（环境科学专业论文）新型高效液相色谱固定相的制备与应用研究.pdf

云南师范人学硕士学位论文 2 0 0 5 摘要 本论文分为五个部分： 1 综述了纤维素类色谱固定相、全衍生化i s 一环糊精类色谱固定相的研究进展， 并简要介绍了分子印记技术和膜分离技术。 2 制备了纤维素- ( 3 ，5 一二甲基苯基氨基甲酸酯) 色谱柱，对包括醇类、羧酸类、 胺类、氨基酸类及药物类的1 8 种手性化合物进行了拆分，结果有1 5 种手性 化合物得到了分离。结果表明：该柱不仅有良好的手性拆分能力，而且有广 泛的适用性。 3 制备了醋酸纤维素柱，对包括醇类、羧酸类、胺类、氨基酸类及药物类的1 8 种手性化合物进行了拆分，结果有7 种手性化合物得到了分离。然后分别筛 选( + ) 二o ，o - 对甲苯甲酰基d - 酒石酸、( + ) 1 - 苯基1 ，2 一乙二醇和( + ) 一苯乙醇酸 三种手性化合物作为致孔剂，混合醋酸纤维素涂渍修饰硅胶，致孔剂由乙醇 洗脱，得到手性色谱柱，对包括醇类、羧酸类、胺类、氨基酸类及药物类的 1 8 种手性化合物进行了拆分。结果这些色谱柱除了能拆分各自致- f l n 的外消 旋体外，还能拆分结构类似的手性化合物。 4 制备了苯基氨基甲酸酯全衍生化i s 环糊精键合硅胶手性柱，对包括醇类、羧 酸类、胺类、氨基酸类及药物类的1 8 种手性化合物进行了拆分，结果有1 1 种手性化合物得到了分离，结果令人满意。 5 使用自制高效液相色谱柱：纤维素- ( 3 ，5 一二甲基苯基氨基甲酸酯) 和醋酸纤维 素色谱柱，分别对水源水中的芳香族含氮化合物、多环芳烃及其衍生物、芳 香族含卤化合物进行了分离。结果表明；自制柱有良好的分离能力，具有操 作简便、分析速度快等优点。 关键词：高效液相色谱，手性固定相，手性拆分，手性化合物，致孔剂，纤维素， 6 环糊精，芳香族化合物 3 云南师范人学硕士学位论文 a b s t r a c t 。i h et h e s i si n c l u d e sn v es e c t i o n s ： 1 t h ec e l l u l o s ea n dp e r d e r i v a t i v eb c y c l o d e x t r i nc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s ew a s r e v i e w e d t h em o l e c u l a ri m p r i n t i n ga n dm e m b r a n et e c h n o l o g yw a si n t r o d u c e d 2 c e l l u l o s et r i s ( 3 ，5 - d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t e ) ，w h i c hi st h eb e s tc h i r a ls t a t i o n a r y p h a s eo fp o l y s a c c h a r i d e ， w a ss y n t h e s i z e d i nt h en o r m a lp h a s eo f h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , e i g h t c e n c h i r a l c o m p o u n d s ，i n c l u d i n g a l c o h o l s ，a c i d s ，a m i n e s ，a m i n oa c i d sa n dd r u g s ，h a db e e nr e s o l v e do nt h i s c o l u m n o u r e x p e r i m e n t a l r e s u l t sa l s os h o wt h a tc e l l u l o s e t r i s ( 3 ，5 一d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t e ) s t a t i o n a r yp h a s ep