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浙江大学硕士学位论文d - 甘露糖提取纯化工艺研究 摘要 糖类化合物亦称碳水化合物，是自然界存在最多、分布最广的一类重要的有 机化合物。糖类化合物是一切生物体维持生命活动所需能量的主要来源。它不仅 是营养物质，而且还具有肝素的抗凝血作用、血糖的免疫活性等生理功能。 甘露糖是一种具有重要功能的六碳糖，存在于植物的细胞中，在医药工业、 食品工业、饲料工业和生命科学等的研究中具有重要的作用。本文综述了近几年 来d 甘露糖的性能、用途和提取方法，在文献的基础上，设计了一条新的提取 d 甘露糖的工艺路线，以棕树籽为原料，经过酸水解、碱中和、酶催化反应、硅 胶柱洗脱、离子柱除盐、结晶重结晶等步骤，得到目标产物。最终收率为原料重 量的4 8 4 。具体的路线如下： 在原料的筛选中，经过对原料来源难易程度的比较，选择了以棕树籽为原料， 对产品水解后的反应液加入b 甘露聚糖酶再水解，使反应液d 甘露糖浓度大幅度 提高并研究了影响反应水解的重要因素，优化的适宜工艺为：原料经过粉碎过 6 0 目筛，5 硫酸为酸水解剂，原料与水的重量体积比1 ：7 ，油浴设定温度为1 0 0 。c ， 反应时间5 0 m i n ，b a ( o h ) 2 中和成中性，过滤，d 甘露糖浓度为0 2 5 6 9 m l ，滤 液加入b 甘露聚糖酶再水解，用量为液体体积的1 ，再水解时间为5 0 r a i n ，再水 解温度为6 0 c 。d 甘露糖浓度达到0 6 3 9 9 m l 一。 在分离的工序中，以硅胶和浓缩液混合加热搅拌使其成为粉末后过柱，可以 使样品上柱操作容易，不会粘稠而堵塞硅胶柱，收率也有所提高。较适宜的工艺 条件是：以酸水解、p 。甘露聚糖酶再水解后的提取液为原料，浓缩成原体积的l 3 后加入1 ：1 重量的硅胶粉，加热搅拌蒸发掉剩余水分使成粉末状，上硅胶层析柱， 过柱温度为3 0 c ，每次上柱6 0 9 粉末样品，正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：水= 2 ：1 ：0 7 ：0 3 为洗脱液，控制流速范围在2 8 m l m i n 一，收集2 2 0 m l 流出液。d 甘露糖的过柱 收率为9 6 9 。 在除盐的工序中，从0 0 1x l 、0 0 1x 4 、0 0 1 7 、2 0 1x 4 、2 0 1x 7 、d 2 9 0 、d 1 5 1 、 d 1 1 3 等树脂经摇瓶实验，筛选出了0 0 1 4 、2 0 1 7 两种树脂，其脱盐效果最好。 较适宜的工艺为：以过柱后的收集液为原料，经浓缩成原体积的2 3 后过离子交 换树脂除盐，确定了先阳离子交换树脂柱后阴离子树脂交换柱的洗脱顺序，收集 浙江大学硕士学位论文d 一甘露耱提取纯化工艺研究 液从原来的导电率1 9 5 0 u s c m j 降到1 2 5 3 u s c m ，盐度从3 2 p p t 降到0 2 p p t ，除盐 效果比较满意。除盐后本工序收率为9 0 1 。 在结晶的工序中，通过三种不同的结晶方式比较，确定了产品的结晶方法， 具体的工艺如下：以除盐后的收集液为原料，将浓缩液置于一锥形瓶内，量取其 5 倍体积的9 5 乙醇加入其中，放入水浴摇床中在7 5 c 下i ) j , 2 0 0 r m i n - 1 的速率震荡3 小时。取出后室温静置2 4 小时，本工序结晶收率为8 6 7 。 本文实现了整个过程，并对最终提取物的结构进行了检测确认，研究了影响 各步反应及提取的关键因素，为生产过程提供了重要的基础数据。 关键词：糖；d 甘露糖；棕树籽；甘露糖酶 i i i 浙江大学硕士学位论文 d 甘露糖提取纯化工艺研究 a b s t r a c t s u g a r , a l s ok n o w na sc a r b o h y d r a t e ，i sak i n do fo r g a n i cc o m p o u n d 谢t haw i d e d i s t r i b u t i o na n dt h em a i ns o u r c eo fe n e r g yf o ra l lp h y s i o l o g i c a la c t i v i t i e s i ti sn o t o n l yu s e da sn u t r i e n t sb u ta l s oa sa n t i c o a g u l a n ta n di m m u n i t y d m a n n o s e ，e x t r a c t e df r o mp l a n tc e l l s ，i sk i n do fh e x o s e 晰也w i d ea p p l i c a t i o ni n p h a r m a c e u t i c a li n d u s t r y , f o o da n df o r a g ei n d u s t r y , a n da l s ob i o l o g i