（微生物学专业论文）两株重组酿酒酵母的发酵及一株重组酿酒酵母的初步构建.pdf

首都师范大学学位论文使用授权声明 本人已经认真阅读首都师范大学的“研究生学位论文著作权管理规定 ，同意本人所撰写学 位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥有学位论文的部 分使用权，即： 1 )已获学位的研究生必须按学校规定提交印刷版和电子版学位论文，学校可以采用影 印、缩印或其他复制手段保存研究生上交的学位论文； 2 )为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文或解密后的学位论文作为资料在图 书馆、资料室等场所或在校园网上供校内师生阅读、浏览。 ， 回意途塞握交卮发查旦i 澄蜃；旦坐生；霄兰生蕉查。 储盛丑砬月上日 导师签名： 年月一日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程一，同意将本人的学位论文提 交“c a l l s 高校学位论文全文数据库一中全文发布，并可按“章程电的规定享受相关权益。 回意论塞握銮卮澄盾! 旦坐生；旦二生；睡生蕉查。 作者签名：鞘 上z - 年月上舀 导师签名： 年月一日 首都师范人学硕j ：学位论文 首都师范大学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： d 缝彳 首都师范大学位论文授权使用声明 日期：d 7 年舌月6 h 本人完全了解首都师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出 版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名： 刊亏臣气 日期：夕7 年舌月乡日 首都师范大学硕上学位论文 目录 中文摘要。l a b s t r a c t 2 氨基酸名称对照表3 一、前言4 l 世界和我国能源现状及未来发展趋势。4 1 1 世界能源现状4 1 2 我国能源现状及出路。5 2 由生物质能产乙醇的应用历史背景及意义6 2 1 由生物质能产乙醇的应用历史背景6 2 2 由生物质能产乙醇的应用的意义7 3 世界各国乙醇生产现状1 3 4 乙醇发酵的微生物。1 4 4 1 传统工业上发酵葡萄糖产乙醇的酵母及其代谢途径及其问题1 4 4 2 戊糖发酵生产乙醇的酵母及代谢途径1 5 4 3 发酵木质纤维素水解产物的酵母的改良1 7 5 酵母菌的代谢工程及国内外已构建的酵母基因工程菌1 8 5 1 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 19 5 1 1 表达x y l l 和x y l 2 酿酒酵母工程菌1 9 5 2 树干毕赤酵母( p i c h i as t i p i t i s ) 2 9 5 3 巴氏毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 。3 0 5 4 我国该领域的发展现状3 0 6 发展前景3l 7 本实验技术路线3 2 8 本研究的特点和意义3 4 二、材料和试剂3 5 1 实验材料3 5 4 、大肠杆菌感受态细胞t o p l o ，d h 5a 购买白天根公司；大肠杆菌感受态细胞j h l 0 9 ， h b l 0 1 购买自大连宝生物公司3 5 5 、质粒载体p m d l 8 - ts i m p l e 购自大连宝生物公司3 5 6 、质粒载体p y e s 2 由本实验室提供3 5 8 、质粒载体p a c t 2 和p d r l 9 5 为印丽萍教授馈赠3 5 9 、引物为上海生工生物技术服务有限公司合成3 5 2 式剂盒。3 5 3 培养基3 5 4 酶，抗生素及试剂3 7 5 溶液配制3 8 6 主要实验仪器3 8 三、方法和步骤。3 9 l 重组酿酒酵母的发酵实验3 9 1 1 带有x y l l 基因的重组的发酵实验3 9 1 2 重组s c e r e v i s i a ey s 5 8 一p 1 2 的发酵实验4 0 1 3 高效液相分析糖浓度。4 0 首都师范大学硕： ：学位论文 1 4 气相色谱分析乙醇浓度4 l 2 酵母染色体d n a 的提取4 1 3 目的基冈的获得：4 2 3 1 、引物设计：4 2 3 2 扩增x y l1 的p c r 反应条件及程序。4 3 3 3x y l 2 基因的扩增4 4 3 4 琼脂糖凝胶电泳4 5 3 5p c r 产物的纯化回收( p c r 产物纯化试剂盒) 。