o s s e s s e st h ee x c e l l e n tc h i r a l r e s o l u t i o na b i l i t y 3 c e l l u l o s et r i a c e t a t ew a sc o a t e do ns i l i c ag e la ss t a t i o n a r yp h a s ef o rh p l ca n dt h e p o r e s o fm e m b r a n ew e r ec r e a t e d b y c h i r a l a d d i t i v e ( + ) 一d i 一0 ，0 一p t o l u y l d t a r t a r r i ca c i d ， ( + ) - 1 - p h e n y l 1 ，2 e t h a n e d i o l a n d ( + ) 一l - m a n d e l i ca c i d ，r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t ss h o wt h a tt h o s es t a t i o n a r yp h a s e s n o to n l yc a ns e p a r a t ee x t e n s i v e l yr a c e m a t e s ，b u ta l s oc a nr e s o l v et h ec h i r a l a d d i t i v e t h i si sar e p o r t ，f o rt h ef i r s tt i m e ，t h a tt h ec h i r a la d d i t i v ew a su s e di n f o r m a t i o no fc h i r a ls t a t i o n a r yp h a s eo f o p t i c a l l ya c t i v ep o l y m e r 4 m o n o - 6 - e t h y l e n d i a m i n e - b - c y c l o d e x t r i n w a sc o u p l e dt os i l i c am o d i f i e d b y 3 - a m i n o p r o p y l t r i e t h o x y l s i l a n ev i at h es p a c e ro fc h l o r o m e t h y l o x i r a n e t h er e s t h y d r o x y l so f1 3 - c y c l o d e x t r i nw e r ed e r i v a t i z e db yp h e n y li s o c y a n a t e t h eb o n d e d s t a t i o n a r yp h a s ew a sa t t a i n e da n dp a c k e di n t oc o l u m n2 5 0m mx 4 6m mi d u n d e rt h ep r e s s u r eo f4 0i p a f i f t e e nc h i r a lc o m p o u n d s ，i n c l u d i n ga l c o h o l s ， a c i d s ，a m i n e s ，a m i n oa c i d sa n dd r a g s ，w e r er e s o l v e do nt h ec o l u m ni nt h en o r m a l p h a s eo fh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y a m o n gt h e1 8r a c e m a t e s ，1 1 c h i r a lc o m p o u n d sc o u l db es e p a r a t e do nt h ec o l u m n 5 s o m ea r o m a t