c a lr e s e a r c h t h e p r o p e r t y , u s a g ea n de x t r a c t i o nm e t h o d sr e p o r t e di nr e c e n ty e a r sw e r er e v i e w e di nt h i s a r t i c l e ，o nt h eb a s i so fw h i c han e wm e t h o df o re x t r a c t i o no fd m a n n o s ew a ss e tu p i nt h i sn e wm e t h o d , p a l ms e e d su n d e r w e n ts u c hs t e p sa sa c i dh y d r o l y s i s ，e n z y m e c a t a l y t i cr e a c t i o n s ，e l u t i o no ns i l i c a g e lc o l u m n , d e m i n e r a l i z a t i o na n dr e c r y s t a l l i z a t i o n t oo b t a i nd m a n n o s e 嘶t ht h ey i e l do f4 8 4 t h es p e c i f i cr o u t ei sa sf o l l o w s ： p a l ms e e d sw e r es e l e c t e da ss t a r t i n gm a t e r i a lb e c a u s ep a l mi sak i n do fp l a n to f e a s ya c c e s s t h e yw e r ef i r s t l yh y d r o l y z e di na c i da n dm a n l a s e w a ss u b s e q u e n t l y a d d e dt ot h es y s t e mt os t a r tf e r m e n t a t i o n t h ei n f l u e n c ef a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e dt o g e tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n s ：t h ep a l ms e e d sw e r ec r u s h e da n dg r a n u l a t e d 谢t l l6 0 m e s h t h ep r o d u c tw a st h e nh y d r o l y z e di na5 s u l f u r i ca c i d 诵也t h ev o l u m er a t i oo f f e e da n dw a t e r1 ：7a tt h et e m p e r a t u r eo f10 0 ( 2f o r5 0 m i n a f t e rn e u t r a l i z e db y b a ( o h ) 2 ，t h ep r o d u c tw a sf i l t e r e d d m a n n a s ec o n s i s t e n c yw a s0 2 5 6g - m l 1o n ep a r t o fm a n n a s ew a sa d d e dt o10 0p a r t so ft h ec o n t r a c t e df i l t r a t ea n dt h ef e r m e n t a t i o n l a s t e df o r5 0 m i na t6 0 d m a n n a s ec o n s i s t e n c ya c h i e v e d0 6 3 9g m l g e ls i l i c o na n df e r m e n t e dl i q u i dw e r em i x e da n dh e a t e dt op o w d e rw h i c hw a s i s o l a t e db yg e ls i l i c ac o l u m ni nt h es e p a r a t i o n , m a k i n gi te a s yt oo p e r a t ea n dh i g h e r y i e l d t h eo p t i m i z e dp a r a m e t e r sw e r e ：t h ef e r m e n t e dl i q u i dw a sc o n t r a c t e dt oo n e 甑r do ft h ev o l u m ea n dw a sm i x e d 、衍t l lg e ls i l i c ao ft