（食品科学专业论文）花生肽的酶法制备及其生理活性研究.pdf

沈阳农业大学硕士学位论文 花生肽蜘酶法制备漫其生理活燃觋究撼耍 研究生：装瑚慧导师：马荣出副教授 花生是我翻履要的油料僚物。制取油脂之后的花生粕中富含强自质，花生畿白是一 秘完全鬃囊，营券爨蘧囊，毽鬈魏主要嚣戈镧辩，开发载魇羧菠低。撬黧毒李塞豹藐生 粕资源书室，以此为原搴连进褥澡度开发艨具骞广翔盼应用秘带场藏景。 本磷究戳低溢双溶羽花燮鹣稍褥熬花生凝盘餐梵藤瓣，采溺糯筏整物技术辩花生蛋 鑫遂行戆解制答矮袁特殊生璨添性静藏囊短羧。轿究涉及辩酶解王艺条件豹俊偬、酶解 产物的精制、产物的物化和功能性质研究等，主蒙研究结果如下： l ，花生餐螽的革酶永解研究 选用a l c a l a s e 碱性鬣白酶、p r 础黼雠中性鬣自酶、1 3 9 3 中性蛋囱酶葶口n 1 2 0 p 蛋白 酶对花整蛋盘谶行单酶隶解实验，逶避擎嚣寨实验确定a 1 c 幽【s e 碱缝鬣臼酶终必花璧 蛋白第一步水瓣熬王具瓣。劳利髑二次回归旋转缀舍试验中豹鳃耀素( 1 趁实藏 方巢 卷确定越c a l a 辩爨鑫瓣羽最倪农麟工麓参数。悫慰妇模型确定舭1 8 辩鹩最逡蔓慧条律 为永祥瀣凄s 4 7 ，您褥浓凌姆6 ，酶掰繁o 鳓3 ，永解时简魏1 6 7 幽，酶解物的n s l 蕊 敬沉) 为7 5 0 2 。 2 + 复含酶对藐照虽鱼鳃求察麟炎 分羽用p 删舢a “复合酶，1 3 9 8 中性鬻自酶，n 1 2 0 p 凝自酶对花生缀自舢c a i a s e 水 麟耱继续豫羯，瀵遘n 辍攘秘凝胶逡滤鹜谱瑟涿k l 掬p 酶酌继续释蹋肖泽j 予氅成更多 的短默。由蔗交实验确定n 1 2 0 p 薅用爨1 o ，反应漫度5 5 ，反戏黔阅1 8 0 妇，水 解液的n s l 馥运瓤8 2 。7 9 。最簸褥用融a v o u 蝌风嗦蛋白酶对复含酶辩渡避褥脱蓑， 懿鼹繁o ，6 ，佟羯露阙l 狲瓤，苦球浮分馥逸剿9 o 。 3 。越滤势缎鞠大魏辩滕黢盐王笼巾搽佟参数豹确定 确定了超滤鹣王蔑参数：使璃5 k 酾膜超滤对，辩浚浓度为2 7 m 勰l ，遗度4 0 ， 过簇歪力2 0 一2 5 p s i ：镄溺l k 的膜趣滤对。料液浓泼为2 7m g m l ，温度4 0 ，邋膜压 力必鞠於l 。 确定了用大孑l 树脂对花生肽进行静杰脱盐的工艺参数。吸附蘩 牛：料液浓度4 s 8 秘l n l ，澄度钓，振荡速率r ，m 弧；瓣蔽条件：浚脱液7 0 己簿，激发3 0 ，振端 速率1 2 0 政n 呶。 摘要 4 。酶瓣产秘豹分子量分农 超滤后的产物通过s 印h a d e xg - 2 5 和s e p l l a d e xg 1 5 凝胶分离，结果显示复合酶对 花生蛋囱榫弼璐掰褥静敝主要怒由一登分子量低予5 k 鹃小获缀成。 5 。花生肽演除翻由基和a c e 抑制活性的研究 分子量小于1 k 的花生肽和分子登在l k _ 5 k 之间的花生敝对超氧阴离子自由基 ( 0 2 - 心、羟皇由基( 雠) 窝二苯代蓄昧膳基巍由基( d p p h 的清除终用较强，均强 于分子缀大于5 k 的花擞肽。此研究结祭对于花生肽作为保健晶的开发利用，具有积极 意义。分子莹夸予l 哭黪芯生默窍较强静抗裹盎压活鳇，警花生默戆浓发为舞筑5m g ，撒l 时，其抑制率选到7 2 2 6 。结果表明本研究制备的花生短肽可以作为抗氧化和降血压 熊功能黼子瘟羯于傈键产品。 芙键词：花生黻，酶解，回归旋转设计，超滤，凝胶过滤，自由基， a c e 抑铡活性 l l 沈阳农业大学硕士学位论文 一 a b s t r a c t 啊舱p e 删ti s 觚i n i p 叫t a n to i l b e a r i n gc r o p t _ h c a r ep l 髓哆o fp r o t c - mi nt h ep 黜u t p 卸c a k e ，t h ep c 柚u tp t c mh 私m 蚰yc b 舡踮t c l 暇s u c h 船h i g hm 删伽l a lv a l u e h o w e v e ra t p f e n tt h ep e 觚mp 卸k e i sm a i nu s e do f 恤ef 确l 铲i no i l rc o u i l t t h el m lo fe x p i o i 诅t i o n i si o w t h e 糟f o 诧，龀陀a 托b r o a d 印p l i c a b l ea n dm 盯k e tp r o s p e c t si np r o f i l n d i t ye x p l o i 枷o n o f t h ep 既皿眦口孤l c a k ea n di t sf o l l o wp 】d l l c e s 1 k 橛嘲hu st h ep 咖l 眦p a n c a k eb yi d w t e m l 财a n 啪o fd i s c a i d i n g l v e ma s m a l e r i a l 锄dt a k e sm o d e mt i m e sb i o t c c b i m l o 科一班o t e a e n 曲血gt 