r e i g nb o d yr e s p o n s e b a c t e r i a l c e l l u l o s e ( b c ) i sak i n do fn a t u r a lo r g a n i cp o l y m e rw i t hg o o dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e s a n db i o c o m p a t i b i l i t y h y d r o x y a p a t i t e ( 儿) i sa na r t i f i c i a ls u b s t i t u t em a t e r i a li nb o n e t i s s u ee n g i n e e r i n gb e c a u s eo fi t sp e r f e c tb i o c o m p a t i b i l i t y i nt h i sp a p e r ，r e s e a r c ho nm o d i f i c a t i o no f8 - p lh a sb e e ns t u d i e db yt h em e t h o d s o fc r o s s l i n kw i t hg l u t a r a l d e h y d e ( g t a ) a n dc o m b i n a t i o nw i t hc s m o d i f i e d - p la n d e - p l c sw e r ep r e p a r e da n df o l l o w e db yf r e e z e d r y i n gw i t ht h ep u r p o s eo fo b t a i n i n g p o r o u ss t r u c t u r e x r d ，f t i r ，a n ds e mw e r ee m p l o y e d t o i n v e s t i g a t e t h e m i c r o s t r u c t u r ea n dm o r p h o l o g yo ft h ec o m p o s i t e s f t i rr e s u l t si n d i c a t et h a tc h e m i c a l r e a c t i o nt o o kp l a c ed u r i n gm o d i f i c a t i o n x r dr e s u l t sc o n f i r m e dt h er e a c t i o nb yt h e c h a n g eo fc r y s t a ls t r u c t u r ea n dc r y s t a l l i n i t y s e ms h o w st h em i c r o p o r o u ss t r u c t u r e w h i c hc o u l db ec o n t r o l l e d i na d d i t i o n ，c a r b o x y lg r o u p so nb cs u r f a c ew e r es u b s t i t u t e db yh y d r o x y lt h r o u g h m o d i f i c a t i o n ，a n de - p l b cc o m p o s i t e sw e r eo b t a i n e dw i t hm o d i f i e db c f u r t h e r m o r e ， am i m e t i cr o u t ew a su s e dt op r e p a r et h ee - p l b c h ac o m p o s i t e s x r d ，f t i r ，s e m a n a l y s e sw e r ee m p l o y e dt oi n v e s t i g a t et h em i c r o s t r u c t u r ea n dm o r p h o l o g yo ft h e c o m p o s i t e s s e mp i c t u r e ss h o w e dt h a th ap e l l e tp a r t i c l e sd i s t r i b u t e do