（食品科学专业论文）黑曲霉β葡萄糖苷酶的基因克隆.pdf

摘要 b 葡萄糖苷酶( b g l ) 是纤维素酶系中的一个重要组分。b 葡萄糖苷酶可以水解纤 维二糖，实现纤维素酶的彻底降解。本研究对比了黑曲霉a s 3 3 5 0 和绿色木霉3 3 7 4 4b 葡萄糖苷酶活性，结果表明黑曲霉的b 葡萄糖苷酶活( o 3 6 5 6 3 u m 1 ) 明显高于绿色木 霉该酶酶活( 0 0 4 6 1 8u m 1 ) 。 本试验利用c t a b 法、简化c t a b 法、氯化苄法和快速提取法等4 种方法进行黑曲霉 基因组总d n a 的提取，并采用琼脂糖凝胶电泳和p e r 特异性扩增对d n a 进行了鉴定。电 泳检测结果表明4 种方法均可提取到黑曲霉基因组d n a ，但p c r 检测结果表明只有c t a b 法和简化c t a b 法提取的d n a 可用作b 9 1 1 基因的p e r 模板。而且本试验在不影响p e r 模 板质量的前提下对简化c t a b 法进行了优化，降低了试验的危险性。 依据g e n b a n k 已公布的黑盐霉b g l 基因序列，设计合成了一对p c r 引物以黑曲 霉a s 3 3 5 0 总d n a 为模板，扩增得到了大小为3 ，0 k b 的d n a 片段，与p g e m te a s y 载 体连接后成功转入大肠杆菌。对克隆的d n a 片段进行测定，结果表明：所得目的d n a 片段为2 9 4 8 b p ，与g e n b a n k 已公布黑曲霉b g l l 基因全序列进行比较，结果表明核苷酸 序列同源性达到9 1 ，证明该d n a 片段确为黑曲霉b g l l 基因( g e n b a n k 基因序列号为 d q 2 2 0 3 0 4 ) 。分析发现该基因含有a6 3 9 个，t6 8 8 个，g8 4 1 个，c7 8 0 个，g + c 含量为 5 4 9 9 ，在4 5 5 2 2 6 1 b p 间序列同源性较高( 最高可达9 7 ) 。该基因由七个外显子和 六个内含子组成，六个内含子分别位于5 8 1 5 3 b p 、2 9 7 3 4 7 b p 、3 9 3 - 4 4 5 b 口、4 9 9 5 4 9 b p 、 1 7 4 2 1 8 0 4 b p 、2 6 6 4 2 7 1 4 b p 处。 依据目的基因序列对七个外显子进行拼接后得到e d n a 序列，利用相关分析软件分 析发现e d n a 大小为2 5 8 3 b p ，其中a5 4 1 个，t5 7 9 个，g7 5 8 个，c7 0 5 个，g + c 含 量为5 6 6 4 。与g e n b a n k 已公布黑曲霉b g l l 基因( a j l 3 2 3 8 6 ) 的外显子进行比较，结 果表明核营酸序列同源性达到9 3 6 。该e d n a 序列在1 0 1 2 1 1 0 1 b p 的同源性相对最 高( 可达1 0 0 ) ，保守性最好，推测该区域可能为黑曲霉b e t l 基因的主要功能区。 通过核苷酸和氨基酸序列分析可知：该基因可编码一个8 6 0 个氨基酸的蛋白质 - b g l l ，其信号肽序列是n 端前2 0 位氨基酸残基，此蛋白质属于糖萤酶家族3 ，它的 亲核反应的催化中心a s p 2 6 1 区完全保守。 关键词：黑曲霉；1 3 葡萄糖苷酶；p c r ；基因克隆：序列分析 0 一g l u c o s i d a s e r b 9 1 ) i sa ni m p o r t a n tc o m p o n e n to ft h ec e l l u l o s es y s t e m 0 一g l u c o s i d a s e c a nh y d r o l y z ec e l t o b i o s ea n dd e g r a d et h ec e l l u l o s ec o m p l e t e l y b yc o m p a r i n ga s p e r g i l l u s n i g e r 3 3 5 0 、i t ht r i c h o d e r m av i r i d e 3 3 7 4 4 t h e r e s u l ti n d i c a t e dt h a ta n i g e r3 3 5 0w a s s u p e r i o rt ot r i c h o d e r m av i r i d e 3 3 7 4 4o nt h ea c t i v i t yo f 母一g l u e o s i d a s e f o u rd n ap r e p a r a t i o nm e t h o d sw e r es t u d i e dt oe x t r a c tt h eg e n o m i cd n af r o m a s p e r g i l l u sn i g e r ，t h e yw e r ec t a bm e t h o d ，s i m p l i f i e dc t a bm e t h o d ，c h l o r i n a t i o nb e n z y l m e t h o da