i c c o m p o u n d s w e r e s e p a r a t e d o nt h ec e l l u l o s e t r i s ( 3 ，5 一d i m e t h y l p h e n y l c a r b a m a t e ) a n dc e l l u l o s et r i a c e t a t ec o l u m n s k e y w o r d s ：h p l c ，c h i r a ls t a t i o n a r yp h a s e ，c h i r a ls e p a r a t i o n ，c h i r a lc o m p o u n d s ， a d d i t i v e ，c e l l u l o s e ，b - c y c l o d e x t r i n ，a r o m a t i cc o m p o u n d s 4 云南师范大学硕士学位论文 2 0 0 5 第一章毒效液相色谱固定相研究 最早创立色谱的是俄国植物学家茨维特( t s w e e t ) ，他在研究植物叶的色素成 分时，将植物叶的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其 自然流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此 而得名。现今，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用。 2 0 世纪6 0 年代初，g i d d i n g s 理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础。6 0 年代未，现代液相色谱受到科学界的重视。此后，液相色谱也进入了一个快速发 展的时期。高效液相色谱仪的智能化、微型化，各种联用技术以及各种新型高效 和具有广泛适用性的色谱固定相等，都已成为现代色谱研究的热点。 1 1 纤维素类色谱固定相研究进展 纤维素在历史上是高分子化学诞生和发展时期的主要研究对象，纤维素的研 究成果为高分子学科的创立和发展作出了重要贡献。纤维素是天然的高分子化合 物，化学结构是由d 吡喃葡萄糖酐( 1 - 5 ) 彼此以8 ( 1 - 4 ) 糖苷键连接而成的线 形高分子，化学式为( c 6 h 1 0 0 5 ) 。，n 为聚合度。天然纤维素的平均聚合度很高， 如单球囊藻( 2 6 5 0 0 4 4 0 0 0 ) ，棉花纤维的次生壁( 1 3 0 0 0 - 1 4 0 0 0 ) ，a 纤维素( n 2 0 0 ) ， b 纤维素( n = 1 0 2 0 0 ) 和y 纤维素( n 上发表有关茶碱分子印迹聚合物的研 究报道i 叼后，分子印迹技术便成为国内外的研究热点。分子印迹技术( m o l e c u l a r i m p r i n t i n g ，m i v , 又称分子烙印) ，是指为获得在空间结构和结合位点上与某一 分子( 模板分子) 完全匹配的聚合物的实验制备技术。按照单体与模板分子结合 方式的不同，分子印迹技术可分为分子自组装( s e l f - a s s e m b l i n g ) 和分子预组织 ( p r e o r g a n i z a t i o n ) 。两者的主要区别在于单体与模板分子结合的机理不同。近年 来v u l f s o n t 4 8 1 等人又发展了一种称之为“牺牲空问法”( s a c r i f i c i a ls p a c e rm e t h o d ) 的分子印迹技术。该法实际上是把分子自组装和分子预组织两种方法结合起来形 1 0 云南师范大学顾十学位论文 2 0 0 5 成的方法。分子印迹聚合物的制备方法有沉淀聚合( 传统方法) 、原位聚合、乳 液聚合、悬浮聚合和表面印迹等。 分子印迹技术也广泛应用于色谱分析，手性分离是分子印迹技术取得较大进 展的领域1 5 0 j 。分子印迹手性固定相已成功分离氨基酸衍生物f 5 ”、氨基酸【5 2 j 、镇 静药苯二氮1 5 卦、氨基酸乙内酰脲【5 4 】等的对映体。