nt h es u r f a c e b fb ef i b r e ，t h ea m o u n to fd e p o s i t e si n c r e a s e da st i m ei n c r e a s e d k e yw o r d s ：- p l ，c r o s s l i n k ，8 - p l c s ，e - p l b c ，c o m p o s i t e s ，h a 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤垄盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 了睿 签字r 期：劢矽驴年宫月弩同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨凄盘堂一有关保留、使用学位论文的规定。 特授权基鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权 兑明) 学位论文作者签名： 签字日期：刃罗年 j 一 ， 导师签名! 专2 主二一 签字同期：2 口谚，年矿月叫晤 垮印 7 节 月9 第一章绪论 1 1 引言 第一章绪论 创伤、先天性疾病、癌症、肿瘤等原斟1 1 造成的组织、器官缺损和功能障碍 是危害人类健康的重要原因，而缺损组织、器官的修复和功能重建也是目前临床 外科面临的主要难题。大面积的缺损通常都需要采用自体或异体组织、器官移植 进行修复，但在器官移植技术中，仍存在许多困难和问题【2 1 。自体组织器官移植， 由于组织供区有限而存在较大局限性。异体移植会带来移植器官在界面发生的炎 症反应、位移和破裂，而且组织或器官的来源严重不足，造成很多急需器官移植 的病人死亡。例如：到1 9 9 5 年1 2 月，仅美国就有4 4 0 0 0 人在等候器官移植，这其 中许多人的生命不能维持到有器官的时候。用生物材料制成人工器官取代受损组 织或器官，由于所用的材料是人工合成或天然的，具有生物不相容性或生物相容 性差，植入体内后会被宿主视为异物受到机体的攻击和排斥，产生一系列的副作 用。再者，合成材料不是活体组织，不具备人体器官的复杂功能，如微囊化的活 性碳制成的人工肝支持装置，只具有肝脏的解毒功能而无合成性能【3 ，4 】。基于此， 依靠细胞本身作为生物替代材料，在体外构建一个支架，使活细胞与支架进行结 合，构成具有生物活性的人体组织或器官植入体内，即用工程学和生命科学的原 理和方法构建具有生物活性的组织或器官成为解决这一问题的理想途径。 华人学者冯元祯1 9 8 4 年提出了组织工程的概念，之后化学工程师r o b e r t l a n g e r 教授和麻省理工大学医学院的临床医生j o s e p hpv c a n t i 正式提出“组织工 程”学概念。1 9 8 7 年春，美国国家科学基金会( n s f ) 在加利福尼亚的l a k et a h o e 举行的专家讨论会上，首次提出了组织工程的概念，并明确了组织工程的定义： 1 t i s s u ee n g i n e e r i n g i st h ea p p l i c a t i o no fp r i n c i p l e sa n dm e t h o d so f e n g i n e e r i n g a n dl i f es c i e n c e st o w a r dt h ef u n d a m e n t a lu n d e r s t a n d i n go fs t r u c t u r e w f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s i nn o r m a la n dp a t h o l o g i c a lm a m m a l i a nt i s s u e sa n dd e v e l o p m e n to f b i o l o g i c a ls u b s t i t u t e st or e s t o r e ，m a i n t a i n ，o ri m p r o v et i s s u ef u n c t i o n 。基口“组 织工程是运用工程科学和生命科学的原理和方法，从根本上认识正常和病理的 哺乳动物的组织结构一功能关系，并研究生物学替代物以恢复、维持和改进组织 功能 【引。实质上就是要研究开发具有生理功能的组织器官，然后移植到人体， 成为具有修复、维持或改善受损组织的生物替代物。