（分析化学专业论文）对二甲氨基苯甲酰胺衍生物的合成及分子识别应用.pdf

摘要 摘要 以荧光作为输出信号的分子识别具有高灵敏度、高选择性和快速简便等优 点，广泛应用于生命科学、环境科学和信息科学等领域。本文分五个部分介绍荧 光分析法在一些研究领域的发展状况，阐述本论文所建立的荧光化学传感体系及 相关理论模式。 第一章文献综述，简单阐述四种主要的荧光识别原理，概述了国内外近年来 荧光分析技术在过渡金属离子和生物分子识别方面的研究进展。 第二章主要介绍了论文工作中所应用的5 种荧光化合物的合成方法、结构 鉴定及光谱性质。包括 n 羧甲基- n ( 对二甲氨基苯甲酰) 肼基】乙酸( 主体1 ) 、【4 一 二甲氨基苯甲酰) 乙氧羰甲基氨】乙酸乙酯( 主体2 ) 、【羰甲基( 4 二甲氨基苯甲酰) 氨基】乙酸( 主体3 ) 、( 4 二甲氨基苯甲酰氨基) 乙酸乙酯( 主体4 ) 及( 4 二甲氨基 苯甲酰氨基) 乙酸( 主体5 ) 。 第三章采用紫外可见分光光度法及荧光光度法研究了 n 羧甲基- n 一( 对二甲 氨基苯甲酰) 肼基】乙酸( 主体1 ) 与血清白蛋白的相互作用，并探讨其作用机理。 第四章采用紫外可见分光光度法及荧光光度法研究了n 羧甲基- n 一( 对二甲 氨基苯甲酰) 一肼基乙酸锌配合物( 1 z n ) 与蛋白质相互作用。 第五章应用荧光法和紫外可见分光光度法研究【4 二甲氨基苯甲酰) 乙氧羰甲 基氨】乙酸乙酯( 主体4 ) 和( 4 二甲氨基苯甲酰氨基) 乙酸乙酯( 主体2 ) 对 c u 2 + 的识别作用，c u 2 + 的加入使主体荧光猝灭。选择性实验结果表明主体对c u 2 + 具有很好的选择识别作用。 关键词：分子识别：吸收光谱；荧光光谱；i c t 双重荧光：血清白蛋白；铜离 子 i i a b s t r a c t m o l e c u l a rr e c o g n i t i o nb a s e do nf l u o r e s c e n c ed e t e c t i o nh a sm a n ym e r i t s ，i th a s a t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o na n dh a sb e e na p p l i e dt om a n yf i e l d s ，s u c ha sl i f es c i e n c e s ， e n v i r o n m e n t a ls c i e n c e sa n di n f o r m a t i o ns c i e n c e s i nt h i st h e s i s ，i c tf l u o r e s c e n c e c h e m o s e n s o r sc o n t a i n i n gn - a m i n ot h i o u r e a sw e r es y n t h e s i z e d ，t h e i rs p e c t r ap r o p e r t i e s a n da p p l i c a t i o ni nm o l e c u l a rr e c o g n i t i o nh a v eb e e ni n v e s t i g a t e di nt h ef o l l o w i n gf i v e c h a p t e r s i nc h a p t e rl ，t h ed e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rr e c o g n i t i o na n dm a i nf l u o r e s c e n c e m e c h a n i s m so fr e c o g n i t i o nw e r er e v i e w e d t h ef l u o r e s c e n c eb a s e do ni n t r a m o l e c u l a r c h a r g et r a n s f e r ( i c t ) i ss e n s i t i v et ot h ee x t e r n a le n v i r o n m e n t t h u st h ef l u o r e s c e n t c o m p o u n dc o n t a i n i n gi c tf l u o r o p h o r ei sag o o dc a n d i d a t ef o rp r o t e i n sa n dt r a n s i t i o n m e t a li o n s c h a p t e r2d e s c r i b e ds y n t h e s i s ，c h a r a c t e r i z a t i o nb y i ra n d1 h n m ra n dt h e s p e c t r a lp r o p e r t i e so ft h ef i v er e c e p t o r sd e s i g n e di nt h i st h e s i sf o rs e n s i n gf o rp r o t e i n s a n dc u + t h e s er e c e p t o r si n c l u d e 【n c a r b o x y m e t