n dr a p i dd n ae x t r a c t i o nm e t h o d t h ed n ae x t r a c t e dw i t ht h ef o u rm e t h o d sw a s e v a l u a t e dw i t hg e le l e c t r o p h o r e s i sa n dp c r t h er e s u l to fp c rs h o w e dt h ed n ae x t r a c t e d w i t hc t a bm e t h o da n ds i m p l ec t a bm e t h o dw a ss u i t a b l ef o rp c r t a k i n gp c r t e m p l a t e q u a l i t ya sap r e m i s e ，t h ee x p e r i m e n t a t i o no p t i m i z e ds i m p l ec t a bm e t h o d ，t h u sd i s t i n c t l y r e d u c e de x p e r i m e n t sd a n g er a c c o r d i n gt ot h eg e n es e q u e n c eo f1 5 一g i u c o s i d a s eo fa s p e r g i l l u sn i g e r ( a j l 3 2 3 8 6 ， 3 8 8 5 b p ) i nt h eg c n b a n k ，ap a i ro fs p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e d w i t hg e n o m i cd n ao f a s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0a sat e m p l a t e ，ad n af i a g m e n t ( 3 0 k b ) w a sa m p l i f i e db yp o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ( p c r ) a n dc l o n e d t h er e s u l to f s e q u e n c i n gs h o w e dt h a tl e n g t ho f t h es e q u e n c e w a s2 9 4 8 b p ；i t sh o m o l o g yc o u l dr e a c h9 1 o fn u c l e i ca c i dc o m p a r e d 、i t ht h es e q u e n c eo f t h et e m p l a t e t h es e q u e n c ew a sc o m p o s e do fs e v e n e x o n sa n ds i xi n t r o n s g e n b a n kg e n e a c c e s s i o nd q 2 2 0 3 0 4a n dp r o t e i na c c e s s i o na b b 2 9 2 8 5 s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r e g i o no f t h eb e s th o m e o l o g yi s4 5 5 2 2 6 1 b p e d n as e q u e n c ew a so b t a i n e db ys p l i c i n ge x o n so f b g l lg e n e t h e a n a l y s i ss h o w e dt h a t l e n g t ho ft h es e q u e n c ew a s2 5 8 3 b p ；i t sh o m o l o g yc o u l dr e a c h9 3 6 o fn u c l e i ca c i db y c o m p a r i n gi tw i t 】1t h e s ee x o n so f a j l 3 2 3 8 6g e n es e q u e n c e t h er e s u l to f t h es e q u e n c ea n a l y s i s o f e d n a ，s h o w e dt h a tt h er e g i o no f t h eb e s th o m e o l o g yi s1 0 1 2 - 11 0 1 b p t h ea n a l y s i so fa m i n oa c i da n dg e n ei n d i c a t e dt h a tt h eg e n e s e q u e n c ee n c o d e da p r o t e i n b g l ic o n t a i n i n g8 6 0a m