h es a m ew e i g h t t h em i x t u r e w a sh e a t e da n ds t i r r e dt og e tr i do fw a t e r t h ep o w d e ro b t a i n e dw a si s o l a t e db yg e l s i l i c ac o l u m na t3 0 c 6 0 9o fp o w d e rw a si s o l a t e de a c ht i m et og e t2 2 0 r a ll i q u i d t h e e l u a n tc o m p o s i t i o nw a s ：n - b u t a n o l ：e t h y la c e t a t e ：i s o p r o p a n a l ：w a t e r = 2 ：1 ：0 7 ：0 3 a n dt h ev o l u m er a t ew a s2 8 m l m i n t h ey i e l do fi s o l a t i o ni s9 6 9 浙江大学硕士学位论文 d 甘露楗提取纯化工艺研究 t w ok i n d so fr e s i n , 0 0 1 4a n d2 0 1x 7 ，w e r es e l e c t e df r o mt h et y p e so f0 0 1 1 , 0 0 1 4 ，0 0 1 7 ，2 0 1 4 , 2 0 1x 7 ，d 2 9 0 ，d 1 5 1 ，d 1 1 3b yt h es h a k i n gf l a s ke x p e r i m e n t s d u r i n gt h ep r o c e s so fr e m o v i n gs a l t t h eo p t i m i z e dp a r a m e t e r sw e r e ：t h el i q u i df r o m t h ec o l u m nw a sc o n t r a c t e dt ot w o “r do ft h ev o l u m ea n ds u b s e q u e n t l y w e n t t h r o u g hc a t i o ne x c h a n g er e s i na n da n i o ne x c h a n g er e s i n t h ec o n d u c t i v i t yo ft h e s y s t e md r o p p e df r o m1 9 5 0u s c m t o 1 2 5 3 u s c m 1a n dt h es a l i n i t yf r o m3 2 p p tt o 0 2 p p t t h ey i e l do f t h i sp r o c e s sw a s9 0 1 t h r e ed i f f e r e n tm e t h o d sw e r ec o m p a r e di nt h ep r o c e s so fc r y s t a l l i z a t i o n t h e s e l e c t e do n ew a sd e s c r i b e da sf o l l o w s ：t h el i q u i d 晰ms a l tr e m o v e dw a sp u ti n t oa c o n i c a lb e a k e ra n da d d e dw i 也9 5 e t h a n o lo ff i v ef o l dv o l u m e t h es y s t e mw a s v i b r a t e da t2 0 0 r m i n 。1a tr o o mt e m p e r a t u r ei naw a t e rb a s es h a k e rf o r3 h ra n dt h e n p l a c e df o r2 4 h r , t h ey i e l do fw h i c h w a s8 6 7 t h ew h o l ep r o c e s so fe x t r a c t i o no fd m a n n o s ew a si m p l e m e n t e di nt h i sa r t i c l e a n ds t r u c t u r e so fi n t e r m e d i a t e si ne a c hs t e pw e r ed e t e c t e da n dc o n f i r m e d t h e i n f l u e n c i n gf a c t o r so ff i n a l l ys t e pw e r ei n v e s t i g a t e da n dc r u c i a ld a t aw a so b t a i n e df o r i n d u s