4 5 4 目的基因的克隆4 6 4 1 目的基因与t 载体的连接4 6 4 2 大肠杆菌感受态细胞的制备4 7 4 3 连接产物转化大肠杆菌宿主菌。4 7 4 4 重组质粒的筛选和菌落p c r 4 7 4 5 重组质粒的提取。4 8 4 6 重组质粒的酶切验证。4 9 4 7 目的基因x y l l 、x y l 2 的测序验证，以及完整的x y l l 基因片断和部分 p a c r 2 - x y l1 和p d r l 9 5 质粒序列的测序验证5 0 4 8 目的片段的回收、纯化5 l 4 9 带有部分p d r l 9 5 序列重组酵母表达载体p d y 的构建5 l 4 1 0 目的基因与酵母表达载体p a c t 2 和p d r l 9 5 的连接5 l 4 1 1 重组酵母表达载体及测序载体的导入5 2 四、结果与分析。5 2 l 重组酿酒酵母的发酵试验5 2 1 1 酿酒酵母y s 5 8 1 的发酵试验5 2 1 2 酿酒酵母y s 5 8 一1 2 的发酵试验5 4 1 3 重组酿酒酵母y s 5 8 - i 、y s 5 8 - 1 2 和原始菌株y s 5 8 在2 木糖+ 3 葡萄糖培养基上 的木糖利用率和乙醇产量的比较5 6 2c a n d i d as h e h a t a e 木糖还原酶基因( x y l1 ) 的克隆及表达载体p a c t 2 - x y l l 的构建 ! ；8 2 1c a n d i d as h e h a t a e 木糖还原酶基因( x y l1 ) 的克隆5 8 2 2 重组酵母表达载体p a c t 2 - x y ll 的构建5 9 2 3 含有完整启动子和终止子木糖还原酶基因( x y l l ) 的克隆6 l 3s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 木糖醇脱氢酶基因x y l 2 的克隆及重组载体p d r l 9 5 一x y l 2 的构建。6 l 3 1s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 木糖醇脱氢酶基因x y l 2 的克隆。6 l 3 2 重组酵母表达载体p d r l 9 5 - x y l 2 的构建6 2 4 测序载体p d y 的构建。6 3 5 讨论6 4 五、结论6 6 参考文献6 8 j s 【谢7 4 i i 醇的需求越来越迫切。而成本过高是阻碍发展由木质纤维素稀酸水解液生产燃料 乙醇的一个重要因素。其中一个主要的解决办法就是将水解液当中的原本不能够 由酿酒酵母发酵的木糖转化成乙醇，从而大幅度的降低成本。因此需要为传统的 工业酿酒酵母增加木糖代谢途径。文中前言部分还综合了近期国内外能够代谢木 糖的重组酿酒酵母菌的发展概况，以及本实验的目的和意义。 本文首先对重组酿酒酵母y s 5 8 - 1 和y s 5 8 - 1 2 进行发酵，利用重组酵母y s 5 8 - 1 进行木糖发酵实验，实验结果表明只带有x y l l 基因的重组酿酒酵母不能发酵木 糖产生乙醇，在有葡萄糖存在时，该重组菌株的木糖利用率接近5 0 ，但是仍然 不能发酵木糖产生乙醇，主要产物是木糖醇。重组酵母y s 5 8 1 2 进行木糖发酵实 验，结果表明虽然该重组酵母菌能在单独以木糖为碳源的发酵培养基产乙醇，但 是推测是酵母提取物当中含有一定量的可发酵糖类。 采用p c r 的方法克隆得到休哈塔假丝酵母木糖还原酶基因x y l l ，并将该基因 连入酵母表达载体p a c t 2 的强启动子a d h 下，得到重组表达载体p a c t 2 一x y l l 。 继而从该质粒上克隆出带有强启动子a d h 的x y l l 基因。并且讨论了构建过程当 中所遇到的大肠杆菌宿主的质粒选择问题。还采用p c r 的方法克隆得到酿酒酵母 木糖醇脱氢酶基因x y l 2 , 并将该基因连入酵母表达载体p d r l 9 5 的强启动子p m a l 下，得到重组表达载体p d r l 9 5 一x y l 2 。将p d r l 9 5 关键的未知序列克隆至已知序 列的质粒p y e s 2 上，从而测出该序列。 本实验构建的重组酿酒酵母表达质粒为后续的重组菌的改良奠定了良好的 基础。 