也有人把手性固定相接到了分 离性能较好的膜上【5 5 巧7 1 ，或将分子印迹手性固定相用于c e c 5 8 】及t c l 5 9 1 中。此 外，分子印迹聚合物还用作固相萃取材料【6 0 删和传感器的敏感材料【6 3 删等。 1 3 。2 膜分离与致孔剂 从2 0 世纪6 0 年代起，随着新型膜材料和制膜技术的不断开拓，膜分离技术 已完成了从实验室到工业应用的转变，开始在工业生产中发挥举足轻重的作用 ( 6 5 - 6 8 j 。膜：广义而言，是两相之间的一个不连续区间，可为气相、液相和固相或 是它们的组合；简单的说，是指分隔两相界面，并以特定的形式限制和传递各种 化学物质的阻挡层。膜分离过程基于化学物质通过膜相际的传递速度的不同，传 递速度决定于推动力或膜与组分所受的力。分离膜按其凝聚状态可分为固膜、液 膜、气膜三类，目前大规模应用的多为固膜，固膜主要以高分子合成膜为主，它 可以是致密或多孔的，可以是对称或非对称的。对膜材料而言，除了它们化学结 构外，严重影响膜性能的还有它们的分子聚集态，而分子聚集态又与许多因素相 关，如制膜液的组成( 溶剂、致孑l 剂等) 及成膜工艺条件等【6 9 - 7 0 。 致孔剂，又称添加剂或溶胀剂，一般以非溶剂的形式存在。致孔剂的种类和 含量强烈的影响着制膜液的结构状态及溶剂蒸发速度，而它们又是决定膜性能的 两个重要因素。当制膜液中不存在致孔剂或聚合物分子之间的作用力不是很强烈 时，均相制膜液不发生分相，最后制得具有单层致密结构、抗压的较厚的膜。致 孔剂浓度较低时，制得具有闭合孔结构、低孔隙率的膜；中等浓度时，形成开放、 闭合的混合孔结构；浓度极高时，膜表面和内部均为开放型或泪状孔1 6 9 7 ”。 云南师范大学硕士学位论文 2 0 0 5 第二章纤维素三( 3 ，5 - 二甲基苯基氨基甲酸酯) 固定相的制备及手性拆分应用 以纤维素为原料，用3 ，5 二甲基苯基异氰酸酯进行衍生，制得手性固定相纤 维素三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 。将其溶解于四氢呋喃中，涂渍在经3 一氨丙 基三乙氧基硅烷修饰的硅胶表面，制得柱填料。在4 0 m p a 压力下，采用湿法装 柱，得到色谱柱。在高效液相色谱正相色谱条件下，对包括醇类、羧酸类、胺类、 氨基酸类及药物类的1 8 种手性化合物进行了拆分，其中1 5 种手性化合物得到了 基线分离。结果表明该柱柱性能优良，应用范围广，实用性强。 2 1 固定相的制备 2 1 1 主要仪器与试剂 l c 一6 a 高效液相色谱仪( 日本s h i m a d z u 公司) ；s p d 1 0 a v p 紫外检测器( 日 本s h i m a d z u 公司) ：c r 5 a 色谱数据处理器( 日本s h i m a d z u 公司) ；液相色谱 装柱机( 美国a l l t e c h 公司) ；色谱柱：2 5 0 x 4 6 m mi d ( 美国a l l t e c h 公司) ；a s 3 1 2 0 超声波清洗器( 天津奥特恩思仪器有限公司) ；电子天平( 北京奥多利斯天平有 限公司) 。 球形硅胶y w g 一8 0 ( 5 1 j m ，青岛海洋化工厂) ；3 - 氨丙基三乙氧基硅烷( f l u k a ) ； 微晶纤维素( f l u k a ) ；3 , 5 二甲基苯基异氰酸酯( a c r o s ) ；手性化合物均构于 f l u k a 和a c r o s 公司；其他试剂均为分析纯；流动相及样品溶剂均经o 4 5 i x m 滤膜过滤，并用超声波脱气。 2 1 2 纤维素三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) 的制备 取1 克微晶纤维素，放入1 0 0 m l 烧瓶中，在氮气保护下加入4 0 m l 无水吡 啶( 经n a 2 c 0 3 干燥并重蒸) 和4 m l 3 ，5 二甲基苯基异氰酸酯，8 0 。c 回流2 4 1 1 。 然后减压蒸除溶剂，余物倒入5 0 0 m l 甲醇中，收集白色沉淀，6 0 。c 干燥5 h ，即 得产物纤维素三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯) ，结构如图2 - 1 所示，产物的核磁谱 云南师范大学硕士学位论文 图与文献1 7 2 、【7 3 】相符。 