t r i a la p p l i c a t i o n k e yw o r d s ：s u g e r , d m a l l n o s e ，s e e d so ff o r t u n e sw i n d m i l lh a m ，m a n n a s e v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙婆太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权澎婆太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期： 、 年 月 日 签字日期： 年 月 日 浙江大学硕士学位论文 d 甘露耱提取纯化工艺研究 致谢 本论文是在导师陈新志教授的精心指导和严格要求下完成的。本论文从选 题、实验研究的进展到最终的完稿，无不凝聚着导师的智慧和心血。陈老师专业 知识精湛、科研态度求真务实、工作作风一丝不苟，给我留下了非常深刻的印象， 也将潜移默化地影响着我，让我受益终生。陈老师身上很好体现了浙江大学的求 是精神，让我懂得了什么是求是作风，导师在工作上也给予了我许多热情的帮助 和无微不至的关怀，并教给我许多做人的道理值此论文脱稿之，我衷心感谢导 师陈教授的辛勤培养，并祝愿陈老师在今后的工作和生活中万事如意! 在论文的设计和撰写上，师兄钱超博士后给予了我热情帮助与关心，他有着丰 富的专业知识，娴熟的实验技能，勤奋踏实不怕挫折的工作作风。在此对他表示 衷心的感谢! 感谢李爱珍同志对我产品检测方面的热情帮助，感谢殷清华对我的 热情帮助 感谢我的妻子、父母和家人对我的支持、帮助和鼓励 最后，向所有关心和帮助过我的老师、同学、家人和朋友们表示衷心的感谢! 浙江大学硕士学位论文d 甘露糖提取纯化工艺研究 1 前言 糖类化合物亦称碳水化合物，是自然界存在最多、分布最广的一类重要的有 机化合物。糖类化合物是一切生物体维持生命活动所需能量的主要来源。它不仅 是营养物质，而且有些还具有特殊的生理活性。例如：肝脏中的肝素有抗凝血作 用；血型中的糖与免疫活性有关。所以糖类化合物在医学具有更重要的意义。 糖类化合物由c 、h 、o 三种元素组成，分子中h 和o 的比例通常为2 ：1 ， 与水分子中的比例一样，可用通式c 皿( n 2 0 ) n 表示。以前曾把这类化合物称为碳 水化合物，但后来发现有些化合物按其构造和性质应属于糖类化合物，可是它们 的组成并不符合c m ( h 2 0 ) n 通式，如d 鼠李糖( c 6 i - 1 1 2 0 5 ) 、d 脱氧核糖( c 5 h l 0 0 4 ) 等；而有些化合物如乙酸( c 2 i - h 0 2 ) 、乳酸( c 3 h 6 0 3 ) 等，其组成虽符合通式 c m ( h 2 0 ) n ，但结构与性质却与糖类化合物完全不同。所以，碳水化合物这个名称 并不确切，但因使用已久，迄今仍在沿用。 从化学构造上看，糖类化合物是多羟基醛、多羟基酮以及它们的缩合物。根 据能否被水解及水解产物的情况糖类化合物可分为三类：单糖、二糖多糖。 单糖：不能水解的多羟基醛或多羟基酮。常见单糖有d 甘露糖、d 核糖、 d 葡萄糖、d 半乳糖、d 果糖、氨基糖等 二糖：水解后生成两分子单糖的糖。如蔗糖、麦芽糖等。由二分子的单糖 通过糖苷键形成，天然存在的游离态和具有机能的糖类有以哺乳类的乳糖、细菌 和昆虫血液等含有的海藻糖、植物的蔗糖为代表这些是作为各种生物体的能量 来源，或者作为生物体组成的物质原料，承担着贮藏或运输的重要作用。自然界 最普遍的二糖是蔗糖、乳糖和麦芽糖。二糖在人体内必须分解为单糖后才能被吸 收利用 多糖：能水解生成许多分子单糖的糖。如淀粉、糖原、纤维素等，是由多 个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。凡符合高 分子化合物概念的碳水化合物及其衍生物均称为多糖。有由一种类型的单糖组成 的葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖等，由二种以上的单糖组成的杂多糖，含有氨基 浙江大学硕士学位论文胁甘露糖提取纯化工艺研究 糖的葡糖胺等。由糖苷键结合的糖链，至少要超过1 0 个以上的单糖组成的聚合 糖才称为多糖。比1 0 个少的短链称为寡糖。多糖无甜味，在水中不能形成真溶 液，只能形成胶体，无还原性，无变旋性，但有旋光性。多糖分为均一多糖和不 均一多糖。由一种单糖分子缩合而成的多糖，叫做均一多糖。常见的有：糖原、 淀粉、纤维素等。由不同的单糖分子缩合而成的多糖，叫做不均一多糖。常见的 有：硫酸软骨素、透明质酸等。 d 甘露糖是一种具有重要功能的六碳单糖，存在于植物的细胞中。d 甘露 糖在医药工业、食品工业、饲料工业和生命科学等的研究中具有重要的作用，作 为主要原料具有很大的潜在市场而得以迅速发展。本文在文献的基础上，设计了 一条新的提取纯化d 甘露糖的工艺路线，以棕树籽为原料，经过酸水解后碱中 和、酶催化反应、硅胶柱洗脱、离子柱除盐、结晶等步骤，得到最后产物。最终 收率为原料重量的4 6 4 。