关键词：木糖还原酶基因木糖醇脱氢酶基因酿酒酵母木糖和葡萄糖 首都师范人学硕f ：学位论文 a b s t r a c t t h ei n t e n s e g l o b a la n d d o m e s t i c se n e r g ys i t u a t i o ns t r e n g t h e nt h ed e m a n do f m a k i n gf u e l e t h a n o lf r o mc h e a pa n du b i q u i t o u sb i o m a s s h i g hc o s ti st h em a i nf a c t o ro f b l o c k i n gt h e d e v e l o p m e n to f p r o d u c t i o no f e t h a n o lf r o ml i g n o c e l l u l o s e sh y d r o l y s a t e o n es o l u t i o ni st o f e r m e n tt h ex y l o s ee x i s ti nt h e h y d r o l y s a t ei n t oe t h a n o lw h i c hc a nb en o tf e r m e n t e db yt r a d i t i o n a l i n d u s t r i a l & c e r e v i a i a eb e f o r e s oi t sn e c e s s a r yt o e s t a b l i s ham e t a b o l i cp a t h w a yt h a tc a nf e r m e n t y e a s ti nt h ei n d u s t r i a l & c e r e v i a i a e t h ea r t i c l e sp r e f a c ea l s os u m m a r i z e dt h eg e n e r a ls i t u a t i o no f t h er e m b i n a n t & c e r e v i s i a et h a t 锄f e r m e n tx y l o s e ，a n dt h e m e a n i n ga n dt h eo b j e c t i o no ft h i s i nt h i sa r t i c l et w os t r a i n so f r e c o m b i n a n t & c e r e v i s i a ew a sf e r m e n t e db y x y l o s e , g l u c o s ea n d m i x t u r e o f t h e s et w os u g e r s t h ef e r m e n t a t i o no f y s 5 8 1s h o w e dt h a tt h em b i n a n ts t r a i l 强 c a n tf e l n n e n tx y l e n ei n t oe t h a n 0 1 w h e ng l l l c o s em d s ti nt h ef e r m e n t a t i o nc u l t u r e , t h eu t i l i z a t i o no f x y l o s ec o u l dr e a c h e dt o5 0 h o w e v e rt h es t r a i nc o u l d n tf e r m e n tx y l o s et oe t h a n o le i t h e r i ti s a s s u m e dt h a tt h ex y l o s ew a sm a i n l yt r a n s f o r m e di n t ox y l i t 0 1 t h ef e r m e n t a t i o no f y s 5 8 - 1 2 s h o w e dt h a tt h es t r a i n s 啪f e r m e n t e das m a l la m o u n to f e t h a n o l ，b u ti t nb er e s u l t e df r o mt h e u n w a n t e df e r m e n t a b l es u g a re x i s t e di nt h ef e r m e n t a t i o nc 耻l t m ef r o my e a s te x t r a c t i o n c a n d i d as h e h a t a ex y l lg e n ew a sa m p l i f i e db yp c r , a n dc l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o