i n oa c i d t h ep o s i t i o no f i t ss i g n a lp e p t i d a s ew a st h ef i r s t2 0 a m i n oa c i do f n - t e r m i n a l t h eb g l lb e l o n g e dt ot h ef a m i l y3g l y c o s i d a s eb e c a u s ec a t a l y t i c c e n t e ro f i t sn u c l e o p h i l i cr e a c t i o n - a s p 2 6 1r e g i o nh a d v e r yg o o dc o n s e r v a t i s m ，w h i c hw a st h e c o m m o n a l i t yo ff a m i l y3g l y c o s i d a s e k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e r ；1 5 - g l u c o s i d a s e ；p c r ；g e n ec l o n i n g ；s e q u e n c ea n a l y s i s i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谓十的地方外， 论文中不包括其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得河 南工业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 论文作者签名： f 奎垒聋 日期： 遍：皇：型 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南工业大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；本 人授权河南工业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数 据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：园垒墨日期： 导师签名：銎兰丞日期： 逝：k 鼍 矽形、g 2 口 黑曲霉b 一葡萄糖苷酶的基因克睦 第一章前言 1 1 研究黑曲霉b 一葡萄糖苷酶的目的和意义 随着世界人口的迅猛增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境 污染等社会问题日益严重。寻找并开发新的能源、节省粮食、减少环境污染显得越来越 重要，并己引起世界许多国家的重视。 纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生资源。据 报道，全球每年通过光合作用可以获得新的纤维素约4 0 1 0 ”吨，约占地球生物资源 总量的4 0 ，相当于每人每天1 8 4 千克，然而，目前大约8 0 未被开发利用，如此丰 富的纤维素资源怎样得到充分的利用，将会成为在一定程度上解决上述社会问题的一种 非常有效的办法，因而也具有极为诱人的开发前景1 2 1 。 从商效和环保的角度出发，纤维素被彻底降解而不会对环境造成污染的一条有效途 径便是利用纤维素酶的水解作用，它可使大量纤维素资源和城市纤维素废料转变成人类 所需的物质，具有积极的深远意义。到目前为止，纤维素酶已广泛应用于工、农、畜、 医等领域中，并取得了初步成效。 我国对纤维素酶的研究虽然有几十年的历史，但由于纤维素酶的酶系组成相当复 杂，活性不高，生产成本过高而导致其应用仍受到限制。因此选育高活性的纤维素酶是 我国酶制剂研究的一项重要任务 3 1 。尽快采用各静行之有效的高新技术，发展具有中国 自己知识产权的新酶种、新产品、新剂型，满足市场的需求，是当务之急。 目前关于纤维素酶生产菌株的研究，绝大部分集中于纤维素酶系齐全且酶活力较高 的木霉如绿色木霉( t r i c h o d e r m av i r i d e ) 和里氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e o 等菌株上，但木 霉菌发酵产物中存在多种真菌毒素，有毒性嫌疑；另一方面b 葡萄糖苷酶( b g l ) 活 力很低，致使纤维二糖在反应体系中积累，最终影响酶解效率，因而其应用范围受到限 制。黑曲霉不产生毒素，是公认的安全微生物。在产纤维素酶的真菌中，黑曲霉所产纤 维素酶系中以内切葡聚糖酶和1 3 一葡萄糖苷酶的活力较高，特别是1 3 葡萄糖苷酶的活力 较一般菌株高。所以对黑曲霉纤维素酶的研究主要集中于b 葡萄糖苷酶方面。 在纤维素酶水解纤维素的过程中，b 葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖从而释放出葡 萄糖成为关键的一步，其中主要有这样几个问题：首先b 葡萄糖苷酶活性受水解产物 葡萄糖的抑制，而纤维二糖又是纤维素酶系中其他酶的抑制剂，从而整个纤维素的水解 过程受到抑制；其次在产纤维素酶的菌株中，b 葡萄糖苷酶含量几乎都很低( 除黑曲 霉外) ，如木霉分泌的纤维素酶中b 葡萄糖苷酶含量还不到l ，远达不到实际应用的 水平；再次在反应过程中，由于热抑制作用，大量的b 一葡萄糖苷酶活性消失。