组织工程技术是创伤修复领 域的一项新兴技术，是目前最符合创伤修复基本原则与要求的多学科交叉技术， 第一章绪论 它的产生是创伤医学研究发展到一定阶段的必然结果，它的进一步发展将有可能 改变传统“以创伤修复创伤的治疗模式，使创伤外科的治疗从组织器官移植走 向组织器官制造，实现外科治疗领域的一次重大变革【5 6 1 。 1 2 组织工程 1 2 1 概述 生物医学组织工程( t i s s u ee n g i e e r i n g ) 是一个涉及细胞生物学、材料科学、 反应器工程和临床医学的多学科交叉研究领域，其目的在于建造新的组织和器 官。组织工程技术的基本原理是将体外培养扩增的、具有特定生物学功能的种子 细胞( s e e dc e l l ) 与可降解生物材料( b i o d e g r a d a b l ep o l y m e r ) 相结合形成细胞一 材料复合物，在体外培养一定时间后植入体内，用以修复或替代病损组织、器官， 随着种子细胞在体内或体外不断增值并分泌细胞外基质，生物材料被逐渐降解吸 收，最终形成与相应组织、器官形态和功能相一致的组织或器官，从而达到修复 病损和重建功能的目的( 图1 1 ) 。 1 2 2 组织工程研究内容 软骨 骨 肝眭 胰腺 图1 1 组织工程示意图闭 f i g 1 - 1t i s s u ee n g i e e r i n g 骨赃 小肠 种子细胞、可供细胞粘附生长的生物支架、组织构建是组织工程的三个基本 要素，因此，组织工程的研究主要集中于这三个方面。 1 2 2 1 种子细胞研究 应用组织工程的方法再造组织与器官所用的各类细胞统称为种子细胞。种子 2 第一章绪论 细胞的培养是组织工程的基本要素，种子细胞研究的目的在于获取足够数量的接 种细胞，同时保持细胞增殖、合成基质等生物功能并防止细胞老化。组织工程种 子细胞主要有三个来源：与缺损组织细胞同源的自体细胞，如应用自体软骨、 皮肤、肝细胞等修复相应组织缺损。组织特异干细胞：主要包括骨髓基质干 细胞等具有多向分化潜能的多能干细胞及皮肤、肌肉前体细胞等具有定向分化潜 能的专能干细胞，此类细胞经过体外分离纯化、诱导分化与基因修饰等技术，定 向分化为其他组织类型的细胞，同时保持了干细胞可大量扩增、特异性基质合成 与不易老化的特征。组织于细胞的应用扩大了组织工程种子细胞来源，对种子细 胞的研究将是极大的推动。胚胎干细胞，胚胎干细胞由于其独特的高度未分 化特性以及所具有的发育全能性，即在适当条件下可以在体外培养增殖而不改变 进一步形成全身各种组织器官的能力，因而在未来的组织工程种子细胞研究中占 有重要的地位。胚胎干细胞将作为组织工程的“上游”研究为组织工程的进一步 发展提供技术储备 8 1 。 1 2 2 2 支架材料研究 支架材料作为组织工程研究的人工细胞外基质，为细胞停泊、生长、繁殖、 新陈代谢、形成新组织提供支持。 ( 1 ) 可降解高分子材料 国外研究较多的是p g a 、p l a 、p l g a 等。这些材料具有可标准化生产、可 降解、细胞相容性好等优点，但其酸性降解产物有可能对细胞的活力产生不利影 响。同时其亲水性、细胞相容性、力学强度等均尚待改进，采用多种改性技术有 可能满足组织工程对支架材料的要求。 ( 2 ) 陶瓷类材料 目前研究较成熟的是h a ，这类材料生物相容性好，有一定的强度，是骨的 无机盐成分，成为组织工程骨的支架材料，但降解慢、碎性大，因而降低了这种 材料的应用范围。 ( 3 ) 复合材料 将有机材料如p g a 与无机材料如h a 复合，或将h a 与胶原、生长因子如b m p 复合形成复合材料，克服了单纯材料的缺点，综合它们的优点。近几年对纳米材 料或纳米复合材料的研究有了新的突破，这已成为组织工程支架材料研究方向之 o r 、 。 ( 4 ) 生物衍生材料 将生物组织经过处理后获得的材料称为生物衍生材料。来源于人体的生物衍 生材料，保留了正常的网架结构，组织相容性好，是较为理想的组织工程支架材 料。如胶原凝胶，脱细胞真皮构建组织工程皮肤，纤维蛋白凝胶构建组织工程胶 第一章绪论 骨等。 1 2 2 3 组织构建 根据构建组织培育环境的不同，组织构建技术分为体外构建和体内构刮9 1 。 体外构建组织需要时间较长，种子细胞和支架材料在体外形成特定组织后再用于 组织修复。优点是便于观察组织的形成情况，相关影响因素容易被分析和控制。 但要模拟体内组织生长环境有一定的困难，对培养条件要求较高，所以用于培养 条件要求简单的组织如软骨、表皮、肌腱的培养。另外，不同的组织需要不同的 培养环境和条件，所以并非每种组织都能在体外培育成功。