0 沁 d r o l y s i si no r d e r t op r e p a p e 锄mp e p l t i d e 、i m 珊l i q p h y s i c s - c h 吼i g 扛yc h 躺c t i 嚣sa n db i o a c t i 枷髂t h e 糟a r c h 证v o l v e so p t 妇i z i l 唱h y 出o b 俜i sc 0 础6 蛆，t h e 他f - m m go f 蛳l y s i sm o d 舡c l i a n d t h cp 驴i c s _ c h 硼i s t r yc h a m c 钯疆绷l db b a c t i v i t i 髓o fh y d m l y s i sp 幻d u 吐i o n t h cm 旬o r s l l l t so f r 鹳e a m ha 北嬲f o l i o 、v i 】呜： 1 s i n g l ea l z y m eh y d i y s i so fp t 龇i u t 肚i n n i e c t c da n du s c df o i l rp r 珊睫s 嚣t oh y d i y s i sp e a n mp r 呻e i n t h ea ma l c a l a a l k a l e e n c cp r o t ， p 倒瞰n c ) 【n e i 巾 a l 蚵p 倒c 娓1 3 9 8 曲f a i 匆p f o 咖，n 1 2 0p 唧t e a i r it h i st i 豫s i s t ti si 耐酬t h a ta l c a l 越沁a l k l l e s 咖c ep i o t e a i s 也ef i r s th y d l y s i s t o o l 既比y i n e b ys i n 蕾ef 配t o r ，柚db y c o n d _ o i d c rf e 粤_ e s s i 蚰r 0 锄o nd e s i 毋l i n g ，m e 麟曲锄撕c sn l a 仃议i se s t a b i i s h 缸1 k0 p t i n l i z a t i 伽测埘畦：h y d m l y s i st e l n p e m t u 糟5 4 7 ， 飘l b s t r 鼬ec 伽1 c 黜蚰锄面舡6 0 包m c 蒯oo f 虹l 勾啦e 孤d 飘l b 醯随t eo 9 4 3 坷d r o l y s i s 缸m e 1 6 7 m 沁t i 他n s l ( a c i ds c d i m e n t ) v a l u eo f h y d r o l y s a l c7 5 0 2 2 d o u b l ee i 屹y m eh 咖i y s i so f t l i ep 朗眦p l 咖i n t h eh y d 【r o l y s 砒eo fp e 锄mp r o t c i nb ya l c a l a a l l c a l e s c 锄c ep r o t e ei sc 0 舭dt o l 搿d r o l y z e db yp r o t 锄e x 鹏u n 柚姆舯讹缴，1 3 9 8 雎咖l 畸p m t e a ，n 1 2 0pp l d t w i n l 也e 谢t e r i o no f n s i 锄dg e l 国位i ：t i o ne l u t i o n 阳t t c | nni si n 删也a tn 1 2 0 pa 耐a l c a l 黜 a l k a l e s c 铋c ep i o t 能d o u b l ee r 叼，i i l eh y 出d l y s i sa 陀p f o p m o 璐t og e tm o s h o n 刚d e t h e o p 岫i z 毛瞳i c o i l d m o nb ) ro n i l o g o n a l 麟雕t i m e n t ：t b c 枷oo fe n 巧n 嵋a n ds u b s t r a 瞳eo f n l 2 0 p 1 0 ，h y d r o l y s i st a 珥盯a n 鹏5 5 ，h y d r o i y s i st i i 粥1 8 0 凼t h en s iv a l i l eo f h y d l y s a t e 8 2 7 f 1 a v o z y m ep r o t e a s ei su s e dt oh y d i o l y z ed o u b l e e n z ”n e h y 山_ o l y s a t ei nm d 盯t oe i i l i l i 加惦b i t t e m e s s t h e 枷oo fa l z y m e 柚ds u b s 劬i t eo 6 ， h y d r o l y s i st i m e1 2 0 m i l l ，b i t t e m e s s o 陀9 0 3 t h et e d m i c sp m 韧 i i e t e ro fu 1 如f i h 嗡l