r p a c t 2 t op r o d u c et h er e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp a c t 2 - x y l l t h ev e c t o r ss e q u e n p r e f e r e n c eo f e s c h e r i c h i ac o l ih o s tw a sa l s od i s c u s s e d t h es e q u e n c ew i t hx y l lg e n ea d h p r o m o t e ra n dt e t m i n a t o rw a sa l s oc l o n e db yp c r & c e r e v i s i a ex y l 2g e n ew a sa l s oc l o n e db yp c r , a n di n s e r t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e g t o rp d r l9 5t om a k et h er o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r p d r l 9 5 - x y l 2 a n o t h e rv e c t o rc a l l e dp d yw a se s t a b l i s h e db yp a r to f p d r l 9 5a n dp a r to f p y e s 2 t os e q u e n t h eu n s o w nk e ys e q u e n c eo f p d r l 9 5 k e yw o r d s ：x y i1 。x y l 2 , e t h a n o l 。x y l o s e g l u c o s e 。s c e _ r e v i s i a e 2 首都师范人学硕+ l ：学位论文 一字符号 a c d e f g h i k l n p q r s t v y 氨基酸名称对照表 三字符号 a l a ( a l a n i n e ) c y s ( c y s t e i n e ) a s p ( a s p a r t i ca c i d ) g l u ( g l u t a m i ca c i d ) f h e ( p h e n y l a l a n i n e ) g l y ( g l y c i n e ) h i s ( h i s t i d i n e ) l l e ( i s o l e u c i n e ) l y s ( 1 y s i n e ) l e u ( 1 e u c i n e ) m e t ( m e t h i o n i n e ) a s n ( a s p a r a g i n e ) p r o ( p r o li n e ) g i n ( g l u t a m i n e ) a r g ( a r g i n i n e ) s e r ( s e r i n e ) t h r ( t h r e o n i n e ) v a l ( v a li n e ) t r p ( t r y p t o p h a n e ) t y r ( t y r o s i n e ) 3 中文名称 丙氨酸 半胱氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 苯丙氨酸 甘氨酸 组氨酸 异亮氨酸 赖氨酸 亮氨酸 蛋氨酸 天冬酰胺 脯氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 丝氨酸 苏氨酸 缬氨酸 色氨酸 酪氨酸 间里，不断新增的勘探和开发的石油储量为批量化工和精细化工以及运输燃料提 供了廉价和充裕的原材料。n 1 然而在2 1 世纪初，几个因素使得以化石燃料为主的世界经济迫切需要一种 替代品。在过去的十年里，新发现的化石燃料的增长速度已经不能满足全球油料 消费增长的速度了。而且非常明显的是油料消费的速度不可能维持现状，这个现 状被全球油料消费增长的事实所巩固了。随着世界经济规模的不断增大，世界能 源消费量持续增长。1 9 9 0 年世界国内生产总值为2 6 5 万亿美元( 按1 9 9 5 年不 变价格计算) ，2 0 0 0 年达到3 4 3 万亿美元，年均增长2 7 。