由于b 河南工业大学硕士学位论文 葡萄糖苷酶在纤维素酶降解纤维素糖化过程中的瓶颈，纤维素酶水解纤维素会产生大量 的纤维二糖和寡糖的积累。 黑曲霉0 葡萄糖苷酶具有非常重要的生物技术作用和非常显著的工业效益，不仅 在作为纤维素降解系统的组成方面，而且因其安全性在食品、医药等领域中也将会有更 好的发展前景。 1 2b 葡萄糖苷酶概述 p 一葡萄糖苷酶的研究可追溯到1 8 3 7 年，l i e b i g 和w o h l e r 首次在苦杏仁汁中发现了 该酶i 叭。在所有已经发现的微生物中，黑曲霉是产b 一葡萄糖苷酶效率最高的菌种。 1 2 1 自然界中的b 葡萄糖苷酶 p 一葡萄糖苷酶( b g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ) ，属于纤维素酶系，是能催化水解芳基 或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶，其来源不同底物特异性也不同。b 一葡萄糖苷酶几乎存在于自然界所有的生物体中，因其来源不同而性质各异，在人类的 糖原降解和动物、植物、微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。 1 2 2 b - 葡萄糖苷酶的酶族分类 根据氨基酸序列分类，人们将b 葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族1 和3 中。家 族1 中的b 一葡萄糖苷酶来自于细菌、植物中：家族3 中的酶来自于真菌、细菌和植物 中。家族1 中的酶除有葡萄糖苷酶活性外，还有很强的半乳糖苷酶活性【5 1 。 根据高级结构的相似性，糖苷酶家族可被分为若干部族( c l a n ) ，糖苷水解酶家族1 属于“c l a ng h a ”( s u p e r f a m i l y4 7 ) ，其特点是催化结构域具有( b o l ) r 桶状结构， 两个羧基氨基酸参与催化反应，作为质子供体和亲核基团，分别位于第四位和第七位的 1 5 一折叠上吼。 m o r a c c i 等通过比较11 种糖苷酶族1 的酶氨基酸序列发现n e p 和y - i t - e n 两个 保守序列，并用定点突变的方法证明此保守序列中的两个g l u 分别是酸，碱基团和亲核基 团。也有试验通过自身底物共价修饰和定点突变试验证明这结论 7 , e l 。 i 2 3 酶解特征 黑曲霉$ 一葡萄糖营酶主要催化水解含有b d 葡萄糖苷键的化合物，使非还原性1 3 一d - 葡萄糖残基及其末端断裂，同时释放出b d 葡萄糖和相应的配基。在纤维索的糖化 作用中，b 一葡萄糖苷酶的功能是将天然底物中的纤维二糖和纤维素寡糖水解为葡萄糖。 黑曲霉8 一葡萄糖蒂酶可7 k 懈， t 台啦的戽物苴审除了可以强烈水懈对硝粜繁一r n 。 黑曲霉昏一葡萄糖昔酶的基因克隆 葡萄糖苷外，还能微弱水解对硝基苯b d 木糖苷和对硝基苯b - d 一半乳糖苷。 1 2 4 酶学性质 0 一葡萄糖苷酶有脆内酶和胞外酶之分，有些生物体内只含有胞内8 一葡萄糖菅酶， 也有些只含有胞外b 葡萄糖苷酶。但也有少数微生物体内同时含有胞内和胞外1 3 葡萄 糖苷酶。研究结果表明，黑曲霉1 3 一葡萄糖苷酶的来源菌株不同，酶学性质也有很大的 差异。目前对黑曲霉各菌群b ，葡萄糖苷酶的酶学性质研究主要体现在以下几个方面： 1 2 ，4 ，1 酶蛋白的分子量 王沁等从黑曲霉w 2 5 菌株发酵液中分离提纯该酶共得到4 种酶组分( i 一1 a 、l 一1 b 、 i 1 c 、i i i - b ) ，经s d s p a g e 凝胶电泳鉴定均为单一带，且其亚基分子量分别为7 7 0 0 0 、 6 7 0 0 0 、7 3 0 0 0 、4 3 0 0 0 9 1 i 黑曲霉a s p e r g i l l u sn i g e rvt i e g h 中黑曲霉蚤葡萄糖苷酶的分 子量约为1 2 0 0 0 0 ，该酶可能是单体酶f 1 0 1 。 1 2 4 2 化学组成 黑曲霉纤维素酶系各组分均为糖蛋白，黑曲霉w 1 5 的0 葡萄糖苷酶( b g l ) 含糖 量为1 1 | 3 ，有甘露糖( 1 5 5 ) 、葡萄糖( 4 0 9 ) 、半乳糖( 4 3 6 ) 三种组分，均含 有较多的酸性氨基酸( a s p 、g l u ) ，碱性氨基酸( h i s 、a r g ) 含量较低【1 ；黑曲霉a s p e r g i l l u s n i g e rv n e g h 中该酶含有较多的g l u 、l e u 、v a l 等酸性氨基酸，p r o 、c y s 含量较少1 0 1 。 1 2 4 3 最适酶活温度 5 0 7 0 c ，其最适温度与热稳定性温度均高于其它一些真菌和细菌。 1 2 4 4p h 值 黑趣霉w 2 5 中b - 葡萄糖昔酶的4 个组分的等电点分剐在4 , 0 6 ，0 之间，其最适p h 为5 0 5 5 ，当p n 值在2 o 7 o 范围内时该酶的催化活性变化不大唧：黑曲霉a * p e r g i l l u s n i g e rv m e g h 的最适p h 值为4 0 4 5 t 嘲。