具体的路线如下： i 原料l 一5 硫酸水解l 一甘露聚糖酶再水解l - l 一jl _ j l 本文在改进和优化d 甘露糖的提取纯化工艺方面主要做了以下工作： 1 设计了一条新的提取纯化d 甘露糖的工艺路线来提取目标产物，使用廉价易 得的棕树籽作为原料，来源广泛 2 在酸水解碱中和后再用p 甘露聚糖酶反应，使水解出来的多聚糖进一步的水 解，反应条件温和，大幅度提高产品浓度 3 在过柱工序中处理了过柱液，用硅胶和浓缩液加热搅拌处理使成粉末后对过 柱有很大的帮助，上柱容易且不会堵塞硅胶柱，提高了生产效率，对降低生产成 本和简化后处理操作具有指导意义。 4 除盐工序使用了常用的离子树脂，且效果良好，提高了产品质量。除盐后的 产品可当作食品级甘露糖，提高了产品的附加值。 5 结晶工序通过对比实验，资料上要结晶7 2 h ，本工序缩短至2 4 h ，有利于工业 化大生产，且收率比较稳定 本工艺重现性好，产品质量稳定，酸水解、酶反应、硅胶分离、离子除盐、 2 浙江大学硕士学位论文弘甘露糖提取纯化工艺研究 结晶五步工序的总收率为4 8 4 。工艺路线简单，生产成本低。 各步提取纯化的合适工艺条件简要介绍如下。 第一步和第二步，棕树籽的酸水解碱中和及酶再水解： 4 - 棕树籽粉 h d 甘露糖+ 其他单糖+ 多聚糖等 以棕树籽为原料，对产品水解后的反应液进行了加入b 甘露聚糖酶再水解， 并研究了影响反应分解率的重要因素，确定较适合的工艺条件为：原料经过粉碎 过6 0 目筛，5 硫酸为酸水解剂原料与水的重量体积比1 ：7 ，油浴设定温度为 1 0 0 。c ，反应时间5 0 m i n ，b a ( o h ) 2 中和成中性，过滤，d 甘露糖浓度为0 2 5 6 9 - m l 一， 后加入b 甘露聚糖酶再水解，用量为液体体积的1 ，再水解时间为5 0m i n ，再 水勰温度为6 0 。c 。最终再水解后转化的d 甘露糖浓度达到o 6 3 9 9 m l 。 第三步，d 甘露糖的硅胶分离： 以酸水解、b 甘露聚糖酶再水解后的提取液为原料，硅胶和浓缩液混合加 热搅拌使其成为粉末后上柱，实验考察了过柱时的洗脱液各个溶剂的比例、洗脱 曲线、洗脱温度。确定较适合的工艺条件为：以酸水解、p 甘露聚糖酶再水解后 的提取液为原料，浓缩成原体积的1 3 后加入1 ：1 重量的硅胶粉，加热搅拌蒸发 掉剩余水分使成粉末状，上硅胶层析柱，过柱温度为3 0 。c ，每次上柱6 0 9 粉末 样品，正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：水= 2 ：1 ：0 7 ：0 3 为洗脱液，控制流速范围在 2 8 m l m i n 1 ，收集2 2 0m l 流出液d 甘露糖的过柱收率为9 6 9 。 第四步，d 甘露糖的脱盐： 以过柱后的收集液为原料，离子树脂除盐，实验考察了0 0 1 1 、0 0 1 4 、 0 0 1 x 7 、2 0 1 4 、2 0 1 7 、d 2 9 0 、d 1 5 1 、d 1 1 3 等树脂，经摇瓶实验，筛选出了0 0 1 4 、 2 0 1 7 两种树脂脱盐效果最好。确定较适合的工艺为：以过柱后的收集液为原料， 经浓缩成原体积的2 3 后过离子交换树脂除盐，确定了先阳离子交换树脂柱后阴 离子树脂交换柱的洗脱顺序，收集液导电率从原来的1 9 5 0u s c m 1 降到 1 2 5 3 u s c m 1 ，盐度从3 2p p t 降到0 2p p t ，除盐效果比较满意。除盐后产品收率 为9 0 1 。 第五步，d 甘露糖的结晶： 以除盐后的收集液为原料，通过三种不同的结晶方式比较，确定了产品的 浙江大学硕士学位论文d 甘露糖提取纯化工艺研究 结晶方法，确定较适合的工艺为：以除盐后的收集液为原料，将浓缩液置于一锥 形瓶内，量取其5 倍体积的9 5 乙醇加入其中，放入水浴摇床中在7 5 c 下以 l o o r m i n d 的速率震荡3 h 。取出后室温静置2 4 小时，结晶收率为8 6 7 。 本文实现了整个过程，并对各中间步骤的d 甘露糖含量进行了跟踪检测， 并最终确认了其结构，研究了影响各步反应及提取得率的关键因素，为生产过程 提供了重要的基础数据。 4 浙江大学硕士学位论文d 甘露糖提取纯化工艺研究 2 文献综述 2 1 课题背景 长期以来，由于人们低估了糖类对生命过程的贡献，只把它们简单作为一种 能源和细胞结构的支撑物，且由于研究糖类技术的局限性，使糖类研究至少滞后 于同时代诞生的蛋白质和核酸研究2 0 年。肥0 世纪6 0 年代开始，随着糖生物学、 糖化学，糖工程学等的发展，人们逐渐认识到糖类具有极其重要的生物学功能， 同时人们发现多种植物多糖具有明显的抗炎、免疫调节作用，如对急性炎症的抑 制作用【1 1 ，对佐剂性关节炎免疫细胞的调节作用【2 1 ，对免疫性肝损伤的保护作用 【3 1 ；对过敏性鼻炎的抗炎作用【4 】，对哮喘肺组织白三烯释放的抑制作用【5 1 ，对急 性肺损伤的保护作用【6 】，均涉及到植物多糖对炎症的抗炎免疫调节进一步的研 究发现了其中共同的重要组分d 甘露糖。