根据( 2 0 0 4 年b p 能源统计 ，1 9 7 3 年世界一次能源消费量仅为5 7 3 亿吨油当量，2 0 0 3 年已达到 9 7 4 亿吨油当量。过去3 0 年来，世界能源消费量年均增长率为1 8 左右。嗍 导致这个现状的其中一个主要原因是由于亚洲经济的快速增长。而且这个因 素已经导致了原油价格的增长，地缘政治问题，并且由此产生了短期和长期的不 稳定因素。这些因素就需要各国政府去重新考虑单一依靠石油储备的问题了。 世界上大部分国家能源供应不足，不能满足其经济发展的需要。从长远看， 全球已探明的石油储量只能用到2 0 2 0 年，天然气也只能延续到2 0 4 0 年左右，即 使储量丰富的煤炭资源也只能维持二三百年。能源的储量、产量和消费量分布极 不平衡，主要集中在某些地区和少数国家。美国是世界消费一次能源最多的国家， 其消费量接近世界总量的1 4 。中国是能源消费大国，一次能源消费总量仅次于 美国为8 3 9 7 1 0 6 t ，占世界的9 2 ，位于世界第二。口1 首都师范大学硕士学位论文 2 我国能源现状及出路 目前，我国已成为世界第二大能源生产国和能源消费大国。随着经济的发展 和人民生活水平的提高，我国能源需求将持续增长。2 0 0 4 年全国能源消费总量为 1 9 7 亿吨标准煤，其中煤炭消费量占到6 7 ，石油进口量大幅度增长，2 0 0 4 年进口原油1 2 3 亿吨，石油的对外依存度达到了4 2 。在石油进口方面，我国 从中东地区进口的石油数量约占石油进口总量的5 0 ，从非洲进口量约占2 6 ， 另有少部分从中亚一俄罗斯进口，9 0 以上是通过海上运输实现的，安全系数不 高。而由于世界政治形势的影响，诸如美国对部分重要海峡的军事力量控制、 世界恐怖主义的猖獗以及呈上升趋势的海盗侵扰事件等，严重威胁着我国能源的 海外供应。【1 如果达到世界平均消费量，目前年能源消费量为3 0 4 7 ，吨标准煤如果达到 o e c d 国家的能源消费水平，年能源消费量为6 5 亿吨标准煤；如果达到美国的能 源消费水平，年能源消费量将达到1 6 0 亿吨标准煤，超过目前世界能源消费总量。 虽然不能这样简单地进行比较，但可以肯定，随着我国全面建设小康社会及现代 化目标的实现，能源需求必将持续增长。因此，全面构筑安全、经济、清洁的能 源供应体系，必定是一项十分紧迫而又艰巨的任务。目前，我国能源发展面临着 能源资源的严重约束。从目前掌握的能源资源看，煤炭的剩余可采储量约为l1 0 0 亿吨，石油的剩余可采储量约为2 4 亿吨，天然气的剩余可采储量约为2 万亿立方 米。从人均拥有量来看，煤炭、石油和天然气分别为世界人均水平的7 0 、1 0 和5 。按目前剩余可采储量和能源消费量来看，煤炭还可以开采6 0 年，石油 还可以开采1 3 年，天然气还可以开采4 0 年。虽然这只是一种理论性的算法，今后 能源资源还会不断地勘探出来，但足以说明我国面临的严峻能源资源形势。要解 决好我国的能源供应问题，可持续地满足经济发展对能源的需要，除了切实转变 经济增长方式，努力提高能源利用效率，全面建设高效和节能型社会外，还必须 高度重视可再生能源的开发利用，努力增加能源的供应量。我国可再生能源资源 丰富，具有开发利用的良好条件。经过多年发展，我国可再生能源技术已取得长 足进步，可再生能源已经发展为种类多样、技术成熟、初具规模、增长迅速的新 兴产业，在我国能源消费结构中起着重要作用。旧 2 首都师范人学硕士学位论文 2 由生物质能产乙醇的应用历史背景及意义 2 1 由生物质能产乙醇的应用历史背景 化石燃料被用作化学生产原料有关的非常重要的一个问题是其直接与全球 元素循环相关，乍看石油产生表面上是一个为太阳能所驱动的循环过程。然而这 个过程在时问量上和工业上利用生物质生产燃料是惊人的不同的，见图一因为化 石燃料的形成是一个亿万年的过程，然而人类却正在一个相当短的时间内( 至多 几个世纪) 将有限的石油储备逐渐耗尽。石油化工的碳循环时间量不平衡的一个 直接结果就是地球的大气和海洋当中的二氧化碳浓度快速增加。自工业革命伊 始，空气当中的二氧化碳浓度稳步增加，并且在二十世纪后半迅速增加。越来越 多的人们紧密地关注到一一二氧化碳水平的增加会通过众所周知的温室效应来 影响全球气候。嘲 嬲 ，嚣器， h 参lt h ec 盯b 明c y c l e 叩l ，i i 甜t o 隅哪材窖出a 嘲f u e l s l e l l ：心口k m 髓im a t e r i a ls l r e s l l l l lr i g h t ：脚峪们蚰 k 0 l 。c h o l o g j c a lm m e f i a ls l 他a m l 植物来源的生物质提供了一个吸引人的替代品，它规避了化石燃料产生的化 学过程，并且维持了二氧化碳固定和释放的平衡。