因此黑曲霉中1 3 葡萄糖苷酶的酸耐受性强， 适宜于酸性介质中应用，如果汁、果酒等果汁品。 1 2 4 5 底物特异性 黑曲霉0 - 葡萄糖苷酶对底物糖基配体部分的结构专一性较差，能裂解c o 糖苷键、 c - s 键、c - n 键、c f 键等；对糖基部分的c 4 和c 2 构型也不专一，能同时水解8 葡萄 糖苷键和b 一半乳糖营键，而且对c 6 位的专一性也不高，能微弱水解木糖。但在所有底 物中该酶对纤维二糖的水解活性最强 1 2 , 1 3 1 。 河南工业大学硕士学位论文 1 2 4 ，6 酶的抑制和激活 k e m p t o n 等人研究发现a g r o b a c t e r i u mb g l 的一系列有机物抑制剂都与底物和过渡 态结构相似，并且所有的抑制剂直接与底物竞争。有相似的过渡态结构即意味着带有相 同的正电荷和相似的半椅状结构，这些抑制剂能与酶结合的更为紧密。对黑曲霉0 葡 萄糖苷酶抑制剂的相关研究结果表明6 一葡萄糖酸内酯和d 一葡萄糖对浚酶有强烈的 竞争性抑制作用，k i 值分别为1 3 1m m o l l 和5 1 7 m m o l l 。b i r k 【5 4 】等化学合成了异丙基 一1 一硫b - d 一葡萄糖吡喃糖苷( i p t g l c ) ，在黑曲霉培养2 4 小时后加入该化合物，可使b 一葡萄糖苷酶提前3 - 4 天分泌，但当培养基中加入1 葡萄糖时，可阻遏1 3 葡萄糖苷酶的 分泌，使其降低到不可检测的水平，可见葡萄糖对菌株产b 葡萄糖苷酶具有阻遏作用。 纤维二糖、d 一半乳糖等多种碳水化台物对该酶无明显影响，h g ”、a g + 和c u 2 + 在浓度 为l m m o l l 时即表现明显的抑制作用，l m m o l l 的s n 2 + 、l m m o l l 的f e 2 + 、1 m m o l l 的 e d t a 、1 0 m m o l l 的s d s 和1 5m m o l l 的脲也对黑曲霉8 葡萄糖苷酶有一定的抑制作 用。k 十、m n 2 + 、c 0 2 + 在浓度为1 m m o l l 时对该酶有较强的激活作用 1 2 , 1 4 , 15 j 。 l t 2 4 7 动力学参数 黑曲霉w 1 51 3 - 葡萄糖苷酶水解对硝基苯一6 - d 一葡萄糖苷、水杨苷和纤维二糖的 k n l 值分别为2 3 2 、1 9 1 1 和3 0 1 8 m m o l l ，v m a x 值则分别为4 1 2 1 1 m o l m i n m g 、2 3 7u m o l m i n m g 和19 8um o l m i n m g 15 1 。 1 2 5 催化反应机制 1 2 , t 6 , 1 7 1 该酶在催化糖苷键的裂解反应时遵循保留型的酸催化双置换机制( d o u b l e d i s p l a c e m e n tm e c h a n i s m ) ，其中有两个关键的活性部位氨基酸参与：质子供体( p r o t o n d o n o r ) 和亲核基团( n u c l e o p h i l e ) ，它们一般是带羧基侧链氨基酸( a s p 或g l u ) ，位于 糖苷键的氧原子的氢键距离内。其反应方程式如公式( 1 - 1 ) ： e + s 皇e s 兰e _ s 旦e p+ ；圭oe soe p k l 第一步是酶与底物键合形成米氏复合物e s ( 反应速率常数分别为k l 和k 1 ) ： 第二步是酶一底物中间体( e - - s ) 的形成( 反应速率常数为k 2 ) ：酶的一个羧基( 亲 核基团) 攻击底物的端基异构体的中心部位，而另一个羧基( 酸、碱催化剂) 则使糖苷 中的氧质子化，因此可辅助苷元的脱离从而形成a 构像的共价1 3 糖基酶中间体( e - - s ) 。在此过程中，b g l 的活性中心可根据不同类型的底物而相应的发生一定程度的结 构变化r 从而使b g l 可以和多种糖类底物结合，这一步决定了b g l 具有的底物专一性： 黑曲霉日一葡萄糖苷酶的基凼克隆 第三步是中间体的水解，由水按碱催化机制对端基异构体进攻，形成t 3 - 糖基产物 并使酶恢复其初始的质子化态。b g l 在整个反应过程中其构型保持不变。 1 2 61 3 葡萄糖苷酶的结构及其功能 通过x 射线晶体衍生法分析：糖苷水解酶家族1 的典型结构具有8 个( o 0 ) 结 构围成的桶状结构，也被称为4 7 超家族。糖苷水解酶家族3 有a 区和b 区两个域构成， b 区包括s d w 序列，内有活性位点a s p 残基。在分子水平上，水解酶家族3 的编码基 因由5 个典型的区域构成：n 端区、n 端催化区、非同源区、c 端未知功能区、c 端残 基【1 8 l 。 人们通过动力学标记、序列分析、对特殊氨基酸进行化学修饰、点突变等方法研究 该酶催化底物水解的分子机制，发现b 一葡萄糖苷酶中起催化作用的残基是两个谷氨酸 残基。其中，靠近n 一端的谷氨酸起酸碱作用，另一个氨基酸起亲核试剂的作用。它们 都含有酸性氨基酸a s p 和g l u 。