h y l n ( 4 一d i m e t h y l a m i n o b e n z o y l ) - h y d r a z i n o - a c e t i ca c i d ( 1 ) ，【( 4 - d i m e t h y l a m i n o b e n z o y l ) - e t h o x y c a r b o n y l m e t h y l a m i n o - a c e t i c a c i d e t h y le s t e r ( 2 ) ，c a r b o x y m e t h y l - ( 4 一d i m e t h y l a m i n o - b e n z o y l ) 一 a m i n o a c e t i ca c i d ( 3 ) ，( 4 - d i m e t h y l a m i n o - b e n z o y l a m i n o ) - a c e t i ca c i de t h y le s t e r ( 4 ) a n d ( 4 一d i m e t h y l a m i n o - b e n z o y l a m i n o ) 一a c e t i ca c i d ( 5 ) i nc h a p t e r3 ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ni n - c a r b o x y m e t h y l - n ( 4 - d i m e t h y l a m i n o - b e n z o y l ) 一h y d r a z i n o - a c e t i ca c i d ( 1 ) a n ds e r u ma l b u m i n sw a si n v e s t i g a t e db y a b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p ya n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y i np h7 4t r i s h c ib u f f e r s o l u t i o n ，t h ep r e s e n c eo fs e r u ma l b u m i nl e dt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yt oi n c r e a s e a l o n gw i t hs p e c t r u mb l u es h i f t h o w e v e r , o b v i o u ss p e c t r a lc h a n g ec o u l d n tb e o b s e r v e dw h i l e a d d i n gp r o t e i n s i n t ot h es o l u t i o no f c a r b o x y m e t h y l 一( 4 - d i m e t h y l a m i n o b e n z o y l ) a m i n o - a c e t i c a c i d ( 3 ) o r ( 4 - d i m e t h y l a m i n o b e n z o y l a m i n o ) 一a c e t i ca c i d ( 5 ) ，a l t h o u g ht h e i rs t r u c t u r e sa r es i m i l a r i tw a so b v i o u st h a tt h el i n k e r - n h - n h - b r o k et h ec o m m u n i c a t i o nb e t w e e ns i g n a l m o i e t ya n db i n d i n gm o i e t y w h i l elb o u n dw i t hp r o t e i nv i am u l t i h y d r o g e nb o n d so n t h e - n ( c h 2 c o o h ) 2a n dc o n hm o i e t i e s ，t h ec o m m u n i c a t i o nw a sr e s t o r e da n d d r a m a t i cs p e c t r ac h a n g eo c c u r r e d t h el i n k e r - n h 二n h - b e t w e e nf l u o r o p h o r em o i e t y a n db i n d i n gs i t ep l a y e dk e yr o l e s i nc h a p t e r4 ，a b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p ya n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yw e r eu s e dt o i n v e s t i g a t e t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns e r u ma l b