运输用油料是石化生产的主要 产品。而从生物质生产运输用油是非常诱人的，因为这样是可持续和划算的。其 中一个非常有前景的过程就是燃料乙醇的生产。乙醇可以直接利用或者与传统燃 油混合利用。传统的汽车引擎可以根据所利用的混合燃料的不同加以有限的改装 或者根本不需要改装。n ， 从植物来源的生物质制备乙醇已经不是一个新的概念了。早在1 9 1 8 年，英 国政府就指定了乙醇燃料引擎委员会，其中一个职责就是负责工业乙醇扩大生产 的基础论证。几年后，代夫特技术大学g i j sk u e n e n 著名的前辈a l b e r tj a n 3 首都师范大学硕士学位论文 k l u y v e r 在他的就职演讲当中说：“农业地位的强化，使得它的发展对现代工业 越来越重要。这就意味着大宗农业产品将主要提供一些包含三种化合物当中一种 或者几种的原料给化学工业，这三种化和物主要有碳水化合物，油类和蛋白质。 尤其是碳水化合物一如糖类，淀粉，细胞壁组分将要成为主导的原料。 n 1 在过去的几十年当中，人们一致认为最终可持续和低成本的植物生物质来源 的乙醇不仅仅要来源于植物碳水化合物中易于发酵的淀粉和蔗糖部分，更要来源 予难于转化的木质纤维素部分。这个结论同样是早已存在了。k r e s s m a n n 早就提 出：“如果从木材制备乙醇的成本与从粮食或糖蜜制备乙醇的成本相同或者相 似，那么从木材废料制备乙醇就会有很大的利润空间。一n 1 2 2 由生物质能产乙醇的应用的意义 2 2 1 生物质的组成成分 目前储存在植物中的太阳能是世界上最充足的可再生能源，绿色植物中的纤 维素是一种很低廉的基质。n 1 地球上每年植物光合作用的生物量可达11 4 5 亿吨， 其中大部分为木质纤维素类。晒3 木质纤维素广泛存在于农副产业及林产业的木质 废弃物，以及以农、林产品为原料的工业废弃物中。木质纤维素是纤维素、半纤 维素和木质素等聚合物的复合物，在不同的植物中三者的相对含量有所差异( 见 表一及表二) 。从总量上来看，纤维素、半纤维素和木质素是世界上最广泛的可 再生生物资源。嘲 t a b l el p o l y m e rc o m p o s i t i o n o fl i g n o c e l l u l o s e ( d a t af r o m i n g r a me ta 1 1 9 9 9 ) 4 首都师范大学顾：卜学位论文 术质纤维素纤维素( )半纤维素( )木质素( ) 硬木 4 0 5 52 4 _ 4 01 8 2 5 软木 4 5 5 02 5 3 52 5 3 5 坚果壳 2 5 3 02 5 3 03 0 _ 4 0 玉米秸 4 5 3 5 1 5 草 2 5 _ 4 03 5 5 01 0 3 0 纸8 5 9 9oo 1 5 麦杆 3 05 01 5 分类垃圾 6 02 02 0 树叶 1 5 2 0 8 0 8 5 0 棉种毛 8 0 9 55 2 00 报纸 4 0 5 5 2 5 _ 4 01 8 3 0 化学处理的废纸浆 6 0 7 01 0 2 05 1 0 废水中主要残渣 8 1 5不可测出2 4 2 9 猪粪 6 02 8 不可测出 牛粪 1 6 4 71 4 3 32 7 5 7 在农作物的秸秆或甘蔗渣中，上述三种组分的含量分别为3 0 - 4 0 、2 0 - 3 0 和5 - 1 0 ，其中前两种成分可作为乙醇发酵的原料n 帕。纤维素是一种由1 0 0 - 1 0 ， 0 0 0 个1 3 一d _ 吡喃型葡萄糖单体以1 3 - 1 ，4 一糖昔键连接的直链多糖，多个分子平 行紧密排列形成丝状不溶性微小纤维。在工业上，纤维素经酸解或酶解预处理后， 释放出的葡萄糖可进入乙醇发酵途径。半纤维素是由多种多糖分子组成的支链聚 合物，不同来源的半纤维素其单糖的组成各异。在硬木和谷物废料中的半纤维素 中，其主要成分为多聚木糖，由d - 木糖以1 3 - 1 ，4 一糖苷键聚合而成，其支链单 体上还含有l 一乙酰阿拉伯糖苷和糖醛等修饰基团。在软木的半纤维素中，甘露 糖则最为丰富。木质素则是苯的衍生物形成的芳香族聚合物。经测算，木质纤维 素类原料中半纤维素组分的有效利用有可能使乙醇燃料的生产成本降低2 5 ，这 显然应当归功于d 一木糖。木糖是自然界中含量仅次于葡萄糖的糖分，仅仅从美 国垃圾场的废纸和垃圾中微生物转化的残留糖分，每年就可提供4 亿吨的乙醇， 这相当于在输气管线中以1 0 分量混合的燃料乙醇( 由谷物发酵生产) 的1 0 倍 量。 