家族l 中的b 葡萄糖苷酶属于4 7 超家族成员，在其b 折叠结构中的c 端第4 位和第7 位都是g i u 残基。而在家族3 的成员中，则发现a s p 为保守氨基酸。高度保守的c 一端附近的残基也许参与了酶与糖苷基底物的键合，其中 在该区的一些微小差异与不同1 3 葡萄糖苷酶的底物特异性有关【1 6 1 。 d a n 等【”j 通过用2 一脱氧- - 2 - - 氟基一b - - d - - 糖基氟化物对该酶活性部位亲核体鉴 定发现：b g l l 氨基酸序列排布中天冬氨酸- - 2 6 1 完全保守，此完全保守性与催化亲核 体的关键作用完全一致。除了可形成共价糖基化酶中间体和稳定氧化卡宾体的类离子过 渡态外，亲核体还可调节酸碱催化碱基的电离状态，并且过渡态时还在糖状物的2 一羟 基位置上形成很强的氢键。 1 2 7 生理学功能 该酶参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要的作用。哺乳动 物和人体内的乳糖酶根皮苷( l p h ) 水解酶也含有一种芳基b 葡萄苷酶，l p h 因其涉 及成人型乳糖酶缺乏病一一种常见的人体基因紊乱病而被广泛研究。 b 一葡萄糖苷酶可以分解葡萄糖苷酶一n 一脂酰鞘氨醇，因此，若人体缺乏该酶会导 致葡萄糖苷酶- - n - - j 目酰鞘氨醇在巨噬细胞溶菌酶体内积累，引起戈谢病( g a u c h e r d i s e a s e ) ，其特征是骨髓内有戈谢细胞，以及脾、肝肿大，骨畸形等。一直以来，人们 认为b g l 参与微生物糖代谢的非磷酸途径，人们研究还发现它其实参与的是e m p 糖酵 解途径，是参与双歧杆菌糖代谢的有关酶系之一【2 0 i 。 1 3 b 葡萄糖苷酶的分子生物学概述 河南工业大学硕士学位论文 1 3 1b 葡萄糖苷酶基因的克隆 对b 葡萄糖苷酶基因方面的研究已有较长历史，到目前为止，已有上百个微生物 1 3 葡萄糖苷酶基因已得到克隆。早期0 一葡萄糖苷酶基因的克隆是通过构建总d n a 文 库进行活性筛选的方式获得的，随着p c r 技术的应用，利用种属相似性扩增克隆得到 许多b 一葡萄糖苷酶基因。随着基因组学的发展，越来越多的微生物基因组全序列被测 定，通过序列筛查定位分析出可能的1 3 一葡萄糖苷酶基因，是获得b 一葡萄糖苷酶新基因 的有效手段。 p 一葡萄糖苷酶可与许多底物作用并显色，且方法简便灵活性较高，使得筛选工作 很方便。目前在平板上筛选重组转化子大致有三种方法：( 1 ) 在x _ g a i ( 5 一b r o m o - 4 - e h l o r o - 3 一i n d o lg l u e o p y r a n o s i d e ) 平板上筛选，当p 一葡萄糖苷酶与x g a l 作 用时，可水解底物释放出5 - b r o m o - 4 c h l o r o 3 i n d o l ，显蓝斑；( 2 ) 用m u g ( 4 m e t h y l u m b e l l i f e r y l1 3 一d g l u c o p y r a n o s i d e ) 筛选，酶液可水解m u g 释放出4 - m e t h y lu m b e l l i f e r y l ， 它可在紫外灯显荧光；( 3 ) 用p s p g ( p - n i t r o p h e n y lb d g l u e o p y r a n o s i d e ) 筛选，酶与底 物作用时，水解底物释放出p n i t r o p h e n y l 显黄色。 近年来，对于b 葡萄糖苷酶的高效表达普遍采用的是大肠杆菌和芽孢杆菌表达系 统。重组表达的酶活量可达野生型菌株的几十倍至上百倍【2 1 1 。 1 3 2 b - 葡萄糖苷酶基因的表达调控 微生物1 3 - 葡萄糖苷酶的产生是一个复杂的调控过程，不同的培养条件对微生物产 酶具有非常大的影响。近年来，人们试图从分子水平上探明1 3 葡萄糖苷酶的诱导机制， 但目前仍有很多问题没有解决。所面临的困难在于d 葡萄糖苷酶诱导的复杂性，很多 因素都可能在1 3 一葡萄糖苷酶产生的过程中起作用。同时，产1 5 葡萄糖苷酶的微生物千 差万别，很难找到一种普遍的机制。目前通常采用的方法是建立各种突变体，并利用体 外转录、d n a 足迹法、凝胶滞留及双杂交技术等寻找顺式作用元件和反式作用因子， 研究其相关功能。 丝状真菌由于能大量产生胞外水解酶因而其表达调控在近些年得到了广泛的重视， 取得了很多进展。许多编码蛋白水解酶基因的顺式作用元件和反式作用因子有了深入的 研究1 2 2 1 。 1 3 3b 葡萄糖苷酶基因的重组表达与改造 b - 葡萄糖苷酶基因重组表达是当前1 3 一葡萄糖苷酶研究的热点之一，早期研究多在 大肠杆菌中表达，这种以克隆为目的的重组表达一般采用自身的启动子，不能获得高效 争过- 多数重组蓖产酶活力不如原始菌林 随着表达系统的发展与完善，b 。葡萄糖苻 黑曲霉母一葡萄糖管酶的基因克隆 酶己在大肠杆菌和酵母中得到高效表达。近年来，在芽孢杆菌、丝状真菌以及植物中都 有术聚糖酶重组表达的报道，研究表明：采用同源或近源表达常可以获得很高的表达活 力。 大多数天然1 5 葡萄糖苷酶的产量较低，而且催化特性也往往不能满足工业生产的 需求，因此对酶分子进行改造有十分重要的意义。