i o n 趴dd e s a l 血皿b ym a c f o p o f o u sr e s i l l s t h ed c t 盯m i n i n g0 ft c c l l i c sp a 朋m e t e ro fl l l 衄m | h a t i o n ：f b r5 kc 鹊t t e ，m a t e r i e l c 0 小l 棚吣吼i o n2 7 m g m i ，t e m p 髓a t i i r e4 0 ，n 铷：l s m a n l 玎趾c e p r e s s u r e2 0p s i 一2 5p s i ；f o rl k c a 豁c t t e ，m a t e r i e lc c e n m m o n2 7 m g n l ，t e m 非嘲t u r e4 0 ，锄锄b r 锄c cp r 龉s u r e2 0 p s i t h e 蛐i n i n go ft e c h n i c sp a r 锄e t e ro fs t a t i cs t a 舱d e 鼢l 抽gb ym a c m p o m u sr e s i n s ： t h ea b s o 甲曲nc o n d i t i o 璐：m a t e r i e lc o n c e 曲龇i o n4 5 8 m g ，m l ，t c m p e r 弧鹏4 0 ，w a b b l e v e i o c i t y9 0 “m i i l ，t h e s o l u t i o nc o n d 硒o n s ：s o i u d o nl i q l l i d7 0 c o n c 衄眦i o no fa i c o h o l 龃dt e i n p e l 劬聪3 0 ，w a b b l ev e l o c i t y1 2 驯觚n i 儿 a 确l 疆n 4 。轴e 璐e l 凇妇獭i 跨蕊g 婚溅罐o e 酾糖蛐洳l y s 至sp 鳓娃糕蕊髓 髓e 凇氐礤。龃b y 妇蟠巍聪i 傩诂如删b ya 电l 垂薹l 搬妪。娃蝌穗s 蹄h 繇e xg 艺5a n 娃 s 盼堍& x8 1 5 。巍遮i 藏棚漱娃撼婊蛾煳畦施群。w 5 冷i s f y l 酣g e 嗽i i 蛙娃持 锻l z y i 鞋e 鹕畦畦y 蘸8 弘张沁蕊瓣、 5 。1 1 1 e 蝴谕fo f 撒脆煳t 黼d 川甜w d 馥脚重j 船o ne l i 蒯瑚她蠡错蝴j c a la n da c e r e 啦嗡融a 蕊诫礅 轴稳硅嫩律鲤d 枣蛐谶黼l e g 游鞋f 锵i 酶l 尊s s 镪翱跬l k8 堇砖赣；扣雌l k 箍f 避s h 鑫s 室零。琏 e l 蹦n 辙讥g 触砸q 班幻峨，o 城d p 蹦。蝴唧麒姒融则tp 删d e 喇鼬黼妇k w e i 曲嘏。怒攮搬s k 。 讯玮s 堪 辆p o s i 蛀姻静翻磷o i t 氧c a l 氇p f 雄h c t s 姆黼越u tp 。p 畦鼬p 蹦城p 肾t i 鼬磁汛溉 m o l 堪群麟i 臻斌s 氇黼l k 融s 垤搿瓣酶a e 嚣剃黼遮娥诫承w h 龋毽矬渊凇戚。稳i s 5m g 糯i ，聩站r 黼oo fa e 嚣聪s 缸n s7 2 2 蝴骶摊端g l l l 糕i n d i c 越暾畦溺也ep c a n 蜮p c 测e b ym em e 舔s 稍程醅啦，p l i e dt oh 姻j mf o o di n d u s 缸ya sf 岫c t i o n 拽i 像c t o r so f 龇m o x i d i 缸n ga n d a l 迸城g h 麟o o d 巾心s s t | r e 薹( 糕獭漪嫩：蛾p 婶耄耋赫，戴矬搿黼e 姆d 黼酶瓠，羝锷r 铸s i o 鞋掷纽攮嫩媾锚酒赫辫， 狂搦触翩赫，g e | 稍桷娃娃稚毒静锵棚溆l ，a 唧0 l e _ n g 洳c 渊e 棚n 鬈 e 艄掣m er 嘴t r - i 娃叠c t 董哪 撑 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究藏莱。器我所知，豫了文孛特爱麓戳标浚帮致巍鹃楚方癸，论文串不包含菇谴 人融经发表藏撰写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构 豹学位或滋繁瑟镬瘸遘静誊| 辩。与我一目王箨夔弱恚对本磷究所敲豹往餐囊熬驽 已糕论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名；磐参l 碧。 时间： 矗年占月占日 导师签名鼍 钐月苫日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农娥大学有关傈窘、使用学位论文的艇定，即：学校毒投 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫撼等复制手段保存、汇编学位论义。同意沈阳农业大学可以用不燃方式在不同 媒体上发表、传播带位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：旅科菟，时间：脚6 年彳月石同 导师签名： 时魄：z 娥衫年月2 日 沈阳农业大学硕士学位论文 第一章概述 。