已有报道它能抑制伤口愈合时的炎症反 应，减少伤口渗出液中中性粒细胞的数量，减少疤痕肉芽组织的生长【7 1 ，能抑制 中性粒细胞的氧化爆发【8 】；d 甘露糖的衍生物对腹膜炎【9 1 ，佐剂性关节炎【1 0 1 ，伤 口愈合时的炎症有抗炎作用【1 1 】d 甘露糖在医药工业、食品工业、饲料工业和 生命科学等的研究中具有重要的作用，作为主要原料具有很大的潜在市场而得以 迅速发展。目前，d 甘露糖最经济的生产方法是从植物中提取，因此，研究价格 低廉、纯度高、适合大规模生产的d 甘露糖提取纯化方法是非常必要的。 2 2 d 甘露糖简介 d 一甘露糖( d m a n n o s e ) 纯品为白色晶体或白色结晶型粉末，味甜、微苦；c a s 号：3 4 5 8 2 8 4 ，分子式为c 6 h 1 2 0 6 ，相对分子质量为18 0 1 6 ；易溶于水，在水中 的溶解a n 5 0 m g m l 一，微溶于甲醇、乙醇，不溶解于苯、丙酮、乙醚。熔点： 1 3 2 1 3 3 。c ( 1 i t ) 1 2 1 ，比旋度为【0 【】d 2 0 + 1 3 8 士0 5 。( 1 0 水溶液放置2 4h r ) ，分子结 构如图2 1 所示： 浙江大学硕士学位论文 d 甘露搪提取纯化工艺研究 2 3d 甘露糖的应用 o h 图2 1d - 甘露糖结构式 2 3 1 甘露糖对脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的保护作用 徐旋里【1 3 1 研究了d 甘露糖及其它三种同样分子量的己糖( 葡萄糖、半乳糖和 果糖) 对脂多糖( l p s ) 诱导的急性肺损伤l l i ) 的作用，仅有d 一甘露糖( 4 5 m g k g - 1 ) 能显示出保护作用，而其它三种己糖不能拮抗脂多糖引发的急性肺损伤。甘露糖 1 3 5 m g k g 。1 的作用与其它三种同样为1 3 5 m g k g d 剂量的己糖作用存在显著性差 异。 实验结果显示甘露糖预先治疗改善了肺上皮内皮屏障功能。甘露糖改善肺 上皮内皮屏障功能可能与其抑制中性粒细胞( p m n ) 的肺内浸润，抑制炎症细胞 释放的炎症因子如肿瘤坏死因子a ( t n f q ) 和蛋白水解酶等对屏障的破坏相关 甘露糖组支气管肺泡灌洗液( b a l f ) 中白细胞计数显著下降，肺组织病理切片肺 部炎症明显减轻，提示甘露糖能抑制脂多糖诱导的炎症细胞浸润，尤其是中性粒 细胞的浸润。髓过氧化酶( m p o ) 是中性粒细胞的标志酶，其活性高低反映组织中 中性粒细胞的聚集程度【1 4 】。甘露糖抑制中性粒细胞氧化爆发是通过己糖单磷酸 途经( h e x o s em o n o p h o s p h a t es h u n t ，i - i m p s ) ，甘露糖能抑制氧摄取，抑制超氧离子 产生，抑制h m p s 活性【15 1 。徐旋里【1 3 】认为甘露糖对大鼠急性肺损伤的保护作用 至少部分与重塑氧化抗氧化平衡相关。 甘露糖预先治疗显著降低了脂多糖诱导的t n f a 的释放，提示甘露糖保护 急性肺损伤可能与抑制肿瘤坏死因子伍释放，抑制由肿瘤坏死因子a 水平上升 导致的中性粒细胞聚集，及随后的中性粒细胞脱颗粒释放髓过氧化酶和超氧阴离 浙江大学硕士学位论文d 甘露糖提取纯化工艺研究 子等有关。白介素1 0 ( i l ，l o ) 被认为是重要的内源性抗炎症因子，白介素1 0 肿瘤 坏死因子a ( i l 1 0 t n f a ) 比值可能在急性肺损伤的发生和严重程度中起关键性 作用f 1 6 】。徐旋里 1 3 】发现许多实验显示在炎症发生时白介素1 0 水平降低 t 7 q s 】，然 而本实验提示脂多糖引起支气管肺泡灌洗液中白介素1 0 与肿瘤坏死因子a 平行 上升。 甘露糖作为一种简单的单糖，它更安全，副作用更少。而且，k i n g 等人发 现甘露糖能明显抑制细菌在马子宫内膜的粘附【1 9 1 。在合并有细菌感染的急性肺 损伤，甘露糖能抑制细菌在肺部粘附，还可作为对抗生素治疗的补充。 2 3 2甘露糖通过甘露糖受体抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞炎症 近年来人们发现巨噬细胞表面的甘露糖受体( m ) 与免疫及炎症密切相关。 甘露糖受体属于i 型跨膜蛋白受体，徐旋里【1 3 1 研究发现： ( 1 ) 甘露糖能抑制脂多糖诱导的小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞炎症反应，抑制脂 多糖诱导的巨噬细胞吞噬功能的增强，抑制巨噬细胞炎症因子t n f a 和i l 1 d m r n a 的合成和炎症因子蛋白的释放； ( 2 ) 脂多糖对小鼠腹腔和肺泡巨噬细胞的m r 有下调作用，甘露糖在发挥抗 炎效应的同时对m r 有上调作用，且m r 上调涉及到新合成m r 的增加； ( 3 ) 以特异的m r 自然配体甘露聚糖或以转染质粒干扰m r 的合成，能够阻 断甘露糖的抗炎效应，表明甘露糖的抗炎效应至少部分是通过m r 实现的； ( 4 ) 甘露糖能抑制l p s 诱导的巨噬细胞的核因子n f r d 3 的活性，提示甘露糖 可能通过n f 1 cb 信号通路，进而在m r n a 水平上抑制l p s 所致腹腔或肺泡巨 噬细胞t n f a 、i l 1 p 高水平表达。 