鼯- c p - n r ；州i 、) 图2 - 1纤维素三( 3 ，5 - 二甲基苯基氨基甲酸酯) 的结构示意图 2 1 - 3 硅胶基质的修饰 硅胶用作色谱基质材料的重要原因是它具有特殊的表面化学特性和耐压结 构。暴露于硅胶表面的硅羟基，其密度、分布及化学特性对各种类型的色谱行为 都会产生不同程度的影响p 4 】。硅羟基被认为是强吸附的极性基团，而s j o s i 则 是疏水性的。s i 一0 s i 上的6 键通过妇- p 兀相互作用而强化，氧原子上的两个孤对 电子都介入了共轭键，导致s i o s i 部分不能形成氢键【7 5 l 。s c o t t 和k u c e r a 等证 实s i - o - s i 基团几乎不保留极性溶剂分子，但s i o s i 的疏水特性使得非极性分 子在此位点的保留成为可能。 而暴露于空气中的硅胶表面，不可避免的会吸附水而与硅羟基形成氢键结合 水，或者伴随物理吸附水。因此，在硅胶的衍生与键合中，除水是不可或缺的前 处理，特别是在有机相的反应和无水反应。物理吸附水与硅烷化试剂的反应和硅 羟基与硅烷化试剂的反应是两个竞争反应，副反应会引起键合率的降低和非特异 性吸附的增强，使所制备的柱填料性能下降。一般情况下，可用真空下的热处理 除去物理吸附水。但在真空下温度超过2 0 0 。c 时，可能会伴随硅羟基的缩合，形 成s i o s i 键。完全羟基化的硅胶表面的硅羟基浓度为8 i t m o l m 2 ，但由于空间位 阻，在键合相硅胶中很难达到这一数值，一般仅为2 - 4 m o l m 2 ，剩余就被以键 合的官能团所屏蔽。 取一个2 5 0 m l 三颈烧瓶，一边抽真空一边加热，除去瓶内壁吸附水。然后 在氮气保护下，加入硅胶1 2 克，于1 8 0 。c 下真空干燥2 h ，即得到活化硅胶。在 氮气保护下，加入1 2 0 m l 无水苯( 经c a c l 2 干燥并重蒸) 和2 m l 无水吡啶，再 加入3 m l 3 一氨丙基三乙氧基硅烷，8 0 。c 回流1 2 h 。产物经过滤，依次用甲醇、丙 酮和正己烷洗涤后，6 0 0 c 真空干燥2 h ，产物备用。 1 3 云南师范大学硕士学位论文 2 0 0 5 2 1 4 柱填料的制各 取o 8 克纤维素z ( 3 ，5 一二甲基苯基氨基甲酸酯) ，溶解于2 0 m l 四氢呋喃中。 将此溶液涂渍在3 2 克经3 氨丙基三乙氧基硅烷修饰的硅胶表面，真空除去溶剂。 然后加入适量正己烷，使柱填料悬浮其中，用滴管吸取悬浊液过筛，收集滤过物， 自然晾干，得到柱填料。 2 2 色谱柱的填充及柱性能评价 2 2 ，l 色谱柱的填充 采用匀浆法装柱，将2 5 0 x 4 6 m mi d 的不锈钢色谱柱用丙酮清洗干净后，热 风吹干。取上述制备的填料4 0 克，悬浮于1 3 5 m l 正己烷异丙醇( 体积比为9 ：1 ) 和6 5 m l 正己烷石蜡油( 体积比为2 ：1 ) 的混合溶液中，用正己烷异丙醇( 体 积比为9 ：1 ) 作顶替液。待装柱机调整好后，将填料迅速倒入匀浆罐中，并升压 至4 0 m p a ，维持几分钟后，在2 0m p a 压力下维持1 h ，并降至常压。卸下色谱柱， 去除接头处残留的硅胶颗粒，并迅速旋上螺帽，得到自行填充的色谱柱。 2 2 2 柱性能评价 将色谱柱安装在色谱仪上，用正己烷一异丙醇的混合溶液( 体积比为9 ：1 ) 作 流动相，冲洗该色谱柱，直到基线稳定。为了避免色谱柱柱床的移动和变化，色 谱柱在色谱仪上的连接方式应与装柱时的连接方式保持一致。 以1 ，3 ，5 一三叔丁基苯作溶质，流动相作溶剂，测定死时间t m = 5 3 2 1 r a i n ，以苯 作溶质，流动相作溶剂，测得理论塔板数n = 5 9 0 0 5 m 。 2 3 手性化合物的拆分 2 3 1 色谱条件 以正己烷一异丙醇的混合溶液( 体积比为9 ：1 ) 作流动相，流速为o 5 m l m i n ， 柱温3 0 。c ，紫外检测波长为2 5 4 n m ，记录仪的纸速为2 m m m i n 。手性化合物溶 解于正己烷一异丙醇( 体积比为9 ：1 ) ，并经0 4 5 1 x m 滤膜过滤，超声波脱气。 