u m i n s a n d 【n - c a r b o x y m e t h y l i i i n ，( 4 d i m e t h y l a m i n o b e n z o y l ) h y d r a z i n o 一a c e t i c a c i d ( 1 ) z i n cc o m p l e x t h e e x p e ：r i m e n t si n d i c a t e dt h a ti np h 7 4t r i s h c ib u f f e rs o l u t i o n ，t h ee n h a n c e di n t e n s i t y o ff l u o r e s c e n c ew a si np r o p o r t i o nt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n ss u c ha sb o v i n e s e r u ma l b u m i n ( b s a ) ，h u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) i nt h ew i d er a n g e ，a n d t h e i r d e t e c t i o nl i m i t sa r e2 5x10 - 8a n d9 0 x10 - 9m o l l - i , r e s p e c t i v e l y t h eb i n d i n gd i s t a n c e b e t w e e nc o m p l e xa n ds e r u ma l b u m i n sa n dt h ee n e r g y t r a n s f e re f f i c i e n c yw e r e o b t a i n e db a s e do nt h et h e o r yo ff r r e s t e rs p e c t r o s c o p ye n e r g yt r a n s f e r t h eb i n d i n g c o n s t 锄t s 、e r ee s t i m a t e da s6 4 5 x 1 0 4 m o l l 1a n d7 0 8 x 1 0 4 m o l l 1f o rb o v i n es e r u m a i b u m i n ( bs a ) a n dh u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) r e s p e c t i v e l y , a n dt h en u m b e ro f b i n d i n gs i t e sw a s1 f o re a c h t h ee f f e c to fc o m p l e xo nt h ec o n f o r m a t i o no fs e r u m a l b u m i n sw a sf u r t h e ra n a l y z e du s i n gs y n c h r o n o u s f l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yr e v e a l e dt h a tt h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f b s a c h a n g e di nt h ep r e s e n c eo fc o m p l e xb u t t h a to fl i s ad i d n t i nc h a p t e r5 t h ef l u o r e s c e n tc h e m o s e n s o r sb a s e do n4 - d i m e t h y l a m i n o - b e n z a m i d e d e r i v a t i v e sf o rt h er e c o g n i t i o no fc u + i na c e t o n i t r i l es o l u t i o nw a sp r o p o s e d t h e i n t e r a c t i o no f “d i m e t h y l a m i n o b e n z o y l a m i n o ) - a c e t i ca c i de t h y le s t e r ( 4 ) a n d 【( 4 d i m e t h y l a m i n o b e n z o y l ) e t h o x y c a r b o n y l m e t h y l a m i n o - a c e t i ca c i de t h y le s t e r ( 2 ) w i t hc uw a si n v e s t i g a t e db ya b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p ya n d f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y t h ef l u o r o g e n i cc h e m o d o s i m e