2 3 3 甘露糖对植物外植体生长和再生的影响 王韬【2 1 1 等研究了以大麦栽培品种的茎尖、成熟胚为外植体，研究了不同甘 露糖浓度对这些外植体愈伤组织诱导和生长的影响。结果表明：甘露糖浓度为 2 0 9 l 1 时，茎尖的叶片伸长和生根受到明显抑制；甘露糖浓度为l o g l 1 或1 5 9 l 以 时，成熟胚的愈伤组织诱导率降低5 0 ，甘露糖浓度为2 0 9 l 。1 或2 5 9 l 。1 时，成 熟胚愈伤诱导和生长完全受到抑制，因此在以大麦茎尖和成熟胚为外植体的磷酸 浙江大学硕士学位论文d - 甘露糖提取纯化s t _ 艺研究 甘露糖异构酶( p m i ) 甘露糖筛选中，可分别以2 0 9 l 一、2 5 9 l j 甘露糖作筛选压。 为了给以磷酸甘露糖异构酶基因作为筛选标记的小麦遗传转化提供资料，姚 明镜1 等以小麦栽培品种扬麦1 5 8 和华麦1 3 的茎尖、叶基、成熟胚为外植体， 研究了不同甘露糖浓度对这些外植体愈伤组织诱导和生长培养的影响。结果表 明，1 0 9 l 。的甘露糖使茎尖的出苗和生根受到明显抑制，而茎尖幼苗对甘露糖的 耐受力较强，1 5 9 l 。1 甘露糖才能有效抑制幼苗生长。叶基在5 9 l 1 甘露糖时，其 愈伤组织诱导率降低5 5 ，而成熟胚在1 0 或1 5 9 l q 甘露糖时的愈伤组织诱导率 与叶基在5 9 l 以甘日露糖时相当。这些结果说明，在以小麦叶基、茎尖和成熟胚 为外植体的p mi 甘露糖筛选中，可分别以5 、1 0 、1 5g l o 甘露糖作为筛选压。 吴杨【2 3 1 等研究甘露糖对甘蔗外植体再生的影响，以确定用于甘蔗遗传转化 筛选的最适浓度。结果表明：甘露糖对甘蔗茎尖愈伤组织诱导、愈伤分化和幼芽 根形成均产生抑制作用。愈伤组织生长、分化、生根3 个阶段的抗性筛选浓度分 另4 为3 5 、4 5 和3 9 l 。 彭世清【2 4 1 等利用p c r 克隆了大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 中6 磷酸甘露糖异 构酶基n ( p m i ) 。将该基因替换植物表达载体p c a m b i a 2 3 0 1 中的卡那霉索抗性 基因，构建了以p m i 为选择标记基因的植物表达载体p p m i ，并导入根癌农杆菌 ( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s ) e h a l0 5 中。 岳建雄【2 5 1 等l ；( p m i 基因作为筛选标记基因，以甘露糖作为筛选剂，通过农杆 菌介导法将g f p 基因导入棉花细胞并得到再生植株，经过p c r 检测、s o u t h e r n 杂 交证实外源基因已经整合到棉花基因组中，w e s tb l o t i n g - 与荧光显微镜检测证明 g f p 基因得到表达。研究讨论了甘露糖作为棉花转化细胞的筛选剂在农杆菌介导 的转化中的应用浓度及方法，即：甘露糖的筛选浓度在3 0 5 0 9 l 1 之间，在愈伤 组织诱导初期适当低一点，随着愈伤组织的生长而加大筛选浓度 2 3 4 用来合成l 核糖 有国外报道口q 由d 甘露糖可以制得l 一核糖，l 核糖作为一种重要的医药中间 体，是用来合成抗艾滋病、抗病毒、抗癌药物的原料。以d 甘露糖为原料制得2 ， 3 ，5 ，6 二氧异丙叉基d 一甘露糖1 ，4 内酯( 3 ) ，哌啶开环，甲基磺酰氯甲磺酰 化，构型翻转得到中间体，最终合成出l 核糖口7 】其合成路线如图2 2 所示目 浙江大学硕士学位论文 d 甘露糖提取纯化工艺研究 前由于d 甘露糖的市场价格较高，对于能够开发出低成本的d 甘露糖供应市场 将对抗癌药物产生巨大作用。 s e o 等【2 8 1 通过哌啶打开d 甘露糖1 ，4 内酯，再经甲磺酰化作用的s n 2 型o 烷基化逐步实现c 4 构型的翻转，这些过程可以一锅完成。c 4 构型翻转后生成的 l 古洛糖1 ，4 内酯( 6 ) ，其后处理与t a k a h a s h i 等口9 1 的方法类似，以5 4 的总收率 合成出了l 核糖( 1 ) 。其合成路线如图2 3 所示 2 3 5 用来合成莽草酸前体化合物 顾秋英【3 q 等人利用d 甘露糖来合成了莽草酸前体化合物，实验以d 甘露糖 为手性源，经醛基保护、水解、切割、碳链延长等反应化学合成了莽草酸前体化 合物( h ) ，该反应条件温和，产物分离简单，适于工业化生产开发，总收率2 1 。 其中有几个化合物都为全新的甘露糖衍生物，可继续探索合成出达菲、唾液酸等 一系列具有抗禽流感活性的碳环化合物。反应式如图2 4 。 