2 2 2 生物质的预处理 木质纤维素转化成乙醇的过程比较复杂，在微生物作用之前一般采用稀酸水解法 进行预处理，对木质纤维素进行预处理的研究进行了很长的时间，其目的是去除 5 首都师范人学硕士学位论文 木质素，和半纤维素( 近年来随着可以发酵五碳糖的微生物研究进展，五碳糖也 可以作为发酵底物。) 使纤维素和半纤维素的交联程度降低，使原料更加疏松。 【1 2 1 物理方法， 1 机械粉碎 原料一般经过切割粉碎后可降低纤维素的结晶程度，增加反应面积，一般的原料 在粉碎后为0 2 q 咖。所需能耗见下表 木质纤维素加工后大小( 舢)能耗( k w h t o n ) 硬木 稻草 玉米秸 1 6 0 2 5 4 3 2 6 3 5 1 6 0 2 5 4 1 6 0 3 2 0 6 3 5 9 5 切碎机 1 3 0 8 0 5 0 2 5 7 5 6 4 未测 2 0 1 5 3 2 锤式粉碎机 1 3 0 1 2 0 1 1 5 9 5 4 2 2 9 1 4 9 6 未测 未测 1 2 热解， 热解是处理木质纤维素的方法之一，当热处理的条件达到3 0 0 0c 以上时，原 料就会成为半流体物质，其中主要成分是左旋葡聚糖，是通过1 ，6 糖苷键聚合 的葡萄糖，若低于3 0 0 时，流体化就会变。慢粗制的左旋葡聚糖很容易从半流 体中结晶，一般产率可达1 5 以上，用棉纤维热解制取左旋葡聚糖，最适条件 3 8 8 0 c ，2 6 2 m i n 在抽真空为l 咖汞柱的压力下，产量为原料的3 0 ，若用废纸， 在相同条件下，产量为l 卜1 3 。将热解液用四倍的水稀释，加0 2 m o l 1 硫酸 6 首都师范大学硕j ：学位论文 在1 2 0 。c 的高j 玉灭菌锅内蒸2 0 m i n 几乎所有的左旋葡聚糖都转化为葡萄糖。若酸 的浓度超过0 2 m o l 1 ，产量会下降。“3 1 热解的过程中产生的抑制微生物发酵的 副产物，会被酸解成无抑制活性的物质。因此下一步发酵的微生物长势很好 1 3 蒸汽爆破 气爆是近年来应用最广泛的一种处理木质纤维素的方法，这种方法先将原料浸 入水中过夜后取出，放入容器内加压至0 6 卜4 8 3 m p a ，温度在1 6 卜2 6 0 0 c 之间， 保持几秒到几分钟，在此期间，容器中的饱和蒸汽会使大部分半纤维素降解，小 部分纤维素降解，去处一部分的木质素，然后容器迅速恢复常压，也就是我们所 说的爆破。这种方法还会使底物更加疏松，降低了纤维素的交联程度，使纤维素 酶更易于与底物反应，底物由未经爆破的酶水解1 5 增加至处理后的9 0 左右。 如去淀粉麦杆在1 9 0 0 c 时保持l o m i n 后气爆，用纤维素酶水解产糖量为5 2 9 l o o g ， 最近的研究证明，在相对低的温度下保持相对长的时间，气爆的效果会更好，加 入硫酸也能提高后面酶解的产糖量。加入2 的稀硫酸，玉米秸为原料，保持1 9 0 0 c 五分钟后气爆，其后的酶解产糖量为5 6 1 9 l o o g ，各报道中产量最高的是蔗渣， 加入1 喊酸，保持2 2 0 0 c 三分钟进行气爆，其后酶反应为产糖量为6 5 1 ，可能 跟材料不同有关。 气爆有很多好处，经过气爆处理后的产糖量很高，化学试剂消耗少，减少了对环 境的污染。但是能耗较大，对反应设备要求很高，并且这个工艺对木质素的去处 很不彻底，并且对硬木和软木的效果不同，同样反应条件下，硬木较好 1 3 氨水循环渗透法 氨是一种有效的木质素去处剂，也是一种蓬松剂，价格仅为硫酸的1 4 ，挥发性 强因此易被回收和再利用，并且基本上没有腐蚀和污染的顾虑，由于木质素存在 的区域广泛，常态下的氨仅能在表面将木质素去处，氨水循环渗透法也就随之产 生了。方法是反应器以2 3 m p a 的氮气充满，将秸杆放入氨水中浸泡过夜，炉丝 加热至1 7 0 0 c ，同时用流量为5 m l m i n ，浓度为1 5 w t 的氨水在反应器内循环 l o m i n ，结果7 卜8 5 的木质被去处，4 0 一_ 6 0 的半纤维素溶解，却保留了原料中 9 5 的纤维素，在迸一步酶解的实验中，9 2 5 的纤维素水解成了糖，葡萄糖的产 量为3 7 左右。 利用氨的其他方法有氨纤维爆破法，类似气爆法，将氨水与原料高温高压几分钟， 7 首都师范大学硕士学位论文 然后瞬间减至常压，处理后的硬木木腾酶水解糖产量为5 0 ，报纸为4 0 ，氨处 理比蒸汽爆破去处的木质素多，但是半纤维素去处效果没有酸处理和汽爆好。 1 4 超临界二氧化碳法 超临界二氧化碳多被用于萃取溶剂，但作为木质纤维素的预处理溶剂，好处 也有很多，它清洁，廉价，方便，无污染。