体内构建组织则将种 子细胞和支架材料直接或在体外短时间培养后再植入体内，其优点是体外培养周 期短，不需要特定的培养装置和环境，完全依赖体内环境促进组织再生和成熟。 由于体内环境复杂，体外很难模拟，所以体内培养适合组织结构比较复杂，如血 管、神经、肌肉、骨等各类组织器官的培养。有学者提出可以根据机体是否存在 健康的e c m ，选择使用或不使用生物可吸收性支架。修复较大的组织缺损则需 要使用生物支架，在一些具有强增殖活性的细胞如成纤维细胞再生时，种子细胞 可能并非必需 9 , 1 0 1 。 1 2 3 组织工程对材料的要求 材料学是组织工程领域的一个重要问题。它的发展也决定了组织工程的发 展。作为一种植入物，在临床应用中对其有特殊要求，甚至有些现在认为是理想 的植入物在将来也许就是医疗缺陷乃至医疗事故的起源，我们对其应予以足够重 视。在组织工程中我们使用的材料在某些场合又称为细胞外基质( e c m ) 替代物 【li ，1 2 1 。由于细胞必须依赖于细胞外基质的存在才能发挥其功能，因此在组织工程 中，细胞外基质替代物的选择是一个重要方面。基质材料不仅影响细胞的生物学 行为和培养效率，而且决定着移植后能否与机体很好的适应、结合和修复的效果， 这是限制组织工程在i 临床应用的一个重要环节。作为一种体内理想的移植物， 临床上应满足如下要求。 ( 1 ) 组织相容性好、无排斥反应 组织相容性是植人物能否长期存留体内的决定因素。目前常用的羟基磷灰 石、注射性胶原、硅橡胶等都有发生排斥反应而被排除的报道。聚乳酸( p l a ) 、 聚乙醇酸( p g a ) 等相容性虽有所提高，但也有报道发生排异反应且没有长期随访 的最终报道。同时也有报道指出不同材料及其降解产物在体内的致癌性、致炎性 和毒性反应。因此，作为临床使用的最基本条件，还应开发出组织相容性更好的 材料【1 3 1 。 4 第一章绪论 ( 2 ) 生物可降解性、降解可调性及降解无毒性 作为一种好的基质材料应能在体内适时地降解并逐渐由新生组织替代形成 新的有功能的器官而最终完成其使命。如果不能降解则将会影响新生器官的质量 和功能，无法完全达到组织工程修复组织器官的目的。目前可降解高分子聚合物 类生物材料应成为开发的一个重点，同时还应该指出降解的可调性也应引起重 视。基质的降解应能根据移植细胞的类型进行调整，并且能与新生组织的生长速 度形成一种平衡。能视新生组织的生长快慢而调整自我的降解速度，而现有的基 质材料却远不能实现这种平衡。再者，降解产物应对机体及微环境无毒。某些降 解产物可在局部形成过酸或缺氧等对细胞产生毒性作用，这将不利于种子细胞的 扩增d 4 j 5 。 ( 3 ) 易于塑型 由于临床工作中个体差异及病损的不同的原因，植人物要求高度个性化。要 能塑成各种形状、结构及方便地进行剪裁，故不能脆性过大、过硬，复合材料要 解决断面封闭的问题，同时也要视不同修复组织而具备不同的强度，使之在植入 部位能承担相应的外力而不致变形。目前已有科学家将计算机和三维成像技术应 用于生物材料的个性化设计和制备，这就使得材料的制备更趋于服从量化指标而 非依赖于研究者的个人经验。 ( 4 ) 易于消毒 能在使用现行常规的高压、熏蒸、浸泡等简单的消毒情况下，结构及性状不 发生改变。 ( 5 ) 易于保存 可于常温常湿等自然条件下保存，并且可以长期保存而不发生变化。 ( 6 ) 适于细胞生长的材料标准 在作为植入物的基础上，作为细胞外基质这种材料还应有其特殊的物理和化 学特征，以满足种子细胞生长、繁殖的需要。 材料的表面修饰 材料的处理应能有利于细胞的贴附，为细胞在其表面生长繁殖、分泌基质提 供良好的环境【l6 1 。就目前来说，可以调整基质表面化学及微结构的修饰、整合上 一些特异的细胞表面受体识别物质，以利于细胞的粘附、促进细胞的分裂及发生 形态的分化。再者，也可通过提高材料表面的亲水性来提高细胞的贴附和分化。 材料的物理结构 材料应能提供最大限度的空间和面积以利于容纳最大限度的贴附细胞，这就 需要材料有高度的孔隙率，应达9 0 ，同时又能保证材料的强度。材料的超结构 的整体和表面合理性即结构相容性和表面相容性的设计要更加完善，以利于增加 第一章绪论 孔隙率和材料表面积与体积之间的比例。除了要让细胞贴附以外，植入体内后的 血管长入也已被证明与材料的孔径、孔隙率高度相关。现已知细胞与最近的毛细 血管间间距为几百微米就可能会死亡。因此，适当地使其达到平衡，使血管能以 最快的速度长入植入体以此保证材料深部的细胞不至于因缺少氧及营养成分而 死亡也是非常关键的f 1 7 1 。 引导性能 能与各种促进细胞定向分化、分裂的各种生长因子共同诱导新生组织的生 成。 