9 浙江大学硕士学位论文d 一甘露糖提取纯化工艺研究 h o h o 图2 3 d - 甘露糖一1 ，4 内酯( 3 ) 的一锅转化合成- 核糖( 1 ) c h 2 0 h a h o h o 8 0 b cd e f g 图2 4 莽草酸的前体合成 1 0 h a c e t 浙江大学硕士学位论文 d 甘露糖提取纯化y - e 研究 2 3 6 用来合成三氟甘露糖 杨志杰【3 l 】等利用d 甘露糖来制备三氟甘露糖，国外目前报道合成三氟甘露 糖的方法收率较低，前两步收率只有2 5 左右【3 2 1 ，以d 甘露糖为原料经乙酰化、 选择性水解、磺化三步反应合成三氟甘露糖。研究了离子液体对合成工艺的影响， 通过优化反应条件，产物总收率为4 6 。纯化后产品纯度可达9 9 o 。通过改进 反应条件，在合成化合物( 3 ) 时添加离子液 b m i m b f 4 水混合物，使两步总收率 提高到6 0 ，合成三氟甘露糖( 4 ) 路线如图2 5 。 l 4 d i 卜 a e 2 5 f l a h 3 e 卜 a ：( a c o ) 2 0b ：p b 5 b m i n 】b f 4 h 2 0 c h 3 c o o n a h c l 0 4 c ：( c f 3 s 0 2 ) 2 0c s h 6 nc h 2 c 1 2 d ：18 0 h 2 0c h 3 c ne ：h c l 图2 5 三氟甘露糖的合成 2 4d 甘露糖的提取方法 f 1 8 6 d 甘露糖的提取分为化学合成和植物提取制备两种方法，目前，化学合成是 利用葡萄糖的差向异构化来制备。 2 4 1以葡萄糖为原料 赵光辉3 3 1 等人研究了在酸性条件下，以钼酸铵为催化剂，使葡萄糖发生差 相异构反应，部分生成了d 一甘露糖；考察了葡萄糖溶液的浓度、p h 值、反应温 度、反应时间及催化剂加入量等因素对葡萄糖转化率的影响；通过正交试验分析， a c 浙江大学硕士学位论文d 甘露糖提取纯化工艺研究 确定了葡萄糖转化率达到最大值的条件为：p h 值3 、反应温度1 5 0 。c 、钼酸铵加 入量1 ( 以葡萄糖量计) 、反应时间1 2 0 m i n ，葡萄糖的转化率为3 2 1 3 。通过甘 露糖葡萄糖混合液进行加氢反应。可用来制备晶体d 甘露醇，同时联产液体d 山梨醇。这个反应对直接合成d 甘露糖并不理想，转化后的产物为葡萄糖、甘露 糖混合物，不易分离出单体d 甘露糖。 2 4 2以咖啡渣为原料 黄广剐3 4 等利用咖啡渣来提取d 甘露糖，咖啡渣中含有咖啡油、蛋白质、 纤维素和多糖类等，而多糖类主要是甘露聚糖【3 5 。6 】，甘露聚糖经酸或酶水解可得 d 甘露糖 3 7 - 3 9 】目前速溶咖啡生产厂家生产速溶咖啡后，其废渣除用作肥料和燃 料外，大多废弃不用，潜在的自然资源没有发挥其应有的效益，若将咖啡渣制取 d 甘露糖，可以充分利用原料变废为宝。通过对酸的选择、硫酸浓度、水解温度、 水解时间等条件研究，得出硫酸水解咖啡渣并提取d 甘露糖的最佳工艺条件是： 咖啡渣的粒度 8 0 目，硫酸的浓度为2 5 3 5 m o l l ，水解温度为1 1 0 1 3 0 ，水 解时间为8 0 1 2 0 r a i n 。其水解液中d 甘露糖的收率可达2 8 0 o - - 3 0 ，经脱色、蒸发 浓缩、结晶、分离、干燥等一系列工艺过程，可得n d 甘露糖精品。 2 4 3以棕树籽为原料 方积年【4 0 】等利用我国南方各省盛产的棕树籽来提取d 甘露糖，棕树是传统 的药用植物，属于棕榈科棕树据历代本草和现代药物资料记载，它的叶、花、 根和皮都可入药。棕树籽则是它的成熟果实。据统计国内棕树籽年产量可达4 5 万吨。近年来大部分出口到日本和西欧作为动物饲料，其余基本上无其他用途。 直接从棕树子中酸解提取d 甘露糖。具体工艺如下：将棕树籽磨成粉末，搅拌下 加入冷的8 0 硫酸，加完后间歇搅拌，放置数小时，搅拌下缓慢加入冰水稀释， 使硫酸的浓度逐渐下降为2 n ，1 0 0 * c 回流5 “小时，冷却，过滤，滤液中加活性 炭脱色，沸水中回流1 小时，冷却，过滤除去活性炭，脱色液加入氢氧化钡和碳 酸钡中和，使溶液的p h 值为6 7 ，离心得清液。减压浓缩至糖浆状，糖浆中加入 热甲醇，使其溶解，再加入异丙醇，静止片刻后倾倒取出上清液。不溶的胶状物 再用甲醇研磨溶解，震摇下加入异丙醇，静置，倾取上清液。胶状物沉淀再用甲 浙江大学硕士学位论文d 甘露糖提取纯化工艺研究 醇异丙醇如上法提取。合并三次上清液，加入活性炭，回流半小时，趁热过滤， 滤液减压浓缩至糖浆状，加入冰醋酸，加热使其溶解，然后在热的醋酸下加入少 量的乙醇，冷却后加入少量的d 甘露糖晶种，放置室温下结晶3 4 天，得到白色 结晶性晶体。结晶液经过滤，固体用冷的乙醇甲醇( 1 ：1 ) 混合液、乙醇、乙醚相 续洗涤。真空干燥得微黄色d 甘露糖固体。结晶母液经减压浓缩至糖浆状，再如 上法在冰醋酸中结晶，收率为3 0 。精制以上提取出来的d 甘露糖，要将固体再 次溶于等量水中，加几滴醋酸，使p h l ，在沸腾情况下加入活性炭脱色半小时， 过滤，滤液浓缩至糖浆状，加入热的甲醇和异丙醇混合液，上层清液减压浓缩至 原体积的1 2 ，溶液冷却后加入少许d 甘露糖晶种，放置至室温，偶尔搅拌结晶， 过滤的白色颗粒状结晶，其熔点为1 2 9 1 3 0 c ，与标准d 甘露糖混合，熔点不下 降。从棕树籽中提取d 甘露糖，将为我国的甘露糖来源开辟重要途径，也为棕树 籽的再利用找到新的出路