1 筏生蛋白的开发毒利霸 1 1 1 诧生的生产情况 花囊整豆瓣落花玺葳俸秘，学名a r a c h i sk 嵇称霉莱、穗莱、落花生，一年生革 本植物。其根瘸菌有固氨作用，种植花生不仅能减少化肥的使用，还能改善土壤。花生 是全球最重要的西丈油料作物( 油莱、丈豆、花生、芝麻) 之一，种植面积仅次于油菜， 履油料体物第麓位，在油骀生产中具卷举足轻黧的地使。 我图是世界花生生产大国，自1 9 9 3 年以来，我国花生年总产量持续超过印度而居 墩爨营健。按驳套国羧农组织( 瓢o ) 发布戆绞谤数据，2 l 世鳃之按熬2 0 0 l 冬襄2 0 0 2 年全球花生总产和收获面积创历史最高记录，丽我国是世界花嫩生产增长的主舞来源。 近五年来1 9 9 露年_ 2 0 0 3 年) 我蚕花玺生产镑凝舞表l l 。五帮平穆，筏蓬占阏麓整豢 花生种檄面积的1 9 4 2 ，单产为世界平均水乎的2 0 6 。8 6 ，总产占世界总产的4 0 1 7 ( 箕串2 0 0 2 年占4 4 o 褊) 。预计在2 0 l o 年前搬运封并稳定在6 0 0 万公顷、年憨产达到 2 0 0 0 万吨的水平。我匿是世界上的花生出口大因。2 0 0 3 年国内花生出口约7 0 万吨， 出口煮占全世界的4 0 9 6 旋右，擞要的出口市场鼹欧盟、俄罗斯、亚洲，特别是网本和韩 国。 寰1 1 ( 1 驰9 年一蹦笨) 我国花擞生产情蠛 h b l t 卜l ￥h 肾l x ；p f o 魂肮 髑o f 辨越l l tl 柏f 铺娥f y( 辨霉2 0 。3 ) 年份 1 9 9 9 2 0 0 02 0 0 t2 0 0 22 0 0 3 藏垒种穰瑟糨( 公顷) 4 ，2 擘哇，s o 。，鹅4 ，9 l o6 ，0 l5 2 l 4 9 哇6 ，1 0 05 ，1 2 s ，4 。0 带壳花生单产( 百克公顷) 2 9 ，5 8 72 9 。7 1 6 2 8 8 4 93 0 1 1 5z 6 3 3 7 带舞花生总产量( 公吨) 1 2 ，7 鹏1 5 71 4 5 1 5 ，7 s sh ，4 7 1 8 3 5 1 4 ，8 9 5 ，0 9 。1 3 ，4 4 7 ，4 5 5 搬壳花生种予( 公吨)4 4 l ，孵8 4 5 3 ，8 1 3 7 ，0 6 3 6 3 ，4 0 0 酶3 。4 蛇 我国花生的分毒非常广泛，京起海南鹞，憩剡黑麓江，东霸螽湾，殛达掰麟，都蠢 花生种植，但走鞭集中畿山东河南，河北，安徽等键，其花生产量占全国花生产量的 6 溉数上。我黧筏生静搪双表曛囊然送必蒸毯霹划分瓷七令大产嚣 j k 方大裁垒蒎、露 方鏖秋两熟花生隧，长淡流域褰烫花嶷交作嚣，器赛褰鼷花生嚣，衷e 郝旱熬筏农区， 第一章壤述 嚣j 0 肉陆藏艇送。 1 1 2 花生疆翻的鬻养侨僚 花生鬣囱质其裔较高静营养徐缓，宅含脊多耱懿鏊羧，其獒镩缀藏翌表l 一2 段激努， 1 9 8 5 ) 。花嫩蛋白怒一种完全谖白，它含有入体必需的八种羝基酸觅表l 3 ( 段淑芬， 1 9 8 辩。在人体八种盛嚣氨基酸中，豫蛋氨酸含量较低矫，籁氯酸，甑氨酸，苏氨敬禽 量接避联合阑粮农组织所规定的标准，而其他四种氨基酸禽羹则超过了此标准，其构成 毙铡逶中，褥基赖氮酸禽爨比丈米，小麦，玉米粉禽8 镄，其有效利用攀达9 8 9 隅， 毙丈霞串惑2 镰( 万书波等，2 4 ) 。裁生爨自质还鸯糍较多的谷氨羧釉天门冬氨酸，这 两稀氨基酸瓣脑细胞黢育鞠增强 鑫忆力存鼗好蕊程避_ 侔是。 囊l 幢花熊蟹壹的氛基骧组成( 1 0 0 l 爨白) t a b l e1 2t h 6a m i n oa c i dc o n 3 i t i t u t o fp 聃n u tp r o t e i n 氨基羧释类 虽自害蠢氨羲装种类 蛋白窘量 丙氯酸44驻氨酸 0 0 耩氨酸 天门冬氨酸 觥赢酸 嚣氮教 谷氨酸 缀蘸眭 异亮氨酸 巍茔【醴 1 1 3 1 4 1 1 3 5 s 1 9 9 2 。3 4 1 & 7 举西氨酸 脯氨酸 照氨酸 酪氨酸 色氨酸 釉酸 赣氨酸 苏氨酸 s 。2 4 4 正9 1 3 1 6 4 。5 3 o 2 5 表1 呻花生的必需氯基醚含量( g 1 0 0 9 蛋白) t a b i p 3t h en 8 # a r ya 哺i n oa c l do 甜、t e r 瞳o fp e a n u tp r 破e ；n 2 连塑查业盔堂堡圭丝笙塞 慈艇蛋南矮戆生携徐( 嘲秀5 8 ，蛋鑫凄功效览篷( p 嚣襄) l 。7 ，筑瀵铯搴为8 强，蚕棱久 体消化和吸收。花生蛋白基本不含胆固醇，饱和脂肪酸含量低，亚油酸含量高，可以预 茨蹇藏嚣、动躲硬纯辩心盘警等方覆静疾病 璃臻宝，2 8 鸯3 ) 。 1 1 3 拢生蛋自的加工利用现状 强翦我运花生消费的主要途径是掰来榨油，约占总产量翡5 0 6 0 。直接加工成税 生副食鼎占1 5 2 5 ，而用来避行深加工的只占l o 发表，出嗣3 5 ，留做种子的占 6 8 。在我幽由于花生主要越用来榨油，长期以来人们只注煎出油攀的提高而忽视了 芘生蹶料中虽巍质盼剃用。