t r i cb e h a v i o r st o w a r dv a r i o u sm e t a li o n s w e r ea l s o s t u d i e d h i g hs e n s i t i v i t ya sw e l la ss e l e c t i v i t yw a s a c h i e v e df o rc u 十t h ep r e s e n c eo f c u 2 + i n d u c e dt h ef o r m a t i o n1 ：ic o m p l e xw i t hb o t hr e c e p t o r s t h eb i n d i n gc o n s t a n t s w e r ee s t i m a t e da s5 1 x 1 0 7 m o l q - la n d8 5 x 1 0 6m o l - k l ，r e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ，i c t d u a lf l u o r e s c e n c eh o s t , a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y , f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , s e r u ma l b u m i n ，c u i v 符号说明 符号说明 饿一厂c o o h k - - - c o o h 中文名称：【n 羧甲基- n - ( 对二甲氨基苯甲酰) 肼基】乙酸 英文名称：n c a r b o x y m e t h y l - n ( 4 d i m e t h y l a m i n o b e n z o y l ) - h y d r a z i n o a c e t i ca c i d 代称：主体1 h ) 弋 1 3 b ( 1 8 x 1 0 6m 。) 1 3 e ，与h s a 作用的p k 的大小顺序为：1 3 a 1 3 b 1 3 c ， 实验还说明了它们是作用在h s a 的i i 区，二价阴离子在蛋白质的环境中是稳定 的。 1 3 tr l - 珏i 魁- c i 1 3 or i - 琏r 2 - h 1 3 cr i - 也r 2 , - 0 1 1 1 3 y a n gjh 等1 4 1 】研究了香豆素衍生物1 4 ( 7 羟基6 甲氧基香豆素) 与血清白 蛋白的相互作用，探讨了作用机理。该主体使b s a 荧光猝灭而自身荧光强度增 强。在优化条件下，体系荧光强度的增加值与蛋白质的加入量在一定范围内成正 比，可用作定量检测蛋白质的荧光探针，对b s a 和h s a 的检测限分别是 1 4 x l o 。8g - m l 。1 和1 1 x 1 0 8g - m l 。 1 4 1 3 1 2 荧光素类荧光传感器 荧光素又称荧光黄，由于氧桥键把两个苯环固定在一个平面上，使分子具有 6 第一章分子识别与荧光传感器研究进展 刚性平面结构，在激发光的作用下能产生强而稳定的荧光，具有高的摩尔消光系 数、激发和发射波长都在可见光区、在水中具有较高的荧光量子产率、无毒和成 本低等优点 4 2 - 4 5 。 j u ne j 等【4 6 】合成了一种新的荧光素的衍生物1 5 ，采用荧光光谱法在p h 7 4 生理条件下，能识别毫微级浓度范围的c u 2 + ，从而利用这个配合物识别蛋白质， 能起到荧光化学生物传感的效果。 1 5 1 3 1 3 卟啉类荧光传感器 y a n grh 等【4 7 1 在环式糊精衍生物七( 2 ，6 - 一- i e 辛烷) p 环糊精( o c 3 - c d ) 存 在条件下研究了四苯基卟啉( t p p ) 、四苯基卟啉钴i i 配合物( c o t p p ) 与蛋白质的 相互作用。o c 1 3 c d 使t p p 荧光增强，增强的荧光却被c o t p p 猝灭。在该体 系中加入蛋白质，t p p 与蛋白质作用，被猝灭的荧光恢复。根据光谱法测量原 理和激发态荧光寿命研究了作用机理，t p p 荧光猝灭是由于t p p 和c o t p p 形 成了基态配合物，荧光恢复是由于c o t p p 与蛋白质结合，破坏了原来的聚合体。 在最优条件下，该体系对b s a 和h s a 的检测线性范围分别为0 8 7 5 4p g m l 和3 2 - 9 3 2g g m l ，检测限分别为o 3 2 嵋m l 。和1 0 6 嵋m l 一。该方法直接 应用于人血清中h s a 含量的检测。 f l - c d ：r h o c f l - c d ：舡们e h l ， 1 6 a n d r a d esm 等【4 8 】采用时间分辨荧光各向异性和荧光光谱法研究了两种不 同p h 值条件下自由基、水溶卟啉阴离子、苯基卟啉( t s p p ) 与药物载体蛋白 和b s a 的相互作用。旋转相关时间和平移扩散时间揭示t s p p 与血清白蛋白 结合导致蛋白质构象的微小变化。相比之下，卟啉则呈双指数衰减和很短的旋转 相关时间，这可能与卟啉在蛋白质结合位点的摆动有关。