1 4 云南师范大学硕上学位论义2 0 0 5 2 1 3 2 结果与讨论 在上述色谱条件下，对包括醇类、羧酸类、胺类、氨基酸类及药物类的1 8 种手性化合物进行了拆分，1 8 种手性化合物的分子结构如表2 - 1 所示，其中1 5 种手性化合物得到了基线分离，分离情况如表2 2 所示： 表2 - 1 手性化台物的分子结构 墨塑堕蔓查兰堡兰竺笙兰型堕 1 5 ( ) 拉贝洛尔 ( ) 于h 尔敏 1 7 ( ! ) - 心得安盐酸盐 1 8 ( ) 一阿司咪唑 h n c 、 二o h c h2 n h 一c h 2 c n d c l ) 1 h c h2 c h ：n ( c h 出c h c h o。如一n q 吼。 h 3 c _ o o 删z 一( 逾 $ h 。? 一 表2 - 2 手性化合物的拆分情况 一一一一一 塑呈至丝些宣塑堕鱼整 ! !堡 ! 塾 1 f + ) - 1 一苯基1 ，2 一乙二醇 0 1 3 4 0 3 5 12 2 6 11 5 7 1 2 ( + 1 3 苄氧基1 ，2 丙二醇 o 1 7 8 0 3 9 12 1 9 01 4 0 0 3( 曲2 苯基1 丙醇 未分开 4 ( + ) 1 ( 1 - 萘基) 乙醇 2 8 0 23 6 5 5 1 3 0 42 9 8 7 5 ( + ) 一2 ，2 , 2 - - - 氟1 一( 9 蒽基) 乙醇 3 9 1 1 6 2 4 81 5 9 84 , 4 5 5 6f 、，苯乙醇酸 0 1 5 30 3 6 72 4 0 1 1 2 5 9 7( ! ) 二一o ，o - 对甲苯甲酰基酒石酸 未分开 8d e - 3 苯基丁酸 未分开 9 d l - 苯基j + 二酸 0 1 5 60 3 6 8 2 3 6 81 4 0 0 1 0d l 广m 甲基苄胺 0 1 8 2 0 4 0 72 2 4 11 7 0 4 1 1d l - 酪氨酸 0 1 7 2 0 3 9 12 2 7 41 6 0 0 1 2d l - 色氨酸 0 1 7 60 4 0 22 2 8 1 1 6 5 5 1 3d l - 苯甘氨酸 o 1 4 6 0 3 6 02 4 7 21 5 3 8 1 4 d l - 苯丙氨酸 0 1 5 10 3 6 32 4 1 41 3 3 3 】5 任1 一拉贝洛尔 0 1 4 8 0 3 5 82 。4 2 31 2 3 5 1 6( ) - 手 尔敏 0 2 5 8 1 2 5 64 7 0 43 5 8 5 1 7( 1 一心得安盐酸盐 o 1 7 60 3 9 8 2 ，2 4 01 2 9 7 1 8 ( ) - 阿司咪唑 o 1 9 2 0 4 1 92 1 8 31 5 5 6 在1 5 号的醇类化合物中，只有3 号未能分开。此外，4 号、5 号手性化合 物的保留时间相对于1 号、2 号的保留时间长得多，主要是因为4 号、5 号化合 物分子中有体积庞大的萘基和蒽基【7 6 1 。部分手性化合物的分离图如图2 - 2 和图 云南师范人学硕士学位论文 2 0 0 5 2 3 所示 n0黯l 图2 - 2 ( ) 一1 ( 1 - 萘基) 乙醇的分离图 “w r t 一k o 一。 c “- 一； 图2 - 3 ( ) _ 2 ，2 ，2 - 三氟- 1 ( 9 - 葸基) 乙醇的分离图 在6 - 9 号的羧酸类化合物中，有两种手性化合物得到了较好的分离，分离情 况如图2 - 4 和图2 5 所示： 昏器城 图2 - 4 ( + ) - 苯乙醇酸的分离图 图2 - 5d l - 苯基丁二酸的分离图 1 0 号化合物为胺类化合物，得到了很好的分离，分离图如图2 - 6 所示 黔辫。l。i!iii 誊一霉l； i；ii_ 云南师范人学硕上学位论文 2 0 0 5 f “一 ：艺 。登l * 堪o i 篡： =“ 量：蠢麓! l 冀 i ：。二 j 篝一 “n 寰l 7 。 