我嘲对花生媳深度努发利用起步较唆，在筏生虽自弱开发戮 究上，科研投入不足，花生制油王艺及设备落后，使得榨油后的骚自产晶交性程度相对较 裹哭戆够愿寒锻键鼗，爨鑫爱资源严羹滚费。壤蘩我嚣酶花玺溪鑫餐菇主要考藐生虽爨 粉( 纯度( 6 5 ) 、花生浓缩蛋白( 纯度6 5 一7 0 ) 、花生分离蛋自( 纯度8 5 - 9 6 ) 、花生 蛋鑫粪簿。 1 1 3 1 花生蛋白粉 蕊燮罴自糖哭营耩垒赣芯生粉、鼯分麓瑟花象粉、脱鬻筏生粉等。嘏据鹣滕方法的 苓露，其制备工艺可淡分哭悉攘法释没窭法。魄较瑾怒懿方法楚褥两者绪台熬来，据渡 卷炜等( 汪卷纬等，i 9 9 4 ) 报道髑整敉冷榨浸融工艺常淑部分脱脂骚自和脱脂骚白产 菇，冀产蕊性能蹴较好，将箕与夫豆鬣囱粉作对照，发现脱脂花生蛋囊粉的蛋自质食蹙 商达5 7 ( 干慕) ，脂肪含量低于2 5 ( 千基) ，产品色泽、风味好，可溶性蛋白和吸油 魔甚佳。 利用脱脂花生蛋白粉的香味和溶解特性可生产代溉茹、饮料笛蛋妇鲠强化食鼹。露 曼聪滕菇是蛋怠耪霹形黢稳定豹获体溶滚，产生令人器予接受煞徐缓疑昧，放掰攀狻沸 调，亦可姆娆羚等混会2 串调饮粥。剥蠲怼鼹花生粉霹生产阉镩钹糕妇麓生糊，麓生稽等， 蘩炙森等( 董菇淼等，l 姻) 述稿嗣乳酸菌发酵生产花奎酸奶。 农瑟包、辍糕、镬头中添翔筏生餐自粉，不傻可 ；l 改善谷物鹃营养价值，还缝使产 品结构蓬松、柔软、富有弹性，添加量为面包4 一8 ，摄糕1 5 一2 0 ，馒头1 5 一3 5 。 在面条中加入花擞蛋自耪可增细糯团韧性，不易骶条，剿；蟊漕突。花生蛋白粉经浆法戴 碱法处理厢，是很好的发泡剂，w 广泛应用于中西糕点、糖果簿食品中，另还可作为碳 羧饮辩、嗥灏簿静发溆稳定裁。将花生蛋臼羚翔入至敬激凌中霹壤如铡藩鼹爨铯健，掇 搿膨胀率，改进产品质爨，改莓磐养鳞构。 3 第一章概述 。3 2 芯生滚缝蛋自 国内制取张生浓缩灏白多采用水剂法，在理论研究和中试生产方面已经取得了很大 静戏裁( 李磺传，1 9 瓤) 。瘩熬法虽然凝畜不袋霜簿发性荔燃滚藕豹特点，毽翻予蠲懿 法制得的蛋白产品中含油量较高而影响蛋白质的功能性，同时擞产中大蹙的废水难以处 理，这照因素都涮约了农帮法静推广。为了改遴花生浓缩蛋自酌制备工麓，刘天川等( 刘 大川等，1 9 9 6 ) 研究用稀酸沉淀法，乙醇洗涤法，稀酸沉淀和忍醇洗涤捆结合三种不同 的方法来制备浓缩蛋自，并将产品的功能特性岛大豆浓缩蛋白进行了对照，发现用稀酸 沉淀积忍醇洗涤稠结会熬方法制褥的产菇其吸承性、纛纯性及襞纯稳定性与大援浓续爨 自相当。 慈警滚鸯摹鬓是吴骞嶷姆瓣暇拳毪、铩痰毪、吸淫褴、嚣托链等毪鬟，霉鞋将其添黧 到火腿、香肠、午餐肉等畜禽肉制品中，可保持肉汁水分不流失，加工中风味物质不损 失，键逶鬻莸裁收，减痧裁品鹣“走i 蠡”现象，翻品黥够这虱缀织细腻、风味诱入，富 有弹性。将花擞粉加入到冰激凌中可增加制品的乳化性，提高膨胀率，改进产晶质量， 改善营养结构。 1 1 。3 3 花生分离蛋白 花艇分离鬣白的蛋自质含豢在8 5 秘9 0 9 6 之闯戚更高( 周瑞宝，2 0 0 3 ) 。据有关报道( 刘 大川等，2 0 0 1 ) 以采瓣藏浸羧提淀淀法纛超滤貘法裁备花生努褰蛋爨，共饕越秀穆工 艺进行了比较，用超滤膜法制备的花生分离蛋白强白纯度明显优于碱浸提酸沉淀法制备 瓣花玺分离蛋巍，瑟量萌麓特髓氇有显藩瓣挺麓，这 ；毛麓超滤貘法翻餐花生分嵩蛋自愁 一种先进的，有巨大潜力的新工艺。但魑目前尚需解决的技术问题是超滤膜的污染及适 宜静清洗方法。 1 1 3 4 花生萤自肉 稳锈辍裔淘麓一静高强自信岗整千翻食晶。辩前市两豹植物灏自肉种类主要有大媛 萤自爵鞫花生蛋囱肉( 文泽富，1 9 9 4 ) ，其生产工艺主要是戳脱精花生粉为原料，用均 匀挤堪膨化方法敬变花生骚白的缀织形式，经纺数集柬、挤雅喷爆等加工处理，使之凤 有瘦肉的质椅特蔹。秘生蛋白肉还含有花生的臀眯，蕊犬豆蛋白肉中峰奔豆艨噱。具体 的制作工艺是将脱脂花生粉加水2 5 、纯碱o 7 、食盐1 混合均匀，经蓉列加工处理， 生成具鸯瘦肉特镢戆产最帮为芯黛缀织蛋鑫，熔拣芘生鬣羯巍，鬣鑫震含爨袭5 溅左右。 食用时用热水浸淑3 5 嫩n 裁霹泡较，醮似瘦滤黪。藐生蛋白痰w 曩予炒菜，代耩部分 4 沈阳农业太学硕士学位论文 誉爽终雾瑟、火凝、争餐瘫等。 1 1 4 花生蟹白利用巾存在阍题及改进方法 1 。 毒。 改逡制渣工艺，获番低空牲兹生蛋叁 花生在我豳多年来以制油为主要目的，传统的制油方式使褥蛋白质变性严霞。现在 已经程大豆翔正中研究采用祗漱预榨一浸出法，水溶i 袅等先迸翻油工黧。在花生加工中 为了得至q 低变性的花生蛋皂，探讨了低温榨油王艺，假最终没商实现大规模驰正业化生 产，主鬻原因怒油品纯度较低，风味麓，若能通过调配等方法提高油晶风味，则低温榨 油工艺可以进一步来撼广。爨鞑今蜃懿歪艺改避应该缝合瑰鸯戆设备表疆究霹以摧广翳 油脂与焉白兼得的技术，使蛋囱质资源得以最大限度的利用。 l 。 。4 。2 不嚣臻缝耪憋芯生蛋彝产鑫懿秀发 植物蛋白的改性釉功能性研究是当今西方发达国家研究的热点。美国和日本在这方 蘑璐究矮毽秀颁先蘧缱，仅美戮a 蕊公镯和c e n t r a ls o y 公看j 簸可生产5 个系捌上吾葶争 具有不同功能特性的大豆分离蛋白，广泛用于肉食品、乳制品、焙烤食品和保健食品等 行监。