点突变技术已被广泛应用于b 一葡萄 糖菅酶的分子改造，这一技术尤其适用于那些已经知道其酶学性质的酶。 酶分子的体外定向进化属于酶分子的非合理设计，它不需事先了解酶分子的空间结 构和催化机制，而是人为的创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制( 随机突变、基因 重组和自然选择) ，在体外改造酶基因，并定向筛选出具备所需性质的突变酶。近些年 新兴的体外分子直接进化技术( e r r o rp h o n ep c r & d n as h u f f l i n g ) 也被广泛用于b 葡萄 糖苷酶的研究，这不仅因为b 葡萄糖苷酶是一种重要的工业用酶，在生物质的转化中 有重要的作用，而且b 葡萄糖苷酶的很多特性也非常适合于分子进化工作的研究。尤 其是属于糖苷水解酶家族1 的b 葡萄糖苷酶，这类葡萄糖苷酶大都来自于细菌，基 因较小，翻译后无糖基化修饰，很多酶的晶体结构、催化活性中心都已知道。这一家族 的b 葡萄糖苷酶大都可以很好的在大肠杆菌中进行表达。 由于b 葡萄糖苷酶的转糖苷作用有着重要的生物学作用，近年来也有许多工作致 力于改善且葡萄糖苷酶的转糖苷作用。通过体外分子进行技术也可大大改善1 3 一葡萄糖 苷酶在生物寡糖合成中的稳定性和催化效率【2 3 1 。 1 4 国内外的研究进展 1 4 1 - 葡萄糖苷酶基因的研究进展 b 葡萄糖苷酶基因现已从燕麦、蜀黍、旱金莲、长春花、黑檀等植物中进行了克隆 和表达。 但更早对9 葡萄糖苷酶基因克隆与表达的研究是在微生物体中。m i s a w a nn ， n a k a m u r ak 1 2 4 1 子1 9 8 9 年对瘤胃球菌蛋白b 葡萄糖苷酶基因在z m o b i l i s 中的表达和稳 定性进行了研究。g r a b n i t zf ，s e i s sm ，r u e k n a g e lk a r lp 等【2 5 1 对芽孢梭菌b 葡萄糖苷 酶基因结构的序列分析，表明纤维素酶和包括人体乳糖酶的1 3 葡萄糖苷酶形成了一个 超基因簇。g o n z a l e z c a n d e l a sl ，r a m o nd ，p o l a i n a lj 【2 6 1 研究认为，从芽孢杆菌分离出 的两个编码b 葡萄糖苷酶基因序列和同源性分析，已知确定了从芽孢杆菌中分离出的 编码b 一葡萄糖苷酶的两个基因b g l a 和b g l b 的核苷酸序列。这两个基因包含1 3 4 4 b p 的编码区。这两个编码区分别与5 1 6 4 3 和5 1 5 4 7 的m r s 的多肽有关。其所使用的编码子 的型式表明：两个基因均以低频率表达。以前的研究资料暗示：由b 9 1 a 和h 9 1 b 编码的堡 河南工业犬学硕士学位论文 白质分别是胞内酶和胞外酶，然而这两种推断的氨基酸序列没有一个具有与典型的引导 肽有关的n 末端。由b g l a 和b g l b 编码的蛋白质彼此之间有显著的同源性，而且与b g l 和bg a l 也有显著的同源性。山东大学邹文1 2 7 】等以黄单胞菌x a 5 5 为供体菌，广泛寄 主质粒p r k 4 0 4 为载体，在大肠杆菌中克隆了一个b 葡萄糖营酶基因，重组质粒p l z s l 接合导入黄单胞菌x a 5 5 ，得到了克隆子x a 5 5 ( p l z s l ) 。结果表明，所克隆的基因编 码的产物对于水杨苷底物有较强的亲和力，并可以在一定程度上降低x a 5 5 中酶与 p n p g 底物的亲和力，使其酶活减小。s a i l p a a v i l a i n e n 等【2 8 1 对杆状细菌b 一葡萄糖萤酶的 纯化、特性、基因克隆和序列进行了研究表明，该基因在e c o l i 中克隆，基因组成的开 放阅读框有13 5 0 b p 编码、蛋白质有4 5 0 个氨基酸，该酶显示5 个细菌中同源性从4 5 到6 0 。其中还有2 个3 5 和一1 0 区域，并有倒置重复序列，有3 处s p hi 和1 处h i n d i i i 的酶切位点。核糖体的结合位点为g a a a g g a g ，位于上游的1 2 b p 有a t g 甲硫氨 酸起始密码，b g l a 基因的g + c 是5 3 9 。 1 9 9 9 年v a r g h e s e , i n 等1 2 9 】分离得n - f 大麦1 3 葡萄糖苷酶分子的三维结构，表明该酶 是由6 0 5 个氨基酸组成的，含有两个结构域和三个糖基化位点的蛋白。n 端3 5 7 个残基 构成( n ，b ) 8 桶状折叠，内含具有亲核功能的保守性残基：第二个结构域由第3 7 4 5 5 9 个氨基酸残基构成的1 3 - 三明治结构，由一条反向t 3 折叠片和五条正向b 折叠片构 成，而每一1 3 一折叠片一遍有三个a - 螺旋。在这两个结构域的交界处的口袋结构里可看 到有半个葡萄糖分子和催化反应所必需的a s p 2 8 5 和g l u 4 9 1 两个残基。因此作者认为这 个交界处可能有该分子的活性位点，而且活性是通过其空间位置进行调节的；另一方面 也提出第二个结构域可能是糖的结构位点。 