白杨( 硬木) 木屑在湿度7 3 ( w w ) ， 1 6 5 ，压力为3 1 0 0 p s i ( 1 p s i = o 0 6 8 p a ) 超临界二氧化碳处理3 0 m i n 后，其酶水 解产量为理论值的8 4 7 ，而软木木屑在同样的条件下处理后，酶水解产量为理 论值的2 7 3 ，而不加二氧化碳在其他条件相同处理后，酶水解产糖量仅为理论 值的1 0 。无论硬木还是软木，材料的湿度是影响产量的一个重要因素，若原料 湿度为0 ，即使其他条件都具备，糖的酶水解产量与未处理原料的产量是一样 的。而温度只有达到1 3 8 0 c 以上时，处理后酶水解产糖量才会明显增加。由于高 于3 1 0 0 p s i 时高密度超临界二氧化碳的会使木屑中的水减少，因此处理后的糖产 量会减少。总的来说，相同条件下，硬木比软木更易处理。 1 5 湿法氧化 这种预处理方法于超临界二氧化碳法类似，本法可以氧化许多有机聚合物， 将原料加入一定量的水通入压力为5 2 0 i i l p a 的氧气，在温度1 5 0 3 5 0 的条件下 进行处理。如软木木屑加水至6 0 9 1 ，1 2 b a r 的氧气，2 0 0 0 c 下反应十分钟后含 有原纤维素的6 0 9 6 ，原半纤维素的2 - 1 6 ，以及原木质素的2 0 - 3 0 ，酶解产糖量 为2 6 ，相当于总多糖产量的5 5 。n 3 1 1 - 6 臭氧处理法 作为一种强氧化剂，臭氧主要降解木质素，小部分半纤维素，几乎不降解纤 维素，6 0 的降解木质素被降解，随着木质素的含量从2 9 9 6 降至8 ，锯末处理后 酶水解率从o 升到了5 7 ，臭氧处理法具有以下优点有效的去除木质素，几乎不 产生对后面发酵有毒的物质，处理可以在常温常压下进行。缺点是，臭氧造价高。 1 7 酸水解法 浓的硫酸和盐酸都可以用来对木质纤维素进行处理，但是由于产生的浓盐酸 和硫酸难于处理，对环境污染较大，因此近年来逐渐被淘汰使用。 而预处理所遇到的问题是1 ，产量较低2 。在产糖的同时易产生抑制下一步水解 的副产物。3 。所产糖的降解4 。能耗大，也就是造价问题n 町 8 首都师范大学硕士学位论文 2 2 3 由生物质能产乙醇的应用的意义 l h y d r o l y s i s ii f e r m e n t a t i o n l - i 枷，f _ r m r n l 此hc o n v e n i o n o t s u g l r 蚶一 lt i ，唧- o f c i ii 酬刊b y y - ti ip r e t r e a t m e n t 卜 s h f l 锹躲翟r 一嘶a i s s f _ 1 h y d r o l y s i s f e 州r m e n t a t i o n | _ e t h a n o l n 蛋i k m 岫盼i l l m t r j i o no f c kl w o c 嚣s 岫i g nf o r 哪婶棚饵h l m ip r o d u a i o u j 确酽：飘巾- 哺ob y - - i sm d 膏m m 啊o n ；册 s i m u l m , m 曲“f i 妇ii 均怕t y 幽 a n df 孤憎嘶 图2 所示为由木质纤维素转化为乙醇的一般过程。经预水解和水解处理后产 生的水解产物中含有单糖，其存在形式包括：戊糖( d - 木糖和l 一阿拉伯糖) 和 己糖。( 表三) 水解产物中还包括范围很广的物质，稀酸处理后一部分糖转化成 有毒的脱氢化合物糖醛及羟甲基糖醛，在适当的条件下会进一步转化成乙酰 丙酸、甲酸和乙酸，这些物质对微生物具有不同程度的毒性。n 司 t a m e2c o m p o s i t i o n ( m a j o rs u g a r s ) o fc o m m o da g r i c u h m a ll i g n o c e l l u l m i cf 酬或h ( 岫鲫一打c 柚o r o h m a n aa n d b o t h a s t1 9 9 4 ：l e e1 9 9 7 ：h t t p j w w w e c n n v p h y l l i s ) 图2 木质纤维素转化为乙醇的过程 因此，如果能利用微生物发酵木质纤维素生产乙醇，一方面降低乙醇生产的 成本，提高了利润率。另一方面又充分利用了可再生资源，缓解了对自然环境的 压力，对解决未来能源短缺以及环保问题具有重大意义和潜在价值。“町 使以木质纤维素为原料制备乙醇廉价的一个重要因素就是能够将生物质水 解液高产量高效率的发酵成乙醇。能进行这个反应的微生物要比传统意义上从六 碳糖及其二糖发酵产乙醇的酿酒酵母的要求要高的多。例如，半纤维素的水解产 物要产生一定数量的木糖，并且这些木糖不能被野生型的酿酒酵母所发酵。还有 9 首都师范大学硕士学位论文 植物水解产物含有数种抑制微生物的成分。能够耐受这些成分并且