对于花嫩蛋自可以采用缀化因索( 如酰化作用、磷酸化作用、脱酰胺作用、糖萋 化作用、共价交联作熙、蛋白水解作用等) 和物理因豢( 如热、射线、机械振蕊等) 采 改性以获得功能性质( 乳化性，溶解性，吸油性等) 比较好的产晶( 孔祥珍与周惠 骧，2 0 激) ，将薨添燕戮篡它食鼓孛，扩大花生强鑫豹莛臻途径，提蠢兹裳蛋毫熬拳| 鼹攀。 另外通过酶法改性还可以制得具有不同生理活性的花擞蛋白肽产品，以满足特殊人群对 营莽豹器求。 1 1 4 3 花生黼白的营养均衡 惩臀花生蛋鑫是释优鬟豹翟叁震资源，毽宅依然存在一是豹弱赢，帮爨黉蘸摹黢 缀成不平簿，存攫限潮性氮墓酸。因越螫充分稠爆花生爨囊熬营葬赞毽，一方瑟应当洼 骥箕释为辅料和添热i f l | 与跨镧晶、乳翻黼配合使埔班挺离其惑蕊和营养价值。勇方面 缀警撩强采聪馓生锡发酵、复台游翻翔求解等生裙技术转纯花警蛋自质，提离箕营养价 值和附加值。 1 。2 功缝性短肽的研究现状 1 2 。功能性趟黻的概念 入 】遥遭疆巍发凝，在甍基黢梅簸煞终鬟审，有一类不溺予蛋鑫瑷静中蠲物质，这 转憋缓基窍特殊瓣珐缝，入稻称之为敖，又称多款，它爨蠢嚣个翻死吾令豹氨基羧组成 5 第一章概述 ( 刘玉德与曹雁平，2 0 0 2 ) 。对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物 叫生物活性肽或功能性肽( b i 0 1 0 9 i c a l l ya c t i v ep e p t i d e s 或b i o p e p t i d e s ) ( 陈义勇 等，2 0 0 4 ) 。自从1 9 7 9 年，b r a n t l ( 庞广昌等，2 0 0 1 ) 等首先报道了从喂食了牛乳酪蛋 白酶解物的豚鼠的小肠中发现了具有类吗啡活性的小肽以来，已经从动、植物和微生物 中分离出多种生物活性肽。他们具有多种多样的生物学功能，如激素作用、免疫调节、 抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抑制细菌、病毒和抗癌作用，抗氧化作用、改善元素吸 收和矿物质运输、促进生长、调节食品风味、口味和硬度等。 1 2 2 功能性短肽的吸收机制 现代营养学研究发现，蛋白质经消化道中酶作用后并不是完全以游离氨基酸的形式 被吸收，而是主要以肽( 特别是二、三肽) 的形式被吸收，而且机体对肽的吸收代谢速 度比对游离氨基酸快，这主要是因为肽与游离氨基酸在体内有不同的输送体系。肽的吸 收是逆浓度梯度进行的，其转运系统可能有以下三种( 杨闯，2 0 0 3 ) ：第一种是依赖氢 离子浓度或钙离子浓度的主动运转过程，需要消耗a t p 。这种转运方式在缺氧或添加代 谢抑制剂的情况下被抑制。第二种是具有p h 依赖性的非耗能性钠离子氢离子交换转运 系统。第三种是谷胱甘肽( g s h ) 转运系统，由于谷胱甘肽在生物膜内具有抗氧化作用， 因而g s h 转运系统可能具有特殊的生理意义，但目前其机制尚不十分清楚。此外，肽在 机体肠道细胞中还存在许多独立的肽酶反应( 励建荣与封平，2 0 0 4 ) ；肽的抗原性要比 其原型蛋白质的抗原性低；肽比游离氨基酸更少高渗性，还可避免氨基酸之间的吸收竞 争。这都使得一些肽能以完整的形式被机体吸收进入血液循环系统，并被组织利用。由 此可见多肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高，用生物活性肽开发有益于人类健 康的各类保健食品前景看好。 1 2 3 功能性短肽的制备 目前，制取生物活性肽的方法主要有合成法和蛋白质体外水解法两种。合成法又有 化学合成、d n a 合成、酶法合成三种方法( 郑静佳，1 9 9 2 ) 。化学合成法虽然可按人们的 意志任意合成活性肽，但因副反应多且易产生有毒物质和残留化学物质等问题制约着其 发展。d n a 重组技术有望成功，将会有广阔的发展前景，但就目前情况来看，其成本太 高，无法大规模工业化生产。蛋白质体外水解有三种方法：酸解、碱解和酶解。前两者 简单易操作，但可能存在营养和毒理安全问题，如蛋白质在酸水解中会造成某些氨基酸 的损失、产生的蛋白质衍生物包含非天然结构，或不能被人体代谢，甚至也有可能产生 6 沈阳农业大学硕士学位论文 撩翻撵瘸亵毒谯( 酶解嚣孛产生瓣氯秀酪) ：蛋鑫震经藏簸理爱，其串熬懿薹酸发生了溺 旋作用，使必需氨基酸的l 一对映体减少和消化寨降低，并产生肖毒的肛氨基酸。因此 强囊袋静纯学法术瓣在食菇热置中羲痰曩l 受羁极大静限涮。 蛋囱质的酶法水解怒一种漱和的水解方法，一般不会导致营养方面的损失，也不会 产生毒能方面的问题。鬣自酶酶解蛋白质的过獠如下( r q u e z 毗e ta l ，1 9 9 9 ) ： 1 打开肽键；c h r l o p 咖卜_ c h r “+ 娃曲蛋白酶_ c h r l 电。0 h + n h ：厂h r “ 。“ 2 旗子交换 c h r 7 c o o h + n h 广h r “c h r o 吒o 旷+ n h 3 + - _ c h r ，7 3 。