1 3 一聚赖氨酸 1 3 1 聚赖氨酸的结构 聚赖氨酸的化学合成是在1 9 4 7 年首先完成的。化学法合成的聚赖氨酸为a 型，其赖氨酸残基之间的酰胺键是由a 氨基和0 【羧基缩合而成。1 9 7 7 年日本学 者s h i m a 和s a k a i 在从微生物中筛选d r a g e n d o r f f p o s i t i v e ( 简写为d p ) 物质的过程 中，发现一株放线菌n o 3 4 6 能产生大量而稳定的d p 物质，通过对酸水解产物的 分析及结构分析，证实d p 物质是一种含有2 5 - - 3 0 个赖氨酸残基的同型单体聚合 物。这种赖氨酸聚合物是赖氨酸残基通过伍羧基和氨基形成的酰胺键连接而 成，故称为聚赖氨酸( p l ) 1 8 , 1 9 1 。研究证明一聚赖氨酸比a 聚赖氨酸有更强 的抑菌活性，而且a 聚赖氨酸有一定毒性【2 0 】。 h 斗一虬一啦一咀一吗一r n h 2 图l - 2 聚赖氨酸分子结构式 f i g 1 - 2s t r u c t u r eo f p o l y ( - l y s i n e ) ，。，h 十h n h 2 c f 。七。h h 2 n c h 2 一c h 2 一c h 2 一亡h 2 图1 - 3 甜聚赖氨酸分子结构式 f i g i - 3s t r u c t u r eo fp o l y ( q t - l y s i n e ) 6 第一章绪论 1 3 2 1 3 - 聚赖氨酸的性质 1 3 2 1 聚赖氨酸的理化性质 聚赖氨酸为淡黄色粉末，吸湿性强，略有苦味，是赖氨酸的直链状聚合物。 它不受p h 值影响，对热稳定( 1 2 0o c ，2 0m i n ) ，能抑制耐热菌，故加入后可热 处理。但遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可能因结合而使活性降 低。与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用又有增效作用。 分子量在3 6 0 0 一- - 4 3 0 0 之间的聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子量低于1 3 0 0 时， 聚赖氨酸失去抑菌活性。由于聚赖氨酸是混合物，所以没有固定的熔点，2 5 0o c 以上开始软化分解。聚赖氨酸溶于水，微溶于乙醇。对其表征进行红外光谱分 析表明，在1 6 8 0 - - 1 6 4 0c m 。和1 5 8 0 , - - - 1 5 2 0c m 一有强吸收峰【2 l 】。 1 3 2 2 聚赖氨酸的生物学性质 聚赖氨酸是一种具有抑菌功效的多肽，这种生物防腐剂在8 0 年代初由日本 学者腾井正弘，平木纯首次应用于食品防腐剂。聚赖氨酸能在人体内分解为赖 氨酸，而赖氨酸是人体必需的8 种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化的 氨基酸。因此聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，安全性高于其他化学防腐剂，其急 性口服毒性为5g k g l 2 2 1 。 聚赖氨酸抑菌谱广，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母菌、产膜毕 氏酵母、玫瑰掷孢酵母：革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中的产气节杆菌、大肠杆菌等引起食物中毒与腐败 的菌有强烈的抑制作用【2 3 】。刘慧等研究也表明：聚赖氨酸对革兰氏阳性的微 球菌，保加利亚乳杆菌，热链球菌，革兰氏阴性的大肠杆菌，沙门氏菌以及酵母菌 的生长有明显抑制效果，聚赖氨酸与醋酸复合试剂对枯草芽胞杆菌有明显抑制作 用。 聚赖氨酸抑菌最适p h5 8 ，也就是说其在中性和微酸性环境中有较强抑菌 性，而在酸性和碱性条件下抑菌效果不理想。可能与聚赖氨酸作为一种赖氨酸聚 合物在酸性和碱性条件下易分解有关。 1 3 3 聚赖氨酸的抑菌作用及抑菌机理， 1 3 3 1 聚赖氨酸的抑菌作用 聚赖氨酸的抑菌性是1 9 8 4 由s h i m a 等人首先提出，s h i m a 发现聚赖氨酸对 革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、真菌的生长繁殖有显著的抑制作用：聚赖氨酸 应当有2 5 - 3 0 个赖氨酸残基，当聚合度低于1o 时，会丧失抑菌活性。