一 ； i ； ：， i - ， - ： ，t ” # ，一一一 ；n 驹 纛l 稳 图2 - 6d l - c l 甲基苄胺的分离图 1 1 1 4 号的氨基酸在此柱上全部得到了分离，部分氨基酸的分离图如图2 7 和图2 8 所示： 嚣l 蓥 薹薹 籀 j “ ；i 豁 1 ；l i 图2 7d l - 苯甘氨酸的分离图图2 - 8d l - 苯丙氢酸的分离图 1 5 1 8 号的手性药物在此柱上也全部得到了分离，部分手性药物的分离图如 图2 9 、2 - 1 0 所示： 1 8 盂南师范人学硕士学位论文 国2 - 9 ( ) - 扑尔敏的分离圈图2 1 0 ( ! ) - 心得安盐酸盐的分离图 2 4 结论 纤维素- - 三( 3 ，5 二甲基苯基氨基甲酸酯1 涂渍硅胶柱，有较高的理论塔板数和 极好的色谱性能，对涉及醇类、羧酸类、胺类、氨基酸类及药物类的1 8 种手性 化合物，8 0 以上的化台物都得到了基线分离。 纤维素一- - ( 3 ，5 一二甲基苯基氨基甲酸酯) 固定相中，氨基甲酸酯基团是一个极 性很强的基团，对化合物中羟基、羧基和氨基产生强烈的氢键作用【7 7 _ 7 8 】，而且纤 维素衍生物是具有螺旋形空穴结构的光学活性天然高分子，3 ，5 二甲基苯基氨基 甲酸酯基团围绕纤维素主链形成许多手性空腔，在手性空腔中，靠近主链的外侧 是芳基，内侧是手性固定相的氨基甲酸酯残基，对手性化合物有很好的选择性 7 9 1 。此外，纤维素类固定相的螺旋形空穴对进入空腔的芳环部分有很好的亲和 力，形成“立体配合”的包结作用 8 0 - 8 ”。 沸澎卜。二；i 臻逮；7。 。一， 一赢拦嘲守潍黝v 0彝一#蓉 云南师范大学硕上学位论文 2 0 0 5 第三章醋酸纤维素类色谱固定相的制备与手性拆分应用 本章共制备了五根色谱柱，即首先制备了醋酸纤维素固定相，涂渍修饰后的 硅胶装柱，并对包括醇类、羧酸类、胺类、氨基酸类及药物类的1 8 种手性化合 物进行了拆分，其中7 种手性化合物得到了基线分离。对于没有分开的手性化合 物，首先选取( + ) 二0 ，0 一对甲苯甲酰基酒石酸单体作为致孔剂，和醋酸纤维素固 定相一起涂渍在修饰后的硅胶表面，在4 0 m p a 下装柱后，用乙醇将致孔剂洗脱 下来，继续对1 8 种手性化合物进行拆分，结果部分在醋酸纤维素柱上没有分离 的化合物在此柱上得到了分离。考虑到装柱时压强是否对分离效果有所影响，选 择在2 0 m p a 下装同样的色谱柱作对比，结果表明：分离情况基本一致，装柱的 压强对柱性能的影响并不大。继续选用( + 1 1 一苯基1 ，2 乙二醇和“) 一苯乙醇酸作为 致孔剂制柱，分离的结果表明：此两根柱也能分离部分在醋酸纤维素柱上没有分 离的化合物。 3 1 醋酸纤维素固定相的制各与手性拆分应用 3 ，1 1 主要仪器与试剂 主要仪器与2 1 1 相同。 冰醋酸、醋酸酐、浓硫酸均为分析纯，其它试剂与2 1 1 相同。 3 1 2 醋酸纤维素的合成 醋酸纤维素的合成参阅文j 缺 8 2 8 3 。取6 克纤维素置于1 5 0 m l 三颈烧瓶中， 搅拌下加入混有浓硫酸的冰醋酸溶液( o 2 m l 浓硫酸+ 2 0 m l 冰醋酸) ，室温放置 1 h 后，加入3 0 m l 乙酸酐和l o m l 冰醋酸的混合溶液，并将水浴温度控制在5 0 0 c ， 1 5 m i n 溶解，3 0 m i n 后结束，并升温至6 0 。c ，加入6 0 0 c 的8 0 的乙酸水溶液3 0 m l ， 保持3 0 m i n ，用以除去过量的乙酸酐，且保证产物不至于沉析。然后冷却，倒入 烧杯中，先加3 0 m l 水，再加大量的水，使醋酸纤维素沉析，过滤，用大量蒸馏 水洗涤产物至中性，产物于1 0 5 。c 真空干燥8 h ，理论产率7 0 。醋酸纤维素的 云南师范大学顾十学位论文 结构如图3 - 1 所示 行 r = - - c - - c h 3 图3 - 1醋酸纤维素的结构不意图 3 1 3 柱填料的制备 取o 8 克醋酸纤维素，溶解于2 0 m l 氯仿中，将此溶液涂渍在3 2 克经3 一氨 丙基三乙氧基硅烷修饰的硅胶( 合成见2 1 3 ) 表面，真空除去溶剂。然后加入 适量正己烷，使柱填料悬浮其中，用滴管吸取悬浊液过筛，收集滤过物，自然晾 干，得到柱填料。 3 1 4 色谱柱的填充 采用匀浆法装柱，取上述柱填料3 9 克，悬浮于2 0 m l 乙醇一正丁醇( 体积比 为2 ：1 ) 的混合溶液中，用乙醇作顶替液，在4 0 m p a 压力下装柱。 3 1 5 柱性能评价 将色谱柱安装在色谱仪上，用正己烷异丙醇的混合溶液( 体积比9 ：1 ) 作流 动相，冲洗该色谱柱，直到基线稳定。