懿基集爨鹣滚定：糍卜吒珏r ，7 + o 扩峰雠漩7 7 + 珏癸 蛋囱酶水解蛋白质时作用部位因肽键种类而异；这种蛋白酶对切点的特异性要求 瓣鞭虽蠢酶露藏物专一瞧。由魏霹冤酶涟裁备奎锈活径敖对，菠确选耩强鑫酶燕生产上 的关键。现有的蛋白酶种类很多，按水解蛋白质的方式不同可分为以下几种； l ，内窃酶。切开蛋稳质分予内部菰键，将鬣囱质承解成分予量较小的多肤类。包括 动物蛋肉酶，如胰蛋白褥、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等；植物擞白酶，如木瓜摄自酶、 菠萝蛋爨酶、无花果蛋囱酶等；以及徽擞物来源蛋白酶，如丹麦诺维信公司生产的碱性 爨白酶a l c a l a s e 、复合骚自酶p l 搬x 、中性撰鑫酶n e u t r a s el 三 及国产匏碱髅蛋鑫酶 地衣型芽孢秆荫2 7 0 9 、中性蛋由酶枯草杆菌1 3 9 8 、放线菌1 6 6 、栖土曲霉3 9 4 2 、酸 经蛋白溱黑夔簿3 3 5 0 等。 2 外切酶。切开蛋白质或多肽分子氮基或羧基末端的肤键，而游离出氨基敞。其中 叉恕稼矮子蘸基寒蝼熊称兔氨默酶，器藤予羧蒸未裁翁旅失装默酶。瓤静麦遘镣偿公司 难产的f l a v o u r g y m e 酶飙含有外切酶。外切酶的一个重簧特性就是能够搬处于黻链末端 静巯承性氮蓁酸零簿趣寒，簿 氐多敖豹蔷踩。 3 。眷些蛋白酶还能撼本解蛋自质或多肽的懿键帮懿腔键。 1 2 4 确艟往黼黻的生耀活性 到爨裁戈止，已经发现了许多具鸯萋要生理功能黥秘髓链短肢，这鉴默类热有等鬻 煎要和广泛的擞物学功麓和调节功能，矮中有贱已经通过工业化生产进八国际市场。自 扶1 9 7 9 每其毒类蹲喀满链鹣短簸谈发现疆寒，戆蛋垂源缒功鼹畿短获方匿懿秘褒邃蓑 迅速，熟生理功能越来越引起人们的重视，并豳趋成为乳品领域研究的焦点。s o f i a 瓿s i l 豫等( s i 强辨苷鑫l ，2 5 试为貉蛋彝磅黥饯短致霄酒大生薅活经：1 羁子 心血管祭统。生蔡包括些抗m 糗肽和抗高血聪肽：2 制于神经系统，主要是阿片肽； 第一苹极述 3 利于免疫系统，主要是一些免疫调节肽和抗菌肽：4 利于营养系统：主要是利于钙的 吸收的酪蛋白磷酸肽( c a s e i n o p h o s p h o p e p t i d e s ，c p p s ) 和能促进胆囊收缩素释放韵糖 巨肽( g l y c o 盼c r o p e p t i d e ) 。 在营养蛋白如大豆、玉米、花生等种子蛋白的多肽链内部普遍存在着功能区，选择 适当的蛋白酶水解这些多肽，可将其释放出来。大豆肽是由大豆蛋白经水解所得到的短 肽，其在原大豆蛋白序列中并无活性，一般通过胃肠道时释放出来的很少，但在体外可 通过酶解将这些功能性歇段释放出来并加以浓集，然后作为新的治疗药剂、功能食品添 加剂或饲料添加剂来使用。大豆肢具有许多生理活性如低过敏原性、降低血脂和胆固醇、 降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢、抗氧化、增强运动员体能等。吴建平等( 吴建 平等，1 9 9 8 ) 、通过酶解法生产大豆降压肽，酶解上清液的半抑制浓度为1 2 0 n l g m 1 ；其 确定酶作用大豆蛋白产生具a c e 抑制活性肽的最适条件为反应温度5 0 ，酶鸯为4 ， 底物浓度为7 5 ，p h 为9 ；在这种条件下所得的肽混合物的氨基酸主要是亲水性氨基酸， a s p 、g 1 u 、a r g 、l e u 占总量的5 1 0 6 ；r p _ h p l c 分析结果表明：产物中至少有1 8 种肽， 主要为2 6 肽。范俊峰等( 范俊峰等，2 0 0 4 ) 用p r o t e a s e a 和o r i e n t a s e b 酶解大豆蛋 白，其产物的a c e 抑制活性均随水解时间的增加成指数规律增加；其中，o r i e n t a s e b 酶解得水解物的抑制活性最高达9 5 ，p r o t e a s “的最高也达到9 1 3 3 ；经鉴定两种酶 解物均由2 5 个氨基酸组成的寡肽，吸收性良好。日本不二制油公司，雪印和森永等乳 业公司先后采用酶法规模化生产出可抗疲劳，增加体能的大豆肽功能食品供运动员使 用，年销售额就高达3 0 亿日元。 玉米蛋白的氨基酸含量极不平衡，这样的蛋白质经消化在肠道中形成的可溶性蛋白 氮含量低，形成的游离氨基酸高，不利于吸收。通过体外水解制备玉米肽，可以减少游 离氨基酸的生成将提高玉米蛋白的营养价值。玉米活性肽具有降血压，促进酒精代谢， 降血脂，清除自由基等生理活性。昌友权( 昌友权，2 0 0 4 ) 利用碱性蛋白酶在5 0 ，即h 8 o 的条件下酶解玉米蛋白，得到的玉米蛋白水解物通过超滤、凝胶过滤龟谱、离子变换色 谱、高效液相色谱等分离提取，最终得到一种抗疲劳肽，一级结构为l e u a s p t y r g l u ， 分子量为5 3 9 2 。李艳丽( 李艳丽，2 0 0 3 ) 在5 5 ，底物浓度5 的条件下采用碱性蛋白 酶和木瓜蛋白酶混合双酶分步永解玉米蛋白，产品得率在6 0 左右，经过生物活性实验 证明产品具有促进乙醇代谢作用和抗疲劳作用，并有明显的量效关系。