k i t o 也报道 7 第一章绪论 聚赖氨酸对酵母、真菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制作用。d e l i h a s 等人研究发现聚赖氨酸能杀死各种细菌；不同种类细菌对聚赖氨酸的敏感性 不同，分枝杆菌对其最敏感，大肠杆菌对其抗性最大；葡萄球菌和链球菌也具有不 同抗性。刘慧等人的研究表明聚赖氨酸对革兰氏阳性的微球菌、保加利亚乳杆 菌、嗜热链球菌、革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌以及酵母菌的生长有明显抑 制效果；聚赖氨酸与醋酸复合试剂对枯草芽胞杆菌有明显抑制作用；经高温处 理后的聚赖氨酸对微球菌仍有抑菌活性，表明聚赖氨酸具有较好的热稳定性 能；聚赖氨酸在中性和微酸性环境中有较强的抑菌性，而在酸性和碱性条件下 抑茵效果不明显。 1 3 3 2 聚赖氨酸的抑菌机理 聚赖氨酸是阳离子表面活性物质，它有氨基，在水中带正电；分子内部有 疏水性的亚甲基，外部有亲水的羧基和氨基。正电荷有利于聚赖氨酸与靶细胞 表面带负电的位点结合，而双性特征对膜结构的破坏效应是必需的。s h i m a 认为 聚赖氨酸通过与细胞膜作用影响微生物的呼吸，与胞内的核糖体结合影响生物大 分子的合成。v a r r a 也认为聚赖氨酸能与细菌的外膜结合，破坏外层膜，并释放 大量脂多糖。d e l i h a s 等人提出聚赖氨酸的抑菌性与细菌的细胞壁结构无必然联 系，细菌对聚赖氨酸的敏感性不同可能与细菌类型或细胞表面接受成分的多少 或细胞分泌出能降解聚赖氨酸的蛋白酶类的多寡有关。 1 3 4 聚赖氨酸的应用 1 3 4 1 聚赖氨酸在食品中的应用 聚赖氨酸由于其优良抗菌性和安全性已广泛应用到食品工业各个领域，如用 于面包点心、奶制品、肉制品、冷藏食品和袋装食品等。聚赖氨酸作为一种生物 防腐剂，是人体必须氨基酸一赖氨酸聚合物，随着进一步研究，其应用领域将不 断拓展。 在食品保鲜防腐方面：徐红华等【2 5 j 通过饱和实验设计研究聚赖氨酸和甘氨 酸对牛奶保鲜作用，结果表明，单独使用聚赖氨酸和甘氨酸，其抑菌能力明显 低于二者混合使用效果。混合使用时其增效随二者用量增加而增加；但当聚赖 氨酸用量过高时，这种增效作用会有所减弱，其中以增；1 7 1 4 2 0m g l 聚赖氨酸 和2 甘氨酸时抑菌效果最佳。 日本学者腾井正弘在米饭中添加0 4 - 0 6 聚赖氨酸一醋酸制剂研究对 米饭防腐作用，结果显示，3 0 培养4 8h 后，添加聚赖氨酸防腐剂样品中细菌 总数为6 0 x 1 0 个g ，而空白样中细菌总数为3 6 x 1 0 个儋，表明聚赖氨酸一醋酸 8 第一章绪论 制剂有明显抑菌作用【2 5 】。 1 3 4 2 聚赖氨酸在医学方面的应用 聚赖氨酸富含阳离子，与带有阴离子的物质有强静电作用力，且对生物膜 有良好穿透力，基于这一特性，聚赖氨酸可用作某些药物载体，因此在医疗和制 药方面得到广泛应用。 h u g u e s 等 2 6 】发现将氨甲嘌呤( 治疗白血病、肿瘤药物) 与聚赖氨酸聚合， 能提高药物疗效。 解放军总医院基础所科研人员用海藻酸钠聚赖氨酸海藻酸钠( a p a ) 微囊 化牛嗜铬( b b c ) 、注入脊髓蛛网膜下，其对慢性疼痛有镇痛作用，且这种a p a 膜具有良好免疫隔离作用【2 7 】。t a n t s l 等【2 8 1 将聚赖氨酸作为媒介应用于酶联免疫 检测( e l i s a ) 。f a n 用聚赖氨酸包裹t 2 毒素，然后接种白兔t 2 抗体，通过专一 性抗原体反应来检测抗体数量。s o s p e d r a 掣2 9 】用以聚赖氨酸为主链的分支聚合蛋 白搭载生物大分子治疗肝炎病毒( h a y ) ，取得良好疗效。d i e d e r i c h 掣3 0 】研究电 脉冲对不同分子量聚赖氨酸修饰细胞膜破坏程度，发现细胞膜吸附高分子量聚赖 氨酸会降低其破损临界电压。 1 4 细菌纤维素 细菌纤维素( b a c t e r i a lc e l l u l o s e ) 是由一定的微生物( 主要为细菌) 产生的 细胞外纤维素，最早由英国科学家b r o w n 在1 8 8 6 年发现。为了与植物来源的纤 维素相区别，将其称为细菌纤维素或微生物纤维素( m i c r o b i a lc e l l u l o s e ) 1 3 1 。细 菌纤维素不仅是地球上除植物纤维素之外的另一类由细菌合成的天然惰性材料， 而且是世界上公认的性能优异的新型生物学材料。