以1 ，3 ，5 一特丁基苯作溶质，流动相作溶剂， 测定死时间m = 5 6 3 3 m i n ；以苯作溶质，流动相作溶剂，测得理论塔板数 n = 2 2 9 6 9 m 一。 3 1 6 手性化合物的拆分 以正己烷异丙醇( 体积比9 ：1 ) 作流动相，流速o 5 m l _ m i n ，柱温3 0 。c ，紫 外检测波长为2 5 4 n m ，记录仪的纸速为2 m m m i n 。 在上述色谱条件下，对包括醇类、羧酸类、胺类、氨基酸类及药物类的1 8 种手性化合物进行了拆分，结果所有药物类的手性化合物都得到了分离，另外 d l - a - 甲基苄胺和d l - 酪氨酸以及( ) 一3 一苄氧基1 ，2 丙二醇也得到了分离，羧酸类 的化合物都没能分开。部分手性化合物的分离图如图3 2 至3 5 所示： i 南师范大学硕+ 学位论文2 0 0 5 譬辚 i零爹 ；羹 ! ! _ 薰 憋i j l 薤 图3 - 4 d l - 酪氨酸 o 醢 _ 旧 s 1 0 图3 - 3d l - a 甲基苄胺 图3 - 5 ( ) 一心得安盐酸盐 上述部分化合物得到了较好的分离，但原来在醋酸纤维素柱上能分离的化合 物在此柱上的分离效果降低。1 8 种手性化合物的分离情况如表3 - 1 所示： 薯)毯 瓷黑话m错警 云南师范大学硕士学位论文 加0 5 3 2 ( + ) 二o ，o - 对甲苯甲酰基d 酒石酸作致孔剂色谱柱的制备与应用 3 2 1 柱填料的制各 称取0 0 4 克( + ) 二o ，d 一对甲苯甲酰基d 酒石酸和o 。8 克醋酸纤维素，溶解 于2 0 m l 氯仿中，将此溶液涂渍在3 2 克经3 氨丙基三乙氧基硅烷修饰的硅胶( 合 成见2 1 3 ) 表面，真空除去溶剂。然后加入适量正己烷，使柱填料悬浮其中， 用滴管吸取悬浊液过筛，收集滤过物，自然晾干，得到柱填料。 3 2 2 色谱柱的填充 采用匀浆法装柱，分别取上述柱填料3 8 克，悬浮于2 0 m l f 己烷正丁醇( 体 积比为9 ：1 ) 的混合溶液中，用正己烷作顶替液，分别在2 0 m p a 和4 0 m p a 压力 石南师范大学硕上学位论文 2 0 0 5 下装柱。 3 2 3 柱性能评价 将色谱柱安装在色谱仪上，用过滤、脱气的乙醇冲洗色谱柱至少6 h ，然后 改用正己烷异丙醇( 体积比为9 ：1 ) 流动相冲洗色谱柱，直到基线稳定。以1 ，3 ，5 一 特丁基苯测定死时间t m = 5 3 0 7 n f i n ；以苯测得的理论塔板数n = 8 3 9 7 m 。1 ( 均指在 2 0 m p a 压力下填充的色谱柱) 。同时对比2 0 m p a 压力下装柱的柱性能和4 0 m p a 压力下装柱的柱性能，基本一致。因为装柱时，选择致孔剂所不能溶解的匀浆液 和顶替液，使致孔齐f j 保留在色谱柱中，而是等到装柱成功后，在色谱仪上进行洗 脱，色谱仪上的工作压力o 2 xl o o k g f ，远远小于装柱时的压力，所以装柱的压 力对柱性能的影响并不大。 3 2 4 手性化合物的拆分 色谱条件同3 1 6 ，对( ) 二o ，o - 对甲苯甲酰基酒石酸进行了拆分，结果得 到了很好的分离，表明此色谱柱对致孔剂分子的外消旋体有很好的选择性。考察 不同进样体积对( ) 一二o ，o - 对甲苯甲酰基酒石酸分离的影响，分离情况如图3 - 6 和3 7 所示： 图3 - 6 进样体积为1 5 1 x l图3 7 进样体积为o 5 t x l 一蚕 誓暑慧胬u釜_i 五南师范大学碗上学位论文2 0 0 5 结果表明：此柱在分离f ) 二0 ，0 对甲苯甲酰基酒石酸时，随着进样量的增 大，此柱有些过载，分离效果不佳。一般来说，在分离物进样过载的情况下，样 品的分离效果较差，随着进样量的降低，样品的分离更充分。这是因为手性分离 是一个吸附和分配的过程，在进样量过载的情况下，没有足够的手性基团与分离 物进行作用，因而对映体的分离就不充分。进样量对分离的影响是发生在进样量 过载的情况下，当进样量没有达到这种极限状态时，进样量对分离的影响不是太 大。 用此柱继续分析了其它手性化台物，结果表明：原来在醋酸纤维素柱上能分 离的7 种手性化合物在此柱上依旧能分离，但分离的效果降低。1 8 种手性化合 物的分离情况见表3 2 ： 表3 2 手性化合物的分离情况 云南师范大学硕