1 4 2 黑曲霉b - 葡萄糖苷酶的研究进展 黑曲霉是到目前为止最高效率的b 葡萄糖苷酶的产生菌：1 9 7 7 年，s t e r n b e r g 等【3 0 1 为了解决木霉中的b - 葡萄糖营酶水解效率低下，将黑曲霉中的p 葡萄糖苷酶加到木霉 的纤维素酶制剂中，发现水解活力显著提高，并提出该协同作用的机制是由于b 葡萄 糖苷酶解除了纤维= 糖对木霉中纤维素酶的抑制。随后b 葡萄糖苷酶便广受关注。1 9 8 0 年，j o n e s 和k o s m a n l 3 l 】从黑曲霉中纯化了一个1 3 葡萄糖苷酶并利用各种不同的底物和 结构类似物以及动力学参数详细的研究了该酶的作用机制。随后a d i k a n e 等f 3 2 】于1 9 8 5 年、w a t a n a b e 等于1 9 9 2 年、h i m m e l 等p 4 1 于1 9 9 3 年、y a n 等【3 5 1 、r a s h i d 等 3 6 1 、g a l a s 等于19 9 7 年、j o h a n s s o n 等1 3 8 1 于1 9 9 8 年以及a b d e l n a b y 等1 3 9 1 于19 9 9 年分别从黑曲 霉中纯化得到不同的b 一葡萄糖苷酶组分。虽然纯化了这么多的0 葡萄糖苷酶，但是它 们的分子量、等电点以及酶学性质却不尽相同。 黑曲霉1 3 一葡萄糖苷酶的基因克旌 1 9 9 6 年，r a s h i d 等f 4 0 】利用分隔电泳技术( c o m p a r t m e n t a le l e e t r o p h o r e s i s ) 去除非共 价结合在b 葡萄糖苷酶上的多糖，以研究该多糖的作用，发现去除后该酶失去了对蛋 白酶、尿素的抵抗作用，并且热稳定性大大下降，说明这些多糖对1 3 - 葡萄糖苷酶具有 保护作用。 2 0 0 0 年，d e c k e r 等分离了五种黑曲霉中的1 1 种1 3 葡萄糖苷酶，其中7 种达到电 泳纯度，对它们的性质进行了研究，将1 3 葡萄糖苷酶分为4 类：i a 、i b 、i i 和i ， 其中大部分普通酶属于i a 和1 b ，小部分属于i i 和i i i ，后两种分别是耐酸和耐葡萄 糖的酶。 2 0 0 0 年，s i e g e ld a n 等又从黑曲霉中纯化了一个t 3 葡萄糖苷酶，测定其n 一末 端氨基酸序列后利用简并引物克隆了该酶的基因，并利用p y e a u r a 3y e a s t l e s c h e r i c h i a c o l i 穿梭载体构建了基因组文库。同时利用p c r 技术扩增得到了该酶的c d n a ，利用合 成的c d n a 探针从基因组文库中调得该酶基因，对该基因及e d n a 进行序列测定与分析 比较，证明该基因含有7 个外显子、6 个内含子，编码天然蛋白质的d n a 前导序列被 一个由8 2 b p 的内含予隔开，e d n a 序列中的开放式阅读框可编码分子量为9 2 ，0 0 0 d a 的 多肽。该酶属于糖菅酶家族3 ，并对其催化的分子机制进行了研究，发现其第2 6 1 位天 门冬氨酸是亲核反应的催化中心。同时他们还将该基因在巴斯德毕氏酵母中进行了过量 表达。到目前为止，在g e n b a n k 、s w i s s p r o t 和d d j b 数据库中已有两个得到克隆的 黑曲霉1 3 葡萄糖苷酶基因的序列，分别是b g l l 和b g l 2 ，以及一个b 葡萄糖苷酶基因类 似序列。 1 51 3 葡萄糖苷酶的应用 b 葡萄糖苷酶已被应用于人类生活的许多方面，包括食品、造酒、医药、化学工 业以及粮食加工等。 1 5 1 生产低聚龙胆糖 目前，工业上对b g l 的主要应用是生产低聚龙胆糖。低聚龙胆糖是龙胆二糖、三 糖、四糖的混合物，生产过程中将高浓度的葡萄糖液用霉菌生产的b g l 在较高温度下 作用，使葡萄糖发生转移反应和缩台反应来酶法合成低聚龙胆糖。该糖比麦芽糖浆具有 更高的吸水性和较低的粘度，可预防食品中的淀粉老化和保持食品中的水分；不易为人 体消化酶所消化，为低热值低聚糖对双歧杆菌具有较强的增值作用；具有轻微的苦味， 特别适合于咖啡制品和巧克力制品中应用，具有增味或味觉改良作用。目前我国低聚龙 胆糖的产量仍很小，而国外生产龙胆低聚糖的唯一一家公司是n i h o ns h o k u h i nk a k o ，其 商品为“g i n t o s e ”，年产量只有3 0 0 4 0 0 吨1 4 “1 河南工业大学硕：亡学位论文 1 5 2 作为风味酶 茶叶、水果、蔬菜中的芳香成分不仅以游离态形式存在，而且有相当一部分是以风 味前体物b 糖苷( 单萜烯基一1 3 ，d 葡萄糖苷) 的形式存在，b g l 与其它风味酶协同 作用于该酶前体物释放出挥发性糖苷配基，起到增香作用从而提高果汁品天然风味。如 李平等i 研究发现黑曲霉b 一葡萄糖苷酶对苹果汁、柠檬汁、茶汁的增香效果良好；宛晓 春1 4 5 】发现黑曲霉m 8 3 3 3 2 5 中该酶对葡萄酒、山楂酒的增香效果均比市场上的商业化酶 优越，特别是对山楂酒效果更明显。s h o s e y o v 等人( 1 9 9 0 年) 报道分离到一株产内切 b 葡萄糖苷酶黑曲霉，用该酶来处理玫瑰红葡萄酒及西番莲果汁，通过g c m s 分析及 感官评定，结果表明：葡萄酒中的单