过量卟啉存在时，采用 7 第一章分子识别与荧光传感器研究进展 万删舶 旺( c h d 2 ) a n h a + 印c h 2 n h 3 * 1 8 1 9 h 2 ) 4 n h 3 + z oz l 1 3 1 5 吡嗪类荧光传感器 吴芳英等【5 l 】合成化合物2 2 ，2 ，5 一二【2 ( 3 ，5 一- - ( 2 吡啶基甲基) 氨基一4 羟基苯 基) 乙烯基】毗嗪，2 2 的锌配合物与血清白蛋白相互作用，在p h7 4 的生理条件 下，以4 3 5 啪为激发波长，体系最大发射波长为5 8 01 1 1 1 1 ，发射出强的绿色荧 光，可实现对白蛋白的“裸眼”检测，表明该配合物对蛋白质的检测在影相学上 有广阔的应用前景，是一种较理想的蛋白质荧光探针。配合物对b s a 和h s a 的检测限分别为1 1 7 x 1 0 一m o l l 1 和2 9 6 x 1 0 一m o l l 一，灵敏度很高。 第一章分子识别与荧光传感器研究进展 z z l 316 方酸菁类荧光传感器 方酸菁染料是由方酸和一些电子给体化合物发生缩合反应生成的一类l ，3 双 取代衍生物，与血清蛋白、乳球蛋白、胰蛋白酶原以非共价结合后，荧光量子产 率和荧光寿命都有显著增加，此类方酸菁染料是很好的蛋白标记物。n a k a z u m i h f 5 2 】等以噻吩或芘作为问隔链合成的双方酸菁探针2 3 和2 4 与b s a 、h s a 可 形成l ：l 复合物，荧光强度大大提高，是很好的近红外非共价蛋白质标记试剂， 尤其是2 3 d 和2 4 b 在分析化学和临床应用上有更大优势。 2 a tz i ；l ，l r ：- 毪l = l l a 2 0 bl 异l ，l 岛畦l 【r = 6 i t , l ：i ：1 0 k 2 3 cn ；i r - - r k - ( c 职咖1 1霹= 五乜 2 3 4z l = i 1 l i = l ( 1 一( c a - - c a ) l 譬= 已l l c o m 【 2 3 er a ：2 ，如r 乙l - t 3 = a x 2 0 fx t = 3 ，r i = l 匹l 【r = m 2 4 鱼n = l ，小矗l ：瓦r 3 = g b z 0 0 h 2 4 bn = l ，r l - 1 1 名一( c a = c a ) i g = c i f 0 1 1 1 2 5 v o l k o v akd 掣5 3 1 研究了苯并噻唑方酸菁染料2 5 与蛋白质的相互作用。 b s a 或h s a 的加入使主体荧光强度明显增强。在一定的浓度范围内，体系荧 9 第一章分子识别与荧光传感器研究进展 光强度的增加值与加入h s a 的量呈良好的线性关系，线性范围是o 2 5 0 0 l a g m u l ，检测限是0 2p g m l - 1 ，是很好的定量检测h s a 的荧光探针。 1 3 1 7 二甲氨基苯甲酰类荧光传感器 吴芳英等伶4 】合成i c t 荧光受体对二甲氨基苯甲酰胺基硫脲、n 对二甲氨基 苯甲酰胺基) - n 苯基硫脲，2 6 和2 7 的锌配合物1 5 5 】与血清白蛋白相互作用，i c t 荧光传感器在长波长处发射荧光，消除生物体系自身的干扰 5 6 - 5 8 。同时，i c t 荧 光试剂对外部微环境极其敏感【5 9 枷】，当环境疏水性增强时，其荧光产率通常会增 大l 引】。荧光强度随着白蛋白加入而显著增强，荧光峰蓝移，对h s a 和b s a 检 测限分别为8 3 9 x l o - 9m o l l 4 和7 5 4 x 1 0 一t o o l l 。 s 乏n h n h 3 3 3 2 = 3 1 。3 4 在摩尔比在1 0 ：1 时能够完全猝灭色氨酸， 3 3 则大约要2 5 ：1 。在一定的浓度范围内3 2 和3 1 不能完全猝灭色氨酸。实验 表明，类黄酮不能改变b s a 的分子结构，氢键作用、离子作用和疏水作用在类 黄酮与牛血清白蛋白结合中起到非常重要的作用。 3 1 h 3 2 1 3 2 金属离子c u 2 + 识别 铜元素是动植物体内必需的一种微量重金属元素。在人体内，铜元素的含量 仪次于锌元素和铁元素1 6 8 1 ，它参与了许多生物过程，例如：血红素的合成、联 接组织的生长及氧化磷酸化作用等 6 9 - 7 1 l 。然而，当铜离子浓度过大时，对人体的 毒性也很大。因此，检测铜离子及寻找铜离子的有效分析方法就显得十分重要。 下面就近年来主要的c u 2 + 荧光传感法的研究进展作一概述。 1 321 含n ，n 二乙酸基团化合物 类似经典螯合剂e d t a 结构及含有n ，n 二乙酸基团的化合物常被用来识 别重金属和过渡金属离子。s h i r a i s h iy 等m l 设计合成了一种新的包含有乙二撑 - n ，n 二乙酸基团的罗丹明衍生物3 5 。该化合物对c u 2 + 有很好的选择性，且发 出很强的绿色的荧光，而和其他金属离子络合却发出较弱的橙色荧光。大多数检 测c u 2 + 的化学传感器都是荧光猝灭的，该化合物和c u 2 + 络合后荧光增强，且 是第一个发射绿色荧光的罗丹明衍生物化学传感器。乙腈溶剂中主体发出很弱的 荧光，最大发射波长是5 7 5a m ，加入c u 2 + 后荧光强度显著增强，最大发射波 长蓝移至5 3 0n m ，发出绿色荧光。 第一章分子识别与荧光传感器研究进展 3 5 1 3 2 2 冠醚类或硫杂杯1 4 l 芳烃类化合物 冠醚类化合物和硫杂杯【4 】烃因具有独特空间结构，经常被选作结合各种金 属阳离子的识别基团。y a n gcl 等【7 3 】设计合成了一种侧链为氮杂1 5 冠5 的基 于芴的共聚物3 6 。该聚合物在一般有机溶剂如c h c l 3 、c h 2 c 1 2 和t h f 中发出 亮蓝色荧光。t h f - m e o h 体系