日本已经蒋玉米 肽开发成低热量的早餐饮料，还开发出了降血压作用的玉米混合物“缩氨肽”等黄晶级 沈阳农业大学硕士学位论文 篡夔暴。 1 3 立题依据与研究内容 对予花生鬣自救豹研究，在国内蠡孽文献壤邋中，主要是致花生粕势原料，选择不同 的蛋自酶进行水解，研究集中农酶制刹的筛选及酶解工艺参数的优化等方面，并且其酶 解产物的分子激均在1 0 0 0 0 d 以上，对冀生物活性的报邋很少。在美国和其他西方国家， 由于饮食的习惯，健们枣食花黛酱，芯患总产爨熬7 p 8 溅鼓用袋加工兹生酱，耀来辖濑 的花生只占总产量很少的一部分，故国外对花擞蛋白的研究主鬻集中在花生过敏原的研 究上，瓣芯生敖麴繇究锻少。我瀑农韭部“一轰”农产品燕王发展撬翔孛瞧鞠确提窭； 2 0 0 5 2 0 1 0 年我国花生加工业主要由数璧的增长转变为质量的提高，产品品种和经济效 益弱步增长，箍嵩深鞠王转纯攀辍羁蠲奉：逡一步谯纯产鼗绪构，着羹提高叟产技术永 平和产鼯的科技含量。同时利用花生粕生产功能性短肽这一课题研究可以为企业解决副 产燕深加工静难题，褥海企韭的经济效益；满建市场上对特定功能食黼的需求。由此可 见发展以花生粕为原料的功能性短驮既适应企渡和市场的嚣求，又符合我重农产晶加工 宏观发煨的要求。 本论文将来爆复合薅解豹方法对兹生蛋鑫遴行较铹瘫戆瘩艇，使分子量在5 鹋o d 以 下的花擞肷的褥率提高。同时对花生肷产品进行精制，并对其擞物活性进行初步的体外 捡溺。逶过蘸实验褥翻艇产兹囊获产熬瓣王艺流程鳃下： 花嫩蛋白粉 花生蛋白溶液 擎貔承辩 l 复台酶东解 酶灭活 l 离心取上清液 l 己醇沉淀 l 囊空旋转蒸发 ； 花啦蛋白酶解液 涨黢一l 超滤 9 第一章概述 1 分予量大予5 k 的拢生肽 分子量小于5 k 的花生肽 l 冷凉干漂 ( 粉碎) 花生肽粉 l ( 鲍花生肤 根据工艺流程，本论文的研究内容又可以具体嫩分成以下四个方面 ( 1 ) 藏生蛋自肇酶水瓣中酶懿秘类救赡选及酶蜒条传鹣馕纯。 ( 2 ) 托生蛋白复合酶解中酶的种类的筛选及酶解条件的优化。 ( 3 ) 越滤分缀秘大魏瓣器魏簸忑艺串掇律参数瓣确定。 ( 4 ) 花生肽产鼎生理灞性的体外检测。 i o 沈阳农业大学硕士学位论文 第二章花生蛋自的单酶水繇硒究 2 1 弓l 言 酶法水解骚自制餐活性肽是目前嫩产活性肤的主要方法。水解蛋囱质的酶种类繁 多，纛最荟秘添鲍拳缎黪力差勇缀丈，嚣此垂确选择逶舍瘩瓣芯生蛋囱豹酶类，是生产 花生蛋白活性肽的关键。本章选用了四种蛋白酶对花擞蛋白进行单一辩解实验，比较不 嚣酶黥汞勰戆力，麸巾舞选出窳解熊力最强煞凝鑫酶俸为第一步拳簿豹工其酶，劳对箕 水解条件进行优化。 2 2 材料和方法 2 。2 。 愿辩靼生要试荆 材料名称来源 藐：璧蛋白羚考繇长寿食箍寿蔽公司 a l c a l a s e 碱性蛋肉酶诺维信公司( 丹麦) o t 醐e x 中毪蛋蠢酶诺缭售公司 ( 李棒楱， 9 8 ) 酶活力定义：在特定条件下作用于酪蛋白底物每分钟产生l 肛g 酪氮酸为一个活力 肇伎。酶活力霹以用n p u 表示。 2 2 3 1 。1 酪氨酸标准曲线的测定 称取l o o 琬gl 一酪氨激( 预先将酪氨黢在1 0 5 烘箱中烘至恒重) ，加o 2 m o l 几盐酸 澄鼹后患容l o 漱l ，秀煺拳稀释5 倍，褥到2 0 0 咎融l 豹酪氨酸滚滚。垮2 0 0 # g 内ll 一 酪氨酸溶液用水稀释至2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0ug m 1 等不同浓魔。从中各取l m l 于试管 孛，翅入0 。4 赫l 虎豹瓣蕊琶溶液s 噩l ，再燕入瓢l 褥转酸试羯，混会均玺螽，在3 0 水浴中保温3 0 m i n ，取出试管，在分光光度计上测出6 6 0 n m 的o d 值，最后以酪氨酸浓 凄为横黛标，竞密度兔缀垒标，作密赘氮酸标准馥线。 2 2 3 1 2 样品酶活力的测定 8 待灏擞自酶液的制备 糖确称取2 0 0 0 9 蛋白酶用缓冲液( 不同种爽的蛋囱酶选择不圊p l 缀鲍磷羧盐缓 申 液) 溶解，最后用缓冲液定容到1 0 0 1 。( 注，糟不能溶解的酶，则需要全部转移) 。放 震l h ，赦翘闻嚣援动数次，然菇将酶渡 豪澄保嚣。冁溺酶溪力羲，数姜璧澄乎餐，据鸳， 褥吸取酶液，用缓冲液将酶液稀释适当的倍数。 b 测定步骤 用溶解该蛋白酶的缓冲液配制2 酪蛋白溶液，将2 9 6 酪蛋白溶液放入4 5 憾温水浴 巾预热3 5 盘i n 。取稀释好豹待溯酶液i m l 于4 5 永浴中预热l 一2 m i n ，在待测酶液中 加入挑酪蛋白溶液l m l ( 记录反应时间) 反应l o m i n 后嶷即加入2 0 t c a 溶液2 l l l l ，摇 匀置于沸水浴2 0m i n 灭酶，4 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，取上清夜l m l + o 4 m 0 1 几的n a 瓯 滚液5 m l + 稀释懿f o l i n 一羚试裁o 。5 m l ，混每，敖入3 0 恒浸水漆显色2 0m n ，s 6 0 n m 嗽色铡定。空白对照：麒他步