能够产生纤维素的细菌种类较 多，主要有醋杆菌属( a c e t o b a c t e r ) 、根瘤菌属( r h i z o b i u m ) 、八叠球菌属( s a r c i n e ) 、 假单胞菌属( p r e u d o m o n a s ) 、固氮菌属( a z o t o b a c t e r ) 、气杆菌属( a e r o b a c t e r ) 、 土壤杆菌属( a g r o b a c t e r i u m ) 和产碱菌属( a l c a l i g c u c s ) 。在众多微生物中，醋 杆菌属中的木醋杆菌( a c e t o b a c t e rx y l i n u m ) 是最早发现也是研究较为透彻的纤 维素产生菌株，可以利用多种底物生长，是目前已知合成纤维素能力最强的微生 物菌种f 3 2 3 5 1 。 1 4 1 细菌纤维素的结构 细菌纤维素是由1 3 - o 一葡萄糖通过p - 1 ，4 - 糖苷键结合成的线性直链，直链间彼 此平行，不呈螺旋结构，无分之结构，又称为p 1 ，4 - 葡聚糖。在葡萄糖单元结构 9 第一章绪论 中，c 2 、c 3 、c 6 位置上连有羟基，可进行一系列与羟基有关的化学反应【3 6 l 。与 植物纤维相比，细菌纤维素是由超细纤维组成的超细纤维网。纤维的直径在 0 o l o 1g r n 之间，每一跟丝状纤维由一定数量的微纤维组成，微纤维的大小与 结晶度有关 3 7 , 3 8 1 。以木醋杆菌( a x ) 为例，a x 纤维素的微纤维直径为0 7 8a m ， 相邻的微纤维之间由氢键横向相互连接形成直径约为3 - 4n m 的微纤维束；多束 微纤维合并形成长度不定，宽度为3 0 1 0 0n m ，厚度3 8n i i l 的纤维丝带，其 直径和宽度仅为棉纤维直径的百分之一到千分之一【3 纠。 图1 4 细菌纤维素分子结构式 f i g 14 m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fb a c t e r i a lc e l l u l o s e 1 4 2 细菌纤维素的性质 细菌纤维素和植物或海藻产生的天然纤维素在化学性质上是相同，但细菌纤 维素具有独特的理化性质和机械性能：植物纤维主要由纤维素组成，但掺杂 其他多糖类，如半纤维素或木质素。而细菌纤维素具有高结晶度( 可达9 5 ，植 物纤维素为6 5 ) 、高聚合度( d p 值2 0 0 0 - - 8 0 0 0 ) 和高度一致的分子取向，并且 以单一纤维形式存在，纯度极高；超精细网状结构。细菌纤维素纤维是由直 径3 - - 一4n m 的微纤维组合成4 0 - 6 0n m 粗的纤维束，并相互交织形成发达的超精细 网络结构；细菌纤维素的纤维直径在0 0 1 o 1p r n 之间，抗拉力强度高，扬氏 模量高达1 5 1 0 1 0p a ，并且纤维素的机械性能与菌株种类、发酵方式和处理方式 ( 加热、加压) 关系不大；细菌纤维素有极强的持水性和透水透气性，能吸收 6 0 - 7 0 0 倍于其干重的水分；细菌纤维素具有较高的生物适应性和良好的生物 可降解性，是很好的环保产品【4 0 】；细菌纤维素生物合成具有可调控性。采用 不同的培养方法，如静态培养和动态培养，利用醋酸菌可以得到不同高级结构的 纤维素1 4 1 。为了改进细菌纤维素的特性使它更适合医学上的用途，s e i f e r t 等1 4 2 l 在细菌纤维素培养基中加入一些多聚体如羧甲基纤维( c m c ) 、甲基纤维素( m c ) 等，可提高细菌纤维素的含水量。加入2 的c m c ，发酵结束后离心得到的冻干、 1 0 h 第一章绪论 肿胀状态的b c c m c ，其含水量达9 6 ，而标准状态下得到的细菌纤维素含水量 只有7 3 。s h i g e r u 等t 4 3 】通过在培养基中加入某些化学试剂，可以改变细菌纤维素 的结构，比如在培养基中加入抗生素抑制细胞分裂或蛋白质合成，可使木醋杆菌 形成细菌纤维素的弹性模量得到提高。 1 4 3 细菌纤维素的合成和分泌过程 细菌纤维素的合成是由醋酸菌细胞壁上的孔向外分泌纤维素，先由1 0 - - 一1 5 条直链多糖聚合成1 5a m 的胶状聚合物，然后由这些聚合物形成走向与茵体长 轴平行的纤维束。醋酸纤维素以2l m y m i n 的速率进行纤维束的合成1 4 4 。 以木醋酸菌为例，细菌纤维素的合成过程大致可以分为4 个步聚1 4 5 1 ，即：葡 萄糖在葡萄糖激酶的作用下转化为6 磷酸葡萄糖；6 磷酸葡萄糖在异构酶的 作用下转化为磷酸葡萄糖；1 - 磷酸葡萄糖在焦磷酸化酶的作用下生成尿苷 二磷酸葡萄糖( u d p g ) ；在细胞膜上，通过纤维素合成酶的催化作用，将 u d p g ( 纤维素的直接前体物质) 合成为1 3 1 ，4 糖苷键链，然后聚合成纤维素。 果糖在激酶、磷酸化酶和异构酶等的催化作用下转变为6 磷酸葡萄糖后同样依 照上述步骤参与细菌纤维素的合成。细菌纤维素的合成速度很快，一个木醋杆菌 细胞在ls 可以聚合2 0 0 ，0 0 0 个葡萄糖分子。 细菌纤维素分泌伴随合成同时进行。木醋杆菌在细胞中合成纤维素后，从细 胞壁的微孔道中分泌出与细胞纵向轴平行的宽约l 2a m 最小构成单元亚小纤 维，亚小纤维间相互以氢键连接形成直径为3 , - - - , 4a m 的微纤维，微纤维间一束束 平行排列、相互缠绕，组成宽度为4 0 - - 1 0 0a m 、长度不定的纤维丝带，纤维丝带 具有高度结晶性【4 6 1 。纤维丝带相互交织，形成网状多孔结构，并在培养基的气液 界面形成一层透明的凝胶薄膜。利用冰冻蚀刻技术进行研究，发现细菌纤维素微 纤维在形成的初期存在一个由无定型外壳形成的核，分泌纤维素的微孔呈线形排 列，孔径在1 2 1 5a m ，深3 5n m l 4 川。 1 4 4 细菌纤维素的应用 1 4 4 1 细菌纤维素在医学材料上的应用 细菌纤维素由于具有独特的生物亲和性、生物相容性、生物可降解性、生物 适应性和无过敏反应，以及高的持水性和结晶度、良好的纳米纤维网络、高的张 力和强度，尤其是良好的机械韧性，因此在组织工程支架、人工血管、人工皮肤 以及治疗皮肤损伤等方面具有广泛的用途，是国际生物医用材料研究的热点之 一 第一章绪论 ( 一) 细菌纤维素在组织工程支架中的应用 生物相容性对于组织工程支架的构建是必不可少的。在研究组织工程细菌纤 维素( b c ) 支架构建中，体内生物相容性的评价非常重要。h e l e n i u s 等t 4 8 】系统地 研究了b c 的体内生物相容性。实验中他们把b c 植入老鼠体内1 1 2 周，利用组织 免疫化学和电子显微镜技术，从慢性炎症反应、异物排斥反应以及细胞向内生长 和血管生成等方面的特征来评价植入物的体内相容性。结果发现植入物周围无肉 眼和显微镜可见的炎症反应，没有纤维化被膜和巨细胞生成。b c 被成纤维细胞 侵入，与宿主组织融为一体，未引起任何慢性炎症反应。因此可以断定b c 的生 物相容性非常好，在组织工程支架构建方面具有潜在价值。 ( 二) 细菌纤维素在人工血管上的应用 2 0 0 1 年k l e m m 等1 4 9 j 研究了在显微外科中以b a s y c ( b a c t e r i a ls y n t h e s i z e d c e l l u l o s e ) 做为人造血管的可行性。他们利用大鼠微脉管插补术试验发现只有1 m m 内径的b a s y c 在湿的状态下具有高的机械强度，大的持水能力，低粗糙度的 内径以及完善的生物活性等优良特性，证明了它在显微外科中作为人工血管的巨 大应用前景。2 0 0 4 年k l e m m 等f 5 0 】进一步证实b a s y c 具有生物活性和相容性。由 于具有与天然血管内腔表面类似的平滑度，因此血管内不会形成血栓，b a s y c 完全符合显微外科中人工血管的物理和生物要求。 ( 三) 细菌纤维素在人工皮肤以及皮肤损伤治疗上的应用 自1 9 9 7 年以来有近1 0 个皮肤伤病医疗单位已报道4 0 0 多例应用b c 膜治疗烧 伤、烫伤、褥疮、皮肤移植、创伤和慢性皮肤溃疡等取得成功的实例，现已有用 其制成的人工皮肤、纱布、绷带和“创口贴”等伤科敷料商品。与其它人工皮肤 和伤科敷料相比，该膜的主要特点是在潮湿情况下机械强度高、对液、气及电解 物有良好的通透性、与皮肤相容性好，无刺激性，可有效缓解疼痛，防止细菌的 感染和吸收伤口渗出的液体，促进伤口的快速愈合，有利于皮肤组织生长。此膜 还可作为缓释药物的载体携带各种药物，利于皮肤表面给药，促使创面的愈合和 康复。 1 4 4 2 细菌纤维素在其它方面的应用 b c 具有十分优良的性能，在许多工业领域都有应用。 ， 在造纸领域，b c 是一种非常好的生物添加剂。由于b c 具有很好的拉伸强 度，将纤维素加入到纸浆当中可以明显的提高纸张的强度和韧度。当纸品被干燥 时，细菌纤维素的微纤维之间会形成大量的氢键，这使得其化学吸附性及拉伸强 度大大提高。如加入了8 0 b c 纤维纸品的平均性能是普通纸品的2 5 倍1 5 1 】。又 如，通过向棉纤维中添加